專利名稱：使用血液中的循環(huán)黑素瘤細(xì)胞為黑素瘤患者預(yù)測臨床結(jié)果的方法
使用血液中的循環(huán)黑素瘤細(xì)胞為黑素瘤患者預(yù)測臨床結(jié)果的方法
背景技術(shù)：
晚期黑素瘤的治療因其異質(zhì)性組織病理學(xué)和在腫瘤進(jìn)展期間積累的構(gòu)成變化而復(fù)雜化。對(duì)具有轉(zhuǎn)移性乳癌或結(jié)腸直腸癌的患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和表征已顯示可提供在臨床上重要且能夠用于監(jiān)測患者管理的獨(dú)立的預(yù)后和預(yù)測信息。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)已顯示是原發(fā)癌、可能治愈的疾病階段以及持續(xù)為大多數(shù)惡性腫瘤的主要死亡原因的轉(zhuǎn)移性疾病之間的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。臨床研究已表明，CTC是轉(zhuǎn)移性乳癌的作用很強(qiáng)后和預(yù)測性生物標(biāo)記，并且據(jù)報(bào)道在前列腺癌和結(jié)直腸癌領(lǐng)域已有類似發(fā)現(xiàn)。這些數(shù)據(jù)顯示，CTC代表了驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)移性癌的基礎(chǔ)生物學(xué)，并且表明對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)一步的細(xì)胞和分子分析能夠揭示對(duì)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控和對(duì)治療的響應(yīng)的新認(rèn)識(shí)。捕獲、計(jì)數(shù)和表征CTC的方法已進(jìn)行修飾以捕獲、計(jì)數(shù)和表征患者的血液中的 循環(huán)黑素瘤細(xì)胞(CMC)。參見于2008年10月20日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?2/254188，Automated Enumeration and Characterization of Circulating Melanoma Cells inBlood。本申請(qǐng)?jiān)诖艘砸梅绞讲⑷?。盡管CMC通過這種方法被捕獲、計(jì)數(shù)和表征，但關(guān)于具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的患者的短期生存的預(yù)測價(jià)值是未知的。本發(fā)明為具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的患者提供預(yù)測總體生存的方法。


圖1 :從全血中回收已知數(shù)目的摻料的SK-Mel 28細(xì)胞。將SK_Mel28細(xì)胞摻料到健康供體樣品內(nèi)(即，在2天中的每一天，將0、5、18、72、280和1183細(xì)胞摻料到來自五個(gè)健康供體的7. 5mL血液內(nèi)，在每種細(xì)胞水平具有總共5個(gè)不同樣品。摻料的細(xì)胞的數(shù)目與觀察到的回收的細(xì)胞的數(shù)目比較進(jìn)行標(biāo)繪。圖2 :行A-E代表通過CellTracks Analyzer丨丨1!軟件鑒定為在來自黑素瘤患者的樣品中具有DAPI和PE信號(hào)的物體。從右到左，索引圖像代表Ki67FITC信號(hào)、⑶45和/或CD34APC信號(hào)、DAPI信號(hào)、HMW-MAA PE信號(hào)、以及DAPI (紫色)和HMW-MAA (綠色)信號(hào)的重疊。行A中的細(xì)胞排除作為黑素瘤細(xì)胞，因?yàn)樗磉_(dá)⑶45和/或⑶34,行B和行C中的細(xì)胞分類為不表達(dá)Ki67的黑素瘤細(xì)胞，并且行D和行E中的細(xì)胞分類為的確表達(dá)Ki67的黑素瘤細(xì)胞。圖3 :來自從黑素瘤患者的7. 5mL血液獲得的CellTracks Analyzer II 的典型CMC圖像的圖庫。圖4 :來自44個(gè)轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者的79個(gè)樣品在55個(gè)健康供體的7. 5mL血液中的CMC的流行程度，小圖A，以及在來自16個(gè)黑素瘤患者的19個(gè)樣品中表達(dá)Ki67的CMC的百分比，小圖B。圖5 :對(duì)于具有< 2個(gè)循環(huán)黑素瘤細(xì)胞/7. 5ml全血的那些和在7. 5ml全血中具有> 2個(gè)循環(huán)黑素瘤細(xì)胞的組中那些，在具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的患者中的總體生存的卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)概率評(píng)估。