專利名稱：使用發(fā)光探針檢測(cè)溶液中稀疏顆粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及光學(xué)分析方法，其通過使用可檢測(cè)源自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)如共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，在諸如分散或溶解于溶液中的原子、分子或其聚集體(下文中，這些稱為“顆?！?例如生物分子如蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或這些的聚集體、病毒和細(xì)胞等粒狀對(duì)象，或者非生物顆粒的狀態(tài)(相互作用、結(jié)合或解離狀態(tài)等)的分析中獲得有用信息，更具體地，涉及借助發(fā)光探針進(jìn)行溶液中粒狀對(duì)象的檢測(cè)、其濃度或其數(shù)密度的測(cè)定等的方法。具體而言，在本說明書中，“發(fā)光探針”為通過熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等發(fā)光，并結(jié)合至要成為觀測(cè)對(duì)象物的顆粒以能夠觀測(cè)所述顆粒的物質(zhì)。
背景技術(shù)：
根據(jù)近年來光學(xué)測(cè)量技術(shù)的發(fā)展，通過使用共焦顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)和能夠計(jì)數(shù)光子 (單一光子檢測(cè))的超高靈敏光檢測(cè)技術(shù)已變得能夠在單一光子或單一熒光分子水平下檢測(cè)和/或測(cè)量微光。因此，存在借助此類微光測(cè)量技術(shù)進(jìn)行生物分子等的分子間相互作用、結(jié)合或解離反應(yīng)的檢測(cè)的各種提議的裝置或方法。例如，在借助激光共焦顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)的突光相關(guān)光譜學(xué)(fluorescence correlation spectroscopy, FCS,參見例如專利文獻(xiàn)I和2和非專利文獻(xiàn)1-3)中，對(duì)進(jìn)出試樣溶液的微小區(qū)域(顯微鏡的激光集中的聚焦區(qū)域，稱為“共焦體積(confocal volume)”)的熒光分子或熒光標(biāo)記的分子(熒光分子等)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，并基于由所測(cè)量的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)值來確定的熒光分子等的平均滯留時(shí)間(dwell time)(平移擴(kuò)散時(shí)間)和微小區(qū)域中滯留分子數(shù)的平均值，實(shí)現(xiàn)了信息如熒光分子的移動(dòng)速度、大小或濃度等的獲得，和/或各種現(xiàn)象如分子結(jié)構(gòu)或大小的變化、分子的結(jié)合或解離反應(yīng)或者分散和凝集的檢測(cè)。另外，在熒光強(qiáng)度分布分析(Fluorescence Intensity Distribution Analysis, FIDA,例如專利文獻(xiàn)3)或光子計(jì)數(shù)直方圖(Photon Counting Histogram, PCH,例如專利文獻(xiàn)4)中，生成有與FCS類似測(cè)量的進(jìn)出共焦體積的熒光分子等的熒光強(qiáng)度的直方圖，通過將統(tǒng)計(jì)學(xué)模型公式擬合(fitting)為直方圖的分布來計(jì)算熒光分子等的固有亮度的平均值和滯留在共焦體積中的分子的平均數(shù)，從而基于這些信息，可估計(jì)分子的結(jié)構(gòu)或大小的變化、結(jié)合或解離狀態(tài)或分散和凝集狀態(tài)。此外，在專利文獻(xiàn)5和6中，提出了基于使用共焦顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)測(cè)量試樣溶液的熒光信號(hào)的時(shí)間經(jīng)過(time progress)來檢測(cè)突光物質(zhì)的方法。專利文獻(xiàn)7已提出了通過光子計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)量從流經(jīng)流式細(xì)胞儀的熒光細(xì)顆?；蚬潭ㄔ诨迳系臒晒饧?xì)顆粒的微光以檢測(cè)流路中或基板上熒光細(xì)顆粒的存在的信號(hào)計(jì)算處理技術(shù)。特別地，根據(jù)采用使用共焦顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)如FCS和FIDA對(duì)微小區(qū)域的熒光測(cè)量技術(shù)的方法，測(cè)量所需的試樣量可極小(用于一次測(cè)量的量至多幾十μ L)，與現(xiàn)有技術(shù)相比其濃度極低，測(cè)量時(shí)間也大幅縮短(在一個(gè)實(shí)施方案中，重復(fù)幾次時(shí)間為秒級(jí)的測(cè)量過程)。因此，期望這些技術(shù)，特別是在進(jìn)行通常用于醫(yī)學(xué)或生物學(xué)研究和開發(fā)領(lǐng)域中的稀有或昂貴的試樣的分析時(shí)，或在進(jìn)行如病的臨床診斷或生物活性物質(zhì)篩選等的大量試樣的試驗(yàn)時(shí)，與常規(guī)生物化學(xué)方法相比，能夠以低成本和/或快速地實(shí)驗(yàn)或檢查的強(qiáng)有力的工具?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1:日本專利特開2005-098876
專利文獻(xiàn)2 日本專利特開2008-292371
專利文獻(xiàn)3 日本專利4023523
專利文獻(xiàn)4 W02008-080417
專利文獻(xiàn)5 日本專利特開2007-20565
專利文獻(xiàn)6 日本專利特開2008-116440
專利文獻(xiàn)7 日本專利特開平4-337446
非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn) I Masataka Kaneshiro; “Protein, Nucleic acid, Enzymelo1. 44，Nο.9，1431-1438 頁，1999
非專利文獻(xiàn) 2 F.J.Meyer-Alms; “Fluorescence CorrelationSpectroscopy” edt. R. Rigler, Springer, Berlin, 204-224 頁,2000
非專利文獻(xiàn) 3 :Noriko Kato, et al. “Gene medicine”，Vol. 6，No. 2，271-277 頁
非專利文獻(xiàn) 4 S . Sando and E. T. Kool, J. Amer. Chem.
Soc,2002，Vol. 124，2096-2097 頁

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題簡(jiǎn)言之，在上述光學(xué)分析技術(shù)如FCS、FIDA和PCH中，通過統(tǒng)計(jì)程序來計(jì)算所測(cè)熒光強(qiáng)度的時(shí)間波動(dòng)的量級(jí)，然后基于波動(dòng)量級(jí)確定進(jìn)出試樣溶液中的微小區(qū)域的熒光分子等的各種特性。因此，為了獲得上述光學(xué)分析技術(shù)的顯著性結(jié)果，可優(yōu)選將要成為試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象物的熒光分子等的濃度或數(shù)密度制備為在平衡狀態(tài)下時(shí)長(zhǎng)為秒級(jí)的一次測(cè)量中，使能夠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的數(shù)量的熒光分子等進(jìn)出微小區(qū)域，優(yōu)選使約一個(gè)熒光分子等總是存在于微小區(qū)域中(典型地，由于共焦體積的體積約為lfL，可優(yōu)選熒光分子等的濃度約為InM以上。)。換言之，當(dāng)試樣溶液中觀測(cè)顆粒的濃度或數(shù)密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于能夠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的水平(例如，遠(yuǎn)低于InM)時(shí)，將發(fā)生在測(cè)量中觀測(cè)對(duì)象物很少進(jìn)入微小區(qū)域的狀態(tài)，因此，熒光強(qiáng)度的測(cè)量結(jié)果將包括長(zhǎng)期在微小區(qū)域中根本沒有觀測(cè)對(duì)象物存在的狀態(tài)，以及顯著熒光強(qiáng)度的觀測(cè)量將減少，因而在基于如上所述熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)波動(dòng)的光學(xué)分析技術(shù)中不能期望顯著或精確的分析結(jié)果。在記載于專利文獻(xiàn)5和6中的使用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)熒光物質(zhì)的方法中，在不進(jìn)行如上所述的熒光強(qiáng)度波動(dòng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的情況下，試樣中觀測(cè)的熒光分子等的存在與否可由幾秒的測(cè)量中具有顯著強(qiáng)度的熒光信號(hào)產(chǎn)生與否來確定，并公開獲得具有顯著強(qiáng)度的熒光信號(hào)的頻率與試樣中熒光分子等的數(shù)量之間的關(guān)系。特別地，在專利文獻(xiàn)6中，教導(dǎo)攪動(dòng)試樣溶液內(nèi)部的不規(guī)則流動(dòng)的產(chǎn)生改善了檢測(cè)靈敏度。然而，即使在那些方法中，也只是檢測(cè)通過擴(kuò)散或不規(guī)則流動(dòng)而隨機(jī)進(jìn)入微小區(qū)域的熒光分子等的存在，而不能掌握微小區(qū)域中的熒光分子等顆粒的行為，因此，例如還未實(shí)現(xiàn)顆粒計(jì)數(shù)或顆粒的濃度或數(shù)密度的定量計(jì)算。此外，專利文獻(xiàn)7中所記載的技術(shù)為單獨(dú)檢測(cè)在流式細(xì)胞儀的流路(flow)中的熒光細(xì)顆?；蚬潭ㄔ诨迳系臒晒饧?xì)顆粒的存在，而不是檢測(cè)顆粒如通常狀態(tài)下溶解或分散在試樣溶液中的分子和膠體，即在試樣溶液中隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的顆粒的技術(shù)，因此，還未實(shí)現(xiàn)定量計(jì)算出溶解或分散在試樣溶液中的顆粒的濃度或數(shù)密度。另外，由于專利文獻(xiàn)7的技術(shù)包括例如在流式細(xì)胞儀中測(cè)量或?qū)晒忸w粒固定在基板上的處理的方法，試驗(yàn)所必需的試樣量與光學(xué)分析技術(shù)如FCS、FIDA和PCH相比大幅增加，并且對(duì)進(jìn)行試驗(yàn)的人員可要求復(fù)雜高級(jí)的操作技術(shù)。然后，為了在進(jìn)行光學(xué)分析技術(shù)如FCS、FIDA和PCH時(shí)不使用統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，由此實(shí)現(xiàn)在要觀測(cè)顆粒的濃度或數(shù)密度低于前述光學(xué)分析技術(shù)中所使用的水平的試樣溶液中觀測(cè)的顆粒的狀態(tài)或特性的檢測(cè)。本申請(qǐng)的申請(qǐng)人在日本專利申請(qǐng)2010-04714和PCR/JP2011/53481中的新原理的基礎(chǔ)上提出對(duì)觀測(cè)顆粒進(jìn)行觀測(cè)的光學(xué)分析技術(shù)。簡(jiǎn)言之，在該新的光學(xué)分析技術(shù)中，使用能夠檢測(cè)來自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)，如類似于FCS、FIDA等的共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，另外，微小區(qū)域的位置即光檢測(cè)區(qū) 域在試樣溶液中移動(dòng)，即用微小區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)部，并且當(dāng)發(fā)光的顆粒(下文稱作“發(fā)光顆?！?在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)，橫穿微小區(qū)域的內(nèi)部時(shí)，檢測(cè)微小區(qū)域中從發(fā)光顆粒發(fā)出的光，從而單獨(dú)檢測(cè)出試樣溶液中的各發(fā)光顆粒，以便變得能夠進(jìn)行發(fā)光顆粒的計(jì)數(shù)并獲取關(guān)于試樣溶液中發(fā)光顆粒的濃度和數(shù)密度的信息。根據(jù)該新型光學(xué)分析技術(shù)(此后稱為“掃描分子計(jì)數(shù)法”)，類似于光學(xué)分析技術(shù)如FCS、FIDA和PCH，測(cè)量所必需的試樣量少(例如，約幾十μ L)，測(cè)量時(shí)間短，此外，與光學(xué)分析技術(shù)如FCS、FIDA和PCH的情況相比，變得能夠在較低濃度或數(shù)密度下定量檢測(cè)性質(zhì)如發(fā)光顆粒的濃度或數(shù)密度。為了進(jìn)一步開發(fā)上述專利申請(qǐng)2010-044714中提出的掃描分子計(jì)數(shù)法，本發(fā)明的主要目的為提出借助發(fā)光探針有利地采用特別用于觀察試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的顆粒的掃描分子計(jì)數(shù)法的方法。用于解決問題的方案根據(jù)本發(fā)明，提供一種光學(xué)分析方法，其通過使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)來自結(jié)合至在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的顆粒的發(fā)光探針的光從而檢測(cè)顆粒，所述光學(xué)分析方法的特征在于包括以下步驟制備包含所述顆粒和所述發(fā)光探針的試樣溶液；通過改變光學(xué)系統(tǒng)的光學(xué)通路而在所述試樣溶液中移動(dòng)所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置；在所述試樣溶液中移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域的位置的過程中，檢測(cè)來自所述光檢測(cè)區(qū)域的光；和在所述檢測(cè)光中單獨(dú)檢測(cè)來自結(jié)合至各所述顆粒的所述發(fā)光探針的光信號(hào)從而單獨(dú)檢測(cè)所述顆粒。在該結(jié)構(gòu)中，“在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的顆?！睘橹T如在試樣溶液中分散或溶解的原子、分子或其聚集體等的顆粒(所述顆?？蔀榘l(fā)光顆粒或不發(fā)光顆粒任一種)，其也可為在溶液中自由地進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)而不固定在基板等上的任意粒狀物質(zhì)。另外，“發(fā)光探針”為具有結(jié)合至要成為觀測(cè)對(duì)象的顆?