專利名稱：使用細(xì)胞系篩選線粒體K_ATP調(diào)節(jié)劑的方法
使用細(xì)胞系篩選線粒體Katp調(diào)節(jié)劑的方法要求在先提交的美國(guó)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)本申請(qǐng)要求2010年3月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/319，061號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過引用納入本文。
背景技術(shù)：
三磷酸腺苷敏感性鉀通道(Katp通道)作為連接所述細(xì)胞代謝水平和細(xì)胞膜興奮性的分子傳感器。迄今為止，就調(diào)節(jié)Katp通道能力來快速和有效評(píng)估分子的機(jī)制局限于繁瑣的電學(xué)分析。本文提供在細(xì)胞如肝細(xì)胞中進(jìn)行Katp通道試驗(yàn)并可特異分析線粒體Katp通道的方法、組合物和機(jī)器。還公開通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞中Katp通道治療肝紊亂的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本文公開使用線粒體ATP-敏感性鉀離子通道(mito_KATP)作為藥物靶標(biāo)的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法可鑒定能預(yù)防或治療肝病的化合物。在一些實(shí)施方式中，所述化合物是mito-KATP通道調(diào)節(jié)劑。本文還公開使用無標(biāo)記生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)篩選肝細(xì)胞中mito-KATP通道調(diào)節(jié)劑的方法。附圖簡(jiǎn)要說明圖I顯示內(nèi)源Katp通道在肝細(xì)胞系H印G2C3A中的表達(dá)。圖2顯示內(nèi)源Katp離子通道存在于H印G2C3A細(xì)胞的線粒體中，由其Kir6. 2亞基的Western印跡表明。圖3顯示H印G2C3A細(xì)胞中Katp開放劑吡那地爾(pinacidil)誘導(dǎo)的DMR信號(hào)，如本發(fā)明所述一個(gè)實(shí)施方式的實(shí)時(shí)記錄所示。(A)顯示H印G2C3A響應(yīng)不同劑量的吡那地爾刺激的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)DMR信號(hào)。(B)顯示刺激30分鐘后吡那地爾DMR信號(hào)的幅度，以及吡那地爾DMR信號(hào)的動(dòng)力學(xué)(t1/2)，其為吡那地爾劑量的函數(shù)。圖4顯示通過siRNA的SUR敲減對(duì)h印G2C3A細(xì)胞中吡那地爾誘導(dǎo)的DMR信號(hào)的影響。(A)顯示有或沒有RNAi敲減SUR2或SURl時(shí)吡那地爾DMR信號(hào)的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)。(B)顯示細(xì)胞響應(yīng)吡那地爾的幅度(刺激后30分鐘)是不同RNAi敲減預(yù)處理的函數(shù)。也包括陰性對(duì)照(即對(duì)載劑緩沖液的細(xì)胞響應(yīng))。圖5顯示通過SiRNA的Kir6. x敲減對(duì)h印G2C3A細(xì)胞中吡那地爾誘導(dǎo)的DMR信號(hào)的影響。(A)顯示有或沒有RNAi敲減Kir6. I或Kir6. 2時(shí)吡那地爾DMR信號(hào)的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)。(B)顯示細(xì)胞響應(yīng)吡那地爾的幅度(刺激后30分鐘)是不同RNAi敲減預(yù)處理的函數(shù)。也包括陰性對(duì)照(即對(duì)載劑緩沖液的細(xì)胞響應(yīng))。圖6顯示H印G2C3A細(xì)胞中mito_KATP通道的藥理學(xué)特性。(A)顯示通過已知Katp阻斷劑甲磺氮卓脲對(duì)吡那地爾DMR信號(hào)的劑量依賴性抑制。(B)顯示通過已知Katp阻斷劑組對(duì)吡那地爾DMR信號(hào)的劑量依賴調(diào)節(jié)，如作為其劑量函數(shù)的吡那地爾DMR信號(hào)的幅度所圖示。(C)顯示各32μΜ的不同阻斷劑對(duì)吡那地爾DMR信號(hào)的影響。在所有實(shí)驗(yàn)中，所述吡那地爾濃度是40 μ M0
圖7顯示MUo-Katp信號(hào)傳導(dǎo)關(guān)聯(lián)Rho激酶活性。ROCK抑制劑Y-27632劑量依賴性減弱H印G2C3A細(xì)胞中的吡那地爾DMR信號(hào)。(A)顯示存在不同劑量的Y-27632時(shí)的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)吡那地爾DMR信號(hào)。(B)顯示吡那地爾DMR信號(hào)的幅度是Y27632劑量的函數(shù)。在所有實(shí)驗(yàn)中，所述吡那地爾濃度是40 μ M0圖8顯示MUo-Katp信號(hào)傳導(dǎo)關(guān)聯(lián)Rho激酶活性。RNAi敲減ROCKl或R0CK2顯著減弱吡那地爾DMR信號(hào)(Α)顯示實(shí)時(shí)吡那地爾DMR信號(hào)，和⑶顯示吡那地爾DMR信號(hào)的幅度是不同RNAi敲減的函數(shù)。RNAi敲減還顯著降低H印G2C3A細(xì)胞中的對(duì)應(yīng)蛋白(C)顯示ROCKl敲減，和(D)顯示R0CK2敲減。在所有實(shí)驗(yàn)中，所述吡那地爾濃度是40 μ Μ。圖9顯不Mito_KATP f目號(hào)傳導(dǎo)關(guān)聯(lián)肌動(dòng)蛋白重塑。兩種熟知的肌動(dòng)蛋白破壞劑對(duì)吡那地爾DMR信號(hào)的劑量依賴性抑制，A)顯示松胞菌素B，和(B)顯示紅海海綿素A。在所有實(shí)驗(yàn)中，所述吡那地爾濃度是40 μ M0

圖10顯示MUo-Katp信號(hào)傳導(dǎo)關(guān)聯(lián)JAK激酶活性。JAK抑制劑AG490劑量依賴性抑制H印G2C3A細(xì)胞中的吡那地爾DMR信號(hào)(A)顯示實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)，和(B)顯示吡那地爾DMR的幅度是AG490劑量的函數(shù)。在所有實(shí)驗(yàn)中，所述吡那地爾濃度是40 μ M0·圖11顯示mito-KATP通道信號(hào)傳導(dǎo)關(guān)聯(lián)JAK活性。RNAi敲減JAK2或JAK3但非JAKl可顯著減弱吡那地爾DMR信號(hào)(A)顯示實(shí)時(shí)吡那地爾DMR信號(hào)，和(B)顯示吡那地爾DMR信號(hào)的幅度是不同RNAi敲減的函數(shù)。圖12顯示mito_KATP通道調(diào)節(jié)抑制利福平引起的初級(jí)肝細(xì)胞中CYP3A4活性誘導(dǎo)。(A)顯示吡那地爾對(duì)CYP3A4活性的影響。(B)顯示吡那地爾對(duì)利福平誘導(dǎo)CYP3A4活性的影響。(C)顯示格列甲嗪對(duì)CYP3A4活性的影響。(D)顯示格列甲嗪對(duì)利福平誘導(dǎo)CYP3A4活性的影響。(E)顯示吡那地爾對(duì)CYP1A2活性的影響。(F)顯示格列甲嗪對(duì)CYP1A2活性的影響。CYP酶活性測(cè)量前，所述初級(jí)肝細(xì)胞與特定劑量的化合物預(yù)孵育3天。
具體實(shí)施例方式材料、組合物和試驗(yàn)離子通道離子通道是膜整合蛋白，控制離子穿過細(xì)胞膜的運(yùn)動(dòng)。人中，約400基因編碼能裝配形成多于數(shù)千種不同離子通道亞型的蛋白，因?yàn)檫@些通常為具有形成孔和附屬亞單元的異源多聚復(fù)合物?？筛鶕?jù)其離子選擇性、序列同源性、四級(jí)結(jié)構(gòu)或門控機(jī)制來鑒定這些亞型。離子通道通過響應(yīng)廣泛刺激的門控來控制所述細(xì)胞的電學(xué)性能。迄今為止，已鑒定對(duì)以下敏感的離子通道配體如小分子或離子濃度變化、膜電勢(shì)變化、溫度波動(dòng)、膜張力變化、和最近的暴露于可見光。離子通道蛋白可通過胞內(nèi)或胞外配體或離子、電壓、溫度或牽張來門控。通過細(xì)胞膜內(nèi)通道的離子流由三種因子測(cè)定功能性通道的數(shù)量，用于離子降低其電化學(xué)梯度所存在的驅(qū)動(dòng)力和處于開放、離子傳導(dǎo)狀態(tài)的通道比例。該開放可能性可通過大量各種信號(hào)傳導(dǎo)分子調(diào)節(jié)，包括G蛋白、脂質(zhì)、激酶以及其他信號(hào)傳導(dǎo)分子。離子通道可在引起人疾病狀態(tài)的分子途徑中有關(guān)鍵作用，所述狀態(tài)通過疾病和先天離子通道異常(所謂離子通道病)之間的已知關(guān)聯(lián)數(shù)量增加來反映。此外，離子通道在5種主要藥物靶標(biāo)家族中，有G蛋白偶聯(lián)受體、激酶、轉(zhuǎn)運(yùn)子和酶。治療高血壓的L-型Ca2+通道阻斷劑、用于治療糖尿病的細(xì)胞膜Katp通道開放劑、治療焦慮的GABAA受體調(diào)節(jié)劑和給予癲癇和心律不齊患者的使用依賴性Na+通道阻斷劑是具有巨大銷量的藥物示例。因此，離子通道是非常吸引人的藥物靶標(biāo)。然而，大多數(shù)市售離子通道藥物為偶然發(fā)現(xiàn)，且用數(shù)百萬化合物庫開發(fā)離子通道藥物受到缺少可用于高通量技術(shù)的功能試驗(yàn)的阻礙。肝臟和肝病肝臟是人每天接觸的大量各類化學(xué)品代謝的主要位置。肝中最重要的代謝酶類是細(xì)胞色素P450，其積極參與藥物和其他化學(xué)品的清除。P450啟動(dòng)分解化學(xué)品的過程，從而所述化學(xué)品能被排出，但在代謝期間可能產(chǎn)生一些具有所需藥理效應(yīng)的活性代謝物。然而，反之亦然；代謝可產(chǎn)生毒性代謝物，如常見止痛劑乙酰氨基酚的分解中。肝臟是血液中許多毒性物質(zhì)解毒以及許多化合物合成和分泌的主要位置。肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞是組成70-80%肝胞質(zhì)團(tuán)的最豐富細(xì)胞，其進(jìn)行大多數(shù)肝中的代謝和生物合成。因此， 體外培養(yǎng)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞正逐漸流行用于藥物代謝和毒性研究。肝炎(hepatitis,復(fù)數(shù)為hepatitides)指肝臟受傷,其表征為器官組織存在炎癥細(xì)胞。所述病癥可為自限的、自愈的或可進(jìn)展為肝臟瘢疤。肝炎持續(xù)少于6個(gè)月被認(rèn)為是急性的，持續(xù)更長(zhǎng)則為慢性。肝炎可通過肝炎病毒引起，其導(dǎo)致全世界大多數(shù)肝損傷病例。肝炎還可由于毒素(特別是酒精)、其他感染引起或源自自身免疫過程。有許多肝炎類型，包括甲肝、乙肝、丙肝、丁肝、戊肝、己肝和庚肝和缺血性肝炎。肝炎可由病毒誘導(dǎo)(如甲肝-戊肝主要由病毒感染引起)。肝炎還可緣于毒素、化學(xué)品和藥物分子(如酒精、毒素、撲熱息痛、羥氨芐青霉素、抗結(jié)核藥物、二甲胺四環(huán)素)。肝炎還可由循環(huán)不足(即缺血性肝炎)、自身免疫病癥、代謝病或遺傳如威爾遜氏病引起。急性肝炎可由下述病毒引起甲肝-戊肝病毒(多于95%的病毒原)、單純皰疹病毒、細(xì)胞巨化病毒、EB病毒、黃熱病毒和腺病毒。急性肝炎還可由非病毒感染引起，如弓形蟲、鉤端螺旋體、Q熱和落磯山斑疹熱，以及通過化學(xué)品和毒素如酒精、毒素和藥物(如撲熱息痛、羥氨芐青霉素、抗結(jié)核藥物、二甲胺四環(huán)素和許多其他)引起。慢性肝炎通常由病毒性肝炎(即乙肝病毒，有或沒有丁肝、丙肝)、自身免疫、酒精、某些藥物(如米諾環(huán)素、甲基多巴、呋喃妥因、異煙肼、酮康唑)引起，還可由于遺傳如威爾遜氏病和α I-抗胰蛋白酶缺陷引起。人體將幾乎所有藥物識(shí)別為外來物質(zhì)且對(duì)其進(jìn)行各種化學(xué)過程(即代謝)以使其適于消除。這涉及化學(xué)品轉(zhuǎn)換以(a)降低脂溶性和(b)改變生物活性。盡管體內(nèi)幾乎所有組織都有一些代謝化學(xué)品的能力，但肝中滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是內(nèi)源化學(xué)品(如膽固醇、類固醇激素、脂肪酸和蛋白)和外源物質(zhì)(如藥物或其他非天然化學(xué)品)的主要"代謝清除室〃。肝臟在清處和轉(zhuǎn)化化學(xué)品中的中心作用還使其易受藥物誘導(dǎo)的損傷影響，稱為肝中毒。某些藥劑攝取過量時(shí)，有時(shí)甚至在治療范圍內(nèi)引入時(shí)，可能損傷肝臟。其他化學(xué)劑如用于實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)的那些、天然化學(xué)品(如微藻素)和草藥也可誘導(dǎo)肝中毒。多于900種藥物與引起肝損傷有關(guān)且其是藥物退出市場(chǎng)的最普遍原因?；瘜W(xué)品常引起肝臟的亞臨床損傷，其僅表示為異常的肝臟酶測(cè)試。藥物誘導(dǎo)的肝損傷引起5%的所有入院就醫(yī)和50%的所有急性肝衰竭。數(shù)種機(jī)制引起誘導(dǎo)肝損傷或損傷過程加重。許多化學(xué)品能損傷線粒體，所述線粒體是一種產(chǎn)生能量的胞內(nèi)細(xì)胞器官。其功能障礙會(huì)釋放過量氧化劑，繼而損傷肝細(xì)胞。細(xì)胞色素P-450系統(tǒng)中一些酶如CYP2E1的活化可引起氧化應(yīng)激。肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和膽管細(xì)胞的損傷引起膽酸在肝臟內(nèi)積累。這可進(jìn)一步加重肝損傷。非實(shí)質(zhì)細(xì)胞如庫普弗細(xì)胞、脂肪儲(chǔ)存星狀細(xì)胞和白細(xì)胞(即嗜中性和單核細(xì)胞)也在該機(jī)制中起作用。藥物代謝通常分為兩個(gè)階段1階段和2階段。認(rèn)為I階段反應(yīng)是為2階段反應(yīng)準(zhǔn)備藥物。然而，許多化合物可在2階段直接代謝。I階段反應(yīng)涉及氧化、還原、水解、水合和許多其他罕見化學(xué)品反應(yīng)。這些過程往往增加所述藥物的水溶性并可生成化學(xué)上更活躍且更可能有毒性的代謝物。大多數(shù)2階段反應(yīng)在細(xì)胞溶質(zhì)中發(fā)生并通過轉(zhuǎn)移酶參與內(nèi)源化合物的結(jié)合?；瘜W(xué)活性I階段產(chǎn)物相對(duì)惰性并適于通過該步驟消除。稱為細(xì)胞色素P-450的位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一組酶是肝中最重要的代謝酶家族。細(xì)胞色素P-450是電子傳遞鏈的最終氧化酶組分。其不是單一的酶，而是由50種緊密相關(guān)同種型的家族組成，其中6種代謝90%的藥物。個(gè)體P-450基因產(chǎn)物有巨大的多樣性且該異質(zhì)性使肝臟在I階段中的許多化學(xué)品(包括幾乎所有藥物)上進(jìn)行氧化。P450系統(tǒng)的三種重要 特征遺傳多樣性、酶活性變化和競(jìng)爭(zhēng)性抑制在藥物誘導(dǎo)的毒性中起作用。許多物質(zhì)可影響P-450酶機(jī)制。藥物與所述酶家族以數(shù)種方式相互作用。修飾細(xì)胞色素P-450酶的藥物稱為抑制劑或誘導(dǎo)劑。CYP抑制劑阻斷一種或數(shù)種P-450酶的代謝活性。該效應(yīng)通常立即發(fā)生。另一方面誘導(dǎo)劑通過增加合成來提高P-450活性。根據(jù)誘導(dǎo)藥物的半衰期，通常在酶活性提聞如有延遲。不良藥物反應(yīng)分為A型(固有的或藥理學(xué)的)或B型(特異體質(zhì)的)。A型藥物反應(yīng)引起80%的所有毒性。具有藥理學(xué)(A型)肝中毒的藥物或毒素是具有可預(yù)測(cè)劑量響應(yīng)曲線(較高濃度引起更多肝損傷)和良好表征的毒性機(jī)制如直接損傷肝組織或阻斷代謝過程的那些。在對(duì)乙酰氨基酚過量的情況中，該類型損傷在達(dá)到一些毒性閾值不久后發(fā)生。當(dāng)試劑在易受影響個(gè)體中引起不可預(yù)測(cè)肝中毒時(shí)，特異體質(zhì)性損傷沒有警告地發(fā)生，與劑量無關(guān)并具有不同的潛伏期。此類損傷沒有清晰的劑量響應(yīng)或時(shí)間關(guān)系，且多數(shù)通常不具有可預(yù)測(cè)模型。特異體質(zhì)性肝中毒甚至是在作為FDA批準(zhǔn)過程一部分的嚴(yán)格臨床測(cè)試后，引起數(shù)種藥物退出市場(chǎng)；曲格列酮(Rezulin )和曲伐沙星(Trovan )是特異體質(zhì)性肝損傷毒素的兩種主要示例?？鼓?jiǎng)┫Ｃ兰尤?ximelagatran) (Exanta )的開發(fā)由于考慮到肝損傷而中斷。ATP-敏感性鉀離子通道和mito_KATP通道三磷酸腺苷敏感性鉀通道(Katp通道)作為連接所述細(xì)胞代謝水平和細(xì)胞膜興奮性的分子傳感器。Katp通道通過與胞內(nèi)MgADP相互作用激活并通過高水平的ATP抑制。一種Katp通道蛋白復(fù)合物由四種小的成孔內(nèi)向整流鉀通道亞單元(Kir6. I或Kir6.2)和四種稱為磺酰脲受體的ATP結(jié)合盒(ABC)超家族成員的調(diào)節(jié)β亞基(SUR1或SUR2A、2B)組成。Katp通道在具有不同分子組成的各種組織中表達(dá)，所述組織包括心肌細(xì)胞、胰島β細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和神經(jīng)元(Seino S. Annu. Rev. Physiol. 1999. 61:337-62)。除了在細(xì)胞質(zhì)膜上表達(dá)，Katp通道還可在線粒體內(nèi)膜(Inoue I.,等Nature 1991; 352:244-7)和核被膜(I. Quesada,等 PNAS 2002;99:9544-9549)上發(fā)現(xiàn)。Katp通道結(jié)構(gòu)、功能和相關(guān)疾病與其他內(nèi)向整流K+通道類似，Kir6. I和Kir6. 2的各亞基具有兩個(gè)跨膜區(qū)段(Ml和M2)和有胞內(nèi)N末端和C末端的成孔區(qū)域，其含有數(shù)種可能的蛋白激酶A(PKA)或蛋白激酶 C(PKC)依賴性磷酸化位點(diǎn)(Seino S. Annu. Rev. Physiol. 1999. 61:337-62)。SUR亞基各含三種跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD OU和2)和兩種胞內(nèi)核酸結(jié)合域(NBD1和2)。SURl和SUR2對(duì)磺酰脲的結(jié)合親合力和組織分布不同，而SUR2的兩種變體僅在最后42個(gè)氨基酸上彼此不同。Kir和SUR亞基之間的相互作用不僅決定Katp通道在細(xì)胞表面的表達(dá)，還調(diào)控ATP結(jié)合和水解后的通道活性。在胰島β細(xì)胞中，Katp通道由Kir6. 2和SURl組成，其在調(diào)控胰島素分泌中有重要作用。血流中的高葡萄糖水平誘導(dǎo)β細(xì)胞中的胞質(zhì)ATP濃度增加，導(dǎo)致Katp通道關(guān)閉，這引起β細(xì)胞膜去極化和壓力門控Ca2+通道開放以及后續(xù)的胰島素分泌?；酋ｋ?如甲磺氮草脲和格列甲嗪)可以高親和性結(jié)合SURl并抑制Katp通道活性從而刺激胰島素分泌。已發(fā)現(xiàn)SURl或Kir6. 2中導(dǎo)致胰島素過分泌的功能性突變喪失引起嬰兒期的持續(xù)性高胰島素低血糖癥(PHHI)。相反，引起Katp通道持續(xù)開放的突變可引起暫時(shí)或永久性新生兒糖尿病。
這些年來，不同組織中Katp通道的分子組成通過重組表達(dá)不同組合的Kir6.x和SURx亞基并與天然ATP敏感性鉀電流作比較來測(cè)定。Katp通道的心肌細(xì)胞主要由Kir6. 2和SUR2A構(gòu)成，平滑肌細(xì)胞中為Kir6. 2和SUR2B，且血管平滑肌細(xì)胞中為Kir6. I和SUR2B。在心臟中，顯示肌纖維膜和線粒體Katp通道都對(duì)缺血性預(yù)處理(IPC)有保護(hù)效應(yīng)。Katp通道在膀胱、結(jié)腸和氣道的平滑肌收縮調(diào)節(jié)中起強(qiáng)效作用。Katp通道還通過血管擴(kuò)張劑起始的循環(huán)AMP依賴性PKA信號(hào)傳導(dǎo)途徑或循環(huán)GMP依賴性PKG途徑來引起血管舒張。Katp通道開放劑、阻斷劑和其治療潛力除了通過胞內(nèi)ATP/MgADP濃度調(diào)節(jié)，Katp通道還可通過稱為鉀通道開放劑(KCO)的一組結(jié)構(gòu)多樣性化合物和阻斷化合物如磺酰脲和其他非磺酰脲化學(xué)品來實(shí)現(xiàn)(Babenko，A.P.等· J. Biol. Chem. 2000;275:717-720)。對(duì)不同KCO的通道響應(yīng)依賴Katp通道的分子組成。二氮嗪有效激活Kir6. 2/SUR1通道但對(duì)Kir6. 2/SUR2A通道具有很小的效果；而吡那地爾、克羅卡林和尼可地爾優(yōu)選激活Kir6. 2/SUR2通道。放射性結(jié)合試驗(yàn)和用嵌合通道的研究表明KCO結(jié)合SUR亞基；具體地，二氮嗪結(jié)合TMDl且吡那地爾或其類似物結(jié)合TMD2 ;其對(duì)Katp通道的效果由核苷酸和NBD之間的相互作用來調(diào)節(jié)?；酋ｋ逅幬镆延糜谥委烮I型糖尿病，因?yàn)槠浣Y(jié)合SURl亞基且關(guān)閉Katp通道并引起胰島素分泌。這些藥物還顯示對(duì)基于SUR2的Katp通道的相似抑制。此外，還有非磺酰脲阻斷劑如U-37883A，其已被報(bào)道為選擇性抑制含Kir6. I的Katp通道。Katp通道開放劑和阻斷劑都有治療潛力例如，磺酰脲藥物已用于治療II型糖尿病。此外，選擇性Katp通道阻斷劑可用于通過降低動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間來預(yù)防心律不齊。Katp通道開放劑已用于治療高血壓、胰島素機(jī)能亢進(jìn)、冠狀動(dòng)脈疾病。肝細(xì)胞中的Katp通道關(guān)于Katp通道的大多數(shù)研究已在胰島β細(xì)胞或心肌細(xì)胞中進(jìn)行。Malhi等報(bào)道了 Katp通道的表達(dá)和其對(duì)大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞系中細(xì)胞增殖的影響(Malhi，H等J. Biol. Chem. 2000, 275:26050-26057)。然而，其他研究表明人肝癌細(xì)胞系IfepG2的細(xì)胞表面具有很小的Katp通道電流，但Katp通道表達(dá)可通過轉(zhuǎn)染胰島素和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子GLUT2來誘導(dǎo)(Liu’G.J.等 FASEB J. 2003; 17:1682 - 1684)。通過用分離自大鼠肝臟線粒體的絲狀體記錄的單通道，1991年首次報(bào)道無神經(jīng)的線粒體Katp通道(Inoue I，等Nature 1991,352:244-247)。由于技術(shù)困難和線粒體的復(fù)雜性，線粒體Katp通道的分子組成仍不清楚(Rodrigo, G. C.和Standen, N. B. CurrentPharmaceutical Design, 2005, 11:1915-1940)。有建議認(rèn)為線粒體Katp通道在心臟組織的IPC中有保護(hù)作用，并通過數(shù)種可能機(jī)制阻止細(xì)胞凋亡，所述機(jī)制包括調(diào)節(jié)活性氧(ROS)生成、保持線粒體基質(zhì)體積和調(diào)節(jié)線粒體Ca2+水平(Ardehali, H. J. Bioenergetics andBiomembranes, 2005, 37:171-177)。用無標(biāo)記試驗(yàn)篩選線粒體ATP敏感性鉀離子通道離子通道仍是一類未充分開發(fā)的靶標(biāo)。一種限制因素是缺少生理相關(guān)的篩選工具。包括常規(guī)和自動(dòng)膜片鉗的膜片鉗具有低至中等的通量，且涉及使用人工系統(tǒng)(即工程改造細(xì)胞和/或人工試驗(yàn)環(huán)境)。最重要的是這些試驗(yàn)是單細(xì)胞試驗(yàn)。然而，細(xì)胞響應(yīng)在單細(xì)胞水平高度異質(zhì)。同樣重要的是這些試驗(yàn)是侵入性的，需要的緊密密封可能擾亂離子通道復(fù)合物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。除了具有侵入性和使用人工系統(tǒng)(即工程改造的細(xì)胞和/或染料標(biāo)記分子)，離子流/熒光分析通常產(chǎn)生較差的命中質(zhì)量-較高的假陽性和陰性，這是由于需要預(yù)裝載可能改變細(xì)胞背景的染料或離子。為了克服這些缺點(diǎn)，本文公開的方法使用無標(biāo)記細(xì)胞試驗(yàn)就天然細(xì)胞中的內(nèi)源離子通道篩選調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方式中，所公開的方法使用無標(biāo)記細(xì)胞試驗(yàn)就內(nèi)源mito-KATP離子通道篩選調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方式中，所述篩選在非常規(guī)細(xì)胞系中進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，所述mito-KATP通道的功能作用未知，但其活性可通過生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)準(zhǔn)確檢測(cè)。所述無標(biāo)記生物傳感器，具體為包括SPR和RWG的視覺生物傳感器是非侵入性的且可實(shí)時(shí)檢測(cè)通過離子通道介導(dǎo)的敏感區(qū)內(nèi)離子通道配體誘導(dǎo)的細(xì)胞物質(zhì)動(dòng)態(tài)再分配。得到的DMR信號(hào)是整合的細(xì)胞響應(yīng)，并跟蹤離子通道活性的完整發(fā)展。實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)能對(duì)在離子通道和其調(diào)控蛋白上作用的調(diào)節(jié)劑作用模式分類。所述生物傳感器離子通道細(xì)胞試驗(yàn)的其他益處可包括但不限于所述生物傳感器離子通道試驗(yàn)?zāi)芫瓦B接離子通道活性和細(xì)胞生理的離子通道調(diào)節(jié)劑提供新見解。內(nèi)源mito_KATP作為治療祀標(biāo)用于預(yù)防或治療肝病 內(nèi)源mito_KATP通道在肝細(xì)胞或肝組織的生物、生理和病理生理作用未知。然而，有一些證據(jù)表明Katp通道在轉(zhuǎn)化的肝腫瘤細(xì)胞系0fepG2)中內(nèi)源性表達(dá)。所公開的方法還可提供證據(jù)顯示初級(jí)肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)化的mito-KATP通道表達(dá)、內(nèi)源mito-KATP通道活化的下游細(xì)胞生物學(xué)和生理學(xué)以及mito-KATP通道活化在初級(jí)肝細(xì)胞藥物代謝中的作用。公開的方法還可將下游的mito-KATP活化靶標(biāo)(如JAK和Rho激酶)鑒定為治療肝病的潛在治療靶標(biāo)。Rho 激酶Rho激酶又稱為R0CK，是RhoA的主要效應(yīng)子。ROCK是約160kDa的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，對(duì)應(yīng)的基因產(chǎn)物是ROCK I和ROCK II (rho-相關(guān)卷曲螺旋，含激酶_1和_2，還分別稱為Rokb/pl60R0CK和Roka)。這兩種激酶在人類中具有64%總體相同性，在催化激酶結(jié)構(gòu)域有89%相同性。兩種激酶都含由Cl保守區(qū)域分開的卷曲螺旋區(qū)域和普列克底物蛋白同源(PH)結(jié)構(gòu)域。這兩種ROCK具有空間上差異的表達(dá)。Rho激酶通過其C00H-末端結(jié)構(gòu)域自我調(diào)節(jié)，其折疊回到活性位點(diǎn)上以抑制其激酶活性。僅RhoA的活性GTP結(jié)合形式結(jié)合ROCK并阻斷所述蛋白的失活。只要Rho的活化形式結(jié)合R0CK，則激酶保持活化。Rho激酶還可被花生四烯酸和鞘氨醇磷脂酰膽堿(sphingosylphosphorylcholine)活化。胱冬酶對(duì)抑制性C00H-末端的切割可使ROCK活性在凋亡期間增加。