OS時(shí)間從每次血液抽取時(shí)開始計(jì)算。生存中值對(duì)于具有< 2個(gè)CMC的組的12.1個(gè)月與對(duì)于具有彡2個(gè)CMC的人的2. O個(gè)月比較(通過時(shí)序檢驗(yàn)P = O. OOl ;在具有彡2個(gè)細(xì)胞/7. 5ml的患者中的死亡風(fēng)險(xiǎn)比，3. 2)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明包括預(yù)測具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的患者的總體生存的方法，包括a)從具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的患者獲得7. 5ml血樣，所述樣品包含懷疑含有循環(huán)黑素瘤細(xì)胞的混合細(xì)胞群；b)富集所述樣品的級(jí)分，所述級(jí)分包含所述循環(huán)黑素瘤細(xì)胞；c)確認(rèn)所述稀有細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性為未受損的；d)分析所述未受損的稀有細(xì)胞；其中所述分析關(guān)聯(lián)疾病進(jìn)展；
e)評(píng)估所述血樣中的循環(huán)黑素瘤細(xì)胞的數(shù)目其中如果所述數(shù)目大于或等于2，預(yù)測所述患者的總體生存為低，并且其中如果所述循環(huán)黑素瘤細(xì)胞的數(shù)目小于2，預(yù)測所述患者的總體生存為高。在此所用的術(shù)語“富集”是指從步驟(a)的血樣中分離CMC。富集方法包括但不限于使用偶聯(lián)至磁性顆粒的抗⑶146。優(yōu)選的方法是使用偶聯(lián)至磁珠的針對(duì)存在于黑素瘤細(xì)胞上的抗原的抗體以捕獲來自血樣的細(xì)胞。術(shù)語“確認(rèn)”是指確定分離的細(xì)胞是CMC還是其它細(xì)胞組分。確認(rèn)方法包括但不限于使用核酸染料或?qū)τ诤谒亓黾?xì)胞特異性的單克隆抗體。優(yōu)選的確認(rèn)方法是用不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體(并且優(yōu)選的抗體是CD45 &CD34，以排除白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)和高分子量黑素瘤相關(guān)抗原HMW-MAA染色CMC以鑒定黑素瘤細(xì)胞。術(shù)語“分析”是指評(píng)估捕獲的CMC以確定CMC是否表達(dá)多種黑素瘤特異性標(biāo)記，例如HMW-MAA、MART-1 (由T細(xì)胞識(shí)別的黑素瘤抗原)和其它標(biāo)記例如Ki_67。優(yōu)選的分析方法是指確定CMC是否表達(dá)K1-67和/或HMW-MAA。術(shù)語“評(píng)估”是指確定在樣品中有多少CMC，并且使用包括但不限于自動(dòng)化圖像分析的方法。優(yōu)選的評(píng)估方法使用CellTracks Analyzer II 。本發(fā)明通過下列方法和實(shí)施例加以證實(shí)。這些實(shí)施例和方法并不旨在限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例提供下列方法以有利于本發(fā)明的實(shí)踐?；颊吆脱菏占?。將血液從健康志愿者和具有惡性黑素瘤的患者中抽取到抽成真空的IOmL血液CellSave保存血液抽取管內(nèi)(新澤西州拉里坦的維里德克斯有限責(zé)任公司(Veridex LLC, Raritan, NJ))，并且在 72 小時(shí)內(nèi)加工?；颊呔鶑呐＝虼髮W(xué)醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)系(Department of Medical Oncology of theUniversity of Oxford)在邱吉爾醫(yī)院(Churchill Hospital)加入,其使用研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的方案。所有患者均提供書面知情同意書。44個(gè)患者加入，25個(gè)男性和19個(gè)女性，并且他們的年齡范圍為31-81歲(平均59歲)。在第一次血液抽取時(shí)，39/44個(gè)(86% )具有轉(zhuǎn)移性疾病，并且5個(gè)患者具有未切除的III期疾病。具有轉(zhuǎn)移性疾病的38/44個(gè)(78% )患者具有內(nèi)臟病，5/44個(gè)(11% )無內(nèi)臟牽涉，并且對(duì)于I個(gè)患者，未記錄轉(zhuǎn)移部位。隨訪持續(xù)時(shí)間中值是10.1個(gè)月。在靜脈內(nèi)療法施用前或最低限度7天后，始終從癌癥患者中抽取血液。55個(gè)健康志愿者包括作為對(duì)照，并且在抽取時(shí)無已知疾病或發(fā)熱，并且無惡性疾病史。