；蚺c之締合，并發(fā)光的特性的物質(zhì)(通常為分子或其聚集體)，典型地，其為熒光顆粒，但可為通過磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等發(fā)光的顆粒。共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測(cè)區(qū)域”為在這些顯微鏡中檢測(cè)光的微小區(qū)域，所述區(qū)域?qū)?yīng)于當(dāng)照明光從物鏡給出時(shí)照明光聚集的區(qū)域。在這一點(diǎn)上，特別是在共焦顯微鏡中，根據(jù)物鏡與針孔(pinhole)的空間關(guān)系來確定該區(qū)域。對(duì)于沒有照明光而發(fā)光的發(fā)光探針，例如根據(jù)化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光而發(fā)光的分子或其聚集體，在顯微鏡中不需要照明光。就這一點(diǎn)而言，在本說明書中，除另有說明以外，“光信號(hào)”是指“表示來自已結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針的光的信號(hào)”。如上述所理解的，在本發(fā)明的基本結(jié)構(gòu)中，首先，在通過任意方法制備其中混合了要檢測(cè)的顆粒和結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針的試樣溶液后，在試樣溶液中移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的同時(shí)，即用光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液的內(nèi)部的同時(shí)，順次進(jìn)行光的檢測(cè)。然后，當(dāng)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域包括隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的已結(jié)合至顆?；蚺c顆粒締合的發(fā)光探針時(shí)，通過光檢測(cè)部檢測(cè)來自發(fā)光探針的光，從而檢測(cè)一個(gè)顆粒的存在。(依賴于實(shí)驗(yàn)方式，發(fā)光探針可能在檢測(cè)光時(shí)從發(fā)光探針曾結(jié)合的顆粒中解離)。另外，在順次檢測(cè)的光中，單獨(dú)檢測(cè)來自發(fā)光探針的光信號(hào)，從而逐個(gè)順次檢測(cè)(已結(jié)合至發(fā)光探針)顆粒的單獨(dú)存在，因而將獲取溶液中顆粒狀態(tài)的各種信息。具體地，例如在上述結(jié)構(gòu)中，可通過計(jì)數(shù)單獨(dú)檢測(cè)顆粒的數(shù)量來計(jì)數(shù)在光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)過程中所檢測(cè)的顆粒的數(shù)量(顆粒的計(jì)數(shù))。根據(jù)該結(jié)構(gòu)，通過將顆?！さ臄?shù)量與光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)量相關(guān)聯(lián)，將獲取試樣溶液中顆粒的數(shù)密度或濃度的信息。特別地，通過借助任意方法，例如借助在預(yù)定速度下移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置來確定光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡的整個(gè)體積，可具體計(jì)算顆粒的數(shù)密度或濃度。當(dāng)然，代替直接確定絕對(duì)數(shù)密度值或濃度值，可計(jì)算與多個(gè)試樣溶液或作為濃度或數(shù)密度的參考的標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液對(duì)應(yīng)的數(shù)密度或濃度的相對(duì)比。此外，在上述本發(fā)明中，由于通過改變光學(xué)系統(tǒng)的光路來移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置，所以光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)快速，而實(shí)質(zhì)上不發(fā)生在試樣溶液中的機(jī)械振動(dòng)和流體動(dòng)力效應(yīng)，因而可在穩(wěn)定狀態(tài)下進(jìn)行光測(cè)量，而不影響要檢測(cè)顆粒的動(dòng)力學(xué)作用(試樣溶液中的振動(dòng)和流動(dòng)作用可改變顆粒的性質(zhì))。另外，由于不需要使試樣溶液流動(dòng)的結(jié)構(gòu)，因此與FCS和FIDA等相類似可用少量試樣溶液(在一至幾十μ L的水平下)來進(jìn)行測(cè)量和分析。在上述本發(fā)明的方法中單獨(dú)檢測(cè)顆粒的步驟中，已結(jié)合至一個(gè)顆粒的發(fā)光探針(依賴于實(shí)驗(yàn)方式，包括一個(gè)發(fā)光探針已結(jié)合至一個(gè)顆粒的情況，兩個(gè)或更多個(gè)發(fā)光探針已結(jié)合至一個(gè)顆粒的情況以及已結(jié)合至一個(gè)顆粒的發(fā)光探針從顆粒中解離的情況；以下均相同)是否已進(jìn)入了光檢測(cè)區(qū)域的判定可由順次檢測(cè)的光信號(hào)基于時(shí)間序列中所檢測(cè)的光信號(hào)的形狀來進(jìn)行。在實(shí)施方案中，典型地，可設(shè)計(jì)為當(dāng)檢測(cè)具有比預(yù)設(shè)閾值大的強(qiáng)度的光信號(hào)時(shí)，檢測(cè)到一個(gè)已結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針已進(jìn)入了光檢測(cè)區(qū)域。此外，在移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的上述步驟中，基于已結(jié)合至試樣溶液中的顆粒的發(fā)光探針的特性或數(shù)密度或濃度而適當(dāng)?shù)馗淖冊(cè)嚇尤芤褐泄鈾z測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的，可根據(jù)已結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針在試樣溶液中的特性、數(shù)密度或濃度而改變來自該發(fā)光探針的光的檢測(cè)條件。特別地，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度變快時(shí)，從已結(jié)合至顆粒的一個(gè)發(fā)光探針?biāo)@得的光的量將減少，因此優(yōu)選可適當(dāng)?shù)馗淖児鈾z測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度，以便可精確或在足夠靈敏度下測(cè)量來自一個(gè)已結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針的光。此外，在移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的上述步驟中，優(yōu)選將試樣溶液中光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為比已結(jié)合至作為檢測(cè)對(duì)象的顆粒的發(fā)光探針(即，依賴于實(shí)驗(yàn)方式，顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體(combination),或在已結(jié)合至顆粒后從顆粒解離的發(fā)光探針)的擴(kuò)散移動(dòng)速度(由于布朗運(yùn)動(dòng)引起的顆粒的平均移動(dòng)速度)高。如上所解釋的，在本發(fā)明的方法中，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域穿過已結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針存在的位置時(shí)，檢測(cè)來自發(fā)光探針的光，以便將單獨(dú)檢測(cè)發(fā)光探針。然而，當(dāng)已結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針由于布朗運(yùn)動(dòng)而隨機(jī)移動(dòng)，以致多次進(jìn)出光檢測(cè)區(qū)域時(shí)，將多次檢測(cè)來自一個(gè)已結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針的光信號(hào)(顯示要檢測(cè)顆粒的存在)，因此，將變得難以使一個(gè)要檢測(cè)的顆粒的存在與所檢測(cè)光信號(hào)相關(guān)聯(lián)。那么，如上所述，將光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度設(shè)定為高于已結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針的擴(kuò)散移動(dòng)速度，從而變得能夠?qū)⒁粋€(gè)已結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針與一個(gè)發(fā)光信號(hào)(表示顆粒的存在)相對(duì)應(yīng)。就這一點(diǎn)而言，由于擴(kuò)散移動(dòng)速度依賴于已結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針而不同，因此如上所述，優(yōu)選可根據(jù)已結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針的特性(特別是擴(kuò)散常數(shù))適當(dāng)?shù)馗淖児鈾z測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度?？梢砸匀我夥绞竭M(jìn)行光學(xué)系統(tǒng)光路的改變以移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置。例如，可通過使用激光掃描式光學(xué)顯微鏡中所采用的電流鏡(galvanomirror)改變光路來改變光檢測(cè)區(qū)域的位置。光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡可任意設(shè)定，例如可從圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線軌跡中選擇。順便提及，如上述解釋所理解的，在本發(fā)明的方法中，通過檢測(cè)來自已結(jié)合至顆粒或與其締合的發(fā)光探針的光來求出要檢測(cè)的顆粒的存在。因此，當(dāng)未結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針存在于試樣溶液中時(shí)，顆粒的檢測(cè)結(jié)果的精確度將劣化。所以，在本發(fā)明方法的實(shí)施方案中，可優(yōu)選包括用于防止檢測(cè)來自未結(jié)合至試樣溶液中顆粒的發(fā)光探針的光的結(jié)構(gòu)。作為此類用于防止檢測(cè)來自未結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針的光的結(jié)構(gòu)之一，在本發(fā)明方法中的制備試樣溶液的步驟中，可進(jìn)行從試樣溶液中分離未結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針的步驟。對(duì)于分離未結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針的具體技術(shù)，可選擇如下任意方法通過利用單一發(fā)光探針或未結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針，與顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或已結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針之間的特性的差異例如大小或分子量、對(duì)任意物質(zhì)的親和性、帶電狀態(tài)等的差異來物理分離兩種或更多種物質(zhì)。在單獨(dú)的發(fā)光探針或未結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針的分離技術(shù)的實(shí)施方案中，單獨(dú)的發(fā)光探針或未結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針可通過使用任意操作方法從顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或已結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針中分離單獨(dú)的發(fā)光探針或未結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針而從試樣溶液中除去，所述任意操作方法包括通過層析(親水/疏水性層析、親和層析、離子交換層析等)、超濾、電泳、相分離、離心分離、溶劑提取、過濾吸附等吸附和提取或洗漆。此外，對(duì)于用于防止檢測(cè)來自未結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針的光的可選結(jié)構(gòu)，可將方法設(shè)計(jì)為通過選擇發(fā)光探針或試樣溶液中的其他組分從而提供試樣溶液中的單獨(dú)的發(fā)光探針或未結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針與顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或已結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針之間發(fā)光特性的差異，或者從而避免單獨(dú)的發(fā)光探針或未結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針的光(從試樣溶液中)發(fā)出，變得能夠來區(qū)別單獨(dú)的發(fā)光探針或未結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針與顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或已結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針。該結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)在于不需要從顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或已結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針物理分離單獨(dú)的發(fā)光探針或未結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針的操作。在上述本發(fā)明的方法中，作為此類結(jié)構(gòu)的實(shí)例，可選擇當(dāng)結(jié)合至要檢測(cè)的顆粒時(shí)其發(fā)光特性改變的物質(zhì)作為發(fā)光探針，以便在檢測(cè)光的步驟中可選擇性地檢測(cè)來自已結(jié)合至要檢測(cè)顆粒的發(fā)光探針的光。