絲氨酸/蘇氨酸激酶ROCKl和R0CK2是活化的Rho GTP酶的直接靶標(biāo)，且異常rho/ROCK信號(hào)傳導(dǎo)涉及許多人類疾病。ROCKl和R0CK2是AGC亞家族酶的密切相關(guān)的成員，其為響應(yīng)許多胞外刺激的活化Rho的活化下游，所述刺激包括生長(zhǎng)因子、整聯(lián)蛋白活化和細(xì)胞應(yīng)激。ROCK活化引起一系列協(xié)同事件，促進(jìn)力生成和形態(tài)改變。這些事件直接引起許多肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白-介導(dǎo)的過程，如細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、粘附、平滑肌收縮、神經(jīng)突收縮和噬菌作用。此外，ROCK激酶在增殖、分化、凋亡和致癌轉(zhuǎn)化中起作用，盡管這些響應(yīng)可為細(xì)胞類型依賴性的。ROCK的活化導(dǎo)致許多不同下游靶標(biāo)的后續(xù)磷酸化作用。最熟知的Rho激酶靶標(biāo)是肌球蛋白輕鏈(MLC)。肌球蛋白磷酸酶也被Rho激酶磷酸化且該相互作用引起磷酸化MLC的增加。此外，ROCK在UM激酶-I和激酶-2 (LIMKl和UMK2)的活化環(huán)中保守的蘇氨酸處將其磷酸化，增加UMK活性以及絲切蛋白(cofilin)的后續(xù)磷酸化，其阻斷它們的F肌動(dòng)蛋白切割活性。參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排的許多其他蛋白由ROCK磷酸化。 ROCK酶在許多細(xì)胞過程中有重要作用，包括細(xì)胞形態(tài)、應(yīng)力纖維形成和功能、細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移和侵入、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變、轉(zhuǎn)化、噬菌作用、凋亡、神經(jīng)突收縮、胞質(zhì)分裂和細(xì)胞分化。因此，ROCK激酶代表用于治療各種紊亂的抑制劑開發(fā)的可能靶標(biāo)，所述紊亂包括癌癥、高血壓、血管痙攣、哮喘、早產(chǎn)、勃起機(jī)能障礙、青光眼、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞、月巴大和神經(jīng)疾病。哮喘是慢性炎性氣道疾病，特征為早期和晚期的哮喘性反應(yīng)，所述反應(yīng)與氣道中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和活化以及對(duì)包括神經(jīng)遞質(zhì)和炎癥介質(zhì)在內(nèi)各種刺激的氣道高反應(yīng)性有關(guān)。在哮喘中，通過招募炎癥細(xì)胞和通過駐留結(jié)構(gòu)細(xì)胞而釋放到氣道中的炎癥介質(zhì)導(dǎo)致支氣管收縮增加引起的氣道高反應(yīng)性。此外，慢性炎癥似乎驅(qū)動(dòng)氣道重塑，引起固定氣道阻塞的發(fā)展和慢性哮喘中氣道反應(yīng)性過高。氣道重塑包括數(shù)種關(guān)鍵特征，如胞外基質(zhì)蛋白在氣道壁過量沉積(纖維癥)和包圍氣道的收縮性氣道平滑肌豐度增加。肌肉中固有功能改變或者肌肉功能的神經(jīng)性或非神經(jīng)性控制的改變引起的氣道平滑肌收縮增加可部分解釋氣道高反應(yīng)。此外，氣道高反應(yīng)性的發(fā)展被氣道中的物理變化所加重，所述變化如上皮層損傷、粘膜腫脹、杯狀細(xì)胞增生和氣道壁重塑。氣道重塑通常表征為網(wǎng)狀層增厚、上皮下胞外基質(zhì)沉積擴(kuò)大(纖維癥)和包圍氣道的收縮性氣道平滑肌豐度增加。目前哮喘治療不能令人滿意地抑制這些特征。當(dāng)前，過敏性哮喘的急性和慢性特征的治療主要通過￠2-腎上腺素受體激動(dòng)劑和皮質(zhì)激素類實(shí)現(xiàn)。過度氣道平滑肌收縮引起的急性支氣管痙攣可令人滿意的在多數(shù)患者中通過吸入引起氣道平滑肌放松的￠2-腎上腺素受體激動(dòng)劑而逆轉(zhuǎn)。然而不幸的是，患者可產(chǎn)生對(duì)3 2-腎上腺素受體激動(dòng)劑的耐受性，且這些試劑對(duì)體內(nèi)氣道炎癥和氣道重塑效果很小，盡管報(bào)道了它們能體外抑制氣道重塑的個(gè)體特征(如氣道平滑肌增殖)。吸入的皮質(zhì)激素類是控制包括持續(xù)性輕度、中度和嚴(yán)重哮喘在內(nèi)的數(shù)種過敏疾病的主力，且熟知其降低鑒定哮喘的炎癥過程強(qiáng)度的廣譜活性。然而不幸的是，氣道炎癥的數(shù)種特征(如中性白細(xì)胞增多)可能對(duì)皮質(zhì)激素類治療相對(duì)不敏感。此外，皮質(zhì)激素類僅在抑制氣道重塑特征中部分有效。因此，盡管皮質(zhì)激素類有效阻止氣道重塑的數(shù)種特征(纖維癥、氣道平滑肌增厚、黏液腺肥大)，但其在逆轉(zhuǎn)氣道壁重塑中效果較差。有關(guān)3 2-腎上腺素受體激動(dòng)劑和皮質(zhì)類固醇治療的限制推動(dòng)其他藥物靶標(biāo)的研究和鑒定。Rho激酶在其中作為可能的治療哮喘中氣道反應(yīng)過度的靶標(biāo)。Rho-激酶是RhoA的效應(yīng)分子，這是一種單體GTP結(jié)合蛋白，通過使肌球蛋白磷酸酶失活而引起Ca2+敏化。Rho-激酶的主要生理功能包括細(xì)胞的收縮、遷移和增殖。認(rèn)為這些作用與哮喘的病理生理特征相關(guān)，即氣流受限、氣道高反應(yīng)、￠-腎上腺素脫敏、嗜伊紅細(xì)胞招募和氣道重塑。JAKJanus激酶(JAK)家族在涉及免疫響應(yīng)的細(xì)胞增殖和功能的細(xì)胞因子依賴性調(diào)節(jié)中起作用。當(dāng)前，有四種已知哺乳動(dòng)物JAK家族成員JAKl (又稱為Janus激酶-I)、JAK2 (又稱為Janus激酶-2)、JAK3 (又稱為Janus激酶，白細(xì)胞；JAKL; L-JAK和Janus激酶-3)和TYK2(又稱為蛋白-酪氨酸激酶T)。JAK蛋白大小范圍為120_140kDa且包括7種保守的 JAK同源(JH)結(jié)構(gòu)域；這些之一是功能性催化激酶結(jié)構(gòu)域，且另一是假性激酶結(jié)構(gòu)域，可能作為調(diào)節(jié)功能和/或作為STAT的?？课稽c(diǎn)。在JAK激酶水平阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)開發(fā)許多疾病治療具有良好前景，所述疾病包括炎癥疾病、自身免疫疾病和骨髓增生疾病和人類癌癥等。JAK激酶的調(diào)節(jié)劑或抑制可在皮膚免疫紊亂如牛皮癬和皮膚敏化的患者中具有治療益處。因此，Janus激酶或相關(guān)激酶的抑制劑廣泛可見且許多出版物報(bào)道了有效種類的化合物。JAK相關(guān)疾病的另一示例包括自身免疫疾病如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、狼瘡、牛皮癬、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、重癥肌無力、免疫球蛋白腎病、自身免疫甲狀腺紊亂等。在一些實(shí)施方式中，所述自身免疫疾病是自身免疫大皰皮膚病如尋常性天皰瘡(PV)或大皰性天皰瘡(BP)。JAK相關(guān)疾病的其他示例包括過敏病癥如哮喘、食物過敏、遺傳性過敏皮炎和鼻炎。JAK相關(guān)疾病的其他示例包括病毒性疾病如EB病毒(EBV)、乙肝病毒、丙肝病毒、HIV、HTLV I、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)和人乳頭狀瘤病毒(HPV)。其他JAK相關(guān)疾病包括發(fā)炎和炎癥疾病。示例性的炎癥疾病包括眼部炎癥疾病(如虹膜炎、眼色素層炎、鞏膜炎、結(jié)膜炎或相關(guān)疾病)、呼吸道炎癥疾病(如上呼吸道，包括鼻和竇如鼻炎或竇炎，或下呼吸道，包括支氣管炎、慢性阻塞性肺病等)、炎癥肌肉病如心肌炎和其他炎癥疾病。聲學(xué)生物傳感器聲學(xué)生物傳感器例如石英晶體諧振器使用聲波以鑒定細(xì)胞反應(yīng)。所述聲波通常使用壓電產(chǎn)生和接收。聲學(xué)生物傳感器經(jīng)常設(shè)計(jì)成在共振類型傳感器配置上操作。在通常設(shè)定中，薄石英盤夾在兩個(gè)金電極之間。應(yīng)用跨電極的AC信號(hào)造成晶體的激發(fā)和振蕩，作為敏感振蕩電路。所述輸出傳感器信號(hào)是所述共振頻率和動(dòng)態(tài)電阻。當(dāng)生物傳感器表面是剛性時(shí)，所述共振頻率是吸收材料總質(zhì)量的高度線性函數(shù)。在液體環(huán)境下，所述聲學(xué)生物傳感器反應(yīng)不僅對(duì)結(jié)合分子質(zhì)量敏感，而且對(duì)粘彈屬性的改變和所形成分子復(fù)合物或活細(xì)胞的電荷敏感。通過測(cè)量與晶體相關(guān)的細(xì)胞的所述共振頻率和所述動(dòng)態(tài)電阻，實(shí)時(shí)研究細(xì)胞過程，包含細(xì)胞粘附和細(xì)胞毒性。電學(xué)生物傳感器電學(xué)生物傳感器使用阻抗來鑒定細(xì)胞響應(yīng)，包括細(xì)胞粘附。在通常設(shè)定中，使活細(xì)胞接觸嵌入集成電極陣列的生物傳感器表面。恒定電壓和高頻下的小AC脈沖用于產(chǎn)生電極間電場(chǎng)，其被存在的細(xì)胞所阻礙。所述電脈沖使用集成電路原位產(chǎn)生，并且隨著時(shí)間跟蹤通過所述電路的電流。所得阻抗是對(duì)細(xì)胞層電導(dǎo)率變化的測(cè)量。所述細(xì)胞質(zhì)膜作為絕緣劑迫使電流在細(xì)胞間或之下流動(dòng)，造成阻抗上的相當(dāng)強(qiáng)的改變?；谧杩沟臏y(cè)量用于研究廣泛的細(xì)胞事件，包括細(xì)胞粘著和擴(kuò)散、細(xì)胞微動(dòng)、細(xì)胞形態(tài)變化、和細(xì)胞死亡和細(xì)胞信號(hào)傳遞。光學(xué)生物傳感器光學(xué)生物傳感器首先使用表面結(jié)合電磁波以鑒定細(xì)胞反應(yīng)。所述表面結(jié)合波能在金底物上使用光激發(fā)表面等離子體(表面等離體共振，SPR)或在介電基底上使用衍射光柵偶聯(lián)的波導(dǎo)模式共振(共振波導(dǎo)光柵，RWG)來實(shí)現(xiàn)。對(duì)包含中紅外(mid-IR)SPR的SPR而言，所述讀取是發(fā)生最小反射光強(qiáng)度時(shí)的共振角度。相似地，對(duì)包含光子晶體生物傳感器的RWG生物傳感器而言，所述讀取是實(shí)現(xiàn)最大入偶聯(lián)效率時(shí)的共振角度或波長(zhǎng)。所述共振角度或波長(zhǎng)是傳感器表面或附近的局部折射率的函數(shù)。由于近期設(shè)備和試驗(yàn)的改進(jìn)，不同于限定在試驗(yàn)的幾個(gè)流道的SPR，RWG生物傳感器可用于高通量篩選(HTS)和細(xì)胞試驗(yàn)。在典型RWG中，所述細(xì)胞直接置于微量滴定板的孔內(nèi)，其中置入由高折射率材料組成的生物傳感器。局部折射率的改變?cè)斐苫罴?xì)胞在刺激后的動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布(DMR)信號(hào)。所述生物傳感器已經(jīng)用于研究不同細(xì)胞過程，包含受體生物學(xué)、配體藥理學(xué)和細(xì)胞粘附。本發(fā)明優(yōu)選使用共振波導(dǎo)光柵生物傳感器，例如康寧(Corning) Epic 系統(tǒng)。Epic 系統(tǒng)包含市售可得波長(zhǎng)整合系統(tǒng)，或角度調(diào)制系統(tǒng)或掃頻波長(zhǎng)成像系統(tǒng)(紐約州康寧的康寧公司(Corning Inc.))。所述市售系統(tǒng)由溫度控制單元、光學(xué)檢測(cè)單元、和用機(jī)器人的機(jī)載液體操作單元或用機(jī)器人的外部液體附屬系統(tǒng)組成。所述檢測(cè)單元以集成光纖為核心，能以約7或15秒的時(shí)間間隔對(duì)細(xì)胞響應(yīng)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量。所述化合物溶液通過使用機(jī)載液體操作單元或外部液體附屬系統(tǒng)引入；兩者都使用傳統(tǒng)液體操作系統(tǒng)。也能使用包含高分辨成像系統(tǒng)和高采集光學(xué)生物傳感器系統(tǒng)的不同RWG生物傳感器系統(tǒng)。生物傳感器和生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)基于無標(biāo)記細(xì)胞的試驗(yàn)常使用生物傳感器監(jiān)控活細(xì)胞中分子誘導(dǎo)的響應(yīng)。分子可以是天然產(chǎn)生或是合成的，可以是純化的或未純化的混合物。生物傳感器常利用傳感器，例如光、電、熱量、聲、磁、或類似傳感器將與生物傳感器接觸的細(xì)胞內(nèi)的分子識(shí)別事件或分子誘發(fā)變化轉(zhuǎn)化成可定量的信號(hào)。這些無標(biāo)記生物傳感器可用于涉及鑒定分子復(fù)合物如何隨時(shí)間形成和解離的分子相互作用分析，或用于涉及鑒定細(xì)胞如何響應(yīng)刺激的細(xì)胞響應(yīng)?？捎糜诒痉椒ǖ纳飩鞲衅靼ɡ纾鈱W(xué)生物傳感器系統(tǒng)如表面等離子體共振(SPR)和包括光子晶體生物傳感器的共振波導(dǎo)光柵(RWG)生物傳感器、共振鏡、橢圓計(jì)，和電生物傳感器系統(tǒng)如生物阻抗系統(tǒng)。SPR生物傳感器和系統(tǒng)SPR依靠棱鏡把覆蓋一定入射角范圍的楔形偏振光導(dǎo)入裝有導(dǎo)電金屬膜(例如金)的平面玻璃基材上以激發(fā)表面等離子體。所產(chǎn)生的漸消波與金層中的游離電子云相互作用并被吸收，產(chǎn)生電荷密度波(即表面等離子體)并導(dǎo)致反射光強(qiáng)度的減弱。產(chǎn)生最小強(qiáng)度的共振角隨傳感器表面的反面上接近金層溶液的折射率而變化。RffG生物傳感器和系統(tǒng)RffG生物傳感器可包括，例如基材(例如玻璃)、包埋了光柵或周期性結(jié)構(gòu)的波導(dǎo)薄膜、和細(xì)胞層。RWG生物傳感器通過衍射光柵的方式將光共振偶聯(lián)進(jìn)入波導(dǎo)，導(dǎo)致在溶液-表面界面的全內(nèi)反射，進(jìn)而在界面產(chǎn)生電磁場(chǎng)。這一電磁場(chǎng)本質(zhì)是漸消的，表示它從傳感器表面指數(shù)衰減；它衰減到初始值的1/e的距離稱為貫穿深度，它隨具體的RWG生物傳感器的設(shè)計(jì)而變化，但通常在約200納米左右。這類生物傳感器利用這種漸消波鑒定傳感器表面上或靠近該表面的細(xì)胞層由配體誘導(dǎo)的變化。RWG儀器可以根據(jù)角位移或波長(zhǎng)移位測(cè)量細(xì)分為不同系統(tǒng)。在波長(zhǎng)移位測(cè)量中，采用具有恒定角度的覆蓋一定入射波長(zhǎng)范圍的偏振光照射波導(dǎo)，特定波長(zhǎng)的光被偶聯(lián)入并沿波導(dǎo)傳播?；蛘撸诮俏灰苾x器中，用單色光照射傳感器并測(cè)量光的共振偶聯(lián)角度。共振條件受與生物傳感器表面直接接觸的細(xì)胞層影響(例如細(xì)胞融合、粘附和狀態(tài))。當(dāng)配體或分析物與活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞靶標(biāo)(例如，GPCR、離子通道、激酶)相互作用時(shí)，細(xì)胞層內(nèi)局部折射率的任何變化可以通過共振角(或波長(zhǎng))的變化檢測(cè)出。ConiilIgvEpic/系統(tǒng)采用RWG生物傳感器進(jìn)行無標(biāo)記生化或基于細(xì)胞的試驗(yàn)(康寧公司，紐約州康寧)。所述Epic''系統(tǒng)由RWG讀板儀和SBS (生物分子篩選學(xué)會(huì))標(biāo)準(zhǔn)微量滴定板組成。讀板儀的檢測(cè)器系統(tǒng)利用集成光纖測(cè)量細(xì)胞內(nèi)配體誘導(dǎo)變化所引起的入射光波長(zhǎng)移位。一系列照射-檢測(cè)頭以線性方式排列，從而能從384孔微孔板的列中各孔同時(shí)采集反射光譜。掃描整塊板使得每個(gè)傳感器被多次訪問，每列被依序訪問。采集入射光的波長(zhǎng)并用于分析。所述儀器可包括溫控單元以盡可能減少因溫度波動(dòng)導(dǎo)致的入射波長(zhǎng)假移位。測(cè)得的響應(yīng)代表細(xì)胞群的平均響應(yīng)。系統(tǒng)的不同特征例如樣品加載可以自動(dòng)化，也可以多通路化，例如用96孔或384孔微量滴定板。可以用機(jī)載的液體處理器或外接的液體處理附件進(jìn)行液體操作。具體地，在各孔底部培養(yǎng)了細(xì)胞的細(xì)胞試驗(yàn)板的孔內(nèi)直接添加或抽吸入分子溶液。細(xì)胞試驗(yàn)板包含一定體積試驗(yàn)緩沖液覆蓋細(xì)胞。在分子添加步驟中還可以加入通過上下抽吸數(shù)次完成的簡(jiǎn)單混合步驟。電生物傳感器和系統(tǒng)電生物傳感器由基底(例如，塑料)、電極、和細(xì)胞層組成。在這種電檢測(cè)方法中,在排列于基底上的小金電極上培養(yǎng)細(xì)胞，并隨時(shí)間跟蹤系統(tǒng)的電阻抗。阻抗是對(duì)細(xì)胞層電導(dǎo)率變化的量度。通常，在電極或電極陣列上施加固定頻率或變頻的微小恒定電壓，隨時(shí)間監(jiān)控通過電路的電流。配體誘導(dǎo)的電流變化提供了細(xì)胞響應(yīng)的量度。用于全細(xì)胞感測(cè)的阻抗測(cè)量最初于1984年實(shí)現(xiàn)。從那時(shí)起，基于阻抗的測(cè)量被應(yīng)用于研究廣泛的細(xì)胞事件，包括細(xì)胞粘著和擴(kuò)散、細(xì)胞微動(dòng)、細(xì)胞形態(tài)變化、和細(xì)胞死亡。經(jīng)典阻抗系統(tǒng)的問題在于因使用小檢測(cè)電極和大參照電極導(dǎo)致的高試驗(yàn)變化性。為克服這一變化性，最新一代的系統(tǒng)例如CellKey系統(tǒng)(美迪希實(shí)驗(yàn)儀器公司(MDS Sciex)，加利福尼亞州南舊金山)和RT-CES (艾森生物科學(xué)公司(ACEA Biosciences Inc.),加利福尼亞州圣地亞哥)米用具有微電極陣列的集成電路。高空間分辨率生物傳感器成像系統(tǒng)光生物傳感器成像系統(tǒng)包括SPR成像系統(tǒng)、橢圓計(jì)成像系統(tǒng)、和RWG成像系統(tǒng)，提供了高空間分辨率，可用于本公開的實(shí)施方式中。例如，SPRimager II(GWC技術(shù)公司(GWCTechnologies Inc))采用棱鏡偶聯(lián)SPR，在固定的入射角進(jìn)行SPR測(cè)量，并用C⑶相機(jī)采集反射光。記錄表面的變化作為反射率變化。因此，SPR成像同時(shí)采集陣列中所有元件的測(cè)量?；赗WG生物傳感器的掃頻波長(zhǎng)光解調(diào)系統(tǒng)能用于以成像為基礎(chǔ)的應(yīng)用。該系統(tǒng)中，采用快速可調(diào)激光源照射傳感器或微孔板形式的RWG生物傳感器陣列?？梢酝ㄟ^檢測(cè)激光波長(zhǎng)掃描時(shí)傳感器上反射的光功率隨時(shí)間的變化來構(gòu)建傳感器光譜，用計(jì)算機(jī)化共振波長(zhǎng)解調(diào)模型分析所測(cè)數(shù)據(jù)得到有固定受體或細(xì)胞層的生物傳感器的空間解析圖像。使用圖像傳感器自然生成基于成像的解調(diào)方案?？梢詿o需移動(dòng)部件獲得二維無標(biāo)簽圖像?；蛘撸梢圆捎镁哂袡M向磁力或P-偏振光11^模式的角度調(diào)制系統(tǒng)。該系統(tǒng)由發(fā)射系統(tǒng)和基于CCD相機(jī)的接收系統(tǒng)組成，發(fā)射系統(tǒng)產(chǎn)生光束陣列從而各以約200 u mx3000 y m或200 y mx2000 u m的維度照射RWG傳感器，基于CXD相機(jī)的接收系統(tǒng)用于記錄從這些傳感器反射的光束角度變化。通過分光器和衍射光學(xué)鏡片的組合獲得排列的光束。該系統(tǒng)能每3秒對(duì)最多49個(gè)傳感器(在7x7孔傳感器陣列中)同時(shí)取樣，或每10秒對(duì)最多整個(gè)384孔微孔板進(jìn)行同時(shí)取樣?；蛘撸€可使用掃描波長(zhǎng)解調(diào)系統(tǒng)。該系統(tǒng)中，采用以恒定角度覆蓋一定入射波長(zhǎng)范圍的偏振光照射并掃描波導(dǎo)光柵生物傳感器，可同時(shí)記錄各位置的反射光。通過掃描，也可以獲得生物傳感器的高分辨率圖像。生物傳感器參數(shù)·無標(biāo)簽生物傳感器如RWG生物傳感器或生物阻抗生物傳感器能實(shí)時(shí)跟蹤配體誘導(dǎo)的細(xì)胞響應(yīng)。非侵入性和無操作的生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)不要求對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的現(xiàn)有知識(shí)。所得生物傳感器信號(hào)包含涉及受體信號(hào)傳導(dǎo)和配體藥理學(xué)的重要信息?？梢詮募?xì)胞受刺激后的動(dòng)力學(xué)生物傳感器響應(yīng)中提取多種參數(shù)。這些參數(shù)包括但不限于，總體動(dòng)態(tài)、階段、信號(hào)幅度、以及動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括從一個(gè)階段到另一階段的轉(zhuǎn)變時(shí)間和各階段的動(dòng)力學(xué)(參見 Fang, Y.和 Ferrie, A. M. (2008) “l(fā)abel-free optical biosensor forligand-directed functional selectivity acting on ^ 2adrenoceptor in livingcells (無標(biāo)簽光生物傳感器用于活細(xì)胞內(nèi)￠2腎上腺素受體的配體定向功能選擇性)”，F(xiàn)EBS Lett. 582, 558 - 564 ；Fang, Y.等，(2005) “Characteristics of dynamic massredistribution of EGF receptor signaling in living cells measured with labelfree optical biosensors (用無標(biāo)簽光生物傳感器測(cè)得的活細(xì)胞內(nèi)EGF受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布的特征)” Anal. Chem.，77，5720-5725 ；Fang, Y.等，(2006) “Resonantwaveguide grating biosensor for living cell sensing (用于活細(xì)胞感測(cè)的共振波導(dǎo)光柵生物傳感器)” Biophys. J.，91，1925-1940)。對(duì)聚類或相似性分析而言，每個(gè)節(jié)點(diǎn)(即分子)的所述邊緣屬性(即生物傳感器細(xì)胞反應(yīng)數(shù)據(jù))能不同。例如，對(duì)于細(xì)胞中的分子概況(初級(jí)次級(jí))，邊緣屬性能是特定動(dòng)力學(xué)參數(shù)(如DMR信號(hào)中的DMR事件的幅度或動(dòng)力學(xué))，或在刺激后給定時(shí)間的生物傳感器信號(hào)的真實(shí)值，或刺激后多個(gè)或所有時(shí)間點(diǎn)的生物傳感器信號(hào)的真實(shí)值。就分子生物傳感器次級(jí)概況而言，邊緣屬性也能是在對(duì)各標(biāo)記初級(jí)概況標(biāo)準(zhǔn)化后，相對(duì)特定標(biāo)記的生物傳感器信號(hào)輸出參數(shù)的調(diào)節(jié)百分比。因此，所述共同邊緣屬性代表顯示節(jié)點(diǎn)分子的無標(biāo)記藥理學(xué)的有效方法，從而能根據(jù)本公開方法比較和測(cè)定該分子與已知分子的相似性。生物傳感器輸出參數(shù)本文討論了多種不同的生物傳感器輸出參數(shù)。例如，確定刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)定向質(zhì)量再分布動(dòng)力學(xué)的六個(gè)參數(shù)可以是總體動(dòng)態(tài)(即形狀)、響應(yīng)的階段(在A431靜息細(xì)胞內(nèi)EGF所誘導(dǎo)DMR信號(hào)的具體實(shí)施例中，涉及細(xì)胞響應(yīng)有三個(gè)主要階段正動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布(P-DMR)、負(fù)動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布(N-DMR)、和恢復(fù)性正動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布(RP-DMR))、動(dòng)力學(xué)、各階段總持續(xù)時(shí)間、各DMR事件的總幅度、和從P-到N-DMR階段或從N-DMR到RP-DMR階段的轉(zhuǎn)變時(shí)間。動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布常稱為動(dòng)態(tài)細(xì)胞物質(zhì)再分布或定向質(zhì)量再分布?？梢詮墓舱穹瀚@得其它生物傳感器輸出參數(shù)。例如，可以采用峰位置、強(qiáng)度、峰形和半峰寬(PWHM)。還可以從生物傳感器的共振帶圖像獲得生物傳感器輸出參數(shù)。五種附加特征帶形、位置、強(qiáng)度、分布和寬度。對(duì)于采用本文所公開生物傳感器的任何細(xì)胞試驗(yàn)給定應(yīng)用，所有這些參數(shù)可獨(dú)立使用或一起使用。使用參數(shù)的任何子集或組合可就給定試驗(yàn)或具體試驗(yàn)的給定變化產(chǎn)生特征，例如用于細(xì)胞受體試驗(yàn)的特征，和進(jìn)一步用于基于EGF受體試驗(yàn)的特定特征。