細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞摻料。將黑素瘤細(xì)胞系SK_Mel28在包含補(bǔ)充有10%胎牛血清的RPMI 1640的燒瓶中培養(yǎng)，并且隨后無需胰蛋白酶化收獲。細(xì)胞懸液僅在如通過臺(tái)盼藍(lán)排除評(píng)估的其活力超過90%時(shí)使用。為了確定實(shí)際細(xì)胞的數(shù)目，將200μ L緩沖液和包含總共約20，000粒珠的20 μ L熒光珠(佛羅里達(dá)州邁阿密的貝克曼庫爾特有限公司(Beckman-Coulter, Inc.，Miami, FL))加入 SK-Me128 細(xì)胞的 50 μ L 等分試樣中。將SK-Me 128細(xì)胞用偶聯(lián)至PE的抗HMW-MAA染色用于檢測。僅包含珠的一式兩份管在流式細(xì)胞儀(FACSCalibur ;加利福尼亞州的圣約瑟的 BD Biosciences (BD Biosciences, San Jose,CA))上運(yùn)行，直至抽吸100%的樣品。這提供了存在于20yL中的珠的數(shù)目的準(zhǔn)確評(píng)估量。實(shí)驗(yàn)管隨后一式三份地在流式細(xì)胞儀上測試，直至在每個(gè)管中計(jì)數(shù)10，000粒珠。使用已知數(shù)目的珠/單位體積確定SK-Mel28細(xì)胞的數(shù)目。樣品制備將7. 5mL血液轉(zhuǎn)移至15mL CellTracksl!' AutoPrep1!'樣品管，并且與
6.5mL緩沖液混合，以SOOg離心10分鐘，并且隨d J CellTracksAutoprep (維里德
克斯有限責(zé)任公司(Veridex LLC))上用于自動(dòng)化樣品制備。將試劑最佳化用于黑素瘤細(xì)胞的捕獲和檢測，并且所述試劑由下列組成用免疫磁性富集黑素瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的CD146抗體包被的鐵磁流體，使捕獲效率達(dá)到最大的捕獲增強(qiáng)試劑，與高分子量黑素瘤相關(guān)抗原(HMW-MAA)(克隆9. 2. 27，維里德克斯有限責(zé)任公司(Veridex LLC))結(jié)合以鑒定黑素瘤細(xì)胞的藻紅蛋白偶聯(lián)的抗體，鑒定白細(xì)胞(CD45，克隆HI30，維里德克斯有限責(zé)任公司(Veridex LLC))和內(nèi)皮細(xì)胞(CD34，克隆581，BD Biosciences)的兩種別藻藍(lán)蛋白偶聯(lián)的抗體的混合物，鑒定K1-67蛋白質(zhì)(克隆B56,加利福尼亞州的圣約瑟的BD Biosciences (BDBiosciences, San Jose, CA))的FITC偶聯(lián)的抗體，鑒定有核細(xì)胞的核染料4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，以及洗滌、滲透化處理和重懸細(xì)胞的緩沖液。在最后一個(gè)加工步驟中，將細(xì)胞重懸于MagNestu細(xì)胞呈現(xiàn)裝置(Cell Presentation Device)(維里德克斯有限責(zé)任公司(Veridex LLC))中。通過MagNest裝置生成的磁場引起磁性標(biāo)記的細(xì)胞均勻地分布在料筒的分析表面上，準(zhǔn)備用于使用CellTracks Analyzer II 分析。樣品分析。將MagNest置于CellTracks Analyzer II ，四色半自動(dòng)化突光顯微鏡上。捕獲覆蓋四個(gè)熒光濾光片立方各自的料筒的整個(gè)表面的圖像幀。包含PE以及DAPI陽性事件的圖像呈現(xiàn)于圖庫中，用于通過用戶基于細(xì)胞熒光和形態(tài)來分類事件。關(guān)于物體待定義為黑素瘤細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)包括圓形至卵形形態(tài)、可見的核(DAPI陽性的)、關(guān)于HMW-MAA的正染色，以及關(guān)于⑶45和⑶34的負(fù)染色。黑素瘤細(xì)胞分成KI67+和Ki67_細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果始終表示為細(xì)胞的數(shù)目/7. 5mL血液。黑素瘤細(xì)胞檢測的準(zhǔn)確度、靈敏度和線性。對(duì)于準(zhǔn)確度、線性和靈敏度實(shí)驗(yàn)，將SK-Mel28細(xì)胞以6種不同的細(xì)胞水平(0、5、18、72、280和1183)摻料到7. 5mL血液內(nèi)，所述血液收集到CellSave保存管內(nèi)。通過流式細(xì)胞術(shù)確定摻料到血液內(nèi)的確切細(xì)胞的數(shù)目。在摻料血液后，將樣品在CellTracks AutoPrepu上加工24小時(shí)，并且用CellTracks Analyzer II 分析。樣品測試經(jīng)過不同的兩天執(zhí)行，在每種細(xì)胞水平上具有總
共5個(gè)不同樣品。統(tǒng)計(jì)分析