例如，當(dāng)要檢測(cè)顆粒為核酸或核酸類似物時(shí)，將選擇當(dāng)結(jié)合至核酸或核酸類似物時(shí)顯示熒光強(qiáng)度增加和/或熒光波長(zhǎng)改變的嵌入劑熒光染料作為發(fā)光探針，而當(dāng)要檢測(cè)顆粒為蛋白質(zhì)時(shí)，將選擇當(dāng)結(jié)合至蛋白質(zhì)時(shí)由于其周圍環(huán)境改變而使其熒光強(qiáng)度和/或熒光波長(zhǎng)改變的染料(熒光染料如疏水性探針ANS、MANS、TNS)作為發(fā)光探針。或者，作為發(fā)光探針，可采用由至少兩種組分組成的物質(zhì)，其中當(dāng)該物質(zhì)結(jié)合至要檢測(cè)顆粒時(shí)由于上述至少兩種組分的相對(duì)位置變化而發(fā)出熒光。對(duì)于此類物質(zhì)的實(shí)例，認(rèn)為存在由于當(dāng)結(jié)合至特定顆粒時(shí)的結(jié)構(gòu)改變而會(huì)發(fā)出強(qiáng)熒光的熒光蛋白和當(dāng)結(jié)合至特定顆粒時(shí)會(huì)組裝以形成熒光金屬配合物的分子(配合物的配體)。根據(jù)這些結(jié)構(gòu)，在任何情況下，單獨(dú)的發(fā)光探針或未結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針很難發(fā)光，或者即使發(fā)光，其波長(zhǎng)也不同于顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體的波長(zhǎng)，因此能夠選擇性地檢測(cè)來自顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體的光。此外，在試樣溶液中對(duì)于用于提供單獨(dú)的發(fā)光探針或未結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針與顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或已結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針之間發(fā)光特性的差異的可選結(jié)構(gòu)，可有利地使用熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。作為此類實(shí)例，例如在制備試樣溶液的步驟中，可進(jìn)行將未結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針與吸收發(fā)光探針?biāo)l(fā)出的光的受體結(jié)合的步驟。這里，受體為僅結(jié)合至單獨(dú)的發(fā)光探針或未結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針或者與之締合，并且通過熒光能量轉(zhuǎn)移(立刻)吸收發(fā)光探針?biāo)l(fā)出的光的任意物質(zhì)(猝滅劑或能量受體)。根據(jù)該結(jié)構(gòu)，即使當(dāng)未結(jié)合至要檢測(cè)顆粒的發(fā)光探針進(jìn)入光檢測(cè)區(qū)，該發(fā)光探針也已結(jié)合至受體，也因此不發(fā)光或僅發(fā)出與來自顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或已結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針的光的波長(zhǎng)不同的光，從而變得能夠僅檢測(cè)顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或已結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針的光。作為實(shí)例，在要檢測(cè)顆粒為核酸或核酸類似物和發(fā)光探針為熒光標(biāo)記的核酸或核酸類似物的情況下，當(dāng)通過使要檢測(cè)顆粒與發(fā)光探針在試樣溶液中反應(yīng)來形成顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體時(shí)，并隨后當(dāng)將已與發(fā)光探針的熒光標(biāo)簽的光受體附著的核酸或核酸類似物添加到試樣溶液中時(shí)，已與受體附著的核酸或核酸類似物結(jié)合至未與要檢測(cè)顆粒結(jié)合的發(fā)光探針，從而變得能夠選擇性地檢測(cè)僅來自顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體的光。另外，在使用熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的另一實(shí)例中，可采用作為發(fā)光探針的物質(zhì)，該物質(zhì)具有當(dāng)相互接近時(shí)產(chǎn)生熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的能量供體部位和能量受體部位，其中當(dāng)該物質(zhì)結(jié)合至要檢測(cè)顆粒時(shí)能量供體部位和能量受體部位之間的距離改變(分子信標(biāo)法、蝎子法(Scorpion method)等)。在該情況下，由于突光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的發(fā)生程度取決于發(fā)光探針是否結(jié)合至要檢測(cè)顆粒而變化，所以單獨(dú)的發(fā)光探針不發(fā)光或者單獨(dú)的發(fā)光探針的發(fā)光波長(zhǎng)與顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體的發(fā)光波長(zhǎng)彼此不同，從而變得能夠選擇性地檢測(cè)來自顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體的光。另外，在使用熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的其他實(shí)例中，對(duì)于發(fā)光探針，制備用于熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象中的能量供體的第一探針和用于熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象中的能量受體的第二探針，將它們與要檢測(cè)的顆粒混合。然后，第二探針的光通過熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象從第一和第二探針均結(jié)合至顆粒所形成的結(jié)合體中發(fā)出，因而在區(qū)分于來自第一探針的光的情況下，可選擇性地檢測(cè)僅來自結(jié)合體的光(在該情況下，未結(jié)合至顆粒的第二探針很難發(fā)光)。或者，在要檢測(cè)顆粒具有變?yōu)橛砂l(fā)光探針發(fā)出的光的能量受體的部位的情況下，通過選擇可用作供體的發(fā)光探針，并通過當(dāng)發(fā)光探針結(jié)合至顆粒時(shí)所發(fā)生的熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象檢測(cè)從顆粒的能量受體部位發(fā)出的光，可實(shí)現(xiàn)選擇性地僅檢測(cè)來自顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體的光，另外，反之，在要檢測(cè)顆粒具有發(fā)光部位的情況下，通過選擇具有為由顆粒的發(fā)光部位發(fā)出的光的能量受體的部位的物質(zhì)作為發(fā)光探針，并通過當(dāng)發(fā)光探針結(jié)合至顆粒時(shí)所發(fā)生的熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象檢測(cè)從發(fā)光探針發(fā)出的光，可實(shí)現(xiàn)選擇性地僅檢測(cè)來自顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體的光。典型地，通過本發(fā)明的方法檢測(cè)的顆?？蔀樯飳W(xué)粒狀對(duì)象物如生物分子,諸如蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚集體等、病毒或細(xì)胞，或者非生物顆粒(例如，原子、分子、膠束、金屬膠體等)，發(fā)光探針可為特異性或非特異性結(jié)合至或粘合至上述顆粒的任意物質(zhì)。例如，當(dāng)要檢測(cè)顆粒為核酸時(shí)，探針可為與核酸結(jié)合的染料分子、核酸結(jié)
口蟲H寸ο上述發(fā)明方法可用于使用各種發(fā)光探針檢測(cè)任意顆粒的實(shí)驗(yàn)。例如，本發(fā)明方法可應(yīng)用于如下實(shí)驗(yàn)其中采用如下物質(zhì)作為發(fā)光探針該物質(zhì)具有其間發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的能量供體部位和能量受體部位，并且當(dāng)該物質(zhì)結(jié)合至特定顆粒時(shí)能夠通過預(yù)設(shè)的分解反應(yīng)而分解；在要試驗(yàn)的試樣溶液中添加該發(fā)光探針；檢測(cè)來自試樣溶液的光；根據(jù)熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象存在與否來檢查發(fā)光探針是否已結(jié)合至上述顆粒，即上述顆粒是否存在于試樣溶液中。即，根據(jù)上述發(fā)明的一個(gè)方式，提供具有如下特征的方法發(fā)光探針具有產(chǎn)生熒光能量轉(zhuǎn)移的能量供體部位和能量受體部位；制備試樣溶液的步驟包括進(jìn)行使結(jié)合至要檢測(cè)顆粒的發(fā)光探針分解的反應(yīng)的步驟，和要檢測(cè)的光為從通過上述反應(yīng)而分解的發(fā)光探針?biāo)l(fā)出的光。發(fā)明的效果關(guān)于通過上述發(fā)明方法所實(shí)現(xiàn)的光學(xué)分析技術(shù)的光檢測(cè)機(jī)構(gòu)本身，與光學(xué)分析技術(shù)如FCS、FIDA和PCH的情況類似，采用了在共焦顯微鏡或多光子顯微鏡中檢測(cè)來自光檢測(cè)區(qū)域的光的結(jié)構(gòu)，因此試樣溶液的量可類似地小。然而，由于本發(fā)明中未進(jìn)行計(jì)算熒光強(qiáng)度波動(dòng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)步驟，所以本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)可應(yīng)用于其中顆粒的數(shù)密度或濃度基本上低于光學(xué)分析技術(shù)如FCS、FIDA和PCH所需的水平的試樣溶液。然而，由于在本發(fā)明中單獨(dú)檢測(cè)分散或溶解在溶液中的各顆粒，所以通過使用其信息變得能夠定量進(jìn)行顆粒的計(jì)數(shù)、試樣溶液中顆粒的濃度或數(shù)密度的計(jì)算或關(guān)于濃度或數(shù)密度的信息的獲取。例如，盡管專利文獻(xiàn)5和6能夠獲取在預(yù)設(shè)時(shí)間內(nèi)具有超過預(yù)設(shè)閾值的強(qiáng)度的熒光信號(hào)頻率總計(jì)值與試樣溶液中熒光分子等的顆粒數(shù)量之間的相關(guān)性，但不能掌握顆粒穿過測(cè)量區(qū)域的動(dòng)態(tài)行為(顆粒是直接穿過測(cè)量區(qū)域還是存在于測(cè)量區(qū)域內(nèi))，因此并不清楚具有高于預(yù)設(shè)閾值的強(qiáng)度的熒光信號(hào)與穿過測(cè)量區(qū)域的顆粒之間的對(duì)應(yīng)性，因此理論上不能計(jì)數(shù)發(fā)光顆粒并難以精確確定顆粒在試樣溶液中的濃度。然而，根據(jù)本發(fā)明，由于使穿過光檢測(cè)區(qū)域的顆粒以I對(duì)I的方式與所檢測(cè)的光信號(hào)相關(guān)聯(lián)，從而將一次檢測(cè)一個(gè)顆粒，變得能夠計(jì)數(shù)在溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的顆粒，并且與常規(guī)技術(shù)相比，變得能夠精確地確定顆粒在試樣溶液中的濃度或數(shù)密度。實(shí)際上，如本實(shí)施方案的欄中所記載的，已發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明，在使用發(fā)光探針的試樣溶液中單獨(dú)檢測(cè)顆粒；計(jì)數(shù)其數(shù)量并確定顆粒濃度的方法，能夠確定比基于熒光光譜儀或讀板儀(Plate reader)測(cè)量的熒光強(qiáng)度所能夠確定的濃度低得多的濃度。另外，相對(duì)于其中兩個(gè)或更多個(gè)發(fā)光探針結(jié)合至一個(gè)顆粒的系統(tǒng)，已發(fā)現(xiàn)相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，不僅在較低濃度側(cè)，而且還在較高濃度側(cè)能夠更精確地確定溶液中的顆粒濃度。此外，根據(jù)通過改變光學(xué)系統(tǒng)的光路來用光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)部的方式，由于在沒有對(duì)樣品溶液的機(jī)械振動(dòng)和流體動(dòng)力作用的情況下機(jī)械地穩(wěn)定化試樣溶液的均一條件下觀察試樣溶液的內(nèi)部，所以與例如其中使試樣中產(chǎn)生流動(dòng)的情況(當(dāng)假定流動(dòng)時(shí)，難以給出總是均一的流動(dòng)速度，并且裝置結(jié)構(gòu)變得復(fù)雜，另外，所需的試樣量大幅增加，由于流動(dòng)所引起的流體動(dòng)力作用可使溶液中的顆粒、發(fā)光探針、它們的結(jié)合體或其他物質(zhì)變質(zhì)或變性。)相比，改進(jìn)了定量檢測(cè)結(jié)果的可靠性，并且變得能夠在不存在由動(dòng)力學(xué)作用所引起的對(duì)試樣溶液中的檢測(cè)對(duì)象物的顆粒的影響或人為現(xiàn)象(artifact)的條件下進(jìn)行測(cè)量。通過解釋以下本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)將變得清楚。


[圖1]圖1 (A)為根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析裝置的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的示意圖。圖1⑶為共焦體積(共焦顯微鏡的觀察區(qū)域)的示意圖。圖1(C)為改變鏡7的方向以在試樣溶液中移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)的示意圖。[圖2]圖2(A)和(B)分別為解釋通過根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)的光檢測(cè)原理的示意圖和所測(cè)量光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化的示意圖。[圖3]圖3為示出防止檢測(cè)到未結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針的光的結(jié)構(gòu)的示意性實(shí)例的圖。[圖4]圖4㈧和⑶分別為在要觀察顆粒由于布朗運(yùn)動(dòng)而穿過光檢測(cè)區(qū)的情況下的模型圖和示出在該情況下光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)隨時(shí)間變化的實(shí)例的圖。[圖5]圖5 (A)和⑶分別為在要觀察顆粒通過以比要觀察顆粒的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度下在試樣溶液中移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置而穿過光檢測(cè)區(qū)的情況下的模型的圖，和在該情況下示出光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)隨時(shí)間變化的實(shí)例的圖。[圖6]圖6為以流程圖的形式示出從通過本發(fā)明的方法測(cè)量的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化來計(jì)數(shù)顆粒的步驟的圖。[圖7]圖7為解釋在從通過本發(fā)明的方法測(cè)量的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化來進(jìn)行顆粒計(jì)數(shù)的步驟中檢測(cè)信號(hào)的信號(hào)處理步驟的一個(gè)實(shí)例的圖。[圖8]圖8示出通過本發(fā)明的方法測(cè)量的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的實(shí)例(條形圖)；通過進(jìn)行使數(shù)據(jù)平滑化所獲得的曲線(虛線)；和在脈沖存在區(qū)域擬合的高斯函數(shù)(實(shí)線)。在該圖中，將由于噪音或污染物而標(biāo)有“噪音”的信號(hào)不視為信號(hào)。[圖9]
