專利名稱：：酵母濃度和存活率的測定的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明一般地涉及分析酵母存活率。更具體地，本發(fā)明涉及用于獲取和測定酵母細胞的存活率和濃度的高效的和有效的方法和組合物。
背景技術：
：在過去的二十到三十年間，生物燃料的開發(fā)和生產(chǎn)取得了顯著的增長。隨著化石燃料的持續(xù)消耗和對全球氣候變曖的日益關注，在巴西、美國和許多其他歐洲國家已引入大規(guī)模生物燃料生產(chǎn)以促進可再生能源的更替。目前，最大的生物燃料工藝嚴重依賴于乙醇生產(chǎn)，其米用面包酵母、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，對甘鹿、玉米粉、多糖和廢水進行發(fā)酵。由于其高乙醇耐受性、最終乙醇濃度、葡萄糖轉(zhuǎn)化率以及工業(yè)發(fā)酵的歷史可靠性，酵母是用于生物乙醇生產(chǎn)的理想成分。(Antoni等人，“Biofuelfrommicrobes”，AppliedMicrobiologyBiotechnology，第77卷，第23-35頁，2007年;Vertes等人，“TechnologicalOptionsforBiologicalFuelEthanol，，，JournalofMolecularMicrobiologyandBiotechnology，第15卷，第16-30頁，2008年；Basso等人，“YeastselectionforfuelethanolproductioninBrazil，，F(xiàn)EMSYeastResearch，第8卷，第1155-1163頁，2008年；Nikoli6等人，“EffectofdifferentfermentationparametersonbioethanolproductionfromcornmealhydrolyzatesbyfreeandimmobilizedcellsofSaccharomycescerevisiaevar.ellipsoideus，，，JournalofChemicalTechnologicalBiotechnology，第84卷，第497-503頁，2009年；Gibbons等人，“Integratedbiorefinerieswithengineeredmicrobesandhigh-valueco-productsforprofitablebiofuelsproduction，，，InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant，第45卷，第218-228頁，2009年；Hu等人，“GeneticDissectionofEthanolToleranceintheBuddingYeastSaccharomycescerevisiae，，，Genetics，第175卷，第1479-1487頁，2007年；Argueso等人，“GenomestructureofaSaccharomycescerevisiaestrainwidelyusedinbioethanolproduction，，，GenomeResearch，第19卷，第2258-2270頁，2009年；Ekst`een等人，“StarchFermentationbyRecombinantSaccharomycescerevisiaeStrainsExpressingthea-AmylaseandGlucoamylaseGenesFromLipomycesKononenkoaeandSaccharomycopsisfibuligera，，，BiotechnologyandBioengineering，第84卷，第639-646頁，2003年。)在美國，標準的基于酵母的發(fā)酵工藝利用從玉米淀粉中提取的葡萄糖。對玉米(整株植物，包括玉米粒)進行干式研磨處理，并與a-淀粉酶一起在pH6下加熱至100°C。醪液(mash)與葡糖淀粉酶一起在pH4.5下冷卻到65°C，以將淀粉降解為葡萄糖，其然后可能用野生型面包酵母消化。然后將最終的組合物冷卻至32°C并轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐中，向其中添加酵母以啟動乙醇生產(chǎn)。通常，整個發(fā)酵過程需要約48-72小時，以達到10-12%的最終乙醇濃度。所添加的酵母的濃度和存活率是獲得最大量乙醇產(chǎn)生的關鍵因素。因此，用于測定酵母濃度和存活率的方法對于提供一致的乙醇產(chǎn)出是非常重要的。有幾種用于測定純酵母樣品的濃度和存活率的方法，如使用手動細胞計數(shù)器的光學和焚光顯微鏡術和流式細胞術。(Trevors等人，“AComparisonofMethodsforAssessingYeastViability，，，BiotechnologyLetters，第5卷，第131-134頁，1983年；Hernlem等人，“DualFluorochromeFlowCytometricAssessmentofYeastViability,”CurrentMicrobiology,在線出版，2010年；Chang等人，“Flowcytometricquantitationofyeastanoveltechniqueforuseinanimalmodelworkandinvitroimmunologicassays，，，JournalofImmunologicalMethods，第211卷，第51-63頁，1998年；Deere等人，“FlowCytometryandCellSortingforYeastViabilityAssessmentandCellSelection，”Yeast，第14卷，第147-160頁，1998年；Bouchez等人，“PhysiologicalSignificanceoftheCytometricDistributionofFluorescentYeastsAfterViabilityStaining，，，BiotechnologyandBioengineering，第86卷，第520-530頁，2004年；Malacrin0等人，“Rapiddetectionofviableyeastsandbacteriainwinebyflowcytometry，，，JournalofMicrobiologicalMethods，第45卷，第127-134頁，2001年。)手動細胞計數(shù)器成本低廉，但繁瑣且容易出現(xiàn)人為錯誤，從而導致大的不一致性。