涉及刺激誘導(dǎo)的定向質(zhì)量再分布動(dòng)力學(xué)的參數(shù)有多種生物傳感器輸出參數(shù)涉及刺激誘導(dǎo)DMR的動(dòng)力學(xué)。這些參數(shù)考察當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞的刺激事件時(shí)生物傳感器數(shù)據(jù)輸出發(fā)生的變化速率。刺激事件是能改變細(xì)胞狀態(tài)的任何事件，舉例來說，如向培養(yǎng)基中添加分子、從培養(yǎng)基中除去分子、改變溫度或改變pH、或?qū)?xì)胞引入輻射。刺激事件能產(chǎn)生刺激效果，這可以是由刺激事件對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的任何效果，例如定向質(zhì)量再分布。刺激事件可以是分子、化學(xué)物質(zhì)、生化物質(zhì)、生物物質(zhì)、聚合物。所述生化物質(zhì)或生物物質(zhì)可以是肽、合成肽、或天然產(chǎn)生的肽。例如，很多不同的肽作為信號(hào)分子，包括促炎肽緩激肽、蛋白酶凝血酶、和血壓調(diào)節(jié)肽血管緊張素。盡管這三種蛋白質(zhì)的序列和生理學(xué)不同，通過不同細(xì)胞表面受體發(fā)揮作用，它們共用一類稱為G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的細(xì)胞表面受體。GPCR的其它多肽配體包括加壓素、催產(chǎn)素、促生長(zhǎng)素抑制素、神經(jīng)肽Y、GnRH、促黃體生成激素、促卵泡激素、甲狀旁腺激素、食欲素、硬骨魚緊張肽II、內(nèi)啡肽、腦啡肽等。GPCR屬于廣泛且多樣的基因家族，不僅響應(yīng)肽配體，還響應(yīng)小分子神經(jīng)遞質(zhì)(乙酰膽堿、多巴胺、5-羥色胺和腎上腺素)、光、增味劑、味道、脂質(zhì)、核苷酸和離子。GPCR使用的主要信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制是和G蛋白GTP酶蛋白相互作用，其與包括胞內(nèi)鈣釋放和cAMP生成在內(nèi)的下游第二信使系統(tǒng)偶聯(lián)。肽GPCR使用的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)和所有GPCR所使用的相似，常根據(jù)與其相互作用的G蛋白和被激活的第二信使系統(tǒng)進(jìn)行分類。對(duì)Gs偶聯(lián)的GPCR，由受體激活的G蛋白Gs刺激下游活化腺苷酸環(huán)化酶和生成環(huán)AMP，而Gi偶聯(lián)的受體抑制cAMP的生成。cAMP生成的一個(gè)關(guān)鍵結(jié)果是蛋白激酶A的激活。Gq偶聯(lián)受體刺激磷脂酶C，釋放IP3和二酰甘油。在ER內(nèi)IP3與受體結(jié)合導(dǎo)致胞內(nèi)鈣的釋放，隨后激活蛋白激酶C、鈣調(diào)蛋白依賴性通路。除了 GPCR的這些第二信使信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)以外，GPCR通路顯示與其它信號(hào)傳導(dǎo)通路(包括酪氨酸激酶生長(zhǎng)因子受體和MAP激酶通路)的串?dāng)_。受體酪氨酸激酶如EGF受體或黏著斑復(fù)合物的反式激活可通過銜接蛋白She、Grb2和Sos,以及下游Map激酶激活Erkl和Erk2來刺激ras激活。Src激酶還能在GPCR激活ras和map激酶通路中起到關(guān)鍵的中介作用。可能發(fā)生一些刺激事件但數(shù)據(jù)輸出沒有改變。這種情況仍是刺激事件，因?yàn)榧?xì)胞的情況在某些方面已經(jīng)改變，這可能導(dǎo)致細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)中的定向質(zhì)量再分布或變化。應(yīng)當(dāng)理解對(duì)本文公開的任何試驗(yàn)或任何細(xì)胞情況都能確定具體的特征。本文對(duì)很多不同試驗(yàn)公開了大量“特征”，但對(duì)于本文進(jìn)行的任何試驗(yàn)，該試驗(yàn)的“特征”可以確定。對(duì)于任何給定試驗(yàn)也可能有多于一個(gè)“特征”并且其中每個(gè)都能如本文所述確定。在采集生物傳感器輸出數(shù)據(jù)并考察一個(gè)或多個(gè)參數(shù)后，可以得到給定試驗(yàn)的特征。需要進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)以鑒定最優(yōu)特征，并且需要在不同條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以找出最優(yōu)特征，不過這能夠完成。應(yīng)當(dāng)理解，本文公開的任何方法可含有步驟用于例如“識(shí)別”或“確定”或“提供”添加其上的特征。
總體動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)輸出的總體動(dòng)態(tài)是可供考察的一個(gè)參數(shù)。該總體動(dòng)態(tài)參數(shù)觀察數(shù)據(jù)集合的完整動(dòng)力學(xué)情況?？傮w動(dòng)態(tài)可供觀察的一個(gè)方面是數(shù)據(jù)輸出所產(chǎn)生曲線形狀隨時(shí)間的形狀變化。因此，由數(shù)據(jù)輸出產(chǎn)生的曲線形狀在發(fā)生刺激事件時(shí)或者發(fā)生改變或者保持不變。改變的方向表明總體質(zhì)量分布；例如正DMR (P-DMR)階段表明在傳感器的漸消尾部?jī)?nèi)的質(zhì)量增加；凈零的DMR表明在傳感器漸消尾部?jī)?nèi)幾乎沒有凈質(zhì)量變化；而負(fù)DMR表明在傳感器漸消尾部?jī)?nèi)的凈質(zhì)量減少。采用光生物傳感器所得刺激誘導(dǎo)細(xì)胞響應(yīng)的總體動(dòng)態(tài)可以由單個(gè)階段(P-DMR或N-DMR或凈零DMR)、或兩個(gè)階段(例如，所述兩個(gè)階段可以是這三種階段的任意組合)、或三個(gè)階段或多個(gè)階段(例如，在時(shí)程中可以出現(xiàn)超過一個(gè)P-DMR階段)組成。響應(yīng)的階段可作為時(shí)間函數(shù)觀察的另一參數(shù)是在數(shù)據(jù)輸出中發(fā)生的階段變化。無標(biāo)簽生物傳感器產(chǎn)生數(shù)據(jù)輸出，可供作圖生成曲線。該曲線具有轉(zhuǎn)變點(diǎn)，例如數(shù)據(jù)從增加狀態(tài)變?yōu)闇p少狀態(tài)或相反。這些變化可稱為階段轉(zhuǎn)變，舉例來說，它們發(fā)生的時(shí)間和它們采取的形狀可用作生物傳感器輸出參數(shù)。例如，可以有P-DMR、凈零DMR、N-DMR、或RP-DMR。所述P-DMR、N-DMR和RP-DMR的幅度能作為單獨(dú)生物傳感器輸出參數(shù)測(cè)量。動(dòng)力學(xué)另一生物傳感器輸出參數(shù)可以是數(shù)據(jù)輸出任何方面的動(dòng)力學(xué)。例如，完成階段轉(zhuǎn)變的速度。例如，階段轉(zhuǎn)變多快完成或完成數(shù)據(jù)輸出耗時(shí)多長(zhǎng)。另一可測(cè)量的動(dòng)力學(xué)示例是數(shù)據(jù)輸出整體階段占用的時(shí)間長(zhǎng)度。另一示例是P-和N-DMR階段之一或兩者的總持續(xù)時(shí)間。另一示例是P-和N-DMR階段之一或兩者達(dá)到總幅度的速度或時(shí)間。另一示例可以是從P-到N-DMR階段的轉(zhuǎn)變時(shí)間T0還可以測(cè)量P-DMR和N-DMR事件或階段的動(dòng)力學(xué)。涉及共振峰的參數(shù)給定導(dǎo)模的共振峰是通過考察例如光強(qiáng)度與光偶聯(lián)入生物傳感器的角度，或光強(qiáng)度與進(jìn)入生物傳感器的偶聯(lián)光波長(zhǎng)而產(chǎn)生的一種數(shù)據(jù)輸出。光波導(dǎo)光模光譜是通過采用大角度范圍的光照射生物傳感器的方式考察光強(qiáng)度與偶聯(lián)光進(jìn)入生物傳感器的角度并監(jiān)測(cè)入偶聯(lián)強(qiáng)度隨角度的變化而產(chǎn)生的一種數(shù)據(jù)輸出。在該光譜中，多個(gè)導(dǎo)模的多個(gè)共振峰共同出現(xiàn)。由于共振峰和OWLS光譜的原理相同，當(dāng)發(fā)生特定波長(zhǎng)的光或當(dāng)光的產(chǎn)生使其以特定角度射到生物傳感器上時(shí)，可以在生物傳感器中互換采用給定導(dǎo)模的共振峰或多個(gè)導(dǎo)模的OWLS光譜，光源發(fā)射的光與生物傳感器偶聯(lián)并且這種偶聯(lián)增強(qiáng)了生物傳感器產(chǎn)生的信號(hào)。這種隨偶聯(lián)光的角度或波長(zhǎng)變化的強(qiáng)度改變稱為共振峰。傳感器不同的給定模會(huì)產(chǎn)生具有不同特征的相似共振峰。有許多不同參數(shù)定義給定模式的共振峰或共振光譜，可與該峰相關(guān)使用以評(píng)價(jià)DMR或細(xì)胞效應(yīng)。下面討論其中的子集。峰位置當(dāng)用數(shù)據(jù)輸出作圖時(shí)，共振峰出現(xiàn)在例如光偶聯(lián)進(jìn)入生物傳感器的特定波長(zhǎng)或特定入射角。該峰發(fā)生的角度或波長(zhǎng)位置會(huì)在刺激事件的響應(yīng)中由于質(zhì)量再分布或細(xì)胞事件而改變。例如，存在特定受體如EGF受體的潛在生長(zhǎng)因子時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞的共振峰的位置會(huì)提高或降低偶聯(lián)角度或偶聯(lián)波長(zhǎng)，這會(huì)造成共振峰中心位置改變。應(yīng)當(dāng)理解峰強(qiáng)度位置處可以測(cè)得，這也是一個(gè)良好的測(cè)量點(diǎn)，還可以測(cè)量共振峰上任意點(diǎn)的位置，例如，75%峰強(qiáng)度或50%峰強(qiáng)度或25%峰強(qiáng)度或66%峰強(qiáng)度或45%峰強(qiáng)度(認(rèn)為公開了 1_100%峰強(qiáng)度的所有水平)。但是，當(dāng)使用峰強(qiáng)度以外的點(diǎn)時(shí)，總會(huì)有某一個(gè)峰強(qiáng)度之前的位置和峰強(qiáng)度之后的位置都處于例如45%峰強(qiáng)度。因此，對(duì)任何峰強(qiáng)度以外的強(qiáng)度，在峰內(nèi)總有兩個(gè)位置產(chǎn)生所述強(qiáng)度。這些非峰強(qiáng)度的位置可用作生物傳感器輸出參數(shù)，但需要簡(jiǎn)單知道所述強(qiáng)度的位置是在峰強(qiáng)度之前或峰強(qiáng)度之后。強(qiáng)度正如共振峰特定強(qiáng)度的位置可用作生物傳感器輸出參數(shù)，強(qiáng)度本身的量也可以是生物傳感器輸出參數(shù)。一種特定相關(guān)強(qiáng)度是給定模式的共振峰的最大強(qiáng)度。和位置相似，所述最大強(qiáng)度的量級(jí)會(huì)根據(jù)對(duì)細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)有特定影響的刺激事件的存在而改變，這種改變可以測(cè)得并用作特征。正如共振峰的位置，也可在峰內(nèi)的任何強(qiáng)度或位置測(cè)得共振峰強(qiáng)度。例如，可以采用最大強(qiáng)度的50%或最大強(qiáng)度的30%或最大強(qiáng)度的70%或最大強(qiáng)度的1%和100%之間任意百分?jǐn)?shù)作為生物傳感器輸出參數(shù)。同樣，和強(qiáng)度的位置相似，若采用最大強(qiáng)度以外的強(qiáng)度，例如最大強(qiáng)度的45%，在共振峰內(nèi)總會(huì)有兩個(gè)位置具有該強(qiáng)度。正如強(qiáng)度位置參數(shù)，可以采用非最大強(qiáng)度，只是必須考慮所述強(qiáng)度是最大值前的強(qiáng)度或是最大值后的強(qiáng)度。例如，當(dāng)初始的細(xì)胞融合約為50% (約50%融合時(shí)，傳感器表面的細(xì)胞往往產(chǎn)生最大的PWHM值)時(shí)，抑制劑和激活劑的同時(shí)存在導(dǎo)致培養(yǎng)后半峰寬(PWHM)降低；但是，另一生物傳感器輸出參數(shù)，例如總體角位移(即共振峰的中心位置)可用于區(qū)分抑制劑和激活劑和完全無效的分子。PWHM是在峰最大強(qiáng)度(高度)一半處的峰上兩點(diǎn)間連線的長(zhǎng)度，如圖6B所示。例如，當(dāng)所有傳感器上的細(xì)胞密度基本一致或大致相同時(shí)，細(xì)胞增殖的抑制劑產(chǎn)生的角位移往往小于完全未受處理的細(xì)胞，而激活劑產(chǎn)生的角位移往往大于細(xì)胞未經(jīng)任何處理的傳感器。所有分子的濃度相同時(shí)，可以通過分子對(duì)PWHM值的影響確定分子抑制(作為抑制齊U)或刺激(作為激活劑)細(xì)胞增殖的效能或能力。與共振峰中心位置的變化聯(lián)用，預(yù)先確定的PWHM變化值可用來過濾出抑制劑或激活劑。取決于檢測(cè)給定模式共振峰所用的解調(diào)系統(tǒng)，PWHM的單位或數(shù)值可以不同。例如，對(duì)于角度解調(diào)系統(tǒng)，單位可以是度。例如，PWHM的變化度數(shù)可以是千分之一、千分之二、千分之三、千分之五、千分之七、或千分之十。峰形可采用的另一生物傳感器輸出參數(shù)是總體峰形、或在某強(qiáng)度之間或該處的峰形。例如，可采用最大峰強(qiáng)度一半、或任何其它強(qiáng)度(例如30%、40%、70%、或88%、或20-100%的任何百分?jǐn)?shù))處的峰形作為生物傳感器輸出參數(shù)。形狀可以用特定強(qiáng)度之下或之上的峰面積鑒定。例如，在最大峰強(qiáng)度的一半處，有一個(gè)峰前強(qiáng)度點(diǎn)和一個(gè)峰后強(qiáng)度點(diǎn)?？梢栽谶@兩點(diǎn)間劃線，可以確定共振峰內(nèi)該線上面的面積或共振峰內(nèi)該線下面的面積并成為生物傳感器輸出參數(shù)。應(yīng)當(dāng)理解給定峰的積分面積也可用于分析分子作用于細(xì)胞的效果。另一種涉及形狀的生物傳感器輸出參數(shù)可以是特定峰強(qiáng)度的共振峰寬度。例如，可以通過測(cè)量50%峰強(qiáng)度的共振峰上峰前強(qiáng)度點(diǎn)和50%峰強(qiáng)度的峰后線上點(diǎn)之間連線的尺寸來確定最大峰強(qiáng)度一半處的共振峰寬(HMPW)。該測(cè)量可用作生物傳感器的輸出參數(shù)。應(yīng)當(dāng)理解可以用這一方式確定20到100%峰強(qiáng)度之間任何強(qiáng)度的的共振峰寬度。(此實(shí)施例可參見附圖，例如圖6B)。生物傳感器共振帶圖像的相關(guān)參數(shù)
目前，多數(shù)光生物傳感器一次一項(xiàng)地監(jiān)控靶分子與固定在傳感器表面的探針分子的結(jié)合、或者傳感器表面的細(xì)胞粘著或細(xì)胞活力。對(duì)于多個(gè)生物傳感器上的結(jié)合事件或細(xì)胞粘著或細(xì)胞活力，研究人員通常以時(shí)序的方式監(jiān)控這些事件。因此，不同傳感器之間的直接比較是個(gè)挑戰(zhàn)。此外，這些檢測(cè)系統(tǒng)不論是波長(zhǎng)或是角度調(diào)制都采用小點(diǎn)ri00-500i!m直徑)的激光照射傳感器。響應(yīng)或共振峰代表照射區(qū)域的平均細(xì)胞響應(yīng)。對(duì)于96孔生物傳感器微孔板(例如康寧的Epic微孔板)，各RWG傳感器約為3x3mm2并位于各孔底部，而對(duì)于384孔形式的微孔板，傳感器尺寸一般為lxlmm2。因此，采用現(xiàn)有傳感器技術(shù)所得響應(yīng)僅代表傳感器表面的一小部分。理想地，檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)不但能同時(shí)監(jiān)控附著在多個(gè)生物傳感器上的活細(xì)胞響應(yīng)，還能對(duì)各傳感器上的較大區(qū)域或多個(gè)區(qū)域進(jìn)行信號(hào)解調(diào) 。由成像光學(xué)解調(diào)系統(tǒng)(例如CCD相機(jī))得到的共振帶是通過考察例如跨單個(gè)傳感器限定位置反射(即出偶聯(lián)的)光強(qiáng)度相比物理位置，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)輸出類型。反射光與入偶聯(lián)光直接相關(guān)?；蛘?，可以通過掃描解調(diào)系統(tǒng)采集共振帶，采用小激光點(diǎn)照射傳感器，以一維或二維形式掃描整個(gè)傳感器、并采集給定導(dǎo)模的共振峰。最后可重新組成隨傳感器內(nèi)位置而變化的共振峰或光強(qiáng)度以形成傳感器的共振帶。在生物傳感器中，當(dāng)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光或者當(dāng)產(chǎn)生光使之以特定角度射到生物傳感器上時(shí)，出偶聯(lián)光隨傳感器表面/接近傳感器表面的折射率變化而改變，這種改變導(dǎo)致成像系統(tǒng)采集的各傳感器的共振帶特征改變。此夕卜，培養(yǎng)后細(xì)胞在整個(gè)傳感器上的不均勻粘著可以采用共振帶直接顯現(xiàn)(例如，參見圖I中圈注的共振帶)。在理想的多孔生物傳感器微孔板中，各傳感器的位置相對(duì)其它生物傳感器標(biāo)準(zhǔn)化；即傳感器通過微孔板中整行或整列各孔的中心對(duì)齊。因此，所得共振帶圖像可用作細(xì)胞粘著或響應(yīng)刺激的細(xì)胞變化的內(nèi)部參照。因此，各給定模式傳感器的共振帶提供了可涉及此帶使用的額外參數(shù)以評(píng)價(jià)DMR或細(xì)胞影響。下面討論其中的子集。帶形另一可采用的生物傳感器輸出參數(shù)是各給定模式生物傳感器的共振帶形狀。所述形狀由跨越各傳感器較大區(qū)域的強(qiáng)度分布定義。所述形狀可用于指示所粘附細(xì)胞的均一性或所述較大區(qū)域內(nèi)響應(yīng)刺激的細(xì)胞改變(例如，如圖I所示，各共振帶代表跨越尺寸為約200mmx3000mm的完整傳感器的響應(yīng))。位置和給定模式的各傳感器共振峰的位置類似，各共振帶的位置可用作生物傳感器輸出參數(shù)。可以采用成像軟件定量強(qiáng)度以產(chǎn)生各帶最大強(qiáng)度的中心位置。該位置可用于檢測(cè)響應(yīng)刺激或分子處理的細(xì)胞變化。強(qiáng)度正如共振帶的位置，采用成像系統(tǒng)采集的出偶聯(lián)光強(qiáng)度可用作生物傳感器輸出參數(shù)。整個(gè)帶的平均強(qiáng)度或成像帶中各像素的絕對(duì)強(qiáng)度可用于檢測(cè)細(xì)胞粘附的質(zhì)量并評(píng)價(jià)細(xì)胞響應(yīng)。分布采用成像系統(tǒng)采集到的具有確定角度或波長(zhǎng)的出偶聯(lián)光的分布可用作生物傳感器輸出參數(shù)。該參數(shù)可在無固定細(xì)胞或探針分子時(shí)用于評(píng)估傳感器本身的表面性質(zhì)，也可檢測(cè)傳感器表面照射區(qū)域中細(xì)胞粘附的質(zhì)量。同樣，該參數(shù)還可在整個(gè)區(qū)域的細(xì)胞密度一致時(shí)用于檢測(cè)分子對(duì)細(xì)胞影響的均一性；或在受照面內(nèi)某一區(qū)域與其它區(qū)域的細(xì)胞密度不同時(shí)用于檢測(cè)細(xì)胞密度對(duì)分子誘導(dǎo)的細(xì)胞響應(yīng)的影響。寬度正如給定模式共振峰的PWHM，采用成像系統(tǒng)獲得的共振帶寬度可用作生物傳感器輸出參數(shù)。該參數(shù)和共振峰的PWHM值共有幾乎相同特征，從而共享有用信息內(nèi)容，區(qū)別在于，本參數(shù)能獲得傳感器受照面多個(gè)區(qū)域的多個(gè)帶寬，而不是只有一個(gè)PWHM用于共振峰。與其它通過共振帶圖像獲得的參數(shù)相似，寬度可用于上述應(yīng)用。對(duì)于采用本文所公開生物傳感器的任何細(xì)胞試驗(yàn)給定應(yīng)用，所有這些參數(shù)可獨(dú)立使用或一起使用。使用參數(shù)的任何子集或組合可就給定試驗(yàn)或具體試驗(yàn)的給定變化產(chǎn)生特征，例如用于細(xì)胞受體試驗(yàn)的特征，和進(jìn)一步用于基于EGF受體試驗(yàn)的特定特征。活細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布(DMR)信號(hào)
通過細(xì)胞靶標(biāo)對(duì)刺激的細(xì)胞響應(yīng)可以由下游信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的空間和時(shí)間動(dòng)力學(xué)編碼。為此，實(shí)時(shí)監(jiān)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的整合能提供用于細(xì)胞生物學(xué)和生理學(xué)理解的生理學(xué)相關(guān)信
肩、O光學(xué)生物傳感器包括共振波導(dǎo)光柵(RWG)生物傳感器，能檢測(cè)動(dòng)態(tài)細(xì)胞物質(zhì)再分布相關(guān)的整合細(xì)胞響應(yīng)，從而提供研究細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的非侵入性手段。所有光學(xué)生物傳感器的共同點(diǎn)在于它們能測(cè)量傳感器表面或極接近該表面的局部折射率的變化。原則上，幾乎所有光學(xué)生物傳感器都可用于細(xì)胞感測(cè)，因?yàn)樗鼈兡苁褂脻u消波鑒定細(xì)胞內(nèi)配體誘導(dǎo)的變化。漸消波是電磁場(chǎng)，由光在溶液-表面界面的全內(nèi)反射產(chǎn)生，它通常延伸到溶液內(nèi)較短距離(約數(shù)百納米)，其特征深度稱為貫穿深度或感測(cè)容積。近來，開發(fā)出理論和數(shù)學(xué)模型描述在活細(xì)胞響應(yīng)配體刺激中測(cè)得光學(xué)信號(hào)的參數(shù)和特性。這些模型基于3層波導(dǎo)系統(tǒng)與已知細(xì)胞生物物理的組合，將配體誘導(dǎo)的光信號(hào)與通過受體介導(dǎo)的特定細(xì)胞過程聯(lián)系起來。因?yàn)樯飩鞲衅鳒y(cè)量位于入射光照射區(qū)域的細(xì)胞平均響應(yīng)，可以采用細(xì)胞高度融合層以獲得最佳試驗(yàn)結(jié)果。由于與生物傳感器的短貫穿深度相比細(xì)胞尺寸較大，傳感器配置視作非傳統(tǒng)的三層系統(tǒng)基材、具有光柵結(jié)構(gòu)的波導(dǎo)膜和細(xì)胞層。因此，配體誘導(dǎo)的有效折射率(即，測(cè)得的信號(hào))變化可以是，以一階形式，直接與細(xì)胞層底部折射率變化成比例AN=S(C)Anc其中S(C)為對(duì)細(xì)胞層的靈敏度，An。為生物傳感器感測(cè)的配體誘導(dǎo)的細(xì)胞層局部折射率變化。因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)給定體積的折射率主要由生物分子如蛋白質(zhì)的濃度決定，An?？梢约俣榕c局部細(xì)胞靶標(biāo)濃度或感測(cè)體積內(nèi)分子組件的配體誘導(dǎo)變化直接成比例?？紤]到漸消波從傳感器表面延伸的指數(shù)式衰減性質(zhì)，配體誘導(dǎo)的光信號(hào)受下式支配
i十 IAN = S(C)Od^iACl Csir -e^c
I其中，A Z。為進(jìn)入細(xì)胞層的貫穿深度，a為特定折射增量(蛋白質(zhì)為約0. 18/mL/g)，Zi為質(zhì)量再分布發(fā)生的距離，和d是細(xì)胞層內(nèi)片層的假想厚度。在此細(xì)胞層在豎直方向上分成等間距的片層。上述等式表明配體誘導(dǎo)的光信號(hào)是離傳感器表面不同距離發(fā)生的質(zhì)量再分布之和，各自對(duì)總響應(yīng)的貢獻(xiàn)不等。此外，采用波長(zhǎng)或角度變化形式的所測(cè)信號(hào)主要對(duì)發(fā)生在傳感器表面垂直方向上的質(zhì)量再分布敏感。因?yàn)槠鋭?dòng)態(tài)本質(zhì)，它也稱為動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布(DMR)信號(hào)。細(xì)胞和生物傳感器細(xì)胞依靠多種細(xì)胞通路或組件進(jìn)行處理、編碼和整合它們接收的信息。不同于用光學(xué)生物傳感器特異性測(cè)量分析物與蛋白靶標(biāo)結(jié)合的親和分析，活細(xì)胞更為復(fù)雜和動(dòng)態(tài)。為研究細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以將細(xì)胞與生物傳感器的表面接觸，這能通過細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)。這些培養(yǎng)的細(xì)胞可以通過三種類型接觸附著于生物傳感器表面點(diǎn)狀接觸、緊密接觸和胞外基質(zhì)接觸，其中每種具有與表面的特征分離距離。因此，基礎(chǔ)細(xì)胞膜常位于離表面約10-100nm。對(duì)于懸浮細(xì)胞,細(xì)胞可以通過細(xì)胞表面受體的共價(jià)偶聯(lián)或細(xì)胞表面受體的特異性結(jié)合、或重力導(dǎo)致的簡(jiǎn)單沉降而與生物傳感器表面接觸。為此，生物傳感器能感測(cè)細(xì)胞的底部部分。在很多情況下，細(xì)胞表現(xiàn)出表面依賴性粘著和增殖。.為獲得穩(wěn)健的細(xì)胞試驗(yàn)，需要包被生物傳感器表面以增強(qiáng)細(xì)胞粘著和增殖。然而，表面性質(zhì)會(huì)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)有直接影響。例如，表面結(jié)合的配體能影響細(xì)胞的響應(yīng)，基材的機(jī)械順從性同樣會(huì)影響，機(jī)械順從性決定了在細(xì)胞施加的力作用下材料如何變形。由于培養(yǎng)條件(時(shí)間、血清濃度、融合度等)不同，不同表面和不同條件得到的細(xì)胞狀態(tài)可能不同。因此，需要特定努力控制細(xì)胞狀態(tài)以開發(fā)基于生物傳感器的細(xì)胞試驗(yàn)。細(xì)胞是相對(duì)尺寸較大(通常在數(shù)十微米范圍內(nèi))的動(dòng)態(tài)物體。正如組織培養(yǎng)中用延時(shí)顯微鏡在亞細(xì)胞分辨率下和生物阻抗測(cè)量在納米水平下所觀察到的，即使沒有刺激，細(xì)胞也在不斷進(jìn)行微動(dòng)-細(xì)胞結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)移動(dòng)和重塑。在未刺激條件下，細(xì)胞一般產(chǎn)生幾乎為凈零的DMR響應(yīng)，如RWG生物傳感器所檢測(cè)。這部分是因?yàn)楣馍飩鞲衅鞯牡涂臻g分辨率，如大尺寸激光點(diǎn)和長(zhǎng)傳播距離的偶聯(lián)光所確定。激光點(diǎn)的尺寸決定所研究區(qū)域的尺寸-且通常在一個(gè)時(shí)間只能追蹤一個(gè)分析點(diǎn)。因此，生物傳感器通常測(cè)量位于光入射區(qū)域的大細(xì)胞群的平均響應(yīng)。雖然細(xì)胞在單細(xì)胞水平進(jìn)行微動(dòng)，大細(xì)胞群產(chǎn)生平均為凈零的DMR響應(yīng)。此外，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中胞內(nèi)大分子高度有序且空間限定于適當(dāng)位點(diǎn)。細(xì)胞上和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位的嚴(yán)格控制決定了特定細(xì)胞功能和響應(yīng)，因?yàn)槎ㄎ皇辜?xì)胞能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)與其合適伴侶相互作用的特異性和效率并將蛋白質(zhì)激活和失活機(jī)制進(jìn)行空間隔離。.因?yàn)檫@種控制，在未刺激條件下，在感測(cè)體積內(nèi)細(xì)胞的局部質(zhì)量密度可以達(dá)到平衡狀態(tài)，從而導(dǎo)致光響應(yīng)為凈零。為獲得一致的光響應(yīng)，所檢測(cè)細(xì)胞可以在傳統(tǒng)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)一段時(shí)間，使得多數(shù)細(xì)胞剛好完成單次分裂周期。活細(xì)胞具有感測(cè)和響應(yīng)外源信號(hào)的精細(xì)能力。以前認(rèn)為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過線性路徑作用，其中環(huán)境條件引發(fā)線性反應(yīng)鏈，產(chǎn)生單個(gè)明確的響應(yīng)。但是，研究顯示對(duì)外界刺激的細(xì)胞響應(yīng)要復(fù)雜得多。顯然，細(xì)胞接收的信息會(huì)被處理和編碼成信號(hào)蛋白磷酸化和拓?fù)湟莆坏膹?fù)雜時(shí)間和空間模式。將蛋白在空間和時(shí)間上靶向到適當(dāng)位點(diǎn)對(duì)于調(diào)節(jié)蛋白-蛋白相互作用的特異性和效率至關(guān)重要，因此決定了細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和響應(yīng)的時(shí)間和強(qiáng)度。關(guān)鍵的細(xì)胞決策例如細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)和凋亡，取決于激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的精確時(shí)間控制和相對(duì)空間分布。因此，通過細(xì)胞靶標(biāo)例如G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)常以有序且受控方式進(jìn)行，并由一系列空間和時(shí)間事件組成，其中很多導(dǎo)致細(xì)胞的局部質(zhì)量密度變化或局部細(xì)胞物質(zhì)再分布。當(dāng)這些變化或再分布在感測(cè)體積內(nèi)發(fā)生時(shí)，可以采用光學(xué)生物傳感器直接實(shí)時(shí)跟蹤。