圖9各自示出(A)根據(jù)本發(fā)明方法的核酸濃度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果、(B)使用讀板儀的核酸濃度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和(C)核酸濃度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中的分子狀態(tài)的示意圖。[圖10]圖10各自示出(A)根據(jù)本發(fā) 明方法使用分子信標(biāo)檢測(cè)具有特定堿基序列的核酸的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，和(B)使用具有讀板儀的分子信標(biāo)檢測(cè)具有特定堿基序列的核酸的實(shí)驗(yàn)結(jié)
果O[圖11]圖11示出根據(jù)本發(fā)明方法從通過物理純化而除去未反應(yīng)的熒光標(biāo)記探針的試樣溶液中檢測(cè)要觀察顆粒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在圖中，條形圖為平均值，誤差條為標(biāo)準(zhǔn)差。[圖12]圖12(A)為示意性示出根據(jù)本發(fā)明方法使用熒光能量轉(zhuǎn)移(FRET)檢測(cè)核酸的實(shí)驗(yàn)中分子狀態(tài)的圖，和圖12(B)示出實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)脈沖數(shù)的結(jié)果。在圖中，條形圖為平均值，誤差條為標(biāo)準(zhǔn)差。[圖13]圖13(A)為示意性示出根據(jù)本發(fā)明方法使用熒光猝滅方法檢測(cè)核酸(要觀察顆粒)的實(shí)驗(yàn)中分子狀態(tài)的圖，和圖13(B)示出實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)脈沖數(shù)的結(jié)果。在圖中，條形圖為平均值，誤差條為標(biāo)準(zhǔn)差。[圖14]圖14(A)為示意性示出根據(jù)本發(fā)明方法使用QUAL反應(yīng)檢測(cè)核酸的實(shí)驗(yàn)中分子狀態(tài)的圖，和圖14(B)示出實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)脈沖數(shù)的結(jié)果。在圖中，條形圖為平均值，誤差條為標(biāo)準(zhǔn)差。[圖15]圖15示出計(jì)算熒光強(qiáng)度波動(dòng)的常規(guī)光學(xué)分析技術(shù)中所獲得的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化的實(shí)例，其中㈧示出顆粒濃度在提供足夠測(cè)量精度的水平的情況，⑶示出試樣中的顆粒濃度比(A)情況顯著低的情況。附圖標(biāo)記說明
I—光學(xué)分析裝置(共焦
2光源
3---單模光纖
4準(zhǔn)直透鏡
5，14a二向色鏡
6，7，11反射鏡
8物鏡
9---微型板
10—孔(試樣溶液容器)
12 聚光透鏡
13針孔
14-一屏障濾光片
15---多模光纖
16光檢測(cè)器17鏡偏轉(zhuǎn)器17a載物臺(tái)位置改變?cè)O(shè)備18計(jì)算機(jī)
具體實(shí)施例方式下文中，詳細(xì)描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。光學(xué)分析裝置的結(jié)構(gòu)
·
如圖1 (A)示意性所示，在基本結(jié)構(gòu)中，本發(fā)明的方法可用通過結(jié)合能夠進(jìn)行FCS、FIDA等的共焦顯微鏡和光檢測(cè)儀形成的光學(xué)分析裝置來實(shí)現(xiàn)。參照附圖，光學(xué)分析裝置I由光學(xué)系統(tǒng)2-17和用于與控制光學(xué)系統(tǒng)中各部分的操作一起來獲取和分析數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)18構(gòu)成。光學(xué)分析裝置I的光學(xué)系統(tǒng)可與常規(guī)共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)相同，其中從光源2發(fā)出并通過單模光纖3的內(nèi)部傳輸?shù)募す?Ex)形成發(fā)散為在由光纖發(fā)射端的固有NA決定的角度下放射的光；在用準(zhǔn)直透鏡4形成平行光束后，光在二向色鏡5和反射鏡6和7上反射，進(jìn)入物鏡8。在物鏡8上方，典型地放置有向其中分散有I至數(shù)十UL試樣溶液的試樣容器或具有排列于其上的孔10的微型板9，從物鏡8發(fā)出的激光聚焦在試樣容器或孔10中的試樣溶液中，形成光強(qiáng)度強(qiáng)的區(qū)域(激發(fā)區(qū)域)。在試樣溶液中，分散或溶解了作為要觀察對(duì)象物的顆粒和結(jié)合至該顆粒的發(fā)光探針，其中所述探針為發(fā)光標(biāo)簽如熒光染料附著于其上的分子，當(dāng)已結(jié)合至發(fā)光探針或與之締合的顆粒(依賴于實(shí)驗(yàn)方式，發(fā)光探針一旦結(jié)合至顆粒后便從該顆粒解離)進(jìn)入激發(fā)區(qū)域時(shí)，發(fā)光探針在位于激發(fā)區(qū)域期間被激發(fā)并發(fā)光。發(fā)出的光(Em)在穿過物鏡8和二向色鏡5后在鏡11上反射，并由聚光透鏡12聚集，然后光穿過針孔13 ;通過屏障濾光片14傳輸(其中僅選擇在特定波長(zhǎng)帶域中的光成分)；并且被導(dǎo)入多模光纖15中，到達(dá)光檢測(cè)器16，在轉(zhuǎn)換成時(shí)間序列電信號(hào)后，將信號(hào)輸入計(jì)算機(jī)18，以稍后解釋的方法進(jìn)行光學(xué)分析處理。就這一點(diǎn)而言，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，在上述結(jié)構(gòu)中，針孔13位于物鏡8的焦點(diǎn)位置的接合(conjugate)位置，如圖1(B)所示意性示出的，在從激光共焦區(qū)域，即激發(fā)區(qū)域以外的區(qū)域發(fā)出的光被阻斷的情況下，僅從激光的焦點(diǎn)區(qū)域，即激發(fā)區(qū)域發(fā)出的光穿過針孔13。圖1(B)所示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域?yàn)樵摴鈱W(xué)分析裝置的光檢測(cè)區(qū)域，其有效體積通常為約1-10 μ L(典型地，光強(qiáng)度根據(jù)在區(qū)域中心具有峰的高斯型或洛倫茲型分布而傳播。有效體積為與光強(qiáng)度減少至峰強(qiáng)度的Ι/e2的表面毗連的近似橢圓體的體積)，其稱為“共焦體積”。此外，由于本發(fā)明檢測(cè)來自一個(gè)顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或一個(gè)探針的光，例如來自一個(gè)或多個(gè)熒光染料分子的微光，優(yōu)選地，將可用于光子計(jì)數(shù)的超高靈敏度的光檢測(cè)器用于光檢測(cè)器16。另外，在顯微鏡的載物臺(tái)(未示出)上，可提供有用于移動(dòng)微型板9的水平位置的載物臺(tái)位置改變?cè)O(shè)備17a，以便改變要觀察的孔10。載物臺(tái)位置改變?cè)O(shè)備17a的操作可通過計(jì)算機(jī)18來控制。根據(jù)該結(jié)構(gòu)，甚至在兩種或更多種樣本存在下也能夠?qū)崿F(xiàn)快速測(cè)量。此外，在上述光學(xué)分析裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，提供用于改變光學(xué)系統(tǒng)的光路從而用光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液的內(nèi)部，即在試樣溶液的內(nèi)部移動(dòng)焦點(diǎn)區(qū)域即光檢測(cè)區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)。對(duì)于移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的該機(jī)構(gòu)，例如，如圖1(C)所示意性示出地，可采用改變反射鏡7的方向的鏡偏轉(zhuǎn)器17。該鏡偏轉(zhuǎn)器17可以與裝備在常規(guī)激光掃描型顯微鏡上的電流鏡裝置相同。此外，為了獲得期望的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)模式，在計(jì)算機(jī)18的控制下，與光檢測(cè)器16的光檢測(cè)相協(xié)調(diào)地驅(qū)動(dòng)鏡偏轉(zhuǎn)器17。光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡可從圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線軌跡，或者這些的組合中任意選擇(可設(shè)計(jì)計(jì)算機(jī)18中的程序以便可選擇各種移動(dòng)模式)。就這一點(diǎn)而言，盡管未說明，但光檢測(cè)區(qū)域的位置可以通過上下移動(dòng)物鏡8而沿垂直方向移動(dòng)。正如所提及的，根據(jù)改變光學(xué)系統(tǒng)的光路以移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置從而代替移動(dòng)試樣溶液的結(jié)構(gòu)，在試樣溶液中基本上既不會(huì)發(fā)生機(jī)械振動(dòng)也不會(huì)發(fā)生流體動(dòng)力作用，因此變得能夠消除動(dòng)力作用對(duì)要觀察的對(duì)象物的影響，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定測(cè)量。在顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過多個(gè)光子吸收而發(fā)光的情況下，將上述光學(xué)系統(tǒng)用作多光子顯微鏡。在該情況下，由于僅從激發(fā)光的焦點(diǎn)區(qū)域(光檢測(cè)區(qū)域)發(fā)光，所以可將針孔13移除。另外，在顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針由于化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光現(xiàn)象在非激發(fā)光下發(fā)光的情況下，可省略用于產(chǎn)生激發(fā)光的光學(xué)系統(tǒng)2-5。當(dāng)顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針由于磷光或散射光而發(fā)光時(shí)，原樣使用上述共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。此外，如圖所示，在光學(xué)分析裝置I中，可提供兩個(gè)或更多個(gè)激發(fā)光源2，以便可根據(jù)顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針的激發(fā)波長(zhǎng)適當(dāng)?shù)剡x擇激發(fā)光的波長(zhǎng)。類似地，還可提供兩個(gè)或更多個(gè)光檢測(cè)器16，以便當(dāng)試樣包含兩種或更多種其波長(zhǎng)彼此不同的顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針時(shí)，可根據(jù)波長(zhǎng)單獨(dú)檢測(cè)來自它們的相應(yīng)光。本發(fā)明光學(xué)分析技術(shù)的原理光譜分析技術(shù)如FCS和FIDA的優(yōu)點(diǎn)在于與常規(guī)生物化學(xué)分析技術(shù)相比所需試樣量極小并且可迅速進(jìn)行試驗(yàn)。然而，在這些光譜分析技術(shù)如FCS和FIDA中，要觀察顆粒的濃度和特性主要基于熒光強(qiáng)度波動(dòng)來計(jì)算，因此，為了獲得精確的測(cè)量結(jié)果，如圖15(A)示意性描繪的，試樣溶液中要觀察顆粒的濃度或數(shù)密度應(yīng)處于在熒光強(qiáng)度測(cè)量期間在光檢測(cè)區(qū)域CV中總是存在一個(gè)要觀察顆粒的水平，以便如圖右手邊所示在測(cè)量期限內(nèi)總能檢測(cè)到顯著的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))。如圖15(B)所描繪的，當(dāng)要觀察顆粒的濃度或數(shù)密度低于例如要觀察顆粒很少進(jìn)入光檢測(cè)區(qū)域CV的水平下的濃度或數(shù)密度時(shí)，如圖右手邊所示在部分測(cè)量期限內(nèi)將不出現(xiàn)顯著的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))，因此，精確計(jì)算光強(qiáng)度波動(dòng)將變得困難。此外，當(dāng)要觀察顆粒的濃度顯著低于在測(cè)量期間在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)部總是存在約一個(gè)要觀察顆粒的水平時(shí)，光強(qiáng)度波動(dòng)的計(jì)算將會(huì)受到背景的影響，測(cè)量期限將變長(zhǎng)從而獲得對(duì)于計(jì)算足夠的大的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)量(光子計(jì)數(shù))。然后，在本發(fā)明中，基于如下新原理而提出光學(xué)分析技術(shù)即使當(dāng)要觀察顆粒的濃度低于上述光譜分析技術(shù)如FCS和FIDA所要求的水平時(shí)，該光學(xué)分析技術(shù)也能夠檢測(cè)要觀察顆粒的特性如數(shù)密度或濃度。在本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)中，簡(jiǎn)言之，作為要進(jìn)行的步驟，光檢測(cè)與在試樣溶液中移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域CV的位置一起進(jìn)行，即，如圖2示意性描繪的，通過驅(qū)動(dòng)用于移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置而改變光路的機(jī)構(gòu)(鏡偏轉(zhuǎn)器17)來用光檢測(cè)區(qū)域CV掃描試樣溶液的內(nèi)部。