(Ng等人，“TheChallengetoMeasureCellProliferationinTwoandThreeDimensions，，，TissueEngineering，第11卷，第182-191頁，2005年；Szabo等人，“EvaluationofanAutomatedInstrumentforViabilityandConcentrationMeasurementsofCryopreservedHematopoieticCells，，，LaboratoryHematology,第10卷，第109-111頁，2004年。)與之相比，流式細胞術自動釆集數(shù)據(jù)，但需要用于濃度測定的校準珠(calibrationbeads)，和徹底的清潔程序以防止樣品之間的交叉污染。此外，流式細胞術的成本也阻礙了簡單且具成本效益的酵母濃度測定方法的開發(fā)。(Davey等人，“FlowCytometryandCellSortingofHeterogeneousMicrobialPopulations:theImportanceofSingle-CellAnalyses，，，MicrobiologicalReviews,第60卷，第641-696頁，1996年；Michelson，“FlowCytometry:AClinicalTestofPlateletFunction，’’Blood，第87卷，第4925-4936頁，1996年。)雖然每種方法都有其缺點，但是熒光檢測仍然可以對純酵母樣品提供相對精確的濃度和存活率的測定。(Henry-Stanley等人，“AdaptationofFUN-1andCalcofluorwhitestainstoassesstheabilityofviableandnonviableyeasttoadheretoandbeinternalizedbyculturedmammaliancells，，，JournalofMicrobiologicalMethods，第59卷，第289-292頁，2004年；Zandycke等人，“DeterminationofYeastViabilityUsingFluorophores，，，JournalofAmericanSocietyofBrewingChemists，第61卷，第15-22頁，2003年；King等人，“EpifluorescentMethodforDetectionofNonviableYeast，”JournalofAmericanSocietyofBrewingChemists，第39卷，第52-54頁，1981年；McCaig，“EvaluationoftheFluorescentDye1-AniIino-8-NaphthaleneSulfonicAcidforYeastViabilityDetermination，’’JournalofAmericanSocietyofBrewingChemists，第48卷，第22-25頁，1990年；Nikolova等人，“AnOptimisedMethodforInvestigationoftheYeastViabilitybyMeansofFluorescentMicroscopy，，，JournalofCultureCollections，第3卷，第66-71頁，2002年；Zhang等人，“QuantificationofSaccharomycescerevisiaeviabilityusingBacLight,，，BiotechnologyLetters,第26卷，第989-992頁，2004年；Slater,“RapidNuclearStainingMethodforSaccharomycescerevisiae,”JournalofBacteriology,第126卷，第1339-1341頁，1976年;0h等人,“Rapidviabilityassessmentofyeastcellsusingvitalstainingwith2-NBDG,afluorescentderivativeofglucose,，，InternationalJournalofFoodMicrobiology,第76卷，第47-53頁，2002年；Lloyd等人，“Vigour,vitalityandviabilityofmicroorganisms,，，F(xiàn)EMSMicrobiologyLetters,第133卷，第1-7頁，1995年；Rodriguez-Porrata等人,“Vitalityenhancementoftherehydratedactivedrywineyeast,，，InternationalJournalofFoodMicrobiology，第126卷，第116-122頁，2008年。)然而，更重要的是在發(fā)酵過程中能準確和高效地測定這些參數(shù)，以確保一致的過程。由于雜亂(messy)樣品中的殘渣會嚴重干擾使用細胞計數(shù)器、流式細胞術和熒光顯微鏡術的計數(shù)方法的一致性的事實，以前的出版物的一個共同特點是所有的測試樣品均為脫水的酵母或已經(jīng)經(jīng)過純化。因為玉米醪的殘渣會阻止技術人員和流式細胞儀精確地測定濃度和存活率，上述方法將會造成很大的困難。(Abbott等人,“BufferingcapacityofwholecornmashaltersconcentrationsoforganicacidsrequiredtoinhibitgrowthofSaccharomycescerevisiaeandethanolproduction,，，BiotechnologyLetters,第26卷，第1313-1316頁，2004年;Devantier等人，“Characterizationofveryhighgravityethanolfermentationofcornmash.Effectofglucoamylasedosage,pre-saccharificationandyeaststrain,”AppliedMicrobiologyandBiotechnology,第68卷，第622-629頁，2005年。)先前出版的關于AO和PI的文章在其最佳pH6.5-7.4內(nèi)使用兩種染料，對于對哺乳動物細胞生物學上可行的緩沖液來說，這是最常見的PH值。在明視野(bright-field)方案中，手動和自動兩種方法都受到成像視野中的殘渣的阻礙，因此一致的測定經(jīng)常是受限的。由于溶液中殘渣的非特異性染色，使用熒光測量來特異性檢測雜亂樣品中的酵母也遇到了問題。此外，熒光檢測會導致較弱的靶細胞信號和大量的玉米醪殘渣的非特異性染色。