DMR信號(hào)是活細(xì)胞生理響應(yīng)與研究受體生物學(xué)的傳統(tǒng)藥理學(xué)方法的比較顯示，當(dāng)配體對(duì)細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的受體特異時(shí)，配體誘導(dǎo)的DMR信號(hào)是受體特異性、劑量依賴性和可飽和的。對(duì)于大量G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)配體，發(fā)現(xiàn)功效(根據(jù)EC5tl值測(cè)得)與采用傳統(tǒng)方法測(cè)得的功效幾乎相同。此夕卜，DMR信號(hào)表現(xiàn)出預(yù)期的脫敏模式，因?yàn)槊撁艉驮俅沃旅魧?duì)所有GPCR是共有的。此外，DMR信號(hào)還保持了 GPCR配體的保真度，這與采用傳統(tǒng)技術(shù)所得到的類似。另外，生物傳感器能區(qū)分全激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、反向激動(dòng)劑、拮抗劑和變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明DMR能監(jiān)控活細(xì)胞中的生理響應(yīng)。DMR信號(hào)含有活細(xì)胞內(nèi)配體-受體對(duì)的系統(tǒng)細(xì)胞生物學(xué)信息用配體刺激細(xì)胞引起一系列空間和時(shí)間事件，非限制性的示例包括配體結(jié)合、受體激活、蛋白募集、受體內(nèi)化和再循環(huán)、第二信使交替、細(xì)胞骨架重塑、基因表達(dá)、細(xì)胞粘附變化。因?yàn)楦骷?xì)胞事件有其自身特點(diǎn)(例如，動(dòng)力學(xué)、持續(xù)時(shí)間、幅度、質(zhì)量移動(dòng))，而生物傳 感器主要對(duì)涉及感應(yīng)體積內(nèi)質(zhì)量再分布的細(xì)胞事件敏感，這些細(xì)胞事件能差異性地影響總DMR信號(hào)。化學(xué)生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物物理學(xué)方法可用來闡明配體誘導(dǎo)DMR信號(hào)的細(xì)胞機(jī)理。近來，直接采用化學(xué)物質(zhì)介入特定細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組分的化學(xué)生物學(xué)已經(jīng)用于解決生物學(xué)問題。這可能是由于鑒定了大量特異性控制很多不同種類細(xì)胞靶標(biāo)的調(diào)節(jié)劑。該方法已用于對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其通過受體介導(dǎo)的網(wǎng)狀相互作用進(jìn)行作圖，包括表皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體，和Gq-與Gs-偶聯(lián)受:體。EGFR屬于受體酪氨酸激酶家族。EGF結(jié)合EGFR并刺激其內(nèi)在蛋白-酪氨酸激酶活性，啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，原則上涉及MAPK、Akt和JNK通路。在EGF刺激后，有很多事件導(dǎo)致A431細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)量再分布，A431是內(nèi)源性過度表達(dá)EGFR的細(xì)胞系。已知EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)取決于細(xì)胞狀態(tài)。因此，EGF誘導(dǎo)的DMR信號(hào)也取決于細(xì)胞狀態(tài)。通過0.1%胎牛血清培養(yǎng)20小時(shí)得到的靜息細(xì)胞中，EGF刺激導(dǎo)致DMR信號(hào)有三個(gè)不同且順序的階段(i)信號(hào)增強(qiáng)的正階段(P-DMR)，(ii)轉(zhuǎn)變階段，和(iii)衰減階段(N-DMR)?；瘜W(xué)生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究顯示EGF誘導(dǎo)的DMR信號(hào)主要與Ras/MAPK途徑相關(guān)，該途徑通過MEK進(jìn)行并引起細(xì)胞脫離。兩條證據(jù)指出，P-DMR主要是由于募集胞內(nèi)靶標(biāo)到細(xì)胞表面的活化受體處。首先，阻斷發(fā)動(dòng)蛋白或網(wǎng)格蛋白活性對(duì)P-DMR事件的幅度影響極小。發(fā)動(dòng)蛋白和網(wǎng)格蛋白是EGFR激活的兩個(gè)下游組分，在EGFR內(nèi)化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)執(zhí)行中起關(guān)鍵作用。其次，阻斷MEK活性部分減弱P-DMR事件。MEK是MAPK通路的重要組分，在EGF刺激后，它首先從細(xì)胞質(zhì)移位到細(xì)胞膜，然后與受體一起內(nèi)化。另一方面，N-DMR事件是由于細(xì)胞脫離和受體內(nèi)化。熒光圖像顯示EGF刺激引起大量受體內(nèi)化和細(xì)胞脫離。已知阻斷受體內(nèi)化或MEK活性可防止細(xì)胞脫離，受體內(nèi)化同時(shí)需要發(fā)動(dòng)蛋白和網(wǎng)格蛋白。這表明阻斷發(fā)動(dòng)蛋白或網(wǎng)格蛋白會(huì)抑制受體內(nèi)化和細(xì)胞脫離，而阻斷MEK活性應(yīng)僅抑制細(xì)胞脫離，但不抑制受體內(nèi)化。正如預(yù)期，發(fā)動(dòng)蛋白或網(wǎng)格蛋白的抑制劑完全抑制了 EGF誘導(dǎo)的N-DMR C100%)，而MEK抑制劑僅部分弱化N-DMR (^80%)。熒光圖像還證實(shí)阻斷發(fā)動(dòng)蛋白的活性但不阻斷MEK，削弱了受體內(nèi)化。DMR信號(hào)含有作用于活細(xì)胞的配體的系統(tǒng)細(xì)胞藥理學(xué)信息由于DMR信號(hào)是整合的細(xì)胞響應(yīng)，由很多涉及細(xì)胞物質(zhì)在細(xì)胞底部動(dòng)態(tài)再分布的細(xì)胞事件影響組成，配體誘導(dǎo)的生物傳感器信號(hào)如DMR信號(hào)含有系統(tǒng)細(xì)胞藥理學(xué)信息。已知GPCR常在細(xì)胞內(nèi)顯示豐富活動(dòng)，并且很多配體能誘發(fā)有利細(xì)胞機(jī)理特定部分的操作偏好并顯示出途徑偏向的功效。因此，取決于受體下游細(xì)胞事件如何測(cè)量和用作配體藥理學(xué)讀出，配體很可能具有多種功效。實(shí)踐中很難用傳統(tǒng)細(xì)胞試驗(yàn)系統(tǒng)性表示GPCR配體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，傳統(tǒng)細(xì)胞試驗(yàn)大多數(shù)為通路偏向性并僅試驗(yàn)單個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。但是，因?yàn)闊o標(biāo)簽生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的現(xiàn)有知識(shí)沒有要求，而且為通路非偏向且通路靈敏型，這些生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)?zāi)苓m于研究任何配體的配體選擇性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和系統(tǒng)細(xì)胞藥理學(xué)。用于離子通道調(diào)節(jié)劑的無標(biāo)記生物傳感器和基于生物傳感器的細(xì)胞試驗(yàn)基于無標(biāo)記細(xì)胞的試驗(yàn)常使用生物傳感器監(jiān)控活細(xì)胞中化合物誘導(dǎo)的響應(yīng)。所述化合物可為天然產(chǎn)生或合成、純化或未純化的混合物。生物傳感器常利用傳感器，例如光、電、熱量、聲、磁、或類似傳感器將與生物傳感器接觸的細(xì)胞內(nèi)的分子識(shí)別事件或配體誘導(dǎo)的變化轉(zhuǎn)化成可定量的信號(hào)?？捎糜诒景l(fā)明的生物傳感器包括但不限于，光學(xué)生物傳感器系統(tǒng)如表面等離子體共振(SPR)和共振波導(dǎo)光柵(RWG)生物傳感器、共振鏡、或橢圓計(jì)，和電生物傳感器系統(tǒng)如生物阻抗系統(tǒng)。離子通道是重要的藥物靶標(biāo)，因?yàn)槠湓诳刂品浅V泛的生理過程中起關(guān)鍵作用，且因?yàn)槠涔δ芪蓙y會(huì)引起病理生理異常。然而歷史上，難以開發(fā)靶向此蛋白類型的藥物。開發(fā)新的功能性、高通量篩選(HTS)策略以鑒定易控制的通常在小分子庫中并不豐富的前導(dǎo)結(jié)構(gòu)已產(chǎn)生有希望的結(jié)果。自動(dòng)化基于細(xì)胞的HTS試驗(yàn)可就許多不同類型離子通道配制，用高密度形式的讀板儀通過熒光方法監(jiān)控膜電勢(shì)變化或胞內(nèi)鈣。新的自動(dòng)化膜片鉗技術(shù)提供二級(jí)篩選以確保通道水平的命中活性、測(cè)定通過離子通道超家族的選擇性并提供對(duì)作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)。相同的初級(jí)和二級(jí)試驗(yàn)有效支持了藥物化學(xué)的先導(dǎo)開發(fā)。然而，這些方法極少提供離子通道調(diào)節(jié)如何影響細(xì)胞功能和生理的認(rèn)識(shí)。方法本文所述方法和能用于所述方法的所述組合物和化合物能從很多不同種類中獲得，例如材料、物質(zhì)、分子和配體。公開了對(duì)無標(biāo)記生物傳感器試驗(yàn)獨(dú)特的所述種類特定亞組，稱為標(biāo)記，例如吡那地爾作為Katp通道活化的標(biāo)記。應(yīng)理解還公開所述種類的混合物，例如分子混合物，并能用于公開的方法。在某些方法中，可使用未知分子、檢測(cè)分子、藥物候選物分子和已知分子。在某些方法或情況中，調(diào)節(jié)或調(diào)節(jié)劑起作用，如Katp調(diào)節(jié)劑、JAK調(diào)節(jié)劑或ROCK調(diào)節(jié)劑以及所有這些的潛能。同樣，可使用已知調(diào)節(jié)劑。在某些方法以及組合物中涉及細(xì)胞、以及細(xì)胞系、細(xì)胞組、細(xì)胞靶標(biāo)，其可產(chǎn)生來自例如細(xì)胞過程的細(xì)胞響應(yīng)。細(xì)胞可經(jīng)過培養(yǎng)且細(xì)胞培養(yǎng)物可如本文所述使用。本文公開的方法涉及使用生物傳感器的試驗(yàn)。在某些試驗(yàn)中，以激動(dòng)或拮抗模式完成。通常，試驗(yàn)涉及用一個(gè)或多個(gè)種類處理細(xì)胞，例如材料、物質(zhì)或分子。還應(yīng)理解對(duì)象也能如本文所述處理。在某些方法中，可發(fā)生例如分子和細(xì)胞間的接觸。在公開的方法中，可檢測(cè)反應(yīng)如細(xì)胞反應(yīng)，所述反應(yīng)能顯示作為生物傳感器反應(yīng)，例如DMR反應(yīng)。能測(cè)試所述和其他反應(yīng)。在某些方法中，生物傳感器信號(hào)能是強(qiáng)生物傳感器信號(hào)或強(qiáng)DMR信號(hào)。使用無標(biāo)記生物傳感器的公開方法能生成概況，例如初級(jí)概況、二級(jí)概況和調(diào)節(jié)概況。例如，所述和其他概況能用于產(chǎn)生關(guān)于分子的測(cè)定和能與本文所述的任何種類一起使用。還公開了化合物或組合物的庫和組，例如本文公開的分子、細(xì)胞、材料或物質(zhì)。還公開了特定組，例如標(biāo)記組和細(xì)胞組。公開的方法能使用多個(gè)方面，例如生物傳感器信號(hào)、DMR信號(hào)、標(biāo)準(zhǔn)化、對(duì)照、陽性對(duì)照、調(diào)節(jié)比較、指數(shù)、生物傳感器指數(shù)、DMR指數(shù)、分子生物傳感器指數(shù)、分子DMR指數(shù)、分子指數(shù)、調(diào)節(jié)劑生物傳感器指數(shù)、調(diào)節(jié)劑DMR指數(shù)、分子調(diào)節(jié)指數(shù)、已知調(diào)節(jié)劑生物傳感器指數(shù)、已知調(diào)節(jié)劑DMR指數(shù)、標(biāo)記生物傳感器指數(shù)、標(biāo)記DMR指數(shù)、調(diào)節(jié)標(biāo)記的生物傳感器信號(hào)、調(diào)節(jié)DMR信號(hào)、增強(qiáng)和指數(shù)的相似性。任何組合物、化合物或本文公開的其他物質(zhì)能以任何本文公開的方法鑒定。公開了依賴于鑒定的方法，例如更高和抑制等詞語。在某些方法中，使用受體或細(xì)胞靶標(biāo)。某些方法能提供關(guān)于信號(hào)通路以及經(jīng)分子處理細(xì)胞和其他細(xì)胞過程的信息。在某些實(shí)施方式中，某些效能或效力變成特性，并且可分析直接作用(例如藥物候選分子)。篩選Katp調(diào)節(jié)劑和mito_KATP作為藥物靶標(biāo)的方法本文公開使用線粒體ATP-敏感性鉀離子通道(mito_KATP)作為藥物靶標(biāo)的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法可鑒定能預(yù)防或治療肝病的化合物。在一些實(shí)施方式中，所述化合物是mito-KATP通道調(diào)節(jié)劑。本文還公開使用無標(biāo)記生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)篩選肝細(xì)胞中mito-KATP通道調(diào)節(jié)劑的方法。本文還公開篩選肝細(xì)胞中mito-KATP離子通道調(diào)節(jié)劑的方法。在一些實(shí)施方式中，所述篩選用無標(biāo)記試驗(yàn)進(jìn)行。無標(biāo)記試驗(yàn)可依賴于使用已知的KATP開放劑作為參考。在一些實(shí)施方式中，所述Katp開放劑是吡那地爾。如公開的方法所示，吡那地爾在轉(zhuǎn)化的肝細(xì)胞系H印G2C3A中提供強(qiáng)動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布(DMR)信號(hào)。肝細(xì)胞中的吡那地爾DMR信號(hào)可用于篩選mito-KATP調(diào)節(jié)劑,包括mito-KATP途徑調(diào)節(jié)劑。還公開使用mito-KATP調(diào)節(jié)劑治療或預(yù)防肝病的方法。如公開方法所示，肝細(xì)胞系H印G2C3A中的吡那地爾DMR信號(hào)與Kir6. 2/SUR2KATP離子通道有關(guān)，且Katp離子通道主要位于線粒體內(nèi)。吡那地爾DMR信號(hào)可與肌動(dòng)蛋白重塑、ROCK活性和JAK活性有關(guān)。mito_KATP調(diào)節(jié)劑還可抑制熟知的肝毒性藥物利福平誘導(dǎo)的CYP3A4酶活性。因此，mito-KATP通道可為治療或預(yù)防肝病的可藥化靶標(biāo)。本文還提供分析分子的方法，所述方法包括步驟a.在底物表面培養(yǎng)Katp細(xì)胞系，其中所述生物傳感器表面用于無標(biāo)記生物傳感器分析，b.用所述分子孵育所述細(xì)胞系，產(chǎn)生分子處理的細(xì)胞系，c.用無標(biāo)記生物傳感器分析所述分子處理的細(xì)胞系，產(chǎn)生分子數(shù)據(jù)輸出，d.比較所述分子數(shù)據(jù)輸出和相同細(xì)胞系中已知的Katp調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)輸出，生成分子-Katp調(diào)節(jié)劑比較。本文還提供分析分子的方法，所述方法包括步驟a.在生物傳感器表面培養(yǎng)Katp細(xì)胞系，其中所述生物傳感器表面用于無標(biāo)記生物傳感器分析，b.用標(biāo)記物和所述分子孵育所述細(xì)胞系，產(chǎn)生孵育細(xì)胞系，c.用無標(biāo)記生物傳感器分析所述孵育細(xì)胞系，產(chǎn)生標(biāo)記物-分子數(shù)據(jù)輸出，d.比較所述標(biāo)記物-分子數(shù)據(jù)輸出和相同細(xì)胞系中的標(biāo)記物-Katp調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)輸出，生成標(biāo)記物-分子/標(biāo)記物-Katp調(diào)節(jié)劑比較。本文還提供分析分子的方法，所述方法包括步驟a.在生物傳感器表面培養(yǎng)四種不同細(xì)胞系，其中所述表面用于無標(biāo)記生物傳感器分析，其中所述四種細(xì)胞系為A431、A549、HT29和H印G2，b.用所述分子孵育各細(xì)胞系，產(chǎn)生四種孵育細(xì)胞系，c.用無標(biāo)記生物傳感器分析各孵育細(xì)胞系，產(chǎn)生各孵育細(xì)胞系的分子數(shù)據(jù)輸出，和d.比較所述分子數(shù)據(jù)輸出和相同細(xì)胞系中的ROCK抑制劑數(shù)據(jù)輸出，生成各細(xì)胞系的分子-ROCK抑制劑比較。本文還公開治療對(duì)象的方法，所述方法包括給予所述對(duì)象Katp調(diào)節(jié)劑，其中所述對(duì)象需要治療肝病。本文還公開降低對(duì)象肝毒性的方法，所述方法包括給予所述對(duì)象KC0，從而所述KCO能作用于降低給予所述對(duì)象的藥物的肝毒性。在一些實(shí)施方式中，所述Katp細(xì)胞系可包括線粒體ATP-敏感性鉀離子通道(mito-KATP)o在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞系可包括肝細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述肝細(xì)胞可包括肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述肝細(xì)胞可被肝炎病毒感染。在一些實(shí)施方式中，所述肝炎病毒可為甲肝、乙肝、丙肝、丁肝或戊肝、單純皰疹病毒、細(xì)胞巨化病毒、EB病毒、黃熱病毒或腺病毒。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞可獲自感染有非病毒性感染的來源。在一些實(shí)施方式中，所述非病毒性感染可包括弓形蟲、鉤端螺旋體、Q熱和落磯山斑疹熱。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞可獲自已受或受到化學(xué)品、毒素或藥物影響的來源。在一些實(shí)施方式中，所述化學(xué)品或毒素可包括酒精、撲熱息痛、羥氨芐青霉素、抗結(jié)核藥物、米諾環(huán)素、甲基多巴、呋喃妥因、異煙肼或酮康唑。在一些實(shí)施方式中，所述已知的Katp調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)輸出可如下產(chǎn)生孵育所述Katp調(diào)節(jié)劑和培養(yǎng)的Katp細(xì)胞系并用無標(biāo)記生物傳感器分析所孵育細(xì)胞系，產(chǎn)生Katp調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)輸出。在一些實(shí)施方式中，所述方法還可包括當(dāng)所述比較表明所述分子數(shù)據(jù)輸出和所述Katp調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)輸出相似時(shí)鑒定可能的Katp調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方式中，所述Katp細(xì)胞系可選自IfepG2或H印G2C3A細(xì)胞系。在一些實(shí)施方式中，所述已知的Katp調(diào)節(jié)劑可包含鉀通道開放劑(KCO)。在一些實(shí)施方式中，所述KCO可包含二氮嗪、松脂、克羅卡林或尼可地爾。在一些實(shí)施方式中，所述Katp調(diào)節(jié)劑可包括Katp抑制劑。在一些實(shí)施方式中，所述Katp抑制劑可包括磺酰脲或U-37883A在一些實(shí)施方式中，所述磺酰脲可包括甲苯磺丁脲、甲磺氮卓脲或格列甲嗪。在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)記物-Katp調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)輸出可如下產(chǎn)生孵育所述標(biāo)記物和Katp調(diào)節(jié)劑與培養(yǎng)的Katp細(xì)胞系并用無標(biāo)記生物傳感器分析所孵育細(xì)胞系，產(chǎn)生標(biāo)記物-Katp調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)輸出。在一些實(shí)施方式中，所述方法還可包括當(dāng)所述比較表明所述標(biāo)記物-分子數(shù)據(jù)輸出和所述標(biāo)記物-Katp調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)輸出相似時(shí)鑒定可能的Katp調(diào)節(jié)劑。