然后，例如如圖2(A)所示，在移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域CV期間(圖中，時(shí)間t0_t2)，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域CV穿過其中存在一個(gè)顆粒(圖中，附著熒光染料作為發(fā)光探針)的區(qū)域時(shí)(tl)，將如圖2(B)所示檢測(cè)顯著的脈沖光強(qiáng)度(Em)。因此，在進(jìn)行光檢測(cè)區(qū)域CV的位置移動(dòng)和如上所述的光檢測(cè)期間，通過一個(gè)接一個(gè)地檢測(cè)如圖2(B)所示出現(xiàn)的各顯著的光強(qiáng)度，來單獨(dú)檢測(cè)結(jié)合至發(fā)光探針的顆粒，并通過計(jì)算其數(shù)量而可獲取關(guān)于存在于測(cè)量區(qū)域的顆粒的數(shù)量、濃度或數(shù)密度的信息。應(yīng)理解的是，在本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)的原理中，未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算處理如熒光強(qiáng)度波動(dòng)的計(jì)算，并且顆粒是一個(gè)接一個(gè)測(cè)量的，因此，即使在具有處于FCS和FIDA無法獲得足夠精確分析的水平下的低顆粒濃度的試樣溶液中也可獲得關(guān)于顆粒的濃度或數(shù)密度的信息。此外，如下述實(shí)施方案所示，根據(jù)本發(fā)明通過單獨(dú)檢測(cè)試樣溶液中的顆粒并將其計(jì)數(shù)，變得能夠測(cè)量比由熒光分光光度計(jì)和讀板儀所測(cè)量的熒光強(qiáng)度可測(cè)量的濃度低的熒光標(biāo)記顆粒。通常，在用分光光度計(jì)和讀板儀測(cè)量特定熒光標(biāo)記顆粒的濃度中，假設(shè)熒光強(qiáng)度與熒光標(biāo)記顆粒的濃度成比例。然而，在該情況下，當(dāng)熒光標(biāo)記顆粒的濃度顯著低時(shí)，噪音信號(hào)量相對(duì)于從熒光標(biāo)記顆粒中發(fā)出的光的信號(hào)量變大(S/N比的惡化)，從而，熒光標(biāo)記顆粒的濃度和光信號(hào)量之間的比例關(guān)系瓦解，所測(cè)濃度的精確度劣化。另一方面，在本發(fā)明方法中，在從所檢測(cè)的光信號(hào)中檢測(cè)對(duì)應(yīng)于各顆粒的信號(hào)的步驟中，從檢測(cè)結(jié)果中消除噪音信號(hào)，并通過僅計(jì)數(shù)對(duì)應(yīng)于各顆粒的信號(hào)來計(jì)算濃度，因此，變得能夠檢測(cè)比在假設(shè)熒光強(qiáng)度與熒光標(biāo)記顆粒的濃度成比例下檢測(cè)顆粒濃度的情況低的濃度。此外，在多個(gè)發(fā)光探針結(jié)合至一個(gè)要觀察顆粒的情況中，通過根據(jù)本發(fā)明的單獨(dú)檢測(cè)試樣溶液中的顆粒并對(duì)它們計(jì)數(shù)的方法，與其中在假設(shè)熒光強(qiáng)度與熒光標(biāo)記顆粒的濃度成比例下測(cè)定濃度的常規(guī)方法相比，還改善了在較高顆粒濃度側(cè)的顆粒濃度的測(cè)量精確度。在多個(gè)發(fā)光探針結(jié)合至一個(gè)要觀察顆粒的情況下，當(dāng)在試樣溶液中添加特定量的發(fā)光探針時(shí)，隨著要觀察顆粒的濃度變高，結(jié)合至顆粒的發(fā)光探針的數(shù)量相對(duì)降低。在該情況下，由于每個(gè)要觀察顆粒的熒光強(qiáng)度可降低，所以熒光標(biāo)記顆粒的濃度與光量之間的比例關(guān)系瓦解，從而使所測(cè)濃度值的精確度惡化。另一方面，在本發(fā)明的方法中，在從所檢測(cè)光的信號(hào)來檢測(cè)對(duì)應(yīng)于相應(yīng)顆粒的信號(hào)的步驟中由每個(gè)顆粒的熒光強(qiáng)度的減少造成的影響小，由顆粒數(shù)計(jì)算濃度，從而變得能夠檢測(cè)比在假設(shè)熒光強(qiáng)度與熒光標(biāo)記顆粒的濃度成比例下檢測(cè)濃度的情況中的水平高的濃度。本發(fā)明中的操作過稈具體地，在用如圖1(A)所示的本發(fā)明的光學(xué)分析裝置I的本發(fā)明的方法中，進(jìn)行(I)包含發(fā)光探針和結(jié)合探針的要觀察顆粒的試樣溶液的制備，(2)測(cè)量試樣溶液的光強(qiáng)度的過程，和(3)分析所測(cè)光強(qiáng)度的過程。(I)試樣溶液的制備本發(fā)明方法中要觀察顆粒只要在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)則可為任意顆粒，如溶解的分子，該顆粒可為例如生物分子即蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸等，或者它們的聚集體，病毒、細(xì)胞、金屬膠體或其他非生物分子。在試樣溶液(典型地，其為水溶液，但不限于此，并可為有機(jī)溶劑或其他任意液體)中要觀察顆粒典型地以任意方式與提供有發(fā)光標(biāo)簽(熒光分子、磷光分子、化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光分子)的發(fā)光探針混合，其中發(fā)光探針結(jié)合至要觀察顆?；蚺c之締合，從而形成結(jié)合體，以使通過發(fā)光探針發(fā)出的光充當(dāng)要觀察顆粒存在的標(biāo)志，從而能夠檢測(cè)要觀察顆粒(如稍后所闡述的，在某些實(shí)驗(yàn)方式中，通過檢測(cè)曾結(jié)合至要觀察顆粒然后通過預(yù)定處理而從要觀察顆粒解離的發(fā)光探針來檢測(cè)要觀察顆粒)。作為要觀察顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體的實(shí)例，當(dāng)要觀察顆粒為核酸時(shí)，對(duì)于發(fā)光探針采用具有與作為要觀察顆粒的核酸互補(bǔ)的堿基序列的核酸或核酸類似物、核酸結(jié)合蛋白、核酸結(jié)合抗體等。作為具體實(shí)例，可例舉當(dāng)要觀察顆粒為DNA-RNA的締合體(association)時(shí)將識(shí)別DNA-RNA雜交體的突光標(biāo)記抗體用作發(fā)光探針的情況(雜交捕捉法)。如上所示，對(duì)于為形成顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體而將要觀察顆粒與發(fā)光探針的混合，應(yīng)注意要求試樣溶液中基本上所有要觀察顆粒都結(jié)合至發(fā)光探針或與之締合。即，如果存在未結(jié)合至發(fā)光探針或未與之締合的要觀察顆粒，試樣溶液中的要觀察顆粒的數(shù)量和/或濃度在其數(shù)字上將被低估。因此，為了確保使基本上所有要觀察顆粒均結(jié)合至發(fā)光探針或與之締合，要求在顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體的形成中向試樣溶液中添加發(fā)光探針，以使試樣溶液中發(fā)光探針的數(shù)量超過要觀察顆粒的數(shù)量。然而，在該情況中，結(jié)果是，既不結(jié)合至要觀察顆粒也不與之締合的發(fā)光探針變得存在于試樣溶液中，如果在無法與來自顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體的光相區(qū)分下，檢測(cè)到來自未結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針或單獨(dú)發(fā)光探針的光，則要觀察顆粒的檢測(cè)中的精確度也將惡化。因此，在通過使用發(fā)光探針單獨(dú)檢測(cè)要觀察顆粒的光學(xué)分析技術(shù)的本發(fā)明方法中，優(yōu)選可采用防止檢測(cè)到未結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針或單獨(dú)的發(fā)光探針的光的結(jié)構(gòu)，即，從檢測(cè)結(jié)果中消除來自未結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針或單獨(dú)的發(fā)光探針的光的結(jié)構(gòu)。作為此類結(jié)構(gòu)，例如可采用以下結(jié)構(gòu)。(i)未結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針從試樣溶液中的分離如圖3(a)示意性所示，在用于從檢測(cè)結(jié)果中消除來自未結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針的光的結(jié)構(gòu)之一中，在形成顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體之后，可通過利用性質(zhì)差異(例如，未結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針或單獨(dú)的發(fā)光探針與顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或已結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針之間的大小或分子量、對(duì)任意物質(zhì)的親和性、帶電狀態(tài)等的差異)而物理分離兩種或更多種物質(zhì)的任意方法來將未結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針或單獨(dú)的發(fā)光探針從試樣溶液中分離和除去。具體地，可采用本領(lǐng)域通常進(jìn)行的物質(zhì)的物理分離，如包括通過層析(親水/疏水性層析、親和層析、離子交換層析等)的吸附、提取或洗滌，超濾，電泳，相分離，離心分離，溶劑提取，過濾吸附等的操作。此外，可使用從試樣溶液中消除單獨(dú)的發(fā)光探針的方法，如ELISA法，其中向要觀察顆粒和發(fā)光探針已混入的試樣溶液中進(jìn)一步混合結(jié)合至要觀察顆粒的不同探針(分離用探針)，從而使其結(jié)合至要觀察顆粒；然后使試樣溶液暴露至載體(該載體結(jié)合至分離用探針)，以便僅保持由要觀察顆粒、發(fā)光探針和分離用探針組成的結(jié)合體，同時(shí)(例如，通過洗滌)從試樣溶液中分離并除去單獨(dú)的發(fā)光探針。(ii)波長(zhǎng)特性改變的熒光染料的使用在該領(lǐng)域中，已知波長(zhǎng)特性依賴于是否結(jié)合至特定物質(zhì)而改變的各種熒光染料。然后，為了從檢測(cè)結(jié)果中消除未結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針或單獨(dú)的發(fā)光探針的光，如圖3(c)示意性描繪的，對(duì)于發(fā)光探針可采用當(dāng)結(jié)合至要觀察顆粒時(shí)其波長(zhǎng)特性改變的熒光染料。當(dāng)采用此類發(fā)光探針時(shí)，通過選擇性地檢測(cè)從當(dāng)結(jié)合至要觀察顆粒時(shí)發(fā)光探針發(fā)出的光而不需要物理消除單獨(dú)的發(fā)光探針或未結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針的操作，可以選擇性地檢測(cè)來自要觀察顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或已結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針的光。此類熒光染料可為當(dāng)結(jié)合至要觀察顆粒時(shí)其激發(fā)和/或發(fā)光波長(zhǎng)變化的染料，或者當(dāng)結(jié)合至要觀察顆粒時(shí)其熒光強(qiáng)度顯著增加的染料。典型地，當(dāng)要觀察顆粒為核酸或核酸類似物時(shí)，可采用核酸的嵌入劑熒光染料(溴化乙錠、吖啶橙、SYTOX Orange,SYTOX RecUSYBRGreen1、SYBR Green I1、SYBR Gold、Picogreen、OllGreen、Gel Red、Gel Green、RiboGreeruEvaGreen和具有花青骨架的染料等)。另外，當(dāng)要觀察顆粒為蛋白質(zhì)時(shí),可采用當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)其熒光強(qiáng)度和熒光波長(zhǎng)由于周圍環(huán)境改變而改變的染料作為發(fā)光探針。對(duì)于此類染料，可使用以下熒光染料例如作為疏水性探針的萘磺酸類，如1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)、N-甲基-2-苯胺基萘-6-磺酸(MANS)、2-對(duì)-甲苯胺基萘-6-磺酸(TNS)、二甲氨基萘(丹酰類)、容易受到局部PH或介電常數(shù)影響的染料，如TAMRA、熒光素、6-joe、B0DIPY、TMR, BODIPY TR, Alexa 488、Alexa 532、BODIPY FL、BODIPY FL/C3、BODIPY FL/C6、FITC、EDANS、若丹明6G、TMR、TMRITC、χ-若丹明、Texas RecUBODIPY 5_FAM、B0DIPY R6G、B0DIPY581。此外，除了如上所述的熒光染料以外，可采用由至少兩種組分組成、如果結(jié)合至要觀察顆粒則其波長(zhǎng)特性改變的物質(zhì)作為發(fā)光探針，其中當(dāng)該物質(zhì)結(jié)合至要觀察顆粒時(shí)，在所述至少兩種組分的相對(duì)位置改變時(shí)該物質(zhì)發(fā)出熒光。作為此類物質(zhì)的實(shí)例，可例舉當(dāng)結(jié)合至特定顆粒時(shí)結(jié)構(gòu)上改變而發(fā)出強(qiáng)熒光的熒光蛋白，或當(dāng)與特定顆粒(配合物的配體)結(jié)合時(shí)聚集而形成熒光金屬配合物的分子。(iii)熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的利用作為用于從檢測(cè)結(jié)果中消除已結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針的光的可選結(jié)構(gòu)，可采用如下方法利用使用至少兩種熒光染料的熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的效果，用裝置I僅檢測(cè)來自要觀察顆粒和發(fā)光探針結(jié)合體或已結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針的光，從而防止來自未結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針的光發(fā)出，或者從而使來自要觀察顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或已結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針的光的波長(zhǎng)與單獨(dú)的發(fā)光探針或未結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針的光的波長(zhǎng)彼此不同。例如，使用熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的方式可為如下(實(shí)施例1)對(duì)于使用熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的結(jié)構(gòu)，可使用熒光猝滅。