只有通過從玉米醪中分離酵母的費力的過濾過程，才可以有效地利用上述方法。然而，當在其發(fā)酵環(huán)境中測定時，酵母的濃度和存活率能得到更精確地表示。因此，在雜亂的工業(yè)樣品測定酵母存活率的需要沒有得到滿足。在此呈現(xiàn)的本發(fā)明描述了使用標準熒光染色劑和調(diào)整緩沖液的PH值，用于檢測和測定酵母的濃度和存活率的新方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明部分基于對用于獲得和測定酵母細胞存活率和濃度的高效和有效的方法和組合物的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明解決了先前方法的缺點，因為可以通過本發(fā)明的方法容易并精確地分析實時樣品，如包含玉米醪和其他殘渣的來自生物燃料植物的樣品。因為本發(fā)明允許高染色特異性，雜亂的樣品可以得到有效地測定。除了玉米醪，甘蔗發(fā)酵中的酵母存活率也可以使用該方法進行測定。一方面，本發(fā)明一般地涉及用于測定酵母細胞的濃度的方法。該方法包括:在pH為約10至約12.5的緩沖液條件下，用染料對將要測定酵母細胞濃度的樣品進行染色；獲取經(jīng)染料染色的樣品的熒光圖像；分析經(jīng)染料染色的樣品的熒光圖像，以確定存活酵母細胞的濃度。另一方面，本發(fā)明一般地涉及用于確定酵母存活率的方法。該方法包括:在PH為約10至約12.5的緩沖液條件下，用第一染料和第二染料對將要測定酵母存活率的樣品進行染色；獲取經(jīng)第一染料染色的樣品的熒光圖像；獲取經(jīng)第二染料染色的樣品的熒光圖像；并比較經(jīng)第一染料染色的樣品的熒光圖像和經(jīng)第二染料染色的樣品的熒光圖像以確定酵母存活率。又一方面，本發(fā)明一般地涉及用于測定存活酵母細胞的濃度的方法。該方法包括:在PH為約10至約12.5的緩沖液條件下，用第一染料和第二染料對待測樣品進行染色；獲取經(jīng)第一染料染色的樣品的至少一幅靜態(tài)熒光圖像；獲取經(jīng)第二染料染色的樣品的至少一幅靜態(tài)熒光圖像；并分析該經(jīng)第一染料染色的樣品的至少一幅靜態(tài)熒光圖像和該經(jīng)第二染料染色的樣品的至少一幅靜態(tài)熒光圖像以確定樣品中的存活酵母細胞的濃度。又一方面，本發(fā)明一般地涉及用于測定酵母存活率的方法。該方法包括:在pH為約10至約12.5的緩沖液條件下，用第一染料和第二染料對將要測定酵母存活率的樣品進行染色；獲取經(jīng)第一染料染色的樣品的至少一幅靜態(tài)明視野圖像和至少一幅靜態(tài)熒光圖像；比較該經(jīng)第一染料染色的樣品的至少一幅明視野圖像和至少一幅熒光圖像以確定樣品中活酵母細胞的特征；獲取經(jīng)第二染料染色的樣品的至少一幅靜態(tài)明視野圖像和至少一幅靜態(tài)熒光圖像；并比較該經(jīng)第二染料染色的樣品的至少一幅明視野圖像和至少一幅熒光圖像以確定樣品中不存活的酵母細胞的特征。該方法可進一步包括確定存活酵母細胞的濃度。又一方面，本發(fā)明一般地涉及用于測定存活酵母細胞的濃度的方法。該方法包括:在PH為約10至約12.5的緩沖液條件下，用第一染料和第二染料對待測樣品進行染色；獲取經(jīng)第一染料染色的樣品的至少一幅靜態(tài)明視野圖像和至少一幅靜態(tài)熒光圖像；獲取經(jīng)第二染料染色的樣品的至少一幅靜態(tài)明視野圖像和至少一幅靜態(tài)熒光圖像；并確定樣品中的存活酵母細胞的濃度。又一方面，本發(fā)明一般地涉及用于測定酵母存活率的方法。該方法包括:在pH為約10.5至約12.5的緩沖液條件下，用吖啶橙對將要測定酵母存活率的樣品進行染色；通過將明視野光束指向樣品獲取經(jīng)吖啶橙染色的樣品的至少一幅靜態(tài)明視野圖像；通過將激發(fā)光束指向樣品獲取經(jīng)吖啶橙染色的樣品的至少一幅靜態(tài)熒光圖像；比較該經(jīng)吖啶橙染色的樣品的至少一幅明視野圖像和至少一幅熒光圖像以確定樣品中的存活酵母的特征；在約10.5至約12.5的pH的緩沖液條件下，用碘化丙錠對將要測定酵母存活率的樣品進行染色；通過將明視野光束指向樣品獲取經(jīng)碘化丙錠染色的樣品的至少一幅靜態(tài)明視野圖像；通過將激發(fā)光束指向樣品獲取經(jīng)碘化丙錠染色的樣品的至少一幅靜態(tài)熒光圖像；比較該經(jīng)碘化丙錠染色的樣品的至少一幅明視野圖像和至少一幅熒光圖像以確定樣品中不存活的酵母的特征；并確定該樣品的酵母存活率。這里給出的附圖是一系列嚴格的熒光成像分析實驗，用以發(fā)現(xiàn)用來直接從發(fā)酵罐中測定酵母存活率的工作模型，其中熒光試劑并不在優(yōu)化條件的正常范圍內(nèi)。圖1顯示了在不同濃度下的一系列4種UV激發(fā)的染料，其中比較了酵母的熒光信號。圖2顯示了在不同濃度下的2種藍光激發(fā)的染料，其中比較了酵母的熒光信號。圖3顯示了在不同濃度下的2種綠光激發(fā)的染料，其中比較了酵母的熒光信號。圖4顯示了對純酵母樣品使用SYTO9(活的)和碘化丙錠(不存活的)染色劑的明視野圖像(左)、存活酵母(右)和不存活的酵母(下)的實例。圖5顯示了吖啶橙或SYTO9對玉米醪樣品中的酵母的活細胞染色的熒光圖像的實例，其中顯示來自玉米醪殘渣的大的非特異性熒光信號。圖6顯示了pH7-pH9的玉米醪中的酵母的一系列熒光圖像，其中玉米醪仍然顯示非特異性信號。圖7顯示了pH10-pH11.50的玉米醪中的酵母的一系列熒光圖像，其中去除了玉米醪的非特異性信號。圖8顯示了在高pH水平下對碘化丙錠的一系列濃度調(diào)整，其中也消除了玉米醪的信號。圖9顯示了來自正在運行的發(fā)酵罐的真實發(fā)酵酵母樣品的2個實例，其中使用所發(fā)現(xiàn)的熒光檢測方法來清楚地區(qū)分玉米醪中存活的和不存活的酵母。圖10顯示了來自正在運行的發(fā)酵罐的真實發(fā)酵酵母樣品的2個實例，其中使用所發(fā)現(xiàn)的熒光檢測方法來清楚地區(qū)分玉米醪中存活的和不存活的酵母。圖11顯示了7個不同階段的發(fā)酵樣品的一系列熒光圖像。圖12顯示了本發(fā)明和手動計數(shù)方法兩者的(a)濃度和(b)存活率相對于發(fā)酵持續(xù)時間的圖。(C)該圖顯示發(fā)酵樣品中的酵母的存活率與乙醇含量的百分比之間的關系。圖13顯示了玉米醪樣品中的酵母的吖啶橙的非特異性弱熒光信號的實例和碘化丙錠的非特異性信號的實例。圖14顯示了主要與本發(fā)明結合使用以測定玉米醪中的酵母存活率的Cellometer(NexcelomBioscience)的圖。