主要終點(diǎn)為總體生存，測量為從取樣日期到由于任何原因的死亡日期的時(shí)間。喪失隨訪或在研究結(jié)束時(shí)仍活著的患者在他們已知活著的最后一個(gè)日期或在研究日期結(jié)束時(shí)進(jìn)行檢查。如果每個(gè)患者存在多個(gè)樣品，則最后一個(gè)樣品用于生存分析。使用卡普蘭-邁耶法計(jì)算總體生存，并且生成生存曲線圖。Cox回歸模型用于確定死亡風(fēng)險(xiǎn)比(HR)。結(jié)果在SPSS 16.0(美國伊利諾伊州芝加哥的SPSS有限公司(SPSS Inc. , Chicago, IL, USA))中進(jìn)行分析。實(shí)旋例I摻料的組織培養(yǎng)黑素瘤細(xì)胞系(SK-Me128)的回收在這個(gè)實(shí)施例中，描述了使用由SK-Me128細(xì)胞摻料的全血的測定性能。用于這個(gè)研究的方案如下。將全血從健康志愿者中抽取到CellSave管內(nèi)，并且用組織培養(yǎng)的黑素瘤SK-Me128細(xì)胞摻料。將不同數(shù)目的SK_Mel28細(xì)胞摻料到血液內(nèi)，并且測量回收。針對(duì)在樣品中觀察到的SK-Mel28細(xì)胞實(shí)際數(shù)目標(biāo)繪的摻料到健康供體樣品內(nèi)的SK_Mel28細(xì)胞的 期望數(shù)目(即，0、5、18、72、280和1183細(xì)胞)顯示于圖1中，并且結(jié)果概括于表I中。摻料細(xì)胞的平均回收是88%，伴隨在最高摻料時(shí)74%的回收與在5SK-Mel28摻料時(shí)的88%比較。皮爾森R2系數(shù)是O. 99。可以預(yù)知，變異系數(shù)(CV)隨著摻料的細(xì)胞的數(shù)目下降而增力口，范圍為在1，183細(xì)胞摻料時(shí)的7%至在5細(xì)胞摻料時(shí)的31%。SK-Mel28細(xì)胞的回收范圍為64-120%，并且不伴隨更低的細(xì)胞的數(shù)目而下降。表1:方法準(zhǔn)確度通過摻料到五個(gè)健康供體的7. 5mL血液內(nèi)的SK-Mel 28細(xì)胞的回收進(jìn)
行測量。
觀察到的CMC計(jì)數(shù)%回收
期望的
CMC計(jì)數(shù)平均值 SD95%CI 平均值 95%CI %CV
0 0 0 0 0 0 054I3-58864-1 12 31
1820218-22I 10100-120 10
72631153-738774-100 17
28723415221-247 8177-856
I 18388056831-929 7470-787循環(huán)黑素瘤細(xì)胞的鑒定將HMW-MAAPE 和 HMW-MAA PE，DAP1、CD45/CD34APC和 Ki67的重疊的索引圖像呈現(xiàn)給操作者用于審查。核的存在、HMW-MAA的表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)、以及⑶45或⑶34表達(dá)的缺乏是CMC的必需特征。圖2顯示呈現(xiàn)給審閱者的來自一個(gè)黑素瘤患者的6個(gè)事件。小圖A顯示由DAPI和HMW-MAA以及由⑶34和/或⑶45染色的細(xì)胞，并且因此不分類為CMC。小圖B、C、D和E顯示由DAPI和HMW-MAA但不由CD34或CD45染色的細(xì)胞，并且分類為CMC。在小圖B和C中的CMC不表達(dá)Ki67，而在小圖D和E中的CMC表達(dá)Ki67。注意到在小圖B中的CMC包含兩個(gè)核，并且不由Ki67染色，而在小圖D中的CMC看起來是主動(dòng)分裂的，并且實(shí)際上表達(dá)Ki67。CMC的大小及其核質(zhì)比在黑素瘤患者內(nèi)和之間的CMC之間極大地不同。圖3顯示具有特征性圓形至卵形形狀和未受損的核的來自不同患者的CMC圖像圖庫。細(xì)胞大小經(jīng)過從4μπι至30 μ m的廣泛范圍改變。還觀察到小細(xì)胞簇和具多核的CMC。
實(shí)施例2循環(huán)黑素瘤細(xì)胞在健康志愿者和黑素瘤患者中的頻率在該實(shí)施例中，描述了循環(huán)黑素瘤細(xì)胞在健康志愿者和黑素瘤患者中的頻率。CMC在來自健康供體的55個(gè)血樣和來自具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的44個(gè)患者的79個(gè)樣品中進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖4的小圖A顯示在對(duì)照組和患者的7. 5mL血液中檢測到的CMC的數(shù)目。在來自在其中檢測到CMC的17個(gè)患者的19個(gè)樣品中確定Ki67表達(dá)的評(píng)估。Ki67+CMC的百分比范圍為34-100%，具有84%的平均值(SD25)。圖4的小圖B顯示在這些樣品中檢測到的Ki67表達(dá)和CMC的數(shù)目。在55個(gè)健康供體中，三個(gè)細(xì)胞分類為CMC，并且所有三個(gè)都不表達(dá)Ki67。實(shí)施例3在黑素瘤患者中的循環(huán)黑素瘤細(xì)胞和總體生存在對(duì)照組中的個(gè)體無一已檢測到2個(gè)或更多個(gè)CMC，并且選擇這個(gè)截止以區(qū)別患 者組。