具體地，如圖3(b)示意性示出的，在要觀察顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體形成后，將結(jié)合至單獨(dú)的發(fā)光探針或未與要觀察顆粒結(jié)合的發(fā)光探針，而不結(jié)合至顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體，而且還通過熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象吸收由發(fā)光探針發(fā)出的光的物質(zhì)(光受體)添加到試樣溶液中，并使該物質(zhì)僅結(jié)合至試樣溶液中的未結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針或單獨(dú)的發(fā)光探針。然后，當(dāng)用光學(xué)分析裝置I觀察其中如此混合光受體的試樣溶液時(shí)，從顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體中的發(fā)光探針發(fā)出光(用光檢測(cè)器檢測(cè)光)和從單獨(dú)的發(fā)光探針或未結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針(已結(jié)合光受體)發(fā)出的光被光受體所吸收，因此，來自單獨(dú)的發(fā)光探針或未結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針的光被猝滅，從而使所述光不反映在檢測(cè)結(jié)果中。作為此類實(shí)例，例如在熒光標(biāo)記的核酸或核酸類似物用作為核酸或核酸類似物的要觀察顆粒的發(fā)光探針的情況下，在發(fā)光探針與要觀察顆粒結(jié)合后，通過添加具有光受體部位的核酸或核酸類似物作為光受體來使光受體結(jié)合至發(fā)光探針，變得可以猝滅未結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針的熒光，該核酸或核酸類似物吸收發(fā)光探針的熒光標(biāo)記的光并具有與發(fā)光探針互補(bǔ)的堿基序列。(實(shí)施例2)作為發(fā)光探針，可采用具有能量供體部位和能量受體部位的物質(zhì)，將該物質(zhì)設(shè)計(jì)為當(dāng)發(fā)光探針結(jié)合要觀察顆粒時(shí)能量供體部位和能量受體部位之間的距離改變。作為此類發(fā)光探針的實(shí)例，例如可例舉分子信標(biāo)，即如圖3(d)所示意性描繪的核酸分子，各自為熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象中的能量供體和能量受體的兩種染料附著于該核酸分子。在此類分子信標(biāo)中，當(dāng)其為單個(gè)分子時(shí)(圖3(d)左)，所添加的染料彼此接近從而在能量供體的激發(fā)光照射時(shí)將發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，因此，能量供體所發(fā)出的光轉(zhuǎn)移至能量受體并猝滅，或者發(fā)射能量受體的染料的發(fā)光波長(zhǎng)的光(波長(zhǎng)2的光);但是，當(dāng)分子信標(biāo)結(jié)合至要觀察顆粒(核酸或核酸類似物)時(shí)(圖3(d)右)，兩種染料之間的距離變長(zhǎng)，因而，在能量供體的激發(fā)光照射時(shí)無熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象發(fā)生，導(dǎo)致能量供體的發(fā)光波長(zhǎng)的光(波長(zhǎng)I的光)發(fā)射。因此，在觀察時(shí)，通過僅選擇性地檢測(cè)分子信標(biāo)能量供體的發(fā)光波長(zhǎng)的光，即使在試樣溶液中存在單獨(dú)的分子信標(biāo)下也變得能夠檢測(cè)要觀察顆粒。然而，作為類似的原理，可使用蝎子探針。就這一點(diǎn)而言，與所示實(shí)例相反，可使用設(shè)計(jì)為如下的發(fā)光探針在單獨(dú)的發(fā)光探針(或者未結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針)中不發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，而在顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體中發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(在該情況下，選擇性檢測(cè)能量受體的發(fā)光波長(zhǎng)的光)。另外，發(fā)光探針不僅可為核酸或核酸類似物，還可為具有至少兩個(gè)發(fā)光部位的物質(zhì)，其中當(dāng)物質(zhì)結(jié)合至要觀察顆?；蚺c之締合時(shí)，所述至少兩個(gè)發(fā)光部位之間的距離改變，導(dǎo)致發(fā)射光的波長(zhǎng)的改變。(實(shí)施例3)如圖3(e)示意性示出，分別制備為能量供體的第一探針(發(fā)光探針
1)和為能量受體的第二探針(發(fā)光探針2)來作為發(fā)光探針，并添加到試樣溶液中。然后，發(fā)光探針I(yè)和發(fā)光探針2均結(jié)合至要觀察顆粒，從而形成結(jié)合體，當(dāng)在該狀態(tài)下照射激發(fā)發(fā)光探針I(yè)的光時(shí)，在結(jié)合體內(nèi)發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，從而使發(fā)光探針2的發(fā)光波長(zhǎng)(波長(zhǎng)
2)的光從結(jié)合體中發(fā)出。另一方面，從未結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針I(yè)中發(fā)出其發(fā)光波長(zhǎng)(波長(zhǎng)I)的光，并且未結(jié)合至要觀察顆粒的發(fā)光探針2基本上不激發(fā)，不發(fā)光。因此，在圖3(e)的系統(tǒng)中，通過使發(fā)光探針I(yè)發(fā)光，使發(fā)光探針2的發(fā)光波長(zhǎng)的光僅從結(jié)合體中發(fā)出，因此，通過選擇性地檢測(cè)發(fā)光探針2的發(fā)光波長(zhǎng)的光，變得可以高度精確地檢測(cè)要觀察顆粒，而不從試樣溶液中物理除去發(fā)光探針。(實(shí)施例4)在要觀察顆粒具有發(fā)光部位時(shí)，可選擇具有作為要觀察顆粒的發(fā)光部位的能量供體的功能的物質(zhì)作為發(fā)光探針。在該情況下，如圖3(f)示意性所示，當(dāng)從單獨(dú)的發(fā)光探針發(fā)出發(fā)光波長(zhǎng)(波長(zhǎng)I)的光時(shí)，在發(fā)光探針結(jié)合的要觀察顆粒中，從發(fā)光探針發(fā)出的光被要觀察顆粒的發(fā)光部位所吸收，然后發(fā)出要觀察顆粒的發(fā)光部位的發(fā)光波長(zhǎng)(波長(zhǎng)2)的光。因此，通過使發(fā)光探針發(fā)光并選擇性地檢測(cè)要觀察顆粒的發(fā)光部位的發(fā)光波長(zhǎng)的光，變得能夠高度精確地檢測(cè)要觀察顆粒，而不從試樣溶液中物理除去發(fā)光探針。作為此類實(shí)例，例如在要觀察顆粒為核酸的情況下，可選擇當(dāng)結(jié)合至核酸時(shí)為核酸中的鳥嘌呤提供能量(鳥嘌呤變?yōu)槟芰渴荏w)的任意熒光標(biāo)記物質(zhì)作為發(fā)光探針。此外，在要觀察顆粒為蛋白質(zhì)的情況下，可選擇當(dāng)結(jié)合至蛋白質(zhì)時(shí)為蛋白質(zhì)中的色氨酸提供能量(即，色氨酸變?yōu)槟芰渴荏w)的任意標(biāo)記物質(zhì)作為發(fā)光探針。(實(shí)施例5)在要觀察顆粒具有發(fā)光部位的情況下，可選擇具有作為要觀察顆粒的發(fā)光部位的能量受體功能的物質(zhì)作為發(fā)光探針。在該情況下，如圖3(g)示意性所述，在發(fā)光探針已結(jié)合的要觀察顆粒中，發(fā)光探針吸收從要觀察顆粒的發(fā)光部位發(fā)出的光，從而發(fā)出發(fā)光探針的發(fā)光波長(zhǎng)(波長(zhǎng)2)的光，而單獨(dú)的發(fā)光探針不發(fā)光。因此，通過使要觀察顆粒的發(fā)光部位發(fā)光并選擇性地檢測(cè)發(fā)光探針的發(fā)光波長(zhǎng)的光，變得可以高度精確地檢測(cè)要觀察顆粒，而不從試樣溶液中物理除去發(fā)光探針。(iv)伴隨要觀察顆粒或發(fā)光探針的解離反應(yīng)的測(cè)量的應(yīng)用
順便提及，在核酸的堿基序列、結(jié)構(gòu)或特性的研究領(lǐng)域，已知使用具有發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的能量供體部位和能量受體部位并設(shè)計(jì)為在已結(jié)合至具有互補(bǔ)堿基序列的核酸的條件下被預(yù)設(shè)的分解反應(yīng)分解的核酸分子作為搜索核酸堿基序列的探針的實(shí)驗(yàn)方法。在此類試驗(yàn)方法中，簡(jiǎn)言之，首先，上述探針添加到要檢測(cè)的試樣中，如果包括與探針的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核酸存在于試樣中，則探針將結(jié)合至核酸(參見圖3(h)的左圖)。在該條件下，如果進(jìn)行預(yù)設(shè)的分解反應(yīng)，則僅結(jié)合至核酸的探針，或探針與核酸二者分解，以使探針上的能量供體部位和能量受體部位分開(參見3(h)的右圖)，因此，不會(huì)發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，導(dǎo)致來自能量供體部位的光(波長(zhǎng)I)變得可觀察。另一方面，如果包括與探針的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核酸不存在于試樣中，則探針不結(jié)合至核酸，即使進(jìn)行預(yù)設(shè)的分解反應(yīng)，探針也不分解，因此，在探針上，來自能量供體部位的光被能量受體部位吸收而不發(fā)射到外部。即，在上述實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)是否檢測(cè)到來自能量供體部位的光，可檢測(cè)要觀察核酸是否存在于試樣中。本發(fā)明的方法可用于使用其中如上所述發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象、并且當(dāng)發(fā)光探針結(jié)合至要觀察顆粒(例如，核酸)時(shí)將通過預(yù)設(shè)的分解反應(yīng)來分解的發(fā)光探針的實(shí)驗(yàn)中。在該情況下，在裝置中檢測(cè)的光為從在結(jié)合至要觀察顆粒后分解的發(fā)光探針發(fā)出的光。作為此類實(shí)驗(yàn)方法的實(shí)例,例舉如下,例如(a)其中將具有在其間發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的能量供體部位和能量受體部位的DNA的發(fā)光探針添加至包含要試驗(yàn)的核酸或核酸類似物(要觀察顆粒)的試樣溶液，檢測(cè)是否發(fā)光探針被具有5' -3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶分解的方法(Taqman法)；(b)其中將具有在其間發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的能量供體部位和能量受體部位并部分地包含RNA的DNA的發(fā)光探針添加至包含要試驗(yàn)的核酸或核酸類似物(要觀察顆粒)的試樣溶液，檢測(cè)是否發(fā)光探針被RNaseH分解的方法(Cycleave法)；(C)其中將具有在其間發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的能量供體部位和能量受體部位并部分地包含限制性酶識(shí)別區(qū)域的DNA的發(fā)光探針添加至包含要試驗(yàn)的核酸或核酸類似物(要觀察顆粒)的試樣溶液，檢測(cè)是否發(fā)光探針被限制性酶分解的方法；(d)其中將具有在其間發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的能量供體部位和能量受體部位的DNA的發(fā)光探針添加至包含要試驗(yàn)的核酸或核酸類似物(要觀察顆粒)的試樣溶液，檢測(cè)是否發(fā)光探針被特異性分解雙鏈核酸的核酸外切酶分解的方法。當(dāng)使用本發(fā)明的方法進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以以常規(guī)方式制備各實(shí)驗(yàn)中的試樣溶液。如稍后所詳述的，在光強(qiáng)度測(cè)量中應(yīng)當(dāng)檢測(cè)到的光的波長(zhǎng)為在發(fā)光探針分解后發(fā)出的光的波長(zhǎng)。此外，檢測(cè)的顆粒數(shù)主要為分解的發(fā)光探針的數(shù)量，該數(shù)將等于已結(jié)合發(fā)光探針的核酸或核酸類似物的分子數(shù)。(2)試樣溶液的光強(qiáng)度的測(cè)量除了在測(cè)量期間驅(qū)動(dòng)鏡偏轉(zhuǎn)器17從而移動(dòng)在試樣溶液中的光檢測(cè)區(qū)域的位置(從而在試樣溶液中掃描)以外，本發(fā)明光學(xué)分析的光強(qiáng)度的測(cè)量可以以與FCS或FIDA中的光強(qiáng)度測(cè)量過程相同的方式進(jìn)行。在操作過程中，典型地，在將試樣溶液分散在微型板9的孔10中并將其置于顯微鏡的載物臺(tái)上后，當(dāng)使用者輸入計(jì)算機(jī)18測(cè)量開始的指令時(shí)，計(jì)算機(jī)18運(yùn)行存儲(chǔ)于存儲(chǔ)裝置(未示出)中的程序(為了移動(dòng)在試樣溶液中的光檢測(cè)區(qū)域的位置而改變光路的步驟，在移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置期間檢測(cè)來自光檢測(cè)區(qū)域的光的步驟)，然后將開始用激發(fā)光照射試樣溶液中的光檢測(cè)區(qū)域，并測(cè)量光強(qiáng)度。在該測(cè)量中，根據(jù)所述程序在計(jì)算機(jī)18的操作處理的控制下，鏡偏轉(zhuǎn)器17驅(qū)動(dòng)鏡7(電流鏡)以移動(dòng)孔10中光檢測(cè)區(qū)域的位置，與此同時(shí)，光檢測(cè)器16順次將檢測(cè)的光轉(zhuǎn)換為電信號(hào)并將其輸送至計(jì)算機(jī)18,該計(jì)算機(jī)18以任意方式產(chǎn)生來自輸送的光信號(hào)的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)并將其存儲(chǔ)。就這一點(diǎn)而言，光檢測(cè)器16典型地為可檢測(cè)單個(gè)光子到達(dá)的超高靈敏度的光檢測(cè)器，因此光檢測(cè)可以在預(yù)設(shè)時(shí)間內(nèi)順次測(cè)量每預(yù)設(shè)的單位時(shí)間(BIN ΜΕ)，例如每IOys內(nèi)到達(dá)光檢測(cè)器的光子的數(shù)量的方式進(jìn)行的光子計(jì)數(shù)，其中時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)將為時(shí)序光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。