圖15顯示了相對于不同緩沖液而言(a)吖啶橙和(b)碘化丙錠的信背比(signal-to-backgroundratio)的圖。該方法在超過5小時的孵育期(c)是穩(wěn)定的。圖16顯示了針對不同濃度的(a)吖啶橙和(b)碘化丙錠的信背比的圖。具體實施例方式本發(fā)明解決了先前方法的缺點，因為可以通過本發(fā)明的方法容易并精確地分析實時樣品，如包含玉米醪和其他殘渣的來自生物燃料植物的樣品。因為本發(fā)明允許高染色特異性，雜亂的樣品可以得到有效地測定。因此，本發(fā)明在部分基于用于獲得和測定酵母細胞的存活率和濃度的高效和有效的方法和組合物的發(fā)現(xiàn)。近來，NexcelomBioscience(Lawrence,MA)開發(fā)了一種新型的成像細胞計數(shù)方法，該方法允許使用僅需要20Ul樣品的廉價的一次性計數(shù)室快速測定細胞濃度。(Lai等人，“IntratumoralEpidermalGrowthFactorReceptorAntisenseDNATherapyinHeadandNeckCancer:FirstHumanApplicationandPotentialAntitumorMechanisms,，，JournalofClinicalOncology,第27卷，第1235-1242頁，2009年3月；Nott等人，“GenomicResponsesfromtheEstrogen-responsiveElement-dependentSignalingPathwayMediatedbyEstrogenReceptoralphaAreRequiredtoElicitCellularAlterations,，，JournalofBiologicalChemistry,第284卷,第15277-15288頁，2009年5月;Qiao等人,“ThiolOxidativeStressInducedbyMetabolicDisordersAmplifiesMacrophageChemotacticResponsesandAcceleratesAtherogenesisandKidneyInjuryinLDLReceptor-DeficientMice,，，ArteriosclerosisThrombosisandVascularBiology,第29卷，第1779-U139頁，2009年11月；Rounbehler等人，“TargetingOrnithineDecarboxylaseImpairsDevelopmentofMYCN-AmplifiedNeuroblastoma,，，CancerResearch,第69卷，第547-553頁，2009年I月；Shanks等人，“QuantitativePCRforGeneticMarkersofHumanFecalPollution,，，AppliedandEnvironmentalMicrobiology,第75卷，第5507-5513頁，2009年9月；Stengel等人，“IdentificationandCharacterizationofNesfatin-1ImmunoreactivityinEndocrineCellTypesoftheRatGastricOxynticMucosa,，，Endocrinology,第150卷，第232-238頁，2009年I月。)利用明視野和熒光成像的結合，該系統(tǒng)可以自動采集細胞圖像，并使用用于精確和一致地測定多種細胞類型的細胞群體和存活率的新型計數(shù)算法進行處理。以前已經(jīng)報道了下述應用，例如對免疫細胞、癌細胞、干細胞、昆蟲細胞、脂肪細胞、肝細胞、血小板、藻類細胞和異質(zhì)細胞的列舉、GFP轉(zhuǎn)染的定量、使用臺盼藍或碘化丙錠測定存活率、測量全血中的白細胞的應用。更重要的是，已證明該方法在生物燃料、飲料和烘焙業(yè)中產(chǎn)生了用于質(zhì)量控制目的的、一致的純酵母的濃度和存活率測定。(NexcelomBioscience,“Simpe,FastandConsistentDeterminationofYeastViabilityusingOxonoI,，，ApplicationFocus:CellometerVision10X,第1-2頁。)本文公開了米用CellometerVision(NexcelomBioscience)測定來自正在運行的發(fā)酵罐的玉米醪中的酵母濃度和存活率的新型成像熒光細胞計數(shù)法。使用本發(fā)明的稀釋緩沖液并用吖啶橙(AO)和碘化丙錠(PI)對樣品進行染色，選擇性地標記了存活的和不存活的酵母，同時消除了來自玉米醪的非特異性熒光信號。該方法使用直接來自加工中的發(fā)酵罐的樣品，不需要進一步的過濾處理，可以高效地進行酵母質(zhì)量控制，在美國過濾處理對監(jiān)測穩(wěn)定的生物乙醇生產(chǎn)可能具有顯著的影響。除了玉米醪，甘蔗發(fā)酵中的酵母存活率也可以使用該方法測定。`一方面，本發(fā)明一般地涉及用于測定酵母細胞的濃度的方法。該方法包括:在pH為約10至約12.5的緩沖液條件下，用染料對將要測定酵母細胞濃度的樣品進行染色；獲取經(jīng)染料染色的樣品的熒光圖像；分析經(jīng)染料染色的樣品的熒光圖像，以確定存活酵母細胞的濃度。所述染料可選自，例如吖啶橙、SYTO9,DAPI,Hescht,Calcofluor白、碘化丙錠、溴化乙錠、Oxonol、Mg-ANS0在一些實施方式中，染料是濃度為約Iμg/mL至約5μg/mL(例如，約Iμg/mL至約4μg/mL、約Iμg/mL至約3μg/mL、約2μg/mL至約5μg/mL、約3μg/mL至約5μg/mL)的卩丫唳橙。在一些實施方式中，緩沖液條件具有約10至約12(例如，約10.5至約12、約10.5至約IL5、約10至約IL5、約10至約11)的pH。所述樣品可以是任何合適的樣品，包括來自生物燃料發(fā)酵工藝(例如，用于生產(chǎn)包括乙醇和/或丁醇的生物燃料)的工業(yè)用樣品。樣品可包括殘渣，如玉米醪和/或甘蔗的殘渣。在某些實施方式中，酵母為釀酒酵母種。在另一方面，本發(fā)明一般地涉及用于確定酵母存活率的方法。該方法包括:在pH為約10至約12.5的緩沖液條件下，用第一染料和第二染料對將要測定酵母存活率的樣品進行染色；獲取經(jīng)第一染料染色的樣品的熒光圖像；獲取經(jīng)第二染料染色的樣品的熒光圖像；并比較經(jīng)第一染料染色的樣品的熒光圖像和經(jīng)第二染料染色的樣品的熒光圖像以確定酵母存活率。