在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)記物可包括ROCKl調(diào)節(jié)劑或R0CK2調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方式中，所述ROCKl調(diào)節(jié)劑或R0CK2調(diào)節(jié)劑可包括ROCKl抑制劑或R0CK2抑制劑。在一些實(shí)施方式中，所述ROCKl抑制劑或R0CK2抑制劑包括Y-27632。在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)記物可包括JAK調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方式中，所述JAK調(diào)節(jié)劑可包括JAK抑制劑。在一些實(shí)施方式中，所述JAK抑制劑可包括AG490。在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)記物可包括細(xì)胞色素P450酶調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞色素P450酶調(diào)節(jié)劑可包括細(xì)胞色素P450活化劑。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞色素P450酶可包括CYP2D6或CYP3A4。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞色素P450活化劑可包括利福平。在一些實(shí)施方式中，所述方法還可包括就ROCK途徑活性測(cè)試分子。在一些實(shí)施方式中，分析步驟可包括，a.在某表面培養(yǎng)ROCK抑制劑響應(yīng)細(xì)胞系，其中所述表面用于無標(biāo)記生物傳感器分析，b.用所述分子孵育所述細(xì)胞系，產(chǎn)生孵育細(xì)胞系，c.用無標(biāo)記生物傳感器分析所孵育細(xì)胞系，產(chǎn)生分子數(shù)據(jù)輸出，和d.比較所述分子數(shù)據(jù)輸出和相同細(xì)胞中已知的ROCK抑制劑數(shù)據(jù)輸出，生成分子-ROCK抑制劑比較。在一些實(shí)施方式中，所述ROCK抑制劑響應(yīng)細(xì)胞系可包括其中通過已知ROCK抑制劑對(duì)ROCK基礎(chǔ)活性的抑制產(chǎn)生穩(wěn)健生物傳感器信號(hào)的細(xì)胞系。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞系可選自A431、A549或HT29。在一些實(shí)施方式中，所述方法可用至少2種標(biāo)記物獨(dú)立進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)記物可以至少EC70、EC80、EC 90、EC95和EC100的濃度添加。在一些實(shí)施方式中，所述ROCK抑制劑可為Y27632且所述Katp調(diào)節(jié)劑可為L(zhǎng)Y-294002。在一些實(shí)施方式中，所述ROCK抑制劑數(shù)據(jù)輸出可如下產(chǎn)生孵育所述ROCK抑制劑和各細(xì)胞系并用無標(biāo)記生物傳感器分析各孵育細(xì)胞系，產(chǎn)生各細(xì)胞系的ROCK抑制劑數(shù)據(jù)輸出。在一些實(shí)施方式中，所述方法還可包括產(chǎn)生Katp調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)輸出，和產(chǎn)生各細(xì)胞系的分子-Katp抑制劑比較。在一些實(shí)施方式中，所述方法還可包含進(jìn)行其他離子通道試驗(yàn)的步驟。在一些實(shí)施方式中，所述其他離子通道試驗(yàn)可包括常規(guī)或自動(dòng)膜片鉗。在一些實(shí)施方式中，所述Katp調(diào)節(jié)劑可包括mito_KATP調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方式中，所述肝病可涉及所述Katp下游的JAK或Rho激酶信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，所述Katp通道可以是Kir6. 2和SUR2通道。在一些實(shí)施方式中，所述KCO可為吡那地爾。定義下面參考附圖(若有)詳細(xì)描述本發(fā)明的各種實(shí)施方式。參考各種實(shí)施方式不限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明范圍僅受所附權(quán)利要求書的范圍的限制。此外，在本說明書中列出的任何實(shí)施例都不意在構(gòu)成限制，而僅是列出要求權(quán)利的本發(fā)明的許多可能實(shí)施方式中的一些。一種除非上下文中另有明確說明，在本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式“一個(gè)”，“一種”和“該”或類似術(shù)語包括復(fù)數(shù)指示物。因此，例如“一種藥物載體”包括兩種或更多載體的混合物等?？s寫可采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的縮寫(例如，表示小時(shí)的“h ”或“hr ”，表示克的“g”或“gm”，表示毫升的“mL”，表示室溫的“rt”，表示納米的“nm”，表示摩爾的“M”以及類似縮寫)。約本公開的實(shí)施方式描述中采用對(duì)例如，組合物中成分的量、濃度、體積、處理溫度、處理時(shí)間、產(chǎn)率、流速、壓力、和類似數(shù)值，及其范圍進(jìn)行修飾的約是指可能發(fā)生的數(shù)值量變化，例如，通過制備化合物、組合物、濃縮物或使用制劑所用的常規(guī)測(cè)量和操作過程；通過這些過程中的偶然性誤差；通過用來進(jìn)行所述方法的起始材料或成分的生產(chǎn)、來源或純度的差異；和類似考慮因素。術(shù)語“約”還包括由于具有特定初始濃度或混合物的組合物或制劑的陳化而不同的量，以及由于混合或加工具有特定初始濃度或混合物的組合物或制劑而不同的量。無論是否受術(shù)語“約”修飾，所附權(quán)利要求書均包括這些量的等同形式。“整個(gè)細(xì)胞組和針對(duì)標(biāo)記組”短語“整個(gè)細(xì)胞組和針對(duì)標(biāo)記組”是指檢測(cè)分子作用于細(xì)胞組內(nèi)各細(xì)胞的初級(jí)概況以及分子調(diào)節(jié)標(biāo)記組的調(diào)節(jié)概況的系統(tǒng)過程。對(duì)于標(biāo)記/細(xì)胞對(duì)，所述過程首先從檢測(cè)分子獨(dú)立作用于每個(gè)類型細(xì)胞的初級(jí)概況開始，然后檢測(cè)相同細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記在分子存在下的二級(jí)概況。術(shù)語“針對(duì)”具體用于表示分子調(diào)節(jié)標(biāo)記誘導(dǎo)的生物傳感器響應(yīng)的能力。激動(dòng)劑激動(dòng)劑是產(chǎn)生作用的分子或物質(zhì),如結(jié)合細(xì)胞上受體的分子，由所述細(xì)胞產(chǎn)生響應(yīng)，其可為胞內(nèi)的。拮抗劑拮抗劑是抑制如阻斷作用如激動(dòng)劑作用的分子或物質(zhì)，如結(jié)合受體的分子，其阻止激動(dòng)劑結(jié)合并因此抑制所述激動(dòng)劑作用?；罨瘎┗罨瘎┦且馉顟B(tài)相比基底狀態(tài)增加的任何物質(zhì)。例如，吡那地爾是Katp通道的活化劑，Katp和Katp通道的結(jié)合引起信號(hào)傳導(dǎo)事件。測(cè)試測(cè)試、試驗(yàn)或類似術(shù)語是指用以確定物質(zhì)如分子或細(xì)胞特征的分析，例如細(xì)胞受一種或多種外源刺激如配體或標(biāo)記刺激后光學(xué)或生物阻抗響應(yīng)的存在、缺乏、量、程度、動(dòng)力學(xué)、動(dòng)態(tài)或類型。細(xì)胞響應(yīng)刺激產(chǎn)生的生物傳感器信號(hào)可以是試驗(yàn)。測(cè)試響應(yīng)“測(cè)試響應(yīng)”或類似術(shù)語是指采用某一方法來鑒定響應(yīng)。例如，若使分子與細(xì)胞接觸，可以采用生物傳感器測(cè)試細(xì)胞在暴露于所述分子后的響應(yīng)。結(jié)合
“結(jié)合”、“附著”、“粘附”、“粘著”、“貼壁”、“固定化”、或類似術(shù)語一般指例如，表面
修飾物質(zhì)、相容劑、細(xì)胞、配體候選分子、和本公開的類似實(shí)體通過如物理吸附、化學(xué)結(jié)合、和類似過程或其組合固定化或固著在表面上。具體而言，“細(xì)胞附著”、“細(xì)胞粘著”或類似術(shù)語是指細(xì)胞與表面的相互作用或結(jié)合，例如通過培養(yǎng)、或與細(xì)胞錨定材料、相容劑(例如纖連蛋白、膠原蛋白、核纖層蛋白、明膠、聚賴氨酸等)相互作用、或兩者一起?！百N壁細(xì)胞”、“固定化細(xì)胞”或類似術(shù)語是指保持與生物傳感器外表面結(jié)合、固定或某種接觸的細(xì)胞或細(xì)胞系或細(xì)胞系統(tǒng)，例如原核或真核細(xì)胞。這類細(xì)胞在培養(yǎng)后能承受或經(jīng)受清洗和介質(zhì)交換過程而保持附著，所述過程是很多基于細(xì)胞的試驗(yàn)的先決條件。激動(dòng)和拮抗模式激動(dòng)模式或類似術(shù)語是指細(xì)胞暴露于分子以確定所述分子引起生物傳感器信號(hào)如DMR信號(hào)的能力的試驗(yàn)，而拮抗模式是指細(xì)胞在分子存在情況下暴露于標(biāo)記以確定所述分子調(diào)節(jié)細(xì)胞響應(yīng)所述標(biāo)記的生物傳感器信號(hào)的能力的試驗(yàn)。生物傳感器生物傳感器或類似術(shù)語是指用于檢測(cè)分析物的聯(lián)合了生物組件和理化檢測(cè)器組件的裝置。生物傳感器通常由三部分組成生物組件或元件(例如組織、微生物、病原體、細(xì)胞、或其組合)、檢測(cè)器元件(以理化方式例如光學(xué)、壓電、電化學(xué)、熱學(xué)或磁力運(yùn)作)、和與兩種組件關(guān)聯(lián)的換能器。生物組件或元件可以是例如，活細(xì)胞、病原體或其組合。在實(shí)施方式中，光學(xué)生物傳感器可以包括將活細(xì)胞、病原體、或其組合中的分子識(shí)別或分子刺激事件轉(zhuǎn)化成可量化信號(hào)的光換能器。以生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)為核心的細(xì)胞概況藥理學(xué)“以生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)為核心的細(xì)胞概況藥理學(xué)”或類似術(shù)語是采用無標(biāo)記生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)確定分子的藥理學(xué)的方法。生物傳感器指數(shù)“生物傳感器指數(shù)”或類似術(shù)語是由生物傳感器數(shù)據(jù)的集合構(gòu)成的指數(shù)。生物傳感器指數(shù)可以是生物傳感器概況，例如初級(jí)概況、或二級(jí)概況的集合。所述指數(shù)可以包含任何種類的數(shù)據(jù)。例如，概況的指數(shù)可以只包括N-DMR數(shù)據(jù)點(diǎn)，它可以是P-DMR數(shù)據(jù)點(diǎn)、或者兩種都有或者它可以是阻抗數(shù)據(jù)點(diǎn)。它可以是與概況曲線相關(guān)的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)。生物傳感器響應(yīng)“生物傳感器響應(yīng)”、“生物傳感器輸出信號(hào)”、“生物傳感器信號(hào)”或類似術(shù)語是指具有細(xì)胞的傳感器系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞響應(yīng)的任何反應(yīng)。生物傳感器將細(xì)胞響應(yīng)轉(zhuǎn)化成可量化的傳感器響應(yīng)。生物傳感器響應(yīng)是由光生物傳感器例如RWG或SPR測(cè)得的刺激后的光學(xué)響應(yīng)或者是由電生物傳感器測(cè)得的細(xì)胞在刺激后的生物阻抗響應(yīng)。因?yàn)樯飩鞲衅黜憫?yīng)與刺激后的細(xì)胞響應(yīng)直接相關(guān)，在公開的實(shí)施方式中，生物傳感器響應(yīng)和細(xì)胞響應(yīng)可以互換使用。生物傳感器信號(hào)“生物傳感器信號(hào)”或類似術(shù)語是指生物傳感器測(cè)得的由細(xì)胞受刺激后響應(yīng)產(chǎn)生的細(xì)胞信號(hào)。生物傳感器表面生物傳感器表面或類似術(shù)語是指能在其上具有培養(yǎng)細(xì)胞的任何生物傳感器的表面。所述生物傳感器表面能用組織培養(yǎng)物處理，或細(xì)胞外基質(zhì)材料(如纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原等)包被或合成材料(如聚賴氨酸)包被。細(xì)胞細(xì)胞或類似術(shù)語是指外部被半透膜限定的小且通常微量的原生質(zhì)，可選包括一個(gè)或多個(gè)核和各種其它細(xì)胞器，能獨(dú)自或與其它類似物質(zhì)相互作用運(yùn)行生命的所有基本功能，并形成能獨(dú)立作用的活性物質(zhì)的最小結(jié)構(gòu)單元，包括合成細(xì)胞構(gòu)建體、細(xì)胞模型系統(tǒng)和類似人工細(xì)胞系統(tǒng)。細(xì)胞可包括不同的細(xì)胞類型，例如與特定疾病相關(guān)的細(xì)胞、來自特定來源的細(xì)胞類型、與特定靶標(biāo)相關(guān)的細(xì)胞類型、或與特定生理功能相關(guān)的細(xì)胞類型。細(xì)胞還可以是天然細(xì)胞、工程細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞、永生細(xì)胞、原代細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、成人干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、或干細(xì)胞衍生的細(xì)胞。人體由約210種已知的不同細(xì)胞類型構(gòu)成。考慮到細(xì)胞的制備方式(例如工程改造、轉(zhuǎn)化、永生化、或新鮮分離自人體)和獲取細(xì)胞的來源(例如不同年齡或不同疾病階段的人體等)，細(xì)胞類型的數(shù)目幾乎是無限的。細(xì)胞系“細(xì)胞系”或類似術(shù)語指可通過至少一種常見特征集合在一起的細(xì)胞，其具有在培養(yǎng)中傳代的能力。細(xì)胞背景“細(xì)胞背景”或類似術(shù)語是有特定狀態(tài)的細(xì)胞類型。例如，不同細(xì)胞類型有不同的細(xì)胞背景(如細(xì)胞受體的差異表達(dá)或組成)。相同類型但不同狀態(tài)的細(xì)胞也有不同的細(xì)胞背景。通過培養(yǎng)(例如細(xì)胞周期停滯或增殖或靜息狀態(tài))或處理(例如不同藥理學(xué)試劑處理的細(xì)胞)能形成所述相同類型但有不同狀態(tài)的細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)“細(xì)胞培養(yǎng)”是指原核或者真核細(xì)胞在受控條件下生長(zhǎng)的過程。“細(xì)胞培養(yǎng)”不單指衍生自多細(xì)胞真核生物的細(xì)胞，特別是動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)，也指復(fù)合組織和器官的培養(yǎng)。細(xì)胞組“細(xì)胞組”或類似術(shù)語是指包括至少兩種細(xì)胞的組。所述細(xì)胞可以是本文公開的任何種類的細(xì)胞或組合。細(xì)胞響應(yīng)“細(xì)胞響應(yīng)”或類似術(shù)語是指細(xì)胞對(duì)刺激的任何反應(yīng)。細(xì)胞過程細(xì)胞過程或類似術(shù)語是指在細(xì)胞內(nèi)或通過細(xì)胞發(fā)生的過程。細(xì)胞過程的例子包括但不限于，增殖、凋亡、壞死、分化、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、極性變化、遷移或轉(zhuǎn)化。細(xì)胞靶標(biāo)“細(xì)胞靶標(biāo)”或類似術(shù)語是指能通過外部刺激改變其活性的生物聚合物例如蛋白質(zhì)或核酸。細(xì)胞靶標(biāo)通常是蛋白，例如酶、激酶、離子通道、和受體。鑒定鑒定或類似術(shù)語是指收集關(guān)于物質(zhì)，例如配體、分子、標(biāo)記或細(xì)胞的任何性質(zhì)的信息，例如獲得配體、分子、標(biāo)記或細(xì)胞的概況。包含
在本說明書的描述和權(quán)利要求中，詞語“包含”和該詞語的其它變化形式，如“含有”和“包括”，表示“包括但不限于”并且不意在排除例如其它添加物、組分、整數(shù)、或步驟。主要由......組成實(shí)施方式中的“主要由……組成”指例如表面組合物、在本公開的生物傳感器、制品、裝置、或設(shè)備表面上制作或使用表面組合物、制劑或組合物的方法，還可包括權(quán)利要求中列出的組分或步驟，以及實(shí)質(zhì)上不影響本公開組合物、制品、設(shè)備和制備使用方法的基本和新性質(zhì)的其它組分或步驟，如所選的特定反應(yīng)物、特定添加劑或成分、特定試劑、特定細(xì)胞或細(xì)胞系、特定表面調(diào)節(jié)劑或表面條件、特定候選配體、或類似結(jié)構(gòu)、材料或過程變量。可對(duì)本發(fā)明的組分或步驟的基本性質(zhì)產(chǎn)生實(shí)質(zhì)影響或可產(chǎn)生本發(fā)明不需要特征的項(xiàng)目包括例如，細(xì)胞對(duì)生物傳感器表面的親和性降低、刺激對(duì)細(xì)胞表面受體或胞內(nèi)受體的異常親和性、響應(yīng)候選配體或類似刺激的異常或相反細(xì)胞活性、和類似特征。組分
公開了用于制備所公開組合物的組分和本文所述方法中使用的組合物本身。本文公開了這些和其它的材料，應(yīng)理解當(dāng)公開這些材料的組合、子集、相互關(guān)系、組等等而未明確地具體提及這些分子的每個(gè)不同的單獨(dú)和共同組合及排列時(shí)，在本文中具體設(shè)想和描述了它們中的每一種情況。因此，如果公開了一類分子A、B、和C以及一類分子D、E、和F和分子組合A-D的實(shí)施例，則即使沒有分別列舉每個(gè)單獨(dú)和共同視為有意義的組合，也應(yīng)當(dāng)認(rèn)為公開了 A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、CUP C-F。同樣，還公開這些組合的任意子集或組合。因此，例如，應(yīng)認(rèn)為已公開亞組A-E、B-F和C-E。此觀念可應(yīng)用于本申請(qǐng)的所有方面，包括但不限于制造和使用所公開組合物的方法。因此，如果存在可進(jìn)行的多個(gè)附加步驟，應(yīng)當(dāng)理解可通過所公開方法的任一特定實(shí)施方式或?qū)嵤┓绞降慕M合來進(jìn)行這些附加步驟中的每一個(gè)。接觸接觸(contacting)或類似術(shù)語是指,若至少兩種物品，例如分子、細(xì)胞、標(biāo)記、至少一種化合物或組合物、或至少兩種組合物、或這些中的任意一種和制品或機(jī)器間可能發(fā)生分子相互作用，使之相互靠近從而能發(fā)生分子相互作用。例如，接觸是指將至少兩種組合物、分子、制品、或物品接觸，即，使其接近以混合或碰觸。例如，有組合物溶液A和培養(yǎng)的細(xì)胞B并將組合物溶液A傾倒到培養(yǎng)的細(xì)胞B上，使組合物溶液A與細(xì)胞培養(yǎng)物B接觸。用配體接觸細(xì)胞會(huì)將配體帶到細(xì)胞以確保細(xì)胞能接近配體。應(yīng)當(dāng)理解本文公開的任何物品可與任何其它物品接觸。例如，可以使細(xì)胞接觸標(biāo)記或分子、生物傳感器等。化合物和組合物化合物和組合物在本領(lǐng)域中具有標(biāo)準(zhǔn)含義。應(yīng)當(dāng)理解，在任何情況下，公開了具體名稱例如分子、物質(zhì)、標(biāo)記、細(xì)胞、或試劑組合物，所述組合物包含這些名稱、由其組成、和基本由其組成。因此，當(dāng)使用具體名稱標(biāo)記時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解還公開了包含該標(biāo)記，由該標(biāo)記組成、或基本由該標(biāo)記組成的組合物。在適當(dāng)之處，當(dāng)給出具體的名稱時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解也公開了該名稱的化合物。例如，若公開具體的生物材料例如EGF，EGF的復(fù)合形式也被公開。對(duì)照術(shù)語對(duì)照或“對(duì)照水平”或?qū)φ占?xì)胞“或類似術(shù)語定義為測(cè)量變化的標(biāo)準(zhǔn)，例如對(duì)照不進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而是接受確定的參數(shù)組，或?qū)φ帐腔谔幚砬盎蛱幚砗蟮乃?。它們或者與測(cè)試平行進(jìn)行，或者在其之前或之后進(jìn)行，或者它們可以是預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)。例如，對(duì)照可以指對(duì)象或客體或試劑等在除了略去受測(cè)過程或試劑或變量等以外按平行實(shí)驗(yàn)處理的實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，該結(jié)果用作判斷實(shí)驗(yàn)效果的比較標(biāo)準(zhǔn)。因此，對(duì)照可以用來確定與過程或試劑或變量等相關(guān)的效果。例如，若所研究的是測(cè)試分子對(duì)細(xì)胞的影響，可以a)簡(jiǎn)單地記錄細(xì)胞在分子存在下的特征，b)執(zhí)行a且隨后添加具有已知活性或無活性的對(duì)照分子、或?qū)φ战M合物(例如，試驗(yàn)緩沖溶液(載劑))并記錄影響，然后將測(cè)試分子的影響與對(duì)照作比較。在某些情況中，一旦進(jìn)行了對(duì)照，所述對(duì)照就可用作標(biāo)準(zhǔn)，其中不必再進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，而在另一些情況中每當(dāng)要作出比較時(shí)都應(yīng)平行進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞色素P450酶調(diào)節(jié)劑“細(xì)胞色素P450酶調(diào)節(jié)劑”是能調(diào)節(jié)P450、增加或降低P450活性的任何分子。已知的P450調(diào)節(jié)劑包括但不限于利福平。細(xì)胞色素P450酶活化劑“細(xì)胞色素P450酶活化劑”是能調(diào)節(jié)P450、增加P450活性的任何分子。已知的P450活化劑包括但不限于利福平。 細(xì)胞色素P450酶抑制劑“細(xì)胞色素P450酶抑制劑”是能調(diào)節(jié)P450、降低P450活性的任何分子。數(shù)據(jù)輸出數(shù)據(jù)輸出指使用分析機(jī)器進(jìn)行試驗(yàn)之后收集的結(jié)果，例如無標(biāo)記生物傳感器。例如，所述無標(biāo)記生物傳感器的數(shù)據(jù)輸出可以是DMR信號(hào)。例如，應(yīng)理解能操控?cái)?shù)據(jù)輸出到指數(shù)。也理解能有任何數(shù)據(jù)輸出類型，所述試驗(yàn)用例如分子、Katp通道、Rho激酶、標(biāo)記物、抑制齊IJ、Katp抑制劑、標(biāo)記物-分子、標(biāo)記物-Katp抑制劑等運(yùn)行。也理解能比較任何兩種輸出，例如分子數(shù)據(jù)輸出和Katp抑制劑數(shù)據(jù)輸出形成分子-Katp抑制劑比較。通常，能與類似的數(shù)據(jù)輸出進(jìn)行所述比較，例如DMR數(shù)據(jù)輸出與DMR數(shù)據(jù)輸出。定義的途徑“定義的途徑”或類似術(shù)語是特定途徑，例如Gaq途徑、Gas途徑、Gai途徑、G12/13、EGFR(表皮生長(zhǎng)因子受體)途徑、或PKC(蛋白激酶C)途徑。失調(diào)的PI3K途徑細(xì)胞系失調(diào)的PI3K途徑細(xì)胞系是其中PI3K途徑超活化的細(xì)胞系，這是由于途徑中關(guān)鍵信號(hào)級(jí)聯(lián)蛋白的改變。這些改變包括但不限于引起未刺激細(xì)胞中Ras和PI3K組成型活化的K-Ras (PI3K上游蛋白)的突變，或也引起PI3K組成型活化的PTEN (PI3K的下游負(fù)調(diào)控因子)的功能喪失。例如，失調(diào)的PI3K途徑細(xì)胞系是含未刺激細(xì)胞中組成型活化的K-Ras突變體的 A549 細(xì)胞系(Krypuy, M.等.“High resolution melting analysis for therapid and sensitive detection of mutations in clinical samples:KRAS codon 12and13mutations in non-small celllung cancer.(快速靈敏檢測(cè)臨床樣品中突變的高分辨率解鏈分析非小細(xì)胞肺癌中KRAS密碼子12和13突變)”BMC Cancer 2006, 6，e295)。PI3K途徑中涉及的蛋白包括但不限于(I)AKT和PI3K家族成員和其調(diào)節(jié)劑AKT1、AKT2、AKT3、APPL、BTK、CTMP、GNB1、GRB10、GRB2、HSPB1、HSPCA、HSPCB、ILK、INPP5D(SHIP)、INPPLl、MAPK8IP1 (JIPl)、MTCPl、PDK2、PDPKl、PIK3CA(pll0a)、PIK3CB (pllOb)、PIK3CG、PIK3R1(p85a)、PIK3R2(p85b)、PIK3R3、PRKCA、PRKCB1、PRKCZ、PTEN、TCL1A、TCL1B;(2)IGF-I或其他 RTK 信號(hào)途徑:CSNK2A1、ELKl、FOS, GRB2、HRAS, IGFl、IGF1R、IRSl、JUN、MAP2K1、MAPK3、MAPK8、PIK3CB、PTPNl URAFU KRAS、RASA I、SHCI、SOS I、SRF; (3)肌動(dòng)蛋白構(gòu)成和細(xì)胞遷移的 PI3K 亞基的 p85-相關(guān)調(diào)節(jié)AICDA、CDC42、CUTLl、PAKl、PDGFRA、RACl、RH0A、WASL、ZFYVE21; (4) PTEN 依賴性細(xì)胞周期停滯和凋亡AKTl、CDKNlB (p27)、CUTLl、FASLG、F0X03A、GRB2、ILK、ITGBI、MAPKI、MAPK3、PDKI、PDK2、PTEN、PTK2、RBL2、SHCI、SOS I、ZFYVE21; (5) BAD磷酸化相關(guān)抗凋亡途徑AKTI、ASAHI、BAD、CUTLI、GRB2、HRAS、IGFIR、IRSI、MAP2KI、MAPKI、MAPK3、PRKAR1B、RAFl、RPS6KA1、SHCl、SOSl、YWHAH、ZFYVE21;和(6)參與 mTOR 信號(hào)傳導(dǎo)途徑的蛋白:AKT1、CUTL1、EIF3S10、EIF4A1、EIF4B、EIF4E、EIF4EBP1、EIF4G1、FKBP1A、FRAP1、MKNK1、PDK1、PDK2、PR48、PTEN、RHEB、RPS6、RPS6KB1、TSC1、TSC2、ZFYVE21。檢測(cè)檢測(cè)或類似術(shù)語是指本公開中的設(shè)備和方法發(fā)現(xiàn)或感測(cè)分子或標(biāo)記誘導(dǎo)的細(xì)胞響應(yīng)以及區(qū)分對(duì)不同分子感測(cè)到的響應(yīng)的能力。(藥物候選分子的)直接作用“直接作用”或類似術(shù)語是指(藥物候選分子)獨(dú)立作用于細(xì)胞的結(jié)果。DMR 信號(hào)“DMR信號(hào)”或類似術(shù)語指光生物傳感器測(cè)得的由細(xì)胞受刺激后響應(yīng)產(chǎn)生的細(xì)胞信號(hào)。DMR 響應(yīng)“DMR響應(yīng)”或類似術(shù)語是指采用光生物傳感器的生物傳感器響應(yīng)。DMR指動(dòng)態(tài)物質(zhì)再分布或動(dòng)態(tài)細(xì)胞物質(zhì)再分布。P-DMR是陽性DMR反應(yīng)，N-DMR是陰性DMR反應(yīng)，并且RP-DMR是恢復(fù)性P-DMR反應(yīng)。藥物候選分子藥物候選分子或類似術(shù)語是指對(duì)其用作藥物或藥效團(tuán)的能力進(jìn)行檢測(cè)的測(cè)試分子。該分子可視為先導(dǎo)分子。功效功效或類似術(shù)語是指在理想或最優(yōu)條件下產(chǎn)生所需規(guī)模效應(yīng)的能力。這些條件區(qū)分了功效和相關(guān)的有效性概念，后者涉及在現(xiàn)實(shí)條件下的改變。功效是受體占用和啟動(dòng)分子、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)水平響應(yīng)能力之間的關(guān)系。更高和抑制和類似詞語術(shù)語更高、提高、提升或升高或類似術(shù)語或這些術(shù)語的變體是指提高到基礎(chǔ)水平以上，例如與對(duì)照相比。術(shù)語低、更低、減少、降低或下降或類似術(shù)語或這些術(shù)語的變體是指降低到基礎(chǔ)水平以下，例如與對(duì)照相比。例如，在向細(xì)胞內(nèi)添加分子例如激動(dòng)劑或拮抗劑之前或不存在添加時(shí)基礎(chǔ)水平是正常體內(nèi)水平。抑制或抑制形式或類似術(shù)語是指降低或遏制。H印G2C3A細(xì)胞系術(shù)語“H印G2C3A”或其他術(shù)語是有關(guān)H印G2細(xì)胞系的腫瘤細(xì)胞系。IfepG2 細(xì)胞系HepG2 (ATCC號(hào)HB-8065)是人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系，并且是患有高分化肝細(xì)胞癌的15歲高加索美國(guó)男性的肝組織衍生的永生細(xì)胞系。