在光強(qiáng)度測(cè)量期間光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度可為例如實(shí)驗(yàn)上或?yàn)榱藵M足分析目的而任意設(shè)定的預(yù)設(shè)速度。在基于檢測(cè)的要觀察顆粒的數(shù)量來獲取數(shù)密度或濃度信息的情況下，需要光檢測(cè)區(qū)域已通過的區(qū)域大小或體積，因此，以能夠控制移動(dòng)距離的方式進(jìn)行光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)。就這一點(diǎn)而言，如果經(jīng)過時(shí)間與光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)距離成比例，則測(cè)量結(jié)果的解釋將變得容易，因此基本上優(yōu)選移動(dòng)速度是恒定的，盡管不限于此。順便提及，關(guān)于光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度，為了從所測(cè)量的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)或要觀察顆粒的數(shù)量的計(jì)數(shù)來進(jìn)行定量地精確地單獨(dú)檢測(cè)要觀察顆粒，優(yōu)選將移動(dòng)速度設(shè)為比要觀察顆粒(更嚴(yán)格地，顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或在結(jié)合至顆粒后已分解并釋放的發(fā)光探針)的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)，即，布朗運(yùn)動(dòng)的移動(dòng)速度更快的值。由于本發(fā)明光學(xué)分析技術(shù)中的要觀察顆粒為分散或溶解在溶液中并自由隨機(jī)移動(dòng)的顆粒，所以其位置由于布朗運(yùn)動(dòng)而隨時(shí)間移動(dòng)。因此，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度慢于由布朗運(yùn)動(dòng)引起的顆粒運(yùn)動(dòng)(如圖4(A)示意性描繪，顆粒在區(qū)域中的隨機(jī)運(yùn)動(dòng))時(shí)，由此，如圖4(B)所示使光強(qiáng)度隨機(jī)變化(如前面所述，光檢測(cè)區(qū)域中的激發(fā)光強(qiáng)度從在區(qū)域的中心的頂點(diǎn)向其外部方向減少)，以致變得難以確定對(duì)應(yīng)于各要觀察顆粒的顯著的光強(qiáng)度變化。然后，如圖5(A)所示，優(yōu)選將光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)為比由布朗運(yùn)動(dòng)引起的顆粒的平均移動(dòng)速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)快，以使顆粒沿近似直線穿過光檢測(cè)區(qū)域，從而在如圖5(B)所示的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，對(duì)應(yīng)于各顆粒的光強(qiáng)度的變化譜變得幾乎均一(當(dāng)發(fā)光顆粒沿近似直線穿過光檢測(cè)區(qū)域時(shí)，光強(qiáng)度變化譜與激發(fā)光強(qiáng)度分布相似)，并可易于確定各要觀察顆粒與光強(qiáng)度之間的對(duì)應(yīng)性。
具體地，由均方位移(mean-square displacement)關(guān)系的表達(dá)式給出具有擴(kuò)散系數(shù)D的要觀察顆粒(更嚴(yán)格地，顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或在結(jié)合至顆粒后已分解并釋放的發(fā)光探針)通過布朗運(yùn)動(dòng)而穿過半徑為Wo的光檢測(cè)區(qū)域所需的時(shí)間At :(2ffo)2=6D · Δ t ——(I)由此Δ t= (2ffo) 2/6D —(2)因此，通過布朗運(yùn)動(dòng)而移動(dòng)的要觀察顆粒的速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)VdifjSSVdif=2ffo/At=3D/ffo —(3)那么，據(jù)此，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度可設(shè)為比Vdif足夠快的值。例如，當(dāng)期望要觀察顆粒的擴(kuò)散系數(shù)為約D=2. OX lO-V/s時(shí)，則Vdif將為1. OX 10_3m/s，假設(shè)Wo約為O. 62m,因此，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度可設(shè)為其10倍以上，如15mm/s等。就這一點(diǎn)而言，當(dāng)要觀察顆粒的擴(kuò)散系數(shù)未知時(shí)，可通過重復(fù)進(jìn)行設(shè)定光檢測(cè)區(qū)域的位置的各種移動(dòng)速度以求得光強(qiáng)度變化譜變?yōu)槠谕V(典型地，類似于激發(fā)光強(qiáng)度分布)的條件的預(yù)實(shí)驗(yàn)，來確定光檢測(cè)區(qū)域的位置的大致移動(dòng)速度。(3)光強(qiáng)度分析當(dāng)通過上述處理獲得試樣溶液的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時(shí)，可在計(jì)算機(jī)18中通過根據(jù)存儲(chǔ)于存儲(chǔ)裝置中的程序的處理來進(jìn)行如下所述的光強(qiáng)度分析。(i) 一個(gè)要觀察顆粒的檢測(cè)當(dāng)一個(gè)要觀察顆粒在其穿過光檢測(cè)區(qū)域中的軌跡如圖5(A)所示大致呈直線時(shí)，如圖7(A)示意性描繪的(由光學(xué)系統(tǒng)確定)，時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中對(duì)應(yīng)于要觀察顆粒的光強(qiáng)度變化具有反映光檢測(cè)區(qū)域中光強(qiáng)度分布的譜(通常呈大致鐘形)。然后，在用于檢測(cè)要觀察顆粒的方法之一中，設(shè)定光強(qiáng)度的閾值Ιο，并當(dāng)超過閾值的光強(qiáng)度持續(xù)的時(shí)間寬度Δ τ在預(yù)設(shè)范圍內(nèi)時(shí)，光強(qiáng)度譜可判定為對(duì)應(yīng)于已穿過光檢測(cè)區(qū)域的一個(gè)顆粒，從而檢測(cè) 一個(gè)要觀察顆粒。基于在從相對(duì)于光檢測(cè)區(qū)域以預(yù)設(shè)速度移動(dòng)的要觀察顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體(或者在結(jié)合至顆粒后已分解和分離的發(fā)光探針)發(fā)出的光的強(qiáng)度中所預(yù)期的譜來確定光強(qiáng)度的閾值Io和時(shí)間寬度Λ τ的預(yù)設(shè)范圍，它們的具體值可任意或?qū)嶒?yàn)設(shè)定，還可依賴于要觀察顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體(或者在結(jié)合至顆粒后已分解和分離的發(fā)光探針)的特性而選擇性地確定。此外，在要觀察顆粒的另一檢測(cè)方法中，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域中的光強(qiáng)度分布可假定為高斯分布時(shí)I=A · exp (_2t2/a2) ---(4)，和當(dāng)通過將表達(dá)式(4)擬合到顯著光強(qiáng)度譜(可清楚判定為非背景的譜)而計(jì)算的強(qiáng)度A和寬度a在相應(yīng)預(yù)設(shè)范圍內(nèi)時(shí)，可判定光強(qiáng)度譜對(duì)應(yīng)于觀察到已穿過光檢測(cè)區(qū)域的一個(gè)要觀察顆粒，從而完成一個(gè)要觀察顆粒的檢測(cè)。然而，強(qiáng)度A和寬度a在預(yù)設(shè)范圍外的譜可作為分析中的噪音或污染物而忽略。(ii)要觀察顆粒的計(jì)數(shù)要觀察顆粒的計(jì)數(shù)可通過以任意方式計(jì)數(shù)通過上述要觀察顆粒的檢測(cè)方法所檢測(cè)的顆粒的數(shù)量來完成。然而，例如，對(duì)于大量顆粒，可通過圖6和圖7(B)中所說明的處理來完成。參照?qǐng)D6和圖7(B)，在由時(shí)間序列光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))數(shù)據(jù)計(jì)數(shù)顆粒的方式的一個(gè)實(shí)例中，在如上所述測(cè)量光強(qiáng)度之后，即，在進(jìn)行用光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液并光子計(jì)數(shù)以獲取時(shí)間序列光信號(hào)數(shù)據(jù)(光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù))(步驟100)后，對(duì)這些時(shí)間序列光信號(hào)數(shù)據(jù)(圖7(B)，最上行“檢測(cè)結(jié)果(未處理)”)進(jìn)行平滑化處理(步驟110，圖7(B)的中上行“平滑化”)。盡管由顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針發(fā)出的光是隨機(jī)的，以致在微小時(shí)間內(nèi)的數(shù)據(jù)值將產(chǎn)生間斷，數(shù)據(jù)值中的這類間斷可通過平滑化處理而忽略。平滑化處理可通過例如移動(dòng)平均法(moving average method)來完成。就這一點(diǎn)而言,進(jìn)行平滑化處理的參數(shù)，例如在移動(dòng)平均法中一次平均化中數(shù)據(jù)的點(diǎn)數(shù)、移動(dòng)平均值的次數(shù)等，可根據(jù)在光信號(hào)數(shù)據(jù)獲取時(shí)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度(掃描速度)和/或BIN TIME而適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。接下來，在平滑化處理后的時(shí)間序列光信號(hào)數(shù)據(jù)中，為了檢測(cè)其中存在顯著信號(hào)的時(shí)間域(脈沖存在區(qū)域)，計(jì)算平滑化處理后時(shí)間序列光信號(hào)數(shù)據(jù)隨時(shí)間的第一微分值(步驟120)。如圖7(B)所示的，在時(shí)間序列光信號(hào)數(shù)據(jù)的時(shí)間微分值中，中下行的“時(shí)間微分”，在信號(hào)值改變時(shí)值的變化增加，從而可通過參考時(shí)間微分值而有利地確定顯著信號(hào)(脈沖信號(hào))的起始點(diǎn)和終止點(diǎn)。其后，在時(shí)間序列光信號(hào)數(shù)據(jù)上順次檢測(cè)顯著信號(hào)(脈沖信號(hào))，并判斷所檢測(cè)的脈沖信號(hào)是否為對(duì)應(yīng)于要觀察顆粒的信號(hào)。具體地，首先在時(shí)間序列光信號(hào)數(shù)據(jù)的時(shí)間序列時(shí)間微分值數(shù)據(jù)上，通過順次參照時(shí)間微分值來搜索并確定一個(gè)脈沖信號(hào)的起始點(diǎn)和終止點(diǎn)，從而確定脈沖存在的區(qū)域(步驟130)。當(dāng)已確定一個(gè)脈沖存在的區(qū)域時(shí)，將鐘形函數(shù)的擬合應(yīng)用到在脈沖存在的區(qū)域中的平滑化的時(shí)間序列光信號(hào)數(shù)據(jù)(圖7(B)，較下行的“鐘形函數(shù)擬合”)，然后，計(jì)算鐘形函數(shù)中的參數(shù)，例如峰值強(qiáng)度Imax;脈沖寬度(半高全寬(最小二乘法的)擬合時(shí)的相關(guān)系數(shù)等(步驟140)。就這一點(diǎn)而言，盡管要用于擬合的鐘形函數(shù)典型地為高斯函數(shù)，但其也可為洛倫茲型函數(shù)。并判斷所計(jì)算的鐘形函數(shù)的參數(shù)是否在通過一個(gè)顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或一個(gè)發(fā)光探針穿過光檢測(cè)區(qū)域時(shí)所檢測(cè)的光信號(hào)所描繪的鐘形譜的假定參數(shù)的相應(yīng)范圍內(nèi)，即，是否各峰值強(qiáng)度、脈沖寬度和相關(guān)系數(shù)在對(duì)應(yīng)的預(yù)設(shè)范圍內(nèi)(步驟150)。因此，如圖8左圖所示，將所計(jì)算的鐘形函數(shù)的參數(shù) 判定為在對(duì)應(yīng)于一個(gè)顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針的光信號(hào)中的假設(shè)范圍內(nèi)的信號(hào)判定為對(duì)應(yīng)于一個(gè)要觀察顆粒的信號(hào)，從而，檢測(cè)一個(gè)要觀察顆粒，并計(jì)數(shù)一個(gè)顆粒(將顆粒數(shù)相加。步驟160)。另一方面，如圖8右圖所示，所計(jì)算的鐘形函數(shù)的參數(shù)不在假設(shè)范圍內(nèi)的脈沖信號(hào)忽略為噪音。時(shí)間序列光信號(hào)數(shù)據(jù)的整個(gè)區(qū)域內(nèi)重復(fù)進(jìn)行在上述步驟130-160的處理中的脈沖信號(hào)的搜索和判斷，無論何時(shí)檢測(cè)到一個(gè)要觀察顆粒，都將其計(jì)數(shù)為一個(gè)顆粒。并且，當(dāng)完成時(shí)間序列光信號(hào)數(shù)據(jù)的整個(gè)區(qū)域內(nèi)的脈沖信號(hào)的搜索時(shí)(步驟170)，直到那時(shí)所得顆粒的計(jì)數(shù)值被認(rèn)為是在時(shí)間序列光信號(hào)數(shù)據(jù)中檢測(cè)到的要觀察顆粒的數(shù)量。(iii)要觀察顆粒的數(shù)密度或濃度的確定當(dāng)已完成要觀察顆粒的計(jì)數(shù)時(shí)，要觀察顆粒的數(shù)密度或濃度可使用在時(shí)間序列光信號(hào)數(shù)據(jù)的獲取期間光檢測(cè)區(qū)域穿過的整個(gè)區(qū)域的體積來確定。然而，光檢測(cè)區(qū)域的有效體積依賴于激發(fā)光或檢測(cè)的光的波長(zhǎng)、透鏡的數(shù)值孔徑和光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整條件而變化，因此，通常難以從設(shè)計(jì)參數(shù)值計(jì)算光檢測(cè)區(qū)域的有效體積，并且也不容易計(jì)算光檢測(cè)區(qū)域已穿過的整個(gè)體積。那么，典型地，用具有已知的顆粒濃度的溶液(參考溶液)在與要試驗(yàn)試樣溶液的測(cè)量相同條件下如上所述進(jìn)行光強(qiáng)度測(cè)量、發(fā)光顆粒的檢測(cè)及其計(jì)數(shù)，然后，可由參考溶液中所檢測(cè)的顆粒數(shù)和顆粒濃度來確定光檢測(cè)區(qū)域已穿過的整個(gè)區(qū)域的體積，即要觀察顆粒的檢測(cè)數(shù)和濃度之間的關(guān)系。優(yōu)選地，參考溶液的顆?？蔀榫哂信c要觀察顆粒形成的顆粒和發(fā)光探針的結(jié)合體(或者在結(jié)合至要觀察顆粒后已從所述顆粒分離的發(fā)光探針)相同的波長(zhǎng)特性的發(fā)光標(biāo)簽(熒光染料等)。具體地，例如，假設(shè)在顆粒濃度為C的參考溶液中顆粒的檢測(cè)數(shù)為N，則由下式給出光檢測(cè)區(qū)域已穿過的整個(gè)區(qū)域的體積Vt Vt=N/C —(5)任選地，將多種不同濃度的溶液制備為參考溶液，對(duì)各溶液進(jìn)行測(cè)量，然后，將所計(jì)算的Vt的平均值確定為光檢測(cè)區(qū)域已穿過的整個(gè)區(qū)域的體積Vt。因此，當(dāng)給出Vt時(shí)，給出其顆粒的計(jì)數(shù)結(jié)果為η的試樣溶液的顆粒的數(shù)密度C c=n/Vt ---(6)