例如，該第一染料可選自吖啶橙、SYTO9、DAP1、Hescht、Calcofluor白，且該第二染料可選自碘化丙錠、溴化乙錠、Oxono1、Mg-ANS。在某些實施方式中，第一染料為吖啶橙且第二染料為碘化丙錠。例如，吖啶橙的濃度可為約IUg/mL至約g/mL(例如，約Iiig/mL至約4yg/mL、約Iyg/mL至約3yg/mL、約2ug/mL至約5ug/mL、約3ug/mL至約5ug/mL)。碘化丙錠的濃度可為約IUg/mL至約5ug/mL(例如，約Iiig/mL至約4ug/mL、約Iyg/mL至約3ug/mL、約2ug/mL至約5ug/mL、約3iig/mL至約5ug/mL)。在又一方面，本發(fā)明一般地涉及用于確定存活酵母細胞的濃度的方法。該方法包括:在PH為約10至約12.5的緩沖液條件下，用第一染料和第二染料對待測樣品進行染色；獲取經(jīng)第一染料染色的樣品的至少一幅靜態(tài)熒光圖像；獲取經(jīng)第二染料染色的樣品的至少一幅靜態(tài)熒光圖像；并分析該經(jīng)第一染料染色的樣品的至少一幅靜態(tài)熒光圖像和該經(jīng)第二染料染色的樣品的至少一幅靜態(tài)熒光圖像以確定樣品中存活酵母細胞的濃度。在又一方面，本發(fā)明一般地涉及用于確定酵母存活率的方法。該方法包括:在pH為約10至約12.5的緩沖液條件下，用第一染料和第二染料對將要測定酵母存活率的樣品進行染色；獲取經(jīng)第一染料染色的樣品的至少一幅靜態(tài)明視野圖像和至少一幅靜態(tài)熒光圖像；比較該經(jīng)第一染料染色的樣品的至少一幅明視野圖像和至少一幅熒光圖像以確定樣品中存活酵母細胞的特征；獲取經(jīng)第二染料染色的樣品的至少一幅靜態(tài)明視野圖像和至少一幅靜態(tài)熒光圖像；并比較該經(jīng)第二染料染色的樣品的至少一幅明視野圖像和至少一幅熒光圖像以確定樣品中不存活的酵母細胞的特征。該方法可進一步包括確定存活酵母細胞的濃度。在又一方面，本發(fā)明一般地涉及用于確定活酵母細胞的濃度的方法。該方法包括:在PH為約10至約12.5的緩沖液條件下，用第一染料和第二染料對待測樣品進行染色；獲取經(jīng)第一染料染色的樣品的至少一幅靜態(tài)明視野圖像和至少一幅靜態(tài)熒光圖像；獲取經(jīng)第二染料染色的樣品的至少一幅靜態(tài)明視野圖像和至少一幅靜態(tài)熒光圖像；并確定樣品中存活酵母細胞的濃度。在又一方面，本發(fā)明一般地涉及用于確定酵母存活率的方法。該方法包括:在pH為約10.5至約12.5的緩沖液條件下，用吖啶橙對將要測定酵母存活率的樣品進行染色；通過將明視野光束指向樣品獲取經(jīng)吖啶橙染色的樣品的至少一幅靜態(tài)明視野圖像；通過將激發(fā)光束指向樣品獲取經(jīng)吖啶橙染色的樣品的至少一幅靜態(tài)熒光圖像；比較該經(jīng)吖啶橙染色的樣品的至少一幅明視野圖像和至少一幅熒光圖像以確定樣品中存活酵母的特征；在約10.5至約12.5的pH的緩沖液條件下，用碘化丙錠對將要測定酵母存活率的樣品進行染色；通過將明視野光束指向樣品獲取經(jīng)碘化丙錠染色的樣品的至少一幅靜態(tài)明視野圖像；通過將激發(fā)光束指向樣品獲取經(jīng)碘化丙錠染色的樣品的至少一幅靜態(tài)熒光圖像；比較該經(jīng)碘化丙錠染色的樣品的至少一幅明視野圖像和至少一幅熒光圖像以確定樣品中不存活的酵母的特征；并確定樣品的酵母存活率。實施例熒光染色劑的選擇為了優(yōu)化酵母存活率測定的試驗方案，所選擇用來確定活或死細胞的熒光染色劑應該是明亮的并具有低背景信號。使用CellometerVision,利用375nm/450nm、470nm/525nm和527nm/595nm的激發(fā)/發(fā)射的對，對8種不同的熒光染色劑進行了比較。所述染料在稀釋至約2XIO6個顆粒/mL的Munton脫水酵母上進行實驗。吖啶橙(AO)、SYTO9,DAPI,Hoescht,CalcofIuor白是全細胞染色劑，而Mg-ANS、碘化丙錠(PI)、溴化乙錠(EB)為存活率染料，其可以進入膜受損的細胞。針對每種染料，進行系列濃度的測試以觀察近似的最佳濃度并分析信背比。紫外線(375nm)所激發(fā)的染料為DAP1、Hoescht、Calcofluor白和Mg-ANS。DAP1、Hoescht和Calcofluor白染色所有細胞,但由于酵母包含內(nèi)膜和外細胞壁的生物結構，使染色情況變得難以預知。如圖1所示，UV染料的結果顯示出酵母細胞的非均勻的熒光。對于Mg-ANS，一種存活性染料，它僅染色死酵母細胞，在較低濃度下具有均勻的熒光信號?？傮w而言，紫外染料具有很高的來自基底(substrate)的自體熒光背景，且低功耗、高亮度UVLED不易獲得。藍光(470nm)所激發(fā)的染料為吖啶橙和SYTO9，這兩種染料均染色全部細胞，但類似于UV染料，它們會產(chǎn)生非均勻的熒光。在兩種染料的較低濃度下，一些酵母細胞比其他細胞更明亮地染色，它們對應于膜受損的細胞。(圖2)綠光(527nm)所激發(fā)的染料為溴化乙錠和碘化丙錠，它們是死細胞的存活性染色齊U。在高濃度下，每一個細胞中都誘導產(chǎn)生背景熒光。隨著濃度的降低，死細胞的信號增加(圖3)。PI具有比EB低得多的背景熒光?？傮w而言，AO>SYTO9更適合于全細胞染色而PI更適合于死細胞染色。因此，為針對雜亂樣品進行優(yōu)化，進一步探討了這三種染料。pH值的優(yōu)化以前，已經(jīng)采用SYTO9和PI測定酵母的存活率(Invitrogen)，且通過使用CellometerVision，可得到一致的結果。SYTO9和PI的最佳濃度分別為約3μM和41μg/mL。(圖4)SYTO9和PI對脫水的酵母均很好地染色，但當測試玉米醪中的酵母時，AO和SYTO9均不能很好地染色活細胞。此外，如圖5所示，顯示了高熒光背景，其中殘渣明亮地發(fā)光，使自動計數(shù)不可能進行。通常，由AO所產(chǎn)生的熒光信號要比SYTO9所產(chǎn)生的好得多，因此將進行pH系列試驗(圖6和圖7)。結果顯示，在pH大于8時，殘渣的背景熒光被消除(類似于蜜蜂孢子)且活細胞被明亮地染色。AO和PI混合物的濃度優(yōu)化活細胞的AO染色可以通過優(yōu)化緩沖液的pH值來調(diào)整，但同時，也必須補償PI濃度以淬滅死細胞中的AO熒光。此外，PI也染色殘渣，因此可調(diào)整濃度以減少殘渣信號。(圖8)發(fā)酵樣品的測定對玉米醪中的酵母的幾個發(fā)酵階段測試在調(diào)整的pH下的AOPI混合物。對發(fā)酵2測試了大量的計數(shù)以檢查該方案的一致性。