這些細(xì)胞形態(tài)學(xué)上為上皮細(xì)胞，模式染色體數(shù)量為55且在裸小鼠中不致癌。該細(xì)胞分泌各種主要血漿蛋白如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和急性期蛋白纖維蛋白原、a 2-巨球蛋白、a I-抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白和血纖維蛋白溶酶原。該細(xì)胞會(huì)響應(yīng)人生長(zhǎng)激素的刺激。HepG2細(xì)胞適于體外模型系統(tǒng)，用于研究極化的人肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。另一良好表征的極化肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞系包括大鼠肝細(xì)胞瘤衍生的雜交細(xì)胞系WIF-B。用合適的培養(yǎng)條件，HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)和功能上的穩(wěn)健分化，可控地形成頂端和基底側(cè)細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)域，其分別類似體內(nèi)的膽小管(BC)和竇狀隙(sinusoidal)結(jié)構(gòu)域(概述參見http://www. ATCC.org)。JAKCJanus激酶)介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)JAK介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)指與JAK相互作用的分子或物質(zhì)的上游或下游的信號(hào)傳導(dǎo)。用于內(nèi)源ATP敏感性鉀(Katp)離子通道的開放劑如吡那地爾可為JAK介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的活化劑。JAK和STAT (信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄蛋白)是許多細(xì)胞因子受體系統(tǒng)的關(guān)鍵組分，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、存活、分化和病原體抗性。示例為IL-6(或gpl30)受體家族，其共調(diào)節(jié)B細(xì)胞分化、血漿細(xì)胞發(fā)生和急性期反應(yīng)。細(xì)胞因子結(jié)合誘導(dǎo)受體二聚化，活化關(guān)聯(lián)的JAK，其磷酸化自身和該受體。所述受體和Jak上的磷酸化位點(diǎn)作為停靠位點(diǎn)用于含SH2的Stat如Stat3和含SH2的蛋白，以及連接所述受體與MAP激酶、PI3激酶/Akt和其他細(xì)胞途徑的銜接子。Janus激酶突變是人血液惡性腫瘤的主要分子事件。Jak2假激酶結(jié)構(gòu)域(V617F)中的獨(dú)特體細(xì)胞突變?cè)?gt;90%的真性紅細(xì)胞增多患者以及較大比例的原發(fā)性血小板增多癥和特發(fā)性骨髓纖維變性患者中發(fā)生。該突變導(dǎo)致病理性活化Jak2激酶，其引起造血祖細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。在一些急性巨核細(xì)胞白血病患者中存在的數(shù)種Jak3假激酶結(jié)構(gòu)域突變，也使Jak3組成型活化。Jakl中的體細(xì)胞獲得性功能獲得突變已在約20%的成人T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病中發(fā)現(xiàn)。JAK活化劑“ JAK活化劑”是能活化JAK的任何分子。JAK抑制劑“ JAK抑制劑”是能抑制JAK的任何分子。已知的JAK抑制劑包括但不限于AG490。JAK調(diào)節(jié)劑“ JAK調(diào)節(jié)劑”是能調(diào)節(jié)JAK、增加或降低JAK活性的任何分子。已知的JAK調(diào)節(jié)劑包括但不限于AG490。在分子存在下“在分子存在下”或類似術(shù)語是指將培養(yǎng)的細(xì)胞接觸或暴露于分子。所述接觸或暴露可以在細(xì)胞接觸刺激之前、或同時(shí)發(fā)生。指數(shù)指數(shù)或類似術(shù)語指數(shù)據(jù)的集合。例如，指數(shù)可以是含有一種或多種調(diào)節(jié)概況的列表、表格、文檔、或編目。應(yīng)當(dāng)理解，可以由任何數(shù)據(jù)組合生成指數(shù)。例如，DMR概況可以有P-DMR,N-DMR和RP-DMR?？梢圆捎猛暾母艣r數(shù)據(jù)、P-DMR數(shù)據(jù)、N-DMR數(shù)據(jù)、RP-DMR數(shù)據(jù)、或其中的任意點(diǎn)、或這些或其它數(shù)據(jù)的組合來生成指數(shù)。指數(shù)是任何此類信息的集合。通常，在比較指數(shù)時(shí)，所述指數(shù)具有類似數(shù)據(jù)，即P-DMR對(duì)P-DMR數(shù)據(jù)。
生物傳感器指數(shù)“生物傳感器指數(shù)”或類似術(shù)語是由生物傳感器數(shù)據(jù)的集合構(gòu)成的指數(shù)。生物傳感器指數(shù)可以是生物傳感器概況，例如初級(jí)概況、或二級(jí)概況的集合。所述指數(shù)可以包含任何種類的數(shù)據(jù)。例如，概況的指數(shù)可以只包括N-DMR數(shù)據(jù)點(diǎn)，它可以是P-DMR數(shù)據(jù)點(diǎn)、或者兩種都有或者它可以是阻抗數(shù)據(jù)點(diǎn)。它可以是與概況曲線相關(guān)的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)。DMR 指數(shù)“DMR指數(shù)”或類似術(shù)語是由DMR數(shù)據(jù)的集合構(gòu)成的指數(shù)。缺失和存在分子時(shí)細(xì)胞/標(biāo)記的動(dòng)力學(xué)響應(yīng)“缺失和存在分子時(shí)細(xì)胞/標(biāo)記的動(dòng)力學(xué)響應(yīng)”或類似短語是指缺失和存在分子時(shí)標(biāo)記所誘導(dǎo)細(xì)胞響應(yīng)的整個(gè)試驗(yàn)或部分試驗(yàn)的時(shí)間系列，采用例如模式識(shí)別分析，其可直接用于檢測(cè)分子的藥理學(xué)或作用模式。已知分子已知分子或類似術(shù)語指具有已知藥理/生物/生理/病理生理活性的分子，其精確作用模式可以是已知或未知的。已知調(diào)節(jié)劑已知調(diào)節(jié)劑或類似術(shù)語是指對(duì)至少一種已知靶標(biāo)具有已知親和性的調(diào)節(jié)劑。例如，已知調(diào)節(jié)劑可以是PI3K抑制劑、PKA抑制劑、GPCR拮抗劑、GPCR激動(dòng)劑、RTK抑制劑、表皮生長(zhǎng)因子受體中和抗體、或磷酸二酯酶抑制、PKC抑制劑或激活劑等。已知調(diào)節(jié)劑生物傳感器指數(shù)“已知調(diào)節(jié)劑生物傳感器指數(shù)”或類似術(shù)語是由就已知調(diào)節(jié)劑采集的數(shù)據(jù)生成的調(diào)節(jié)劑生物傳感器指數(shù)。例如，已知調(diào)節(jié)劑生物傳感器指數(shù)可以由已知調(diào)節(jié)劑作用于細(xì)胞組的概況、和已知調(diào)節(jié)劑針對(duì)標(biāo)記組的調(diào)節(jié)概況構(gòu)成，每組標(biāo)記針對(duì)細(xì)胞組中的一種細(xì)胞。已知調(diào)節(jié)劑DMR指數(shù)“已知調(diào)節(jié)劑DMR指數(shù)”或類似術(shù)語是由就已知調(diào)節(jié)劑采集的數(shù)據(jù)生成的調(diào)節(jié)劑DMR指數(shù)。例如，已知調(diào)節(jié)劑DMR指數(shù)可以由已知調(diào)節(jié)劑作用于細(xì)胞組的概況、和已知調(diào)節(jié)劑針對(duì)標(biāo)記組的調(diào)節(jié)概況構(gòu)成，每組標(biāo)記針對(duì)細(xì)胞組中的一種細(xì)胞。配體配體或類似術(shù)語是指能與生物分子結(jié)合并形成復(fù)合物以用于生物學(xué)目的的物質(zhì)或組合物或分子。在生物系統(tǒng)中配體及其靶分子之間實(shí)際的不可逆共價(jià)結(jié)合是罕見的。配體與受體的結(jié)合改變了化學(xué)構(gòu)象，即受體蛋白質(zhì)的三維形狀。受體蛋白的構(gòu)象狀態(tài)決定受體的功能狀態(tài)。結(jié)合的趨勢(shì)或強(qiáng)度稱為親和性。配體包括底物、阻斷劑、抑制劑、激活劑和神經(jīng)遞質(zhì)。放射性配體是放射性標(biāo)記的配體，而熒光配體是熒光標(biāo)記的配體；兩者都可視為配體，常用作受體生物學(xué)和生物化學(xué)研究中的示蹤劑。配體和調(diào)節(jié)劑可互換使用。庫庫或類似術(shù)語指集合。庫可以是本文公開的任何物品的集合。例如，它可以是指數(shù)的集合，指數(shù)庫；它可以是概況的集合，概況庫；或者它可以是DMR指數(shù)的集合，DMR指數(shù)庫；同樣，它可以是分子的集合，分子庫；它可以是細(xì)胞的集合，細(xì)胞庫；它可以是標(biāo)記的集合，標(biāo)記庫；例如，庫可以是隨機(jī)或非隨機(jī)的，確定或不確定的。例如，公開了已知調(diào)節(jié)劑的DMR指數(shù)庫或生物傳感器指數(shù)庫。
肝細(xì)胞“肝細(xì)胞”或類似術(shù)語指源自或獲自肝組織的細(xì)胞。肝細(xì)胞可包括初級(jí)肝細(xì)胞、轉(zhuǎn)化肝細(xì)胞如肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞C3A、和永生肝細(xì)胞如F2N4細(xì)胞。在實(shí)施方式中，所述肝細(xì)胞可包括輔助細(xì)胞如成纖維細(xì)胞NIH3T3。合適的輔助細(xì)胞的示例包括成纖維細(xì)胞如NIH 3T3成纖維細(xì)胞、鼠3T3-J2成纖維細(xì)胞或人成纖維細(xì)胞；人或大鼠肝星狀細(xì)胞；和庫普弗細(xì)胞。長(zhǎng)期試驗(yàn)“長(zhǎng)期試驗(yàn)”或類似術(shù)語用于研究給定分子對(duì)活細(xì)胞的長(zhǎng)期影響。一種具體的長(zhǎng)期試驗(yàn)是“長(zhǎng)期生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)”。在一種實(shí)施方式中，每個(gè)類型的細(xì)胞僅暴露于所述分子一段較長(zhǎng)的時(shí)間(例如，8小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)、32小時(shí)、48小時(shí)、和72小時(shí))。這一長(zhǎng)期試驗(yàn)用于確定分子對(duì)細(xì)胞健康狀態(tài)(例如，活力、凋亡、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞粘附調(diào)節(jié)、增殖)的影響。這一長(zhǎng)期試驗(yàn)還包含可直接用于分子誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)事件或通路研究的早期細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)響應(yīng)(例如，分子刺激后30分鐘、60分鐘、120分鐘、180分鐘)。在另一種實(shí)施方式中，標(biāo)記存在下的長(zhǎng)期生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)用于研究長(zhǎng)期交叉調(diào)節(jié)對(duì)分子和標(biāo)記間細(xì)胞生物學(xué)和生理學(xué)的影響。標(biāo)記的添加可以在分子之前、同時(shí)、和之后。例如，當(dāng)標(biāo)記(例如，H2O2)引發(fā)細(xì)胞組中至少一種細(xì)胞的凋亡時(shí)，可以采用這種長(zhǎng)期試驗(yàn)確定分子是否為保護(hù)性。反之，這種長(zhǎng)期試驗(yàn)也可用于確定標(biāo)記對(duì)分子誘導(dǎo)的細(xì)胞事件(例如，凋亡、或壞死)的保護(hù)或協(xié)同作用。長(zhǎng)期生物傳感器信號(hào)“長(zhǎng)期生物傳感器信號(hào)”是長(zhǎng)期試驗(yàn)產(chǎn)生的生物傳感器信號(hào)。長(zhǎng)期DMR信號(hào)長(zhǎng)期DMR信號(hào)或類似術(shù)語是指長(zhǎng)期光生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)產(chǎn)生的光生物傳感器信號(hào)。標(biāo)記物標(biāo)記或類似術(shù)語是指在生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)中產(chǎn)生信號(hào)的配體。所述信號(hào)還必須是至少一種特定的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路和/或至少一種特定靶標(biāo)所介導(dǎo)至少一種特定細(xì)胞過程的特征。所述信號(hào)可以是陽性、或陰性、或任何組合(例如振蕩)。標(biāo)記物組“標(biāo)記組”或類似術(shù)語是包括至少兩種標(biāo)記的組。標(biāo)記可用于不同的通路、相同的通路、不同的靶標(biāo)、或甚至相同的靶標(biāo)。標(biāo)記生物傳感器指數(shù)“標(biāo)記生物傳感器指數(shù)”或類似術(shù)語是由就標(biāo)記采集的數(shù)據(jù)生成的生物傳感器指數(shù)。例如，標(biāo)記生物傳感器指數(shù)可以由標(biāo)記作用于細(xì)胞組的概況、和標(biāo)記針對(duì)標(biāo)記組的調(diào)節(jié)概況構(gòu)成，每組標(biāo)記針對(duì)細(xì)胞組中的一種細(xì)胞。標(biāo)記DMR指數(shù)“標(biāo)記DMR指數(shù)”或類似術(shù)語是由就標(biāo)記采集的數(shù)據(jù)生成的生物傳感器DMR指數(shù)。例如，標(biāo)記DMR指數(shù)可以由標(biāo)記作用于細(xì)胞組的概況、和標(biāo)記針對(duì)標(biāo)記組的調(diào)節(jié)概況構(gòu)成，每組標(biāo)記針對(duì)細(xì)胞組中的一種細(xì)胞。材料材料是用于構(gòu)成物理實(shí)體的某種物品(化學(xué)的、生物化學(xué)的、生物的、或混合的)的有形部分。培養(yǎng)基培養(yǎng)基是能培養(yǎng)細(xì)胞的任何混合物。生長(zhǎng)培養(yǎng)基是微生物或細(xì)胞在其中經(jīng)歷生長(zhǎng)的物體。模擬本文所用的“模擬”或類似術(shù)語指執(zhí)行參考對(duì)象的一種或多種功能。例如，分子模擬物執(zhí)行分子的一種或多種功能。調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)或其形式，是指提高、或降低、或維持通過細(xì)胞靶標(biāo)介導(dǎo)的細(xì)胞活性。應(yīng)當(dāng)理解，在使用這些詞語之一時(shí)，也公開了其可比對(duì)照提高1%、5%、10%、20%、50%、100%、500%、或1000%,或可以比對(duì)照降低 1%、5%、10%、20%、50%、或 100%。調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)劑或類似術(shù)語是控制細(xì)胞靶標(biāo)活性的配體。它是結(jié)合細(xì)胞靶標(biāo)，例如靶蛋白的信號(hào)調(diào)節(jié)分子。調(diào)節(jié)比較“調(diào)節(jié)比較”或類似術(shù)語是初級(jí)概況和二級(jí)概況標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)果。調(diào)節(jié)概況“調(diào)節(jié)概況”或類似術(shù)語是分子存在時(shí)標(biāo)記的二級(jí)概況和不存在任何分子時(shí)標(biāo)記的初級(jí)概況之間的比較。例如，所述比較可以通過從二級(jí)概況中減去初級(jí)概況或從初級(jí)概況中減去二級(jí)概況或?qū)⒍?jí)概況對(duì)初級(jí)概況進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。調(diào)節(jié)劑生物傳感器指數(shù)“調(diào)節(jié)劑生物傳感器指數(shù)”或類似術(shù)語是由就調(diào)節(jié)劑采集的數(shù)據(jù)生成的生物傳感器指數(shù)。例如，調(diào)節(jié)劑生物傳感器指數(shù)可以由調(diào)節(jié)劑作用于細(xì)胞組的概況、和調(diào)節(jié)劑針對(duì)標(biāo)記組的調(diào)節(jié)概況構(gòu)成，每組標(biāo)記針對(duì)細(xì)胞組中的一種細(xì)胞。調(diào)節(jié)劑DMR指數(shù)“調(diào)節(jié)劑DMR指數(shù)”或類似術(shù)語是通過就調(diào)節(jié)劑采集的數(shù)據(jù)生成的DMR指數(shù)。例如，調(diào)節(jié)劑DMR指數(shù)可以由調(diào)節(jié)劑作用于細(xì)胞組的概況、和調(diào)節(jié)劑針對(duì)標(biāo)記組的調(diào)節(jié)概況構(gòu)成，每組標(biāo)記針對(duì)細(xì)胞組中的一種細(xì)胞。調(diào)節(jié)標(biāo)記的生物傳感器信號(hào)“調(diào)節(jié)生物傳感器信號(hào)”或類似術(shù)語是指使細(xì)胞響應(yīng)標(biāo)記刺激發(fā)生生物傳感器信號(hào)或概況改變。調(diào)節(jié)DMR信號(hào)“調(diào)節(jié)DMR信號(hào)”或類似術(shù)語是指使細(xì)胞響應(yīng)標(biāo)記刺激發(fā)生DMR信號(hào)或概況改變。分子本文所用的術(shù)語“分子”或類似術(shù)語是指以化學(xué)分子或有確定分子量的分子形式存在的生物或生物化學(xué)或化學(xué)實(shí)體。不論其大小，分子或類似術(shù)語是化學(xué)、生物化學(xué)或生物分子。很多分子是稱為有機(jī)分子(含有碳原子和其它原子，通過共價(jià)鍵連接的分子)的類型，盡管一些分子不含碳(包括簡(jiǎn)單的分子氣體例如分子氧和更復(fù)雜的分子例如一些硫基聚合物)。通用術(shù)語“分子”包括大量描述性分子類型或組，例如蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、類固醇、有機(jī)藥物、小分子、受體、抗體和脂質(zhì)。適當(dāng)時(shí)，由于所述方法應(yīng)用于分子亞組，本文中采用這些更具描述性的術(shù)語(其中很多，例如“蛋白質(zhì)”，本身描述了重疊的分子組)中的一個(gè)或多個(gè)，但不減損這些分子用作代表一般類別“分子”和指定亞類(例如蛋白質(zhì))的意圖。除非明確說明，“分子”一詞應(yīng)包括特定的分子及其鹽，例如藥學(xué)上可接受的鹽。分子混合物分子混合物或類似術(shù)語是指含有至少兩種分子的混合物。所述兩種分子可以是但不限于，結(jié)構(gòu)不同(即對(duì)映異構(gòu)體)、或組成不同(例如，蛋白質(zhì)同種型、糖形、或帶有不同聚乙二醇(PEG)修飾的抗體)、或結(jié)構(gòu)和組成不同(例如未純化的天然提取物、或未純化的合成化合物)。分子生物傳感器指數(shù)“分子生物傳感器指數(shù)”或類似術(shù)語是由就分子采集的數(shù)據(jù)生成的生物傳感器指數(shù)。例如，分子生物傳感器指數(shù)可以由分子作用于細(xì)胞組的概況、和分子針對(duì)標(biāo)記組的調(diào)節(jié)概況構(gòu)成，每組標(biāo)記針對(duì)細(xì)胞組中的一種細(xì)胞。分子DMR指標(biāo)“分子DMR指數(shù)”或類似術(shù)語是通過就分子采集的數(shù)據(jù)生成的DMR指數(shù)。例如，分子生物傳感器指數(shù)可以由分子作用于細(xì)胞組的概況、和分子針對(duì)標(biāo)記組的調(diào)節(jié)概況構(gòu)成，每組標(biāo)記針對(duì)細(xì)胞組中的一種細(xì)胞。分子指數(shù)“分子指數(shù)”或類似術(shù)語是涉及分子的指數(shù)。經(jīng)分子處理的細(xì)胞經(jīng)分子處理的細(xì)胞或類似術(shù)語是已暴露于分子的細(xì)胞。分子調(diào)節(jié)指數(shù)“分子調(diào)節(jié)指數(shù)”或類似術(shù)語是指顯示分子對(duì)標(biāo)記組作用于細(xì)胞組的生物傳感器輸出信號(hào)的調(diào)節(jié)能力的指數(shù)。通過將分子存在下受標(biāo)記刺激后細(xì)胞響應(yīng)的特定生物傳感器輸出信號(hào)參數(shù)對(duì)沒有任何分子時(shí)的情況進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化而生成調(diào)節(jié)指數(shù)。分子藥理學(xué)分子藥理學(xué)或類似術(shù)語是指分子作用于細(xì)胞的系統(tǒng)細(xì)胞生物學(xué)或系統(tǒng)細(xì)胞藥理學(xué)或作用模式。通常通過但不限于，毒性、影響特定細(xì)胞過程(例如，增殖、分化、活性氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))的能力、或調(diào)節(jié)特定細(xì)胞靶標(biāo)(例如，Katp通道、PKA、PKC、PKG、JAK2、MAPK, MEK2或肌動(dòng)蛋白)的能力來鑒定分子藥理學(xué)。天然細(xì)胞天然細(xì)胞是任何沒有經(jīng)過遺傳工程改造的細(xì)胞。天然細(xì)胞能是原代細(xì)胞、永生細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、干細(xì)胞或干細(xì)胞衍生細(xì)胞。正常Katp途徑細(xì)胞系正常Katp途徑細(xì)胞系是其中Katp途徑未失調(diào)且因此未被組成型活化的細(xì)胞系。然而，該細(xì)胞系還可含有不能引起Katp途徑組成型活化的某些蛋白突變體。標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)化或類似術(shù)語是指調(diào)整數(shù)據(jù)、或概況、或響應(yīng)以例如去除至少一個(gè)共變量。例如，若產(chǎn)生了兩種響應(yīng)，一種針對(duì)作用于細(xì)胞的標(biāo)記且一種針對(duì)作用于細(xì)胞的標(biāo)記與分子，標(biāo)準(zhǔn)化是指比較沒有分子時(shí)標(biāo)記誘導(dǎo)的響應(yīng)和存在分子時(shí)的響應(yīng)，并消除僅由標(biāo)記引起的響應(yīng)，使得標(biāo)準(zhǔn)化的響應(yīng)代表由于分子對(duì)標(biāo)記的調(diào)節(jié)造成的響應(yīng)。通過在分子存在下標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)記的初級(jí)概況和標(biāo)記的二級(jí)概況(調(diào)節(jié)概況)得到調(diào)節(jié)比較。非病毒性感染術(shù)語“非病毒性感染”或類似術(shù)語指細(xì)胞被非病毒生物體如細(xì)菌或寄生蟲感染的狀態(tài)。這是細(xì)胞被病毒以外的生物體污染的狀態(tài)?？蛇x的“可選的”或“可選地”或類似術(shù)語表示隨后描述的事件或情形可以發(fā)生或不發(fā)生，而且該描述包括事件或情形發(fā)生的實(shí)例和事件或情形不發(fā)生的實(shí)例。例如，短語“組合物可選包含組合”是指組合物可以包含不同分子的組合或不包含組合，從而該描述包括了組合和組合缺失(即組合中單獨(dú)的成員)?；虮疚乃玫脑~語“或”或類似術(shù)語表示特定列表中的任意成員且還包括該列表中成員的任意組合。組組或類似術(shù)語是指預(yù)先確定的樣本組(例如，標(biāo)記、或細(xì)胞、或通路)。可以從庫中選取樣本產(chǎn)生組。淘選淘選或類似術(shù)語是指篩選一種或多種細(xì)胞是否存在一種或多種受體或細(xì)胞靶標(biāo)。途徑本文所用途徑是細(xì)胞中發(fā)生的一系列化學(xué)反應(yīng)。某一途徑內(nèi)，一種分子或物質(zhì)被修飾，然后導(dǎo)致另一種分子或物質(zhì)被修飾，依此類推。通常，酶如激酶參與這些修飾。途徑的發(fā)生可從細(xì)胞表面到細(xì)胞核，以及在細(xì)胞內(nèi)從細(xì)胞器官到細(xì)胞器官，或從細(xì)胞溶質(zhì)到細(xì)胞器官或從細(xì)胞器官到細(xì)胞溶質(zhì)。所述修飾包括化學(xué)(如磷酸化)或物理(如從一個(gè)位置移位到另一位置)修飾。時(shí)間段“時(shí)間段”是指代表時(shí)間推移的任何階段。例如，I秒、I分鐘、I小時(shí)、I天和I周都是時(shí)間段。概況概況或類似術(shù)語是指就組合物，例如細(xì)胞采集到的數(shù)據(jù)。如本文所述，概況可以從無標(biāo)記的生物傳感器采集。初級(jí)概況“初級(jí)概況”或類似術(shù)語是指當(dāng)分子接觸細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生的生物傳感器響應(yīng)或生物傳感器輸出信號(hào)或概況。通常，在將初始細(xì)胞響應(yīng)對(duì)凈零生物傳感器信號(hào)(即基線)標(biāo)準(zhǔn)化以后獲得初級(jí)概況。二級(jí)概況“二級(jí)概況”或類似術(shù)語是指細(xì)胞在分子存在時(shí)響應(yīng)標(biāo)記的生物傳感器響應(yīng)或生物傳感器輸出信號(hào)。二級(jí)概況可以用作分子對(duì)標(biāo)記誘導(dǎo)的細(xì)胞響應(yīng)或生物傳感器響應(yīng)的調(diào)節(jié)能力的指示物。調(diào)節(jié)概況“調(diào)節(jié)概況”或類似術(shù)語是分子存在時(shí)標(biāo)記的二級(jí)概況和不存在任何分子時(shí)標(biāo)記的初級(jí)概況之間的比較。例如，所述比較可以通過從二級(jí)概況中減去初級(jí)概況或從初級(jí)概況中減去二級(jí)概況或?qū)⒍?jí)概況對(duì)初級(jí)概況進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。陽性對(duì)照“陽性對(duì)照”或類似術(shù)語是一種對(duì)照，其顯示數(shù)據(jù)采集的條件能產(chǎn)生數(shù)據(jù)集合。刺激后刺激后或類似術(shù)語是指在細(xì)胞試驗(yàn)中用分子刺激細(xì)胞后的時(shí)間?？赡艿腒atp抑制劑可能的Katp抑制劑是測(cè)定為與本文所述已知Katp抑制劑相似的任何分子。所述已知的Katp抑制劑包括但不限于磺酰脲。已知的Katp抑制劑可用作比較的參考分子。可能的Katp調(diào)節(jié)劑“可能的Katp調(diào)節(jié)劑”是與本文所公開試驗(yàn)中的Katp調(diào)節(jié)劑功能類似的任何分子、化合物或組合物?？赡艿腞ho激酶抑制劑可能的Rho激酶(ROCK)抑制劑是測(cè)定為與本文所述已知ROCK抑制劑相似的任何分子。已知的ROCK抑制劑包括但不限于Y27632、H-89和H-8。Katp抑制劑和已知的Katp抑制劑Katp抑制劑是測(cè)定為Katp.抑制劑的任何分子。所述已知的Katp抑制劑包括但不限于磺酰脲。已知的Katp抑制劑可用作比較的參考分子。Katp 細(xì)胞系“Katp細(xì)胞系”或類似術(shù)語指表達(dá)至少一種Katp通道的細(xì)胞類型。Katp細(xì)胞系的非限制性示例為H印G2或H印G2C3A。應(yīng)理解mito_KATP或類似術(shù)語指線粒體中的Katp。Katp 抑制劑“Katp抑制劑”是能抑制Katp通道開放的任何分子、化合物或組合物。Katp 調(diào)節(jié)劑"Katp調(diào)節(jié)劑”是能調(diào)節(jié)Katp通道開放或抑制其開放的任何分子、化合物或組合物。鉀通道開放劑(KCO)“鉀通道開放劑”是能打開Katp通道的任何分子、化合物或組合物。增強(qiáng)增強(qiáng)、增強(qiáng)的或類似術(shù)語是指由分子引起的細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記的生物傳感器響應(yīng)的特定參數(shù)提高。通過比較標(biāo)記的初級(jí)概況和分子存在下相同標(biāo)記在同一細(xì)胞內(nèi)的二級(jí)概況，可以計(jì)算出分子對(duì)細(xì)胞的標(biāo)記誘導(dǎo)生物傳感器響應(yīng)的調(diào)節(jié)。正調(diào)節(jié)是指分子引起標(biāo)記誘導(dǎo)的生物傳感器信號(hào)增加。概況概況或類似術(shù)語是指就組合物，例如細(xì)胞采集到的數(shù)據(jù)。如本文所述，概況可以從無標(biāo)記的生物傳感器采集。脈沖刺激試驗(yàn)