關(guān)于具有< 2CMC的那些患者的平均OS時(shí)間是12.1個(gè)月(95% Cl 9. 7.-14. 4)，并且顯著長于關(guān)于具有彡2CMC的那些患者的平均OS時(shí)間的2. O個(gè)月(95% Cl O. -4. 9)(圖5)。時(shí)序P是O. 001。通過Cox回歸的死亡風(fēng)險(xiǎn)比是3. 2(95% Cl1. 6-6. 5)。在血液抽取后I個(gè)月內(nèi)死亡的四個(gè)患者具有相對(duì)高數(shù)目的CMC(2、8、10和8043CMC/7. 5ml)。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)測具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的患者的總體生存的方法，包括(a)從具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的患者獲得7.5ml血樣，所述樣品包含懷疑含有循環(huán)黑素瘤細(xì)胞的混合細(xì)胞群；(b)富集所述樣品的級(jí)分，所述級(jí)分包含所述循環(huán)黑素瘤細(xì)胞；(C)確認(rèn)所述稀有細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性為未受損的；(d)分析所述未受損的稀有細(xì)胞；其中所述分析關(guān)聯(lián)疾病進(jìn)展；(e)評(píng)估所述血樣中的循環(huán)黑素瘤細(xì)胞的數(shù)目其中如果所述數(shù)目大于或等于2，則預(yù)示所述患者的總體生存為低，并且其中如果所述循環(huán)黑素瘤細(xì)胞的數(shù)目小于2，則預(yù)示所述患者的總體生存為高。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述級(jí)分通過免疫磁性富集獲得，所述免疫磁性富集使用外部施加的磁場來分離與特異性地結(jié)合所述黑素瘤細(xì)胞的生物特異性配體偶聯(lián)的順磁性顆粒以基本上排除其它群體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述生物特異性配體是黑素瘤細(xì)胞粘附分子 CD146。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述結(jié)構(gòu)完整性通過選自免疫細(xì)胞化學(xué)法、FISH 法、流式細(xì)胞術(shù)、圖像細(xì)胞術(shù)、以及它們的組合的方法確定。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述結(jié)構(gòu)完整性通過核酸染料、高分子量黑素瘤相關(guān)抗原的特異性單克隆抗體確定。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述結(jié)構(gòu)完整性通過使用白細(xì)胞和內(nèi)皮特異性抗體排除共富集的白細(xì)胞和循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞被進(jìn)一步確認(rèn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述特異性抗體是CD45和CD34。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，還包含CD45和CD34以排除共富集的白細(xì)胞和循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中添加FITC標(biāo)記的抗Ki67以確定所述循環(huán)內(nèi)處于活躍細(xì)胞周期的CMC的比例。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中低總體生存為不超過兩個(gè)月。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中高總體生存為十二個(gè)月。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于捕獲并檢測在具有黑素瘤的患者的血液中的循環(huán)黑素瘤細(xì)胞(CMC)的自動(dòng)化方法。在外周血液腫瘤載荷中檢測的循環(huán)黑素瘤細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目部分地為生存、進(jìn)展時(shí)間以及對(duì)治療的響應(yīng)預(yù)測中的因素。
文檔編號(hào)G01N33/574GK103026235SQ201180028015
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月8日
發(fā)明者G.C.勞, M.C.康奈利 申請(qǐng)人:維里德克斯有限責(zé)任公司