首先將10yL的發(fā)酵樣品與5uL的各為5ug/mL的AO和PI混合，最后用5iiL的0.05M的NaOH調(diào)節(jié)pH。對發(fā)酵2進行了超過11次試驗，計算得到19.24%+/-2.35%存活率的平均值。此外，酵母樣品用所調(diào)整的pH值進行預稀釋，然后將10對10iiL的樣品和AOPI染色劑1:1混合I分鐘。在孵育I分鐘后，將溶液吸移到低FL背景片中并插入CellometerVision中。經(jīng)過2-3分鐘,背景殘洛突光擴散出去，在AO通道中只留下明亮的活細胞，而低濃度的PI將明亮地染色死細胞，而殘渣也未染色。(圖9)緩沖液的選擇通過使用NaOH將酵母樣品和染色劑的pH直接改變?yōu)榧s10而進行了某些試驗，但選擇在對于一致的熒光檢測和濃度測定最佳的pH值和離子強度下穩(wěn)定的緩沖液是必要的。選擇Trizma堿和Trizma8.8來測試在沒有最低背景的情況下染色酵母的能力。(圖10)Trizma堿產(chǎn)生pH值約為10的緩沖液并用水稀釋至0.1M，其對于AO和PI通道都產(chǎn)生干凈的背景。然而Trizma8.8沒有高到足以最小化背景以及增強酵母信號。殘渣的背景信號仍然可以觀察到，在AO通道中也可以觀察到死酵母，這造成了活細胞和死細胞之間的一定的混淆。玉米醪中的酵母的表征所提供的酵母和玉米醪的混合物首先通過測定各個樣品的pH值和乙醇含量進行表征。樣品1-7的平均pH值為4.45+/-0.18，乙醇含量分別從1.8%至14.7%遞增。由于酵母的PH耐受性高，在每個樣品中的低pH值可以防止細菌污染。一般而言，在發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵罐中乙醇百分比的增加，酵母的存活率降低，這最終終止生物乙醇的產(chǎn)生。因此，如果在不同發(fā)酵階段可以容易地監(jiān)測酵母的存活率，則當試圖延長酵母的生命周期時，可實現(xiàn)較高的最終乙醇產(chǎn)出。將本發(fā)明的稀釋緩沖液與細胞培養(yǎng)級的H2O和PBS相比，以獲得最高的熒光信號以及低背景水平。圖12a顯示了對于AO和PI，酵母的信背比。對于PI染色，所有三種溶液對于不存活的細胞顯示了相當?shù)男疟潮?，但對于H2O和PBS，玉米醪殘渣的非特異性熒光較高。AO熒光在稀釋緩沖液之間具有最大差異，其中,H2O和PBS對活細胞不顯示任何的熒光信號。與此相反，在本文所公開的緩沖液中稀釋的酵母表現(xiàn)出強烈的AO熒光并且對于不存活的細胞表現(xiàn)出最小的信號，這證實了AO到PI的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。濃度系列的結果顯示于圖12b中，其中對于AO和PI在每個濃度都顯示出高信背t匕。也比較了來自殘渣的非特異性熒光和背景熒光。隨著兩種染料濃度的下降，來自玉米醪殘渣的非特異性熒光也下降。出于其顯示出高信背比和低非特異性熒光信號這一事實，對于AO和PI優(yōu)化的濃度為約1.25ug/mL。通過增加或降低AO:PI的濃度比，可改變酵母的熒光響應(數(shù)據(jù)未示出)。如果AO的濃度高于PI，則隨著殘渣非特異性信號的增加，AO將發(fā)出更明亮的熒光。更重要的是，PI不足以淬滅來自不存活的細胞的AO信號，該信號導致活酵母和死酵母之間較差的區(qū)分。然而，如果AO的濃度超過20ug/mL,則由于抑制自身熒光的二聚體的形成，可能發(fā)生AO分子的自淬滅。另一方面，如果AO的濃度低于PI，AO信號會變?nèi)?，但會在活酵母和死酵母之間提供良好的區(qū)分。因此，通過保持AO和PI在同一濃度消除了AOPI混合物不平衡的問題。使用所選擇的緩沖液和優(yōu)化的染料濃度，按照Cellometer成像細胞計數(shù)法測定每種酵母樣品的濃度和存活率。圖13顯示了七個酵母樣品的明視野圖像和熒光圖像的實例。每個熒光圖像分別為來自AO和PI通道的熒光信號與偽顏色(pseudocolors)綠色和橙色的組合。計過數(shù)的酵母細胞被軟件圈出來，這明確地區(qū)分了活細胞、不存活的細胞和殘渣。被有效染色的酵母細胞具有高熒光強度，而玉米醪非特異性信號被最小化。對樣品1-7計算的平均總細胞濃度分別為0.41、1.33、1.20,0.94、1.31、1.32和0.97XIO8個顆粒/mL，而平均存活率測定值分別為83.8%,90.4%,94.0%,75.9%,80.8%,60.9%和24.1%.使用手動細胞計數(shù)法測定的樣品1-7的平均總細胞濃度分別為0.54、1.43、1.31,0.78、1.18、1.14,0.85XIO8個顆粒/mL，且平均存活率測定值分別為80.0%,90.7%,85.9%,72.3%,80.5%,60.3%和19.5%(圖13)。雖然由于稠混合物的移液不足，兩個樣品(I和4)顯示出較低的細胞濃度，但從Cellometer和細胞計數(shù)器兩者中所獲得的結果是一致的。除樣品I和樣品4以外，其他樣品對Cellometer和細胞計數(shù)器分別表現(xiàn)出1.18XIO8和1.22XIO8個顆粒/mL的平均值，這顯示了新型成像細胞計數(shù)方法在樣品之間的一致性。由于初始酵母和玉米醪樣品用稀釋緩沖液進行了1:20(v/v)的稀釋，因此得到的計數(shù)結果自動乘以因子20。濃度測定的移液誤差并不影響本試驗中的存活率測定，因為存活細胞和不存活細胞的細胞計數(shù)比得到了適當?shù)販y定。由于乙醇百分比的增加，存在存活率降低的總趨勢，這在圖14中繪制出來。在本實驗中，Cellometer能夠證明在整個發(fā)酵過程中存活率的降低。在細胞培養(yǎng)級H2O中稀釋的對照樣品，由于弱的活細胞熒光信號和來自玉米醪的非特異性熒光信號，顯示出很差的成像結果(圖15)。利用CellometerVision和本發(fā)明的稀釋緩沖液的結合直接測定發(fā)酵罐中的酵母濃度和存活率對美國的生物燃料產(chǎn)業(yè)具有十分重要的意義。準確地測定發(fā)酵罐中的酵母的存活率將使生物燃料工廠能夠產(chǎn)生一致的生物乙醇產(chǎn)出。此外，這將促進發(fā)酵罐之間的一致性并提高乙醇生產(chǎn)的效率。另一個優(yōu)點是縮短花費在手工細胞計數(shù)上的時間，通過使用成像細胞計數(shù)法，訓練有素的技術人員可以很容易地在不到10分鐘內(nèi)安裝和運行多個樣品。一般而言，僅在發(fā)酵過程的前2-3小時計數(shù)酵母濃度?？梢匀菀椎匾脒@種新型成像細胞計數(shù)方法的效率和有效性以在整個發(fā)酵過程中監(jiān)測酵母存活率。