“脈沖刺激試驗(yàn)”或類似術(shù)語可用于細(xì)胞僅暴露于分子中極短時(shí)間(例如，數(shù)秒、或數(shù)分鐘)的情況。這種脈沖刺激試驗(yàn)可用于研究分子作用于細(xì)胞/靶標(biāo)的動(dòng)力學(xué)，及其對(duì)標(biāo)記誘導(dǎo)的生物傳感器信號(hào)的影響。可通過在添加分子后的給定時(shí)間用液體操作裝置簡(jiǎn)單地將分子溶液替換成細(xì)胞試驗(yàn)緩沖液來完成脈沖刺激試驗(yàn)。效能效能或類似術(shù)語是用產(chǎn)生給定強(qiáng)度效應(yīng)所需的量表述的分子活性的度量。例如，高效能藥物在低濃度引起較高的響應(yīng)。效能與親和性及功效成比例。親和性是藥物分子與受體結(jié)合的能力。出版物整篇申請(qǐng)中引用了多個(gè)出版物。這些出版物的公開內(nèi)容通過引用全文納入本申請(qǐng)中以更完整地描述本申請(qǐng)所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。所公開的參考文獻(xiàn)也根據(jù)引用所依賴的討論中包含的材料被單獨(dú)地和具體地通過弓I用納入本文。脈沖刺激試驗(yàn)“脈沖刺激試驗(yàn)”或類似術(shù)語可用于細(xì)胞僅暴露于分子中極短時(shí)間(例如，數(shù)秒、或數(shù)分鐘)的情況。這種脈沖刺激試驗(yàn)可用于研究分子作用于細(xì)胞/靶標(biāo)的動(dòng)力學(xué)，及其對(duì)標(biāo)記誘導(dǎo)的生物傳感器信號(hào)的影響?？赏ㄟ^在添加分子后的給定時(shí)間用液體操作裝置簡(jiǎn)單地將分子溶液替換成細(xì)胞試驗(yàn)緩沖液來完成脈沖刺激試驗(yàn)。范圍在本文中，范圍可以表述為自“約”某一具體值始和/或至“約”另一具體值止。表述這種范圍時(shí)，另一種實(shí)施方式包括自某一具體值始和/或至另一具體值止。.類似地，用先行詞“約”將數(shù)值表示為近似值時(shí)，應(yīng)該理解，該具體值構(gòu)成另一個(gè)實(shí)施方式。應(yīng)該進(jìn)一步理解，各范圍的端點(diǎn)不論與另一端點(diǎn)相關(guān)聯(lián)還是獨(dú)立于該端點(diǎn)，都是有意義的。還應(yīng)理解，本文公開了許多數(shù)值，每個(gè)數(shù)值也在本文中公開為數(shù)值本身以外的“約”具體值。例如，如果公開數(shù)值“10”，那么也公開了“約10”。還應(yīng)理解，當(dāng)數(shù)值公開為“小于或等于”該值，“大于或等于”該值時(shí)，也公開由技術(shù)人員適當(dāng)理解的數(shù)值之間可能的范圍。例如，如果公開數(shù)值“10”，則也公開了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。還應(yīng)理解在通篇申請(qǐng)中，提供了許多不同格式的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)代表終點(diǎn)和起點(diǎn)以及由這些數(shù)據(jù)點(diǎn)的任意組合的范圍。例如，如果公開具體數(shù)據(jù)點(diǎn)“10”和具體數(shù)據(jù)點(diǎn)“15”，應(yīng)理解，可以認(rèn)為公開了大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于“10”和“15”、以及10-15。還應(yīng)理解，還公開了兩個(gè)具體單位之間的各單位。例如，如果公開10和15，則也公開了 11，12，13和14。受體受體或類似術(shù)語是指包埋在細(xì)胞的質(zhì)膜或胞質(zhì)內(nèi)的，可以結(jié)合移動(dòng)信號(hào)(或“信號(hào)”)的蛋白分子。與受體結(jié)合的分子稱為“配體”，并可以是肽(例如神經(jīng)遞質(zhì))、激素、藥物、或毒素，當(dāng)產(chǎn)生這種結(jié)合時(shí)，受體發(fā)生的構(gòu)象變化通常啟動(dòng)細(xì)胞響應(yīng)。但是，一些配體只是阻斷受體而不誘導(dǎo)任何響應(yīng)(例如拮抗劑)。配體誘導(dǎo)的受體變化導(dǎo)致生理變化，這構(gòu)成配體的生物活性。強(qiáng)生物傳感器信號(hào)“強(qiáng)生物傳感器信號(hào)”是幅度顯著超過噪音水平或陰性對(duì)照響應(yīng)(例如3x, 10x, 20x, IOOx,或IOOOx)的生物傳感器信號(hào)。陰性對(duì)照響應(yīng)通常是添加試驗(yàn)緩沖溶液(即載劑)后細(xì)胞的生物傳感器響應(yīng)。噪音水平是不另外添加任何溶液時(shí)細(xì)胞的生物傳感器信號(hào)。值得注意的是，在添加任何溶液前，細(xì)胞總是被溶液覆蓋。強(qiáng)DMR信號(hào)“強(qiáng)DMR信號(hào)”或類似術(shù)語是指“強(qiáng)生物傳感器信號(hào)”的DMR形式。Rho-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)Rho介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)指與Rho激酶相互作用的分子或物質(zhì)的上游或下游的任何信號(hào)傳導(dǎo)。用于內(nèi)源ATP敏感性鉀(Katp)離子通道的開放劑如吡那地爾可為Rho介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的活化劑。Rho激酶抑制劑Rho激酶(ROCK)抑制劑是測(cè)定為抑制Rho激酶的任何分子或物質(zhì)，如Y-27632、ROCK激酶抑制劑III Rockout、Rho激酶抑制劑IV、H89和H8。ROCK抑制劑響應(yīng)細(xì)胞系ROCK激酶抑制劑響應(yīng)細(xì)胞系是其中通過已知ROCK抑制劑來抑制ROCK基礎(chǔ)活性，引起所述細(xì)胞中可檢測(cè)生物傳感器信號(hào)的任何細(xì)胞系。例如，A549還是ROCK抑制劑響應(yīng)細(xì)胞系。由于存在活化的K-RAS突變體，未刺激的A549含有失調(diào)的PI3K/Akt活性。ROCK是PI3K的下游靶標(biāo)。因此，已知ROCK抑制劑如Y27632或H89對(duì)ROCK基礎(chǔ)活性的抑制可弓丨起A549細(xì)胞中的強(qiáng)DMR信號(hào)。ROCK 抑制劑“ROCK抑制劑”是能抑制ROCK的任何分子。已知的ROCK抑制劑包括但不限于Y27632、H-89 和 H-8。ROCK 調(diào)節(jié)劑“ROCK調(diào)節(jié)劑”是能調(diào)節(jié)ROCK、增加或降低ROCK活性的任何分子。已知的ROCK調(diào)節(jié)劑包括但不限于Y27632、H-89和H-8。響應(yīng)響應(yīng)或類似術(shù)語是對(duì)任何刺激的任何反應(yīng)。樣品樣品或類似術(shù)語是指按本文所述進(jìn)行試驗(yàn)的動(dòng)物、植物、真菌等；天然產(chǎn)物、天然產(chǎn)物提取物等；動(dòng)物的組織或器官；細(xì)胞(在對(duì)象內(nèi)的、或直接取自對(duì)象、或在培養(yǎng)物中維持的細(xì)胞或來自培養(yǎng)細(xì)胞系的細(xì)胞);細(xì)胞裂解物(或裂解物的部分)或細(xì)胞提取物；或含有一種或多種來自細(xì)胞或細(xì)胞材料的分子(例如多肽或核酸)的溶液。樣品還可以是含有細(xì)胞或細(xì)胞組分的任何體液或分泌物(例如但不限于血液、尿液、糞便、唾液、淚液、膽汁)。包含血清的培養(yǎng)基包含血清的培養(yǎng)基或類似術(shù)語是任何包含血清(例如胎牛血清)的細(xì)胞培養(yǎng)基。胎牛血清(或牛胎兒血清)是血液凝結(jié)后剩余的血漿部分，在這過程中血漿蛋白纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白且在凝塊后殘留。通過屠宰中封閉系統(tǒng)靜脈穿刺從未出生胎牛流出的血中獲得胎牛血清。胎牛血清(FBS)是最廣泛應(yīng)用的血清，因?yàn)榭贵w含量低并且包含更多的生長(zhǎng)因子，可在很多不同應(yīng)用中有多用性。FBS用于培養(yǎng)真核細(xì)胞。血清耗盡的培養(yǎng)基血清耗盡的培養(yǎng)基是任何不包含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基。
“短時(shí)間段”短時(shí)間段或類似術(shù)語是通常為1-30分鐘的時(shí)間段。短期試驗(yàn)“短期試驗(yàn)”或類似術(shù)語用于研究給定分子對(duì)活細(xì)胞的短期影響。一種具體的短期試驗(yàn)是“短期生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)”。在一種實(shí)施方式中，每個(gè)類型的細(xì)胞僅暴露于所述分子中一段短的時(shí)間(例如，5分鐘、10分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、180分鐘、240分鐘)。這一短期試驗(yàn)常用于檢測(cè)早期細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)響應(yīng)，其可直接用于研究分子誘導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)事件或通路或研究分子對(duì)標(biāo)記誘導(dǎo)的細(xì)胞響應(yīng)的調(diào)節(jié)能力。信號(hào)傳導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)指途徑中一種分子或物質(zhì)的修飾引起途徑中另一分子或物質(zhì)的另一修飾。信號(hào)傳導(dǎo)通路“定義的通路”或類似術(shù)語是指從接收信號(hào)(例如外源配體)到細(xì)胞響應(yīng)(例如細(xì)胞靶標(biāo)表達(dá)的提高)的細(xì)胞通路。在一些情況中，配體與受體結(jié)合導(dǎo)致的受體激活與細(xì)胞對(duì)配體的響應(yīng)直接偶聯(lián)。例如，KCO吡那地爾能激活作為離子通道一部分的細(xì)胞表面受體。吡那地爾結(jié)合Katp通道打開作為所述受體一部分的鉀選擇性離子通道。Katp活化使帶負(fù)電的鉀離子移到所述細(xì)胞內(nèi)，這會(huì)促進(jìn)依賴于通道所駐留細(xì)胞的各種作用。但是，對(duì)于很多細(xì)胞表面受體，配體受體相互作用不直接與細(xì)胞響應(yīng)關(guān)聯(lián)。在配體產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞行為的最終生理效應(yīng)之前，激活的受體必須首先與細(xì)胞內(nèi)的其它蛋白質(zhì)相互作用。通常，一系列相互作用的細(xì)胞蛋白質(zhì)的作用在受體激活后發(fā)生改變。由受體激活誘導(dǎo)的整套細(xì)胞變化稱為信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)理或通路。信號(hào)傳導(dǎo)通路可以相對(duì)簡(jiǎn)單或相當(dāng)復(fù)雜。指標(biāo)相似性“指數(shù)相似性”或類似術(shù)語是表示兩種指數(shù)之間、或至少三種指數(shù)之間(一種用于一個(gè)分子)基于指數(shù)的模式、和/或分?jǐn)?shù)矩陣的相似性的術(shù)語。分?jǐn)?shù)矩陣與其對(duì)應(yīng)物密切相關(guān)，例如在相應(yīng)細(xì)胞中不同分子的初級(jí)概況的特征，和不同分子對(duì)各標(biāo)記的調(diào)節(jié)概況的本質(zhì)和百分比。例如，將更高的分?jǐn)?shù)給予更相似的特征，將較低或負(fù)的分?jǐn)?shù)給予不相似的特征。因?yàn)榉肿诱{(diào)節(jié)指數(shù)只有三種調(diào)節(jié)類型，正、負(fù)和中性，相似性矩陣相對(duì)簡(jiǎn)單。例如，簡(jiǎn)單的矩陣可以給相同的調(diào)節(jié)(例如正調(diào)節(jié))評(píng)分為+1，給不同的調(diào)節(jié)評(píng)分為-I?；蛘?，對(duì)具有不同規(guī)模的一種調(diào)節(jié)類型可以給不同的分?jǐn)?shù)。例如，10%、20%、30%、40%、50%、60%、100%、200% 等的正調(diào)節(jié)可以相應(yīng)評(píng)分為 +1、+2、+3、+4、+5、+6、+10、+20。相反，對(duì)于負(fù)調(diào)節(jié)，可以給出相似但相反的評(píng)分。穩(wěn)定在用于藥物組合物時(shí)，術(shù)語“穩(wěn)定”或類似術(shù)語一般在本領(lǐng)域理解為表示于特定保存條件下經(jīng)過給定時(shí)間段后活性成分的損失低于一定量，通常為10%。組合物被認(rèn)定為穩(wěn)定所需要的時(shí)間與各產(chǎn)品的用途有關(guān)，并由以下商業(yè)實(shí)用性所確定生產(chǎn)所述產(chǎn)品、保留產(chǎn)品用于質(zhì)量控制和檢驗(yàn)、運(yùn)送給批發(fā)商或直接到消費(fèi)者處，其中所述產(chǎn)品在其最終使用前被再次保存。包括數(shù)月時(shí)間的安全因子在內(nèi)，藥物的最短產(chǎn)品壽命一般是一年，優(yōu)選超過18個(gè)月。本文所用的術(shù)語“穩(wěn)定”參考了這些市場(chǎng)現(xiàn)實(shí)和在容易實(shí)現(xiàn)的環(huán)境條件例如2° C-8° C冷藏條件下保存與運(yùn)輸產(chǎn)品的能力。
物質(zhì)物質(zhì)或類似術(shù)語是任何物理實(shí)體。材料是物質(zhì)。分子、配體、標(biāo)記、細(xì)胞、蛋白質(zhì)和DNA可認(rèn)為是物質(zhì)。機(jī)器或制品應(yīng)視為由物質(zhì)組成，而本身不視為物質(zhì)。對(duì)象全文中使用的對(duì)象或類似術(shù)語是指?jìng)€(gè)體。因此，“對(duì)象”可以包括，例如馴養(yǎng)的動(dòng)物如貓、狗等，牲畜(例如，牛、馬、豬、綿羊、山羊等)、實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物(例如，小鼠、兔子、大鼠、豚鼠等)和哺乳動(dòng)物、非人哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、鳥、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、魚和任何其它動(dòng)物。在一個(gè)方面，對(duì)象是哺乳動(dòng)物，例如靈長(zhǎng)動(dòng)物或人。對(duì)象可以不是人。懸浮細(xì)胞“懸浮細(xì)胞”是指優(yōu)選在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞系，其中細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不附著或粘著在基底表面。但是，懸浮細(xì)胞通?？梢酝ㄟ^化學(xué)(例如共價(jià)結(jié)合、或抗體-細(xì)胞表面受體相互作用)、或物理方式(例如，由于重力作用沉降到包埋了生物傳感器的孔底部)與生物傳感器表面接觸。因此，懸浮細(xì)胞也可用于生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)。測(cè)試分子測(cè)試分子或類似術(shù)語是指在獲得該測(cè)試分子信息的方法中使用的分子。測(cè)試分子可以是未知分子或已知分子。處理處理或治療或類似術(shù)語可至少以兩種方式使用。首先，處理或治療或類似術(shù)語可以指給予或作用于對(duì)象。其次，處理或治療或類似術(shù)語可以指將任何兩種物品例如任何兩種或多種物質(zhì)如分子和細(xì)胞，混合到一起。這種混合將至少兩種物質(zhì)匯集到一起使它們之間可發(fā)生接觸。當(dāng)處理或治療或類似術(shù)語用于有疾病的對(duì)象時(shí)，并不意味治愈或甚至例如癥狀的減輕。當(dāng)術(shù)語治療性或類似術(shù)語與處理或治療或類似術(shù)語聯(lián)用時(shí)，指潛在疾病的癥狀減輕，和/或一種或多種潛在的細(xì)胞、生理、或生化病因或引起癥狀的機(jī)理減少。應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的減輕表示相對(duì)于疾病的狀態(tài)，包括疾病的分子狀態(tài)，而不僅指疾病的生理狀態(tài)。引發(fā)弓丨發(fā)或類似術(shù)語是指弓丨起或啟動(dòng)事件如響應(yīng)的行為。未知分子未知分子或類似術(shù)語是具有未知生物/藥理/生理/病理生理活性的分子。一數(shù)值就組分、成分、添加劑、細(xì)胞類型、標(biāo)記和類似方面公開的具體和優(yōu)選數(shù)值及其范圍僅用于說明，它們不排除其它定義數(shù)值或定義范圍內(nèi)的其它數(shù)值。本發(fā)明的組分、設(shè)備和方法包括具有本文所述任何數(shù)值或任何數(shù)值組合、具體數(shù)值、更具體數(shù)值和優(yōu)選數(shù)值的組分、設(shè)備和方法。因此，所公開的方法、組合物、制品、和機(jī)器可以包含或由其組成、或基本由其組成的方式聯(lián)合本文討論的不同組分、步驟、分子和組合物等。例如，它們可用于本文定義的分子(包括配體)鑒定方法；本文定義的指數(shù)生成方法；或本文定義的藥物開發(fā)方法。病毒性感染
術(shù)語“病毒性感染”或類似術(shù)語指細(xì)胞被病毒感染的狀態(tài)。這表示細(xì)胞被病毒污染的狀態(tài)。實(shí)施例實(shí)驗(yàn)程序(用于實(shí)施例1-5)試劑所有化合物購(gòu)自西格瑪-艾爾德里奇公司(Sigma-Aldrich)，除了激酶抑制劑庫和離子通道調(diào)節(jié)劑庫、紅海海綿素A,其購(gòu)自生物分子國(guó)際公司(BI0M0L International, L.P.)(賓夕法尼亞州的普利茅斯會(huì)議市)。所有的細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)買自吉布可公司(GIBCO)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)所有的細(xì)胞系購(gòu)自ATCC并按照ATCC的說明保持。細(xì)胞按照ATCC的說明每周傳代培養(yǎng)1-2次。傳代少于15的細(xì)胞用于所有實(shí)驗(yàn)。RT-PCRH印G2C3A細(xì)胞的總RNA用凱杰公司(Qiagen Inc.)的RNeasy試劑盒(貨號(hào)75144)提取自一個(gè)含有單層匯合細(xì)胞(I. 5-3千萬個(gè)細(xì)胞)的T-75燒瓶，所述總RNA提取物中可能的DNA污染物用無RNA酶的Dnase Set (貨號(hào)79254，凱杰公司)消化。用于RT-PCR的引物序列來自 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (2002) 26:135-143和FASEB J. (1999) 13:1833-1838。所有引物由西格瑪-艾爾德里奇公司合成。RT-PCR用凱杰公司的一步RT-PCR試劑盒(貨號(hào)210212)進(jìn)行。PCR條件如下50° C 30分鐘，95° C 15分鐘，然后94° C I分鐘、57° CI. 5分鐘和72° C 2分鐘進(jìn)行60輪，最后72° C延伸10分鐘。RNAi 敲減所有siRNA選自西格瑪-艾爾德里奇公司的預(yù)設(shè)計(jì)的siRNA數(shù)據(jù)庫，這是基于所預(yù)測(cè)敲減效率的排列順序。siRNA ID是用于SURl(Refseq ID:NM_000352)的SASI_Hs01_00092347、SASI_Hs01_00092348 和 SASI_Hs01_00092349;用于 SUR2 (RefseqID:NM_005691)的 SASI_Hs01_00061301、SASI_Hs01_00061302 和 SASI_Hs01_00061303;用于 Kir6. I(Refseq ID:NM004982)和 SASI_Hs01_00113357、SASI_Hs01_00113358 和SASI_Hs01_00113359;用于 Kir6. 2 (Refseq ID:NM000525)的 SASI_Hs01_00220256、SASI_Hs01_00220257 和 SASI_Hs01_00220258。用于 ROCKl(RefseqID:NM_005406)的 SASI_Hs01_00065573、SASI_Hs01_0006557U SASI_Hs01_00065570。用于 R0CK2 (RefseqID:NM004850)的 SASI_Hs01_00204253、 SASI_Hs01_00204252、 SASI_Hs01_00204251。 用于 JAKl(ReqID:Ml_002227)的 SASI_Hs01_00174614、 SASI_Hs01_00174613。 用于 JAK2(ReqID:NM_004972)的 SASI_Hs02_00338675、SASI_Hs01_00041547。 用于JAK3 (ReqID:NM_000215)的 SASI_Hs01_00118128、SASI_Hs02_00302103。siRNA的轉(zhuǎn)染用西格瑪-艾爾德里奇公司的N-TER納米顆粒siRNA轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(貨號(hào)N2913)按照生產(chǎn)商說明進(jìn)行。簡(jiǎn)單的說，將5000個(gè)細(xì)胞接種于Epic 384-孔板的各孔。細(xì)胞在第二天用50nM siRNA轉(zhuǎn)染并在含培養(yǎng)基的siRNA中孵育24小時(shí)，然后用新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基替代。Epic細(xì)胞試驗(yàn)在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行。對(duì)于western印跡實(shí)驗(yàn)，C3A細(xì)胞以3x105/孔接種于6孔組織培養(yǎng)基處理的板上。細(xì)胞接種后用ROCKl或R0CK2siRNA(等級(jí)I)以50nM終濃度轉(zhuǎn)染20小時(shí)。移除含培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染試劑并在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)用新鮮培養(yǎng)基替代。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)裂解以用于western 印跡。免疫沉淀和Western印跡對(duì)于ROCKl和R0CK2Western印跡，120 U I各樣品的細(xì)胞裂解物與40 U 14xSDS樣品緩沖液混合，然后100° C沸騰5分鐘。蛋白在10%SDS凝膠上分離，15iU各樣品上樣于所述凝膠。膜用兔抗R0CKl(sc-5560)或兔抗R0CK2 (sc-5561)或羊抗肌動(dòng)蛋白(sc-1616)(1:500稀釋)印跡I小時(shí)，然后與偶聯(lián)羊抗兔或馬抗羊抗體的第2HRP孵育(1:2000稀釋)15分鐘。對(duì)于Kir6. 2，I億C3A細(xì)胞在I % NP40裂解液中裂解，用偶聯(lián)蛋白A瓊脂糖(西格瑪公司(Sigma) ,P3391)的羊抗Kir6. 2 (sc-11228，G16)免疫沉淀。蛋白在10%SDS凝膠上分離，30 ill全細(xì)胞裂解物或線粒體裂解物上樣于所述凝膠。膜用羊抗Kir6. 2(sc-11228，1:200)印跡I小時(shí)，然后用偶聯(lián)羊抗兔或馬抗羊抗體的第2HRP孵育(I :2000稀釋)30分鐘。用英杰公司(Invitrogen，貨號(hào)KHM3031)針對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體分離試劑盒從I億C3A細(xì)胞中分離C3A線粒體。人肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞人主要肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞購(gòu)自XenoTech (H1500. H15A+Lot No. 770)。解凍細(xì)胞并按照生產(chǎn)商說明用Xenotech肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分離試劑盒(貨號(hào)K2000)進(jìn)行純化。用含10%FBS的無半乳糖MFE平板培養(yǎng)基(康寧公司(Corning Inc.))在第I天將細(xì)胞(50，000/孔)接種于膠原I包被的96-孔板(BD生物科學(xué)公司(BD Bioscience)，貨號(hào)354407)。第2天將培養(yǎng)基變?yōu)楹?0%FBS和0. 25mg/ml基質(zhì)膠(Matrigel) (BD生物科學(xué)公司，貨號(hào)356234)的MFE維持培養(yǎng)基。