以前已經(jīng)證明了CellometerVision是準確和穩(wěn)定的純酵母濃度和存活率測定(http://www.nexcelom.com/Applications/Yeast-Viability.html),例如，測定玉米醪中的酵母濃度和存活率的能力，其中從存活酵母細胞和不存活的酵母細胞檢測和計數(shù)強熒光信號，而玉米醪的非特異性染色得到最小化，以促進有效的自動細胞計數(shù)算法。結合使用CellometerVision和稀釋緩沖液的計數(shù)試驗的開發(fā)為美國生物燃料工業(yè)提供了在發(fā)酵過程中一致且精確地監(jiān)測酵母存活率以確保高質(zhì)量的生物乙醇產(chǎn)出的新方法。此夕卜，在生物燃料工廠引入這種新型成像細胞計數(shù)方法可以支持提高生物乙醇生產(chǎn)的研究，隨著化石燃料的減少和全球變暖問題的加劇，這將成為一個重要的發(fā)展。(Pretorius等人，“DesignerYeastsfortheFermentationIndustryofthe21stCentury,，，F(xiàn)oodTechnologyBiotechnology,第41卷，第3-10頁，2003年；Graves等人，“EffectofpHandlacticoraceticacidonethanolproductivitybySaccharomycescerevisiaeincornmash，，，JournalofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology,第33卷，第469-474頁，2006年；Graves等人，“InteractioneffectsoflacticacidandaceticacidatdifferenttemperaturesonethanolproductionbySaccharomycescerevisiaeincornmash,”AppliedMicrobiologyandBiotechnology,第73卷，第1190-1196頁，2007年。)示例性方法稀釋緩沖液和熒光試劑0.1M的磷酸鹽緩沖液(PBS)(SigmaAldrich)和細胞培養(yǎng)級H2O也用來同本發(fā)明的緩沖液進行比較。熒光染色劑AO和PI均為核染色劑并購自Biolegend(SanDiego,CA)0AO是陽離子膜透性染料，單獨使用時，以綠色熒光標記所有細胞，而PI是完整膜不透性染料，其容易滲透膜受損的不存活的細胞，產(chǎn)生橙色焚光。(Foglieni等人，“Fluorescentdyesforcellviability:anapplicationonprefixedconditions，，，HistochemicalCellBiology,第115卷，第223-229頁，2001年；Ling等人，“ClassificationoflarvalcirculatinghemocytesofthesilkwormBombyxmori，byacridineorangeandpropidiumiodidestaining，，，HistochemicalCellBiology,第120卷，第505-511頁，2003年；Mascotti等人，“HPCviabilitymeasurement:trypanblueversusacridineorangeandpropidiumiodide，，’Transfusion，第40卷，第693-696頁，2000年；So1mon等人，“Factorsinfluencingcordbloodviabilityassessmentbeforecryopreservation，，，Transfusion，第50卷，第820-830頁，2010年；Wallen等人，“ComparisonofTwoFlowCytometricAssaysforCellularRNA-AcridineOrangeandPropidium1dide，”Cytometry，第3卷，第155-160頁，1980年。)由于AO發(fā)射光譜的相當一部分與PI激發(fā)光譜重疊且兩種染料均位于不存活細胞的細胞核中，因此當AO和PI同時使用時會發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。FRET是一種量子力學現(xiàn)象，其中無輻射的能量從供體(AO)轉(zhuǎn)移到受體(PI)。在這種情況下，當AO以高量子產(chǎn)率被激發(fā)時，熒光能量轉(zhuǎn)移，從而激發(fā)不存活的細胞中的PI，這淬滅了它們的AO信號。(Gordon等人，“QuantitativeFluorescenceResonanceEnergyTransferMeasurmentsUsingFluorescenceMicroscopy,”BiophysicalJournal,第74卷，第2702-2713頁，1998年；Koksch等人，“Fluorescenceresonanceenergytransferasanewmethodfortheepitope-specificcharacterizationofant1-plateletantibodies，，’JournalofImmunologicalMethods，第187卷，第53-67頁，1995年；Periasamy，“Fluorescenceresonanceenergytransfermicroscopy:aminireview，，，JournalofBiomedicalOptics，第6卷，第287-291頁，2201年；Selvin等人，“Luminescenceenergytransferusingaterbiumchelate:Improvementsonfluorescenceenergytransfer,ProceedingsNationalAcademyofScience，第91卷，第10024-10028頁，1994年。)Α0ΡΙ組合的特殊光學性質(zhì)使得可以明確地區(qū)分存活細胞和不存活的細胞。酵母樣品制備酵母和玉米醪的混合物由LincolnwayEnergy(Nevada,IA)提供。在發(fā)酵前[2.65h和8h(樣品1-2)]以及發(fā)酵過程中[2.5h、10h、39h、45h和55h(樣品3-7)]，從各個發(fā)酵罐中收集七種酵母和玉米醪混合物置于500mL聚丙烯瓶中用于濃度和存活率測定[來自生物燃料聯(lián)系者的信息]。針對每個樣品測定乙醇百分比和PH值，S卩[所需信息]。