從第I天-第8天，細(xì)胞用5%C02在37° C孵育。從第5天開始，細(xì)胞用IOuM利福平(貨號(hào)R3501，西格瑪-艾爾德里奇公司)處理用于CYP3A4誘導(dǎo)，或50 y M奧美拉唑(貨號(hào)0104，西格瑪-艾爾德里奇公司)處理用于CYP1A2誘導(dǎo)，或等體積DMSO處理72小時(shí)。第 8 天，CYP3A4 和 CYP1A2 試驗(yàn)用 P450-Glo CYP3A4 試驗(yàn)試劑盒或 P450-Glo CYP1A2試驗(yàn)試劑盒(貨號(hào)V8902和V8772，普洛麥格(Promega))進(jìn)行。細(xì)胞數(shù)量用CytoTox 96 非放射性細(xì)胞毒性試驗(yàn)(貨號(hào)G1780，普洛麥格)標(biāo)準(zhǔn)化。PCR-陣列人肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞如上所述培養(yǎng)。第5天，收獲細(xì)胞并用具有柱上DNA酶消化(貨號(hào)79254)的凱杰RNeasy小試劑盒(貨號(hào)74104)提取總RNA。各樣品的RNA濃度用Quant-iT RiboGreen RNA試驗(yàn)試劑盒(英杰公司(Invitrogen),貨號(hào)R11490)定量并在PCR陣列實(shí)驗(yàn)前存于-80° C。陣列板(人類癌癥藥物抗性和代謝PCR陣列，貨號(hào)PAHS-004，馬里蘭州福德里克的SA生物科學(xué)公司(SABioscience))按照SA生物科學(xué)公司手冊(cè)(部分號(hào)1022A)制備。每96孔陣列板使用IugS RNA，各總RNA樣品測(cè)試雙份。所述PCR陣列用軟件SDS2. 3在具有96孔標(biāo)準(zhǔn)塊的ABI-7900HT上進(jìn)行。如用戶手冊(cè)中所示設(shè)置PCR條件(部分號(hào)1022A)。用SA生物科學(xué)公司在線分析工具分析數(shù)據(jù)。光生物傳感器系統(tǒng)和細(xì)胞試驗(yàn)使用Epic 波長(zhǎng)解調(diào)系統(tǒng)(紐約州康寧的康寧公司)進(jìn)行全細(xì)胞感測(cè)。該系統(tǒng)由溫度控制單元、光學(xué)檢測(cè)單元、和用機(jī)器人的機(jī)載液體操作單元組成。所述檢測(cè)單元以集成光纖為核心，能以約15秒的時(shí)間間隔對(duì)細(xì)胞響應(yīng)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量。所述化合物溶液通過使用機(jī)載液體操作單元(即移液(pippetting))引入。RffG生物傳感器能檢測(cè)傳感器表面附近的局部折射率的微小變化。由于細(xì)胞內(nèi)局部折射率隨密度及其生物質(zhì)(例如，蛋白質(zhì)，分子復(fù)合物)分布而變化，生物傳感器利用其漸消波非侵入性地檢測(cè)天然細(xì)胞內(nèi)配體誘導(dǎo)的動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布。漸消波延伸入細(xì)胞并隨距離呈指數(shù)衰減，產(chǎn)生約150納米的特征感測(cè)容量，提示任何通過受體激活介導(dǎo)的光響應(yīng)僅代表進(jìn)行漸消波取樣的細(xì)胞部分的平均值。受體激活下游許多細(xì)胞事件的集合確定配體誘導(dǎo)DMR的動(dòng)力學(xué)和幅度。對(duì)于生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn),通過用HBSS (Ix漢克斯平衡鹽溶液(Hanks balancedsalt solution)，添加20mM Hepes, pH 7. I)稀釋保存的濃縮溶液制得化合物溶液，并轉(zhuǎn)移到384孔聚丙烯化合物保藏板以準(zhǔn)備化合物源板。當(dāng)進(jìn)行兩步試驗(yàn)時(shí)，分別制備兩種化合物的源板。平行地，細(xì)胞用HBSS清洗兩次并保持在30 ill HBSS中以準(zhǔn)備細(xì)胞試驗(yàn)板。然后將細(xì)胞試驗(yàn)板和所述化合物源板在讀板系統(tǒng)的廂內(nèi)孵育。孵育后，記錄細(xì)胞試驗(yàn)微孔板中所有生物傳感器的基線波長(zhǎng)并標(biāo)準(zhǔn)化到O。然后，進(jìn)行2-10分鐘連續(xù)記錄以確立基線，并確保細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)態(tài)。隨后，通過用機(jī)載液體處理器將IOiU所述化合物溶液移入細(xì)胞試驗(yàn)板來引發(fā)細(xì)胞響應(yīng)。所有研究在受控溫度(28° C)下進(jìn)行。進(jìn)行至少兩組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，各組至少有三個(gè)重復(fù)樣。發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)的變異系數(shù)為〈10%。實(shí)施例I :肝細(xì)胞中存在線粒體Katp通道Katp通道作為連接細(xì)胞代謝水平和細(xì)胞膜興奮性的分子感應(yīng)器。Katp通道通過與胞內(nèi)MgADP相互作用激活并通過高水平的ATP來抑制。已在細(xì)胞質(zhì)膜線、粒體內(nèi)膜和核被膜中發(fā)現(xiàn)Katp通道。為了證實(shí)肝細(xì)胞系H印G2C3A中Katp通道的表達(dá)并測(cè)定特異Katp通道亞基，用對(duì)Kir6. l、Kir6. 2、SUR1、SUR2A和SUR2B特異的引物與來自H印G2C3A細(xì)胞的分離總RNA 進(jìn)行 RT-PCR0 如圖 I 所示，Kir6. I、Kir6. 2、SUR2A 和 SUR2B 在 H印G2C3A 細(xì)胞中表達(dá)，但SURl亞基沒有。 全細(xì)胞膜片鉗記錄未能在H印G2C3A細(xì)胞中檢測(cè)到任何K+選擇性電流，表明Katp通道可能在所述細(xì)胞質(zhì)膜中不存在。已報(bào)道了大鼠肝細(xì)胞中的線粒體Katp通道。從H印G2C3A細(xì)胞分離線粒體，然后進(jìn)行western印跡，表明全細(xì)胞裂解物和線粒體裂解物中存在Kir6. 2 (圖 2)。實(shí)施例2 :無標(biāo)記細(xì)胞試驗(yàn)檢測(cè)肝細(xì)胞中的Katp通道無標(biāo)記RWG生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)測(cè)量給定細(xì)胞群體中化合物誘導(dǎo)的質(zhì)量再分布。獲得的信號(hào)可為多重細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)事件之和。然而，Katp通道是內(nèi)向整流K+通道，其可通過生理?xiàng)l件下的細(xì)胞內(nèi)MgADP和特異KCO而被活化。通道組合物特異性KCO的可用性和無標(biāo)記RWG生物傳感器的敏感性使直接監(jiān)控Katp通道活化和后續(xù)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)事件成為可能。為了證明肝細(xì)胞中無標(biāo)記mito-KATP通道試驗(yàn)的可行性和特異性，我們先檢測(cè)了Kir6. 2/SUR2特異性KCO吡那地爾(圖3A)誘導(dǎo)的H印G2C3A細(xì)胞的劑量依賴性響應(yīng)。圖3B顯示吡那地爾誘導(dǎo)的DMR信號(hào)的幅度和動(dòng)力學(xué)是濃度依賴性。由于吡那地爾活化的mito-KATP通道是內(nèi)源表達(dá)的，我們推測(cè)任何特異Katp通道亞基的敲減可引起吡那地爾誘導(dǎo)的DMR信號(hào)降低。如圖4所示，用SURl特異siRNA轉(zhuǎn)染的H印G2C3A細(xì)胞對(duì)吡那地爾誘導(dǎo)的DMR信號(hào)沒有影響，而用SUR2特異siRNA的轉(zhuǎn)染引起吡那地爾誘導(dǎo)的DMR信號(hào)降低。類似地，圖5顯示Kir6. I特異siRNA對(duì)吡那地爾誘導(dǎo)的DMR信號(hào)沒有影響，而用Kir6. 2特異siRNA的轉(zhuǎn)染相比對(duì)照顯著降低DMR信號(hào)。Katp通道可被常見磺酰脲藥物阻斷，如甲磺氮卓脲、甲苯磺丁脲、格列甲嗪等。圖6顯示H印G2C3A細(xì)胞中吡那地爾誘導(dǎo)的DMR信號(hào)可被這些磺酰脲組劑量依賴性抑制。應(yīng)注意，報(bào)道為選擇性抑制含Katp通道Kir6. I的非磺酰脲阻斷劑U-37883A對(duì)吡那地爾誘導(dǎo)的DMR信號(hào)沒有影響。這些實(shí)驗(yàn)共同證明了無標(biāo)記細(xì)胞試驗(yàn)可檢測(cè)肝細(xì)胞中線粒體Katp通道的活化且起作用的線粒體Katp通道的分子組合物可能為Kir6. 2和SUR2。實(shí)施例3 :肝細(xì)胞中mito-KATP信號(hào)傳導(dǎo)與ROCK活性有關(guān)Rho激酶(R0CK1和R0CK2)在小GTP酶rhoA起始的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中有重要作用。已知Rho激酶參與各種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞骨架組織、細(xì)胞增殖和凋亡。如圖7所示，與ROCK抑制劑Y-27632預(yù)孵育會(huì)劑量依賴性降低吡那地爾誘導(dǎo)的DMR信號(hào)。ROCKl或R0CK2特異siRNA的轉(zhuǎn)染顯著降低吡那地爾誘導(dǎo)的DMR信號(hào)(圖8A和8B)。用ROCKl和R0CK2特異抗體的western印跡證實(shí)H印G2C3A細(xì)胞中ROCKl和R0CK2蛋白水平的敲減(圖8C和8D)。與兩種不同肌動(dòng)蛋白絲破壞試劑松胞菌素B或紅海海綿素A預(yù)孵育也可劑量依賴性降低H印G2C3A細(xì)胞中吡那地爾誘導(dǎo)的DMR信號(hào)。這些結(jié)果表明肝細(xì)胞中mito-KATP通道起始的信號(hào)傳導(dǎo)與ROCK活性有關(guān)。實(shí)施例4 :肝臟中mito-KATP信號(hào)傳導(dǎo)與JAK活性有關(guān)Janus激酶(JAK1，2，3)是參與細(xì)胞因子所介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白酪氨酸激酶；其對(duì)包括細(xì)胞存活、增殖、分化和凋亡在內(nèi)的各種細(xì)胞功能至關(guān)重要。圖10顯示與JAK抑制劑AG490預(yù)孵育會(huì)劑量依賴性降低H印G2C3A細(xì)胞中吡那地爾誘導(dǎo)的DMR信號(hào)。如圖11所示，轉(zhuǎn)染JAKl特異siRNA對(duì)吡那地爾誘導(dǎo)的DMR信號(hào)沒有影響，而JAK2或JAK3特異siRNA顯著削弱吡那地爾誘導(dǎo)的DMR信號(hào)。這些結(jié)果表明mito-KATP通路信號(hào)傳導(dǎo)的激活與JAK活性有關(guān)，尤其是JAK2和JAK3。實(shí)施例5 mito-KATP調(diào)節(jié)劑抑制利福平對(duì)CYP3A4活性的誘導(dǎo)利福平是源自利福霉素形式的半合成抗生素，其干擾RNA合成并用于治療細(xì)菌和病毒性疾病。利福平通常用于治療分支桿菌感染，包括結(jié)核病和麻瘋??；且還在與梭鏈孢酸組合治療新青霉素抗性的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)中有作用。其用于針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)(腦膜炎球菌)感染的預(yù)防治療。利福平通過結(jié)合其P亞基，從而阻止信使RNA (mRNA)轉(zhuǎn)錄和后續(xù)翻譯為蛋白來抑制細(xì)菌細(xì)胞中DNA-依賴的RNA聚合酶。其親脂特性使其成為治療腦膜炎形式結(jié)核病的良好候選物，這需要分布到中樞神經(jīng)系統(tǒng)并穿過血腦屏障。然而，利福平表現(xiàn)出主要涉及藥物的肝毒性的副作用，接受利福平的患者通常需要經(jīng)受肝功能測(cè)試，包括天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。利福平是肝細(xì)胞色素P450酶(如CYP2D6和CYP3A4)的潛在誘導(dǎo)劑且會(huì)增加許多藥物的代謝，所述藥物被肝臟通過該酶系統(tǒng)清除。這導(dǎo)致神經(jīng)藥物相互作用如降低激素避孕的效力。例如，利福平能增加包括腎上腺激素、甲狀腺激素和維生素D在內(nèi)的內(nèi)源底物的代謝。使用膠原I基質(zhì)膠夾心條件下培養(yǎng)的人初級(jí)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，研究mito_KATP調(diào)節(jié)劑以及利福平對(duì)CYP酶活性的影響。如圖12A所示，吡那地爾劑量依賴性引起CYP3A4的誘導(dǎo)，最大誘導(dǎo)約2倍。如所預(yù)期，利福平引起3倍的CYP3A4誘導(dǎo)。然而，吡那地爾還劑量依賴性抑制所述利福平誘導(dǎo)(圖12B)。對(duì)mito-KATP阻斷劑格列甲嗪也觀察到相似結(jié)果(圖12C和圖12D)。另一方面，吡那地爾和格列甲嗪對(duì)CYP1A2活性影響都很小?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明mito-KATP調(diào)節(jié)劑可抑制肝毒素利福平的CYP3A4酶誘導(dǎo)活性，表明mito_KATP離子通道可針對(duì)肝毒素誘導(dǎo)的損傷具有保護(hù)性。參考文獻(xiàn)I. Fang, Y.，F(xiàn)errie, A. M.，F(xiàn)ontaine, N. H.，Mauro, J.，and Balakrishnan，J.(2006) Biophys. J. 91，1925-1940.2. Fang, Y.，F(xiàn)errie，A. M.，F(xiàn)ontaine, N. H.，和 Yuen，P. K. (2005) Anal.Chem. 77:5720-5725.3. Fang, Y. (2006) Assays and Drug development Technologies. 4:583-595.4. W02006108183A2Fang, Y.，F(xiàn)errie, A. M.，F(xiàn)ontaine, N. M.，Yuen, P. K.和Lahiri, J. “Optical biosensors and cells (光學(xué)傳感器和細(xì)胞)”
權(quán)利要求
1.一種測(cè)試分子的方法，所述方法包含步驟 a.在生物傳感器表面培養(yǎng)Katp細(xì)胞系，其中所述生物傳感器表面用于無標(biāo)記生物傳感器分析， b.用所述分子孵育所述細(xì)胞系，產(chǎn)生分子處理的細(xì)胞系， c.用無標(biāo)記生物傳感器分析所述分子處理的細(xì)胞系，產(chǎn)生分子數(shù)據(jù)輸出， d.比較所述分子數(shù)據(jù)輸出和相同細(xì)胞系中已知的Katp調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)輸出，生成分子-Katp調(diào)節(jié)劑比較。
2.一種測(cè)試分子的方法，所述方法包含步驟 a.在生物傳感器表面培養(yǎng)Katp細(xì)胞系，其中所述生物傳感器表面用于無標(biāo)記生物傳感器分析， b.用標(biāo)記物和所述分子孵育所述細(xì)胞系,產(chǎn)生孵育細(xì)胞系， c.用無標(biāo)記生物傳感器分析所述孵育細(xì)胞系，產(chǎn)生標(biāo)記物-分子數(shù)據(jù)輸出， d.比較所述標(biāo)記物-分子數(shù)據(jù)輸出和相同細(xì)胞系中的標(biāo)記物-Katp調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)輸出，生成標(biāo)記物-分子/標(biāo)記物-Katp調(diào)節(jié)劑比較。
3.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述Katp細(xì)胞系包括線粒體ATP-敏感性鉀離子通道(mito-KATP)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞系包括肝細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述肝細(xì)胞包括肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述肝細(xì)胞感染有肝炎病毒。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述肝炎病毒是甲肝、乙肝、丙肝、丁肝或戊肝、單純皰疫病毒、細(xì)胞巨化病毒、EB病毒、黃熱病毒和腺病毒。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞獲自感染非病毒性感染的來源。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述非病毒性感染包括弓形蟲、鉤端螺旋體、Q熱和落磯山斑疹熱。
10.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞獲自被化學(xué)品、毒素或藥物影響的來源。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)品或毒素包括酒精、撲熱息痛、阿 莫西林、抗結(jié)核藥物、米諾環(huán)素、甲基多巴、呋喃妥因、異煙肼或酮康唑。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述已知的Katp調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)輸出如下產(chǎn)生孵育所述Katp調(diào)節(jié)劑和培養(yǎng)的Katp細(xì)胞系并用無標(biāo)記生物傳感器分析所述孵育細(xì)胞系，產(chǎn)生Katp調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)輸出。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括當(dāng)所述比較表明所述分子數(shù)據(jù)輸出和所述Katp調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)輸出相似時(shí)鑒定可能的Katp調(diào)節(jié)劑。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述Katp細(xì)胞系選自HepG2或H印G2C3A細(xì)胞系。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述已知的Katp調(diào)節(jié)劑包含鉀通道開放劑(KCO)。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述KCO包含二氮嗪、吡那地爾、克羅卡林、尼可地爾。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述Katp調(diào)節(jié)劑包括Katp抑制劑。
18.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述Katp抑制劑包括磺酰脲或U-37883A。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述磺酰脲包括甲苯磺丁脲、甲磺氮卓脲或格列甲嗪。
20.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記物-Katp調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)輸出如下產(chǎn)生孵育所述標(biāo)記物和Katp調(diào)節(jié)劑與培養(yǎng)的Katp細(xì)胞系并用無標(biāo)記生物傳感器分析所述孵育細(xì)胞系，產(chǎn)生標(biāo)記物-Katp調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)輸出。
21.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括當(dāng)所述比較表明所述標(biāo)記物-分子數(shù)據(jù)輸出和所述Katp調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)輸出相似時(shí)鑒定可能的Katp調(diào)節(jié)劑。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記物包括ROCKl抑制劑或R0CK2抑制劑。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述ROCKl抑制劑或R0CK2抑制劑包括Y27632、H-89、H-8。
24.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記物包括JAK調(diào)節(jié)劑。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述JAK調(diào)節(jié)劑包括JAK抑制劑。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述JAK抑制劑包括AG490。
27.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記物包括細(xì)胞色素P450酶調(diào)節(jié)劑。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞色素P450酶調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞色素P450活化劑。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞色素P450酶包括CYP2D6或CYP3A4。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞色素P450活化劑包括利福平。
31.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括就ROCK途徑活性測(cè)試分子。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述測(cè)試步驟包括， a.在生物傳感器表面培養(yǎng)ROCK抑制劑響應(yīng)細(xì)胞系，其中所述生物傳感器表面用于無標(biāo)記生物傳感器分析， b.用所述分子孵育所述細(xì)胞系,產(chǎn)生孵育細(xì)胞系， c.用無標(biāo)記生物傳感器分析所述孵育細(xì)胞系，產(chǎn)生分子數(shù)據(jù)輸出， d.比較所述分子數(shù)據(jù)輸出和相同細(xì)胞中已知的ROCK抑制劑數(shù)據(jù)輸出，生成分子-ROCK抑制劑比較。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述ROCK抑制劑響應(yīng)細(xì)胞系包括其中通過已知ROCK抑制劑對(duì)ROCK基礎(chǔ)活性抑制而產(chǎn)生穩(wěn)健生物傳感器信號(hào)的細(xì)胞系。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞系選自A431、A549或HT29。
35.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法用至少2種標(biāo)記物獨(dú)立進(jìn)行。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記物以至少EC70、EC80、EC90、EC95和EClOO的濃度添加。
37.一種測(cè)試分子的方法，所述方法包含步驟 a.在生物傳感器表面培養(yǎng)四種不同細(xì)胞系，其中所述表面用于無標(biāo)記生物傳感器分析，其中所述四種細(xì)胞系為A431、A549、HT29和H印G2， b.用所述分子孵育各細(xì)胞系，產(chǎn)生四種孵育細(xì)胞系， c.用無標(biāo)記生物傳感器分析各孵育細(xì)胞系，產(chǎn)生各孵育細(xì)胞系的分子數(shù)據(jù)輸出， d.比較所述分子數(shù)據(jù)輸出和相同細(xì)胞系中的ROCK抑制劑數(shù)據(jù)輸出，生成各細(xì)胞系的分子-ROCK抑制劑比較。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述ROCK抑制劑數(shù)據(jù)輸出如下產(chǎn)生孵育所述ROCK抑制劑和各細(xì)胞系并用無標(biāo)記生物傳感器分析各孵育細(xì)胞系，產(chǎn)生各細(xì)胞系的ROCK抑制劑數(shù)據(jù)輸出。
39.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述方法還包括產(chǎn)生Katp調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)輸出，和產(chǎn)生各細(xì)胞系的分子-Katp抑制劑比較。
40.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包含進(jìn)行其他離子通道試驗(yàn)的步驟。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述其他離子通道試驗(yàn)包括常規(guī)或自動(dòng)膜片鉗。
42.一種治療對(duì)象的方法，所述方法包括給予所述對(duì)象mito-KATP調(diào)節(jié)劑，其中所述對(duì)象需要治療肝病。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于，所述肝病涉及所述mito-KATP下游的JAK或Rho激酶信號(hào)傳導(dǎo)。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述mito-KATP通道是Kir6.2和SUR2通道。
45.一種降低對(duì)象肝毒性的方法，所述方法包括給予所述對(duì)象KC0，從而所述KCO能降低給予所述對(duì)象的藥物的肝毒性。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述KCO是吡那地爾。
全文摘要
公開涉及調(diào)控KATP通道的組合物和方法以及通過調(diào)控KATP和mito-KATP通道治療肝臟紊亂的方法。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102985820SQ201180026686
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2011年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月30日
發(fā)明者Y·方, J·拉希瑞, 孫海燕, Y·衛(wèi) 申請(qǐng)人:康寧股份有限公司