每個樣品用稀釋緩沖液、PBS及細胞培養(yǎng)級H2O以1:20(v/v)稀釋并裝入50mL離心管中。由于酵母混合物為泥漿狀溶液，在稀釋前必須充分振蕩瓶子。CellometerVision平臺和一次性計數(shù)室CellometerVision采用一個明視野和兩個突光通道進行圖像細胞計數(shù)分析(圖11)。對于AO通道，激發(fā)和發(fā)射濾波片組分別為475nm和535nm。對于PI通道，激發(fā)和發(fā)射濾波片組分別為540nm和670nm。Cellometer系統(tǒng)自動在兩個通道之間切換以測定存活細胞和不存活細胞的濃度，并生成每個樣品的存活率。一次性計數(shù)室正好容納20yL樣品(圖12)。四個獨立的區(qū)域在計數(shù)室上進行成像和分析，這通過計數(shù)算法進行，從而產(chǎn)生準確和一致的濃度結果。緩沖液的選擇比較在Nexcelom稀釋緩沖液、PBS和細胞培養(yǎng)級H2O(如上所述)中稀釋的酵母和玉米醪混合物的熒光信號，以便為濃度和存活率測定選擇最佳的緩沖液。隨機選擇酵母樣品2(10iiL)并用10iig/mL的AOPI混合物(10yL)染色以檢查信背比。熒光染料濃度優(yōu)化通過在所選定的優(yōu)化緩沖液中進行兩種染料的濃度系列測試來對AO和PI的濃度進行優(yōu)化。使用酵母樣品2，通過混合10uL酵母和10uL染料，以20、10、5、2.5和1.25iig/mL(終濃度)測試這兩種染料，其中最佳濃度應該對活細胞產(chǎn)生明亮的AO熒光信號或高信背比，而由于PI的淬滅效應對不存活的細胞產(chǎn)生暗淡的信號。不存活的細胞在PI通道中應該是明亮的，而存活細胞應該是暗淡的。濃度和存活率測定方案在預混酵母樣品和稀釋緩沖液后，通過上下顛倒10次在離心管中混合。然后將每個酵母樣品(10yL)與10iiL的2.5iig/mL的AOPI混合物混合，并將其孵育2_3分鐘。然后將染色的酵母樣品(20UL)吸移到細胞計數(shù)室內(nèi)并使之沉降。然后，使用CellometerVision一式三份計數(shù)和分析每個樣品。手動細胞計數(shù)儀計數(shù)方法針對7個樣品中的每一個，從CellometerVision平臺捕獲的圖像在兩個Cellometer計數(shù)室中進行手動計數(shù)。然后將所得的濃度和存活率結果與用軟件自動計數(shù)的結果進行比較。參考文獻[1]D.An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用第一染料和第二染料對將要測定酵母存活率的樣品進行染色；獲取經(jīng)第一染料染色的樣品的熒光圖像；獲取經(jīng)第二染料染色的樣品的熒光圖像；及比較經(jīng)第一染料染色的樣品的熒光圖像和經(jīng)第二染料染色的樣品的熒光圖像以確定酵母存活率。13.權利要求12的方法，其中所述第一染料選自吖啶橙、SYTO9、DAP1、Hescht、Calcofluor白，且所述第二染料選自碘化丙錠、溴化乙錠、Oxono1、Mg-ANS。14.權利要求12的方法，其中所述第一染料為吖啶橙，且所述第二染料為碘化丙錠。15.權利要求12的方法，其中所述緩沖液條件具有約10.5至約12的pH。16.權利要求15的方法，其中所述緩沖液條件具有約10.5至約11.5的pH。17.權利要求12的方法，其中所述將要測定酵母存活率的樣品為來自生物燃料發(fā)酵工藝的樣品。18.權利要求17的方法，其中所述生物燃料包含乙醇。19.權利要求17的方法，其中所述生物燃料包含丁醇。20.權利要求17的方法，其中所述將要測定酵母存活率的樣品包含玉米醪的殘渣。21.權利要求17的方法，其中所述將要測定酵母存活率的樣品包含甘蔗的殘渣。22.權利要求12的方法，其中所述酵母為釀酒酵母種。23.權利要求14的方法，其中吖啶橙的濃度為約Iμg/mL至約5μg/mL,且碘化丙錠的濃度為約IUg/mL至約5μg/mL。24.一種用于確定存活酵母細胞的濃度的方法,包括:在PH為約10至約12.5的緩沖液條件下，用染料對待測樣品進行染色；獲取經(jīng)染料染色的樣品的至少一幅靜態(tài)熒光圖像；及分析所述經(jīng)染料染色的樣品的至少一幅靜態(tài)熒光圖像，以確定樣品中的存活酵母細胞的濃度。25.權利要求24的方法，其中所述染料選自吖啶橙、SYTO9,DAPI,Hescht,Calcofluor白、碘化丙錠、溴化乙錠、Oxono1、Mg-ANS。26.權利要求24的方法，其中所述染料為吖啶橙。27.權利要求24的方法，其中所述緩沖液條件具有約10.5至約12的pH。28.權利要求27的方法，其中所述緩沖液條件具有約10.5至約11.5的pH。29.權利要求24的方法，其中所述待測樣品為來自生物燃料發(fā)酵工藝的樣品。30.權利要求29的方法，其中所述生物燃料包含乙醇或丁醇。31.權利要求29的方法，其中所述待測樣品包含玉米醪或甘蔗的殘渣。32.權利要求24的方法，其中所述酵母為釀酒酵母種。33.權利要求26的方法，其中吖啶橙的濃度為約IUg/mL至約5ug/mL。34.一種用于確定酵母存活率的方法，包括:在pH為約10.5至約12.5的緩沖液條件下，用吖啶橙對將要測定酵母存活率的樣品進行染色；通過將激發(fā)光束指向樣品獲取經(jīng)吖啶橙染色的樣品的至少一幅靜態(tài)熒光圖像；在約10.5至約12.5的pH的緩沖液條件下，用碘化丙錠對將要測定酵母存活率的樣品進行染色；通過將激發(fā)光束指向樣品獲取經(jīng)碘化丙錠染色的樣品的至少一幅靜態(tài)熒光圖像；比較經(jīng)吖啶橙染色的樣品的至少一幅靜態(tài)熒光圖像和經(jīng)碘化丙錠染色的樣品的至少一幅靜態(tài)熒光圖像'及確定所述樣品的酵母存活率。35.權利要求34的方法，其中所述緩沖液條件具有約10.5至約12的pH。36.權利要求34的方法，其中所述待測樣品為來自生物燃料發(fā)酵過程的樣品。37.權利要求36的方法，其中所述生物燃料包含乙醇或丁醇。38.權利要求37的方法，其中所述酵母為釀酒酵母種。39.權利要求34的方法，其中吖啶橙的濃度為約IUg/mL至約5ug/mL,且碘化丙錠的濃度為約Iyg/mL至約5ug/mL。全文摘要本發(fā)明一般地涉及分析酵母存活率。更具體地，本發(fā)明涉及用于獲取和測定酵母細胞的存活率和濃度的高效和有效的方法和組合物。文檔編號G01N33/52GK103154264SQ201180034271公開日2013年6月12日申請日期2011年6月6日優(yōu)先權日2010年6月7日發(fā)明者L·L·錢申請人:耐克思樂生物科學有限責任公司