就這一點(diǎn)而言，可通過任意方法例如使用FCS和FIDA代替上述方法來給出光檢測(cè)區(qū)域的體積和已穿過光檢測(cè)區(qū)域的整個(gè)區(qū)域的體積。另外，在該實(shí)施方案的光學(xué)分析中，對(duì)于光檢測(cè)區(qū)域的假設(shè)的移動(dòng)模式，可預(yù)先在計(jì)算機(jī)18的存儲(chǔ)設(shè)備中存儲(chǔ)關(guān)于各種標(biāo)準(zhǔn)顆粒的濃度C和顆粒數(shù)N之間的關(guān)系(表達(dá)式(5))的信息，從而在進(jìn)行光學(xué)分析時(shí)裝置使用者可適當(dāng)?shù)厥褂藐P(guān)于該關(guān)系的存儲(chǔ)信息。為了證實(shí)上述本發(fā)明的有效性，進(jìn)行如下所述的實(shí)驗(yàn)。就這一點(diǎn)而言，應(yīng)理解的是，以下實(shí)施方案僅說明本發(fā)明的有效性，而不意于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施方案I使用熒光染料的核酸濃度的測(cè)暈使用作為DNA嵌入劑熒光染料的SYTOX Orange (當(dāng)結(jié)合至DNA時(shí)其熒光強(qiáng)度顯著增加的染料)作為發(fā)光探針，證實(shí)通過本發(fā)明的方法的試樣溶液中DNA濃度的可測(cè)量范圍 (參見圖3 (c))。在這一點(diǎn)上，還測(cè)量來自用讀板儀測(cè)量的熒光強(qiáng)度的DNA濃度的可測(cè)量范圍作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。關(guān)于試樣，通過將作為要觀察顆粒的DNA(pbr322, Takara Bio, Inc. , Cat.No. 3035)溶解在包含 IOnM SYTOX Orange (Invitrogen Corp. , Cat. No. S-11368)的憐酸鹽緩沖液(包括O. 05%吐溫20)中以使DNA分子濃度為OM (參考溶液)、IOOfM, lpM、IOpM或IOOpM來制備多種試樣溶液。就這一點(diǎn)而言，SYTOX Orange為當(dāng)結(jié)合至DNA時(shí)其熒光強(qiáng)度增加約500倍的熒光染料(圖3(c)中其波長(zhǎng)特性改變的熒光染料的實(shí)例)。在根據(jù)本發(fā)明方法的測(cè)量中，裝備有共焦熒光顯微鏡和光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)的光學(xué)系統(tǒng)的單分子突光測(cè)量設(shè)備MF-20 (Olympus Corporation)用作光學(xué)分析裝置，并根據(jù)上述“(2)試樣溶液的光強(qiáng)度的測(cè)量”中所述的方式來獲取上述各試樣溶液的時(shí)間序列光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。在此時(shí)，將633nm激光用于激發(fā)光，并使用帶通濾波器將檢測(cè)光的波長(zhǎng)設(shè)為660-710nm。將在試樣溶液中的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)為15mm/秒；BIN ΜΕ設(shè)為lOysec.;和測(cè)量持續(xù)時(shí)間設(shè)為2秒。在光強(qiáng)度測(cè)量后，根據(jù)上述“(3) (ii)要觀察顆粒的計(jì)數(shù)”中所述的步驟，計(jì)數(shù)在來自各試樣溶液所獲取的時(shí)間序列光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的時(shí)間序列數(shù)據(jù)中檢測(cè)的光信號(hào)。在通過步驟110中數(shù)據(jù)的移動(dòng)平均法平滑化時(shí)，一次平均的數(shù)據(jù)點(diǎn)為9個(gè)，移動(dòng)平均處理重復(fù)5次。此外，在步驟140的擬合中，通過最小二乘法進(jìn)行高斯函數(shù)對(duì)時(shí)間序列數(shù)據(jù)的擬合，(在高斯函數(shù)中)確定峰值強(qiáng)度、脈沖寬度(半高全寬)和相關(guān)系數(shù)。此外，在步驟150的判定過程中，僅將滿足以下條件的脈沖信號(hào)判定為對(duì)應(yīng)于要觀察顆粒的光信號(hào)20 μ sec. < 脈沖寬度〈400 μ sec.峰值強(qiáng)度>1(光子/10 μ sec.)—⑷相關(guān)系數(shù)>0.95而不滿足上述條件的脈沖信號(hào)忽略為噪音，然后，將判定為對(duì)應(yīng)于要觀察顆粒的光信號(hào)的數(shù)量計(jì)數(shù)為“脈沖數(shù)”。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，使用讀板儀SH_80001ab (Corona)測(cè)量上述各試樣溶液的熒光強(qiáng)度。將激發(fā)光波長(zhǎng)設(shè)為543nm ;檢測(cè)光的波長(zhǎng)設(shè)定為570nm ;激發(fā)側(cè)和檢出測(cè)的頻帶寬度均設(shè)定為12nm。在測(cè)量熒光強(qiáng)度時(shí)，進(jìn)行3次施加50回激發(fā)光閃爍的測(cè)量，并將它們的平均值用作最終的熒光強(qiáng)度值。
圖9(A)和(B)各自示出在各濃度的試樣溶液中所檢測(cè)的通過上述本發(fā)明方法的測(cè)量結(jié)果(脈沖數(shù))和對(duì)照實(shí)驗(yàn)的測(cè)量結(jié)果(熒光強(qiáng)度)。首先，關(guān)于圖9(A)，通過本發(fā)明方法測(cè)量的脈沖數(shù)(計(jì)數(shù)的光信號(hào)數(shù))幾乎與核酸濃度成比例地增加。根據(jù)該結(jié)果，已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法能夠一個(gè)接一個(gè)地檢測(cè)單個(gè)核酸(要觀察顆粒)，并發(fā)現(xiàn)通過根據(jù)本發(fā)明的方法計(jì)數(shù)單個(gè)要觀察顆粒，可定量確定其濃度。另外，在圖9(B)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，可認(rèn)識(shí)到在核酸濃度為OM情況下的熒光強(qiáng)度和在核酸濃度為IOOpM情況下的熒光強(qiáng)度之間無顯著差異，而在圖9(A)的本發(fā)明方法中，在核酸濃度為OM情況下的脈沖數(shù)和在核酸濃度為IOOfM情況下的脈沖數(shù)之間發(fā)現(xiàn)了顯著差異。這些結(jié)果的原因被認(rèn)為如下對(duì)于用讀板儀測(cè)量的熒光強(qiáng)度，由于噪音或污染物產(chǎn)生的光信號(hào)重疊，因此在噪音或污染物對(duì)熒光強(qiáng)度的影響相當(dāng)大的低濃度范圍中S/N比變得更差。另一方面，在本發(fā)明的情況下，判斷時(shí)間序列光信號(hào)數(shù)據(jù)中各脈沖信號(hào)是否對(duì)應(yīng)于要觀察顆粒，并且忽略判定為噪音或污染物的信號(hào)(參見圖8)，因此，即使在噪音或污染物對(duì)熒光強(qiáng)度的影響相當(dāng)大的低濃度區(qū)域，S/N比也保持相當(dāng)良好。因此，已顯示，根據(jù)本發(fā)明的方法，顆粒的數(shù)密度或濃度可確定為比通過使用熒光強(qiáng)度的常規(guī)方法可測(cè)量的數(shù)密度或濃度的限度還要低的濃度范圍。另外，在包括例如熒光強(qiáng)度波動(dòng)的計(jì)算等的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的光學(xué)分析技術(shù)如FCS、FIDA和PCH中可測(cè)量的顆粒濃度的下限約為InM，在本實(shí)施方案中可測(cè)量的顆粒濃度的下限為 IOOfM,因此，還顯示，根據(jù)本發(fā)明能夠測(cè)量濃度范圍顯著低于光學(xué)分析技術(shù)如FCS、FIDA和PCH的情況中的顆粒。順便提及，參照?qǐng)D9結(jié)果的較高濃度側(cè)，在本發(fā)明的情況下，在濃度從IOpM增加至IOOpM時(shí)脈沖數(shù)期望地增加約10倍，而在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，濃度從IOpM增加至IOOpM時(shí)熒光強(qiáng)度的增加寬度比期望的10倍小。該現(xiàn)象可被認(rèn)為如下在本實(shí)施方案的系統(tǒng)中，如圖9 (C)左圖所示，兩種或更多種熒光染料一起結(jié)合至為要觀察顆粒的核酸。在該情況下，當(dāng)核酸濃度低于熒光染料濃度時(shí)，存在大量染料，因此已結(jié)合至一個(gè)核酸的染料數(shù)量是穩(wěn)定的，但如圖9 (C)右圖所示，當(dāng)核酸濃度較高時(shí)，染料的數(shù)量變得相對(duì)不足，而已結(jié)合至一個(gè)核酸的染料數(shù)量減少，因此可認(rèn)為熒光強(qiáng)度不容易跟隨核酸濃度而增加。另一方面，由于將本發(fā)明設(shè)計(jì)為可計(jì)數(shù)對(duì)應(yīng)于要觀察顆粒的光信號(hào)的數(shù)量，因此由于已結(jié)合至一個(gè)核酸的染料數(shù)量的減少所引起的影響小，因此可認(rèn)為脈沖數(shù)期望地增加至較高濃度范圍。這表示，根據(jù)本發(fā)明的方法，在兩種或更多種發(fā)光探針結(jié)合至要觀察顆粒的系統(tǒng)中，可確定顆粒的數(shù)密度或濃度達(dá)到高于可在現(xiàn)有技術(shù)中假設(shè)熒光強(qiáng)度與發(fā)光探針的數(shù)密度或濃度成比例的情況下可測(cè)量的數(shù)密度或濃度的上限的濃度范圍。實(shí)施方案2使用分子信標(biāo)的核酸檢測(cè)證實(shí)可根據(jù)本發(fā)明的方法使用分子信標(biāo)來檢測(cè)具有特定堿基序列的核酸分子。如前面所述，分子信標(biāo)為其中供體染料和受體染料已分別添加至其兩端的核酸分子，并將該分子設(shè)計(jì)為在單個(gè)分子中，供體染料和受體染料之間的距離如此近以至于可發(fā)生從供體染料向受體染料的熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，但是當(dāng)其結(jié)合至具有與其自身堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核酸或核酸類似物時(shí)，供體染料和受體染料之間的距離增加，從而不會(huì)發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(參見圖3(d))。在實(shí)驗(yàn)中，作為分子信標(biāo)，使用具有以下堿基序列的核酸，其中TAMRA(供體染料)連接至5’端，BHQ_2(受體染料，在該情況下，熒光很難發(fā)出。)添加至3’端TAMRA-cctacgccaacagctccaactacgtagg-BHQ2另外，對(duì)于要觀察顆粒，使用具有如下堿基序列的核酸gtagttggagctgttggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcag上述核酸通過請(qǐng)求Sigma genosis, Inc.來合成。然后，為了制備試樣溶液,上述分子信標(biāo)和要觀察顆粒(核酸)分別以500pM和IOOnM溶解在磷酸鹽緩沖液(包括O. 05%吐溫20)中。對(duì)于對(duì)照溶液，制備僅包含500pM分子信標(biāo)而無要觀察顆粒(核酸)的溶液。在與實(shí)施方案I的情況相同的條件下進(jìn)行通過本發(fā)明的方法的試樣溶液和對(duì)照溶液的測(cè)量。另外，作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，類似于實(shí)施方案I的情況，使用將激發(fā)光的波長(zhǎng)設(shè)為550nm，檢測(cè)光的波長(zhǎng)設(shè)為576nm的讀板儀測(cè)量試樣溶液和對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度。圖10 (A)和⑶各自示出對(duì)于試樣溶液(MB+靶標(biāo))和參考溶液(僅MB)通過上述本發(fā)明方法的測(cè)量結(jié)果(脈沖數(shù))和通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)的測(cè)量結(jié)果(熒光強(qiáng)度)。首先，參照?qǐng)D10(A)清楚地示出，與對(duì)照溶液的情況相比，包含要觀察顆粒核酸的試樣溶液的脈沖數(shù)顯著增加(6倍差)，方差也小。另一方面，在圖10(B)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)的情況中，看到試樣溶液和對(duì)照溶液之間熒光強(qiáng)度平均值的差異，但方差大。正如前面所提及，本實(shí)施方案中的分子信標(biāo)的濃度為500pM，如從實(shí)施方案I的結(jié)果所理解的，認(rèn)為該濃度接近于可由使用讀板儀的熒光強(qiáng)度所測(cè)量的濃度下限，圖10的結(jié)果示出，與基于熒光強(qiáng)度的常規(guī)檢測(cè)方法的情況相比，根據(jù)本發(fā)明的方法，使用分子信標(biāo)檢測(cè)具有某一特定堿基序列的核酸還可在低發(fā)光探針濃度的溶液中以較好的精確度實(shí)現(xiàn)。實(shí)施方案3在未反應(yīng)的熒光標(biāo)記探針已通過物理純化除去的試樣溶液中的核酸檢測(cè)證實(shí)，在熒光標(biāo)記的短核酸(熒光標(biāo)記探針)作為發(fā)光探針與為要觀察顆粒的核酸(靶核酸)結(jié)合后，可根據(jù)本發(fā)明的方法在通過借助物理純化除去未反應(yīng)的熒光標(biāo)記探針而獲得的試樣溶液中檢測(cè)到靶核酸。(參見圖3(a))具體地，通過將退火處理(退火溫度95°c、90°c、8(rc、7(rc、6(rc、5(rc、4(rc、30°C、20°C各IOmin,-O. 1°C /sec.)應(yīng)用到通過以IOOpMilOnM的比例將靶核酸和熒光標(biāo)記探針混入STE緩沖溶液(200mM NaCl，IOnM Tris, InM EDTA, pH=7. O)中所獲得的溶液中來制備樣本(探針-靶標(biāo))，通過類似地將退火處理應(yīng)用到通過將熒光標(biāo)記探針溶解在IOnM的STE緩沖溶液而獲得的溶液來制備樣本(探針)。所使用的靶核酸和熒光標(biāo)記探針的堿基序列如下靶核酸5，-gaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcactggccgtcgttttac-3>突光標(biāo)記探針ATT0647N_ggggatcctctagagtcgacc(ATTOM7N 為熒光染料。)其后，使用硅膠膜將這些樣本的部分純化(QIAGEN的純化試劑盒(MinElute PCRPurification kit))，并用50L STE緩沖溶液洗脫。然后，在與實(shí)施方案I的情況相同的條件下，根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行光的測(cè)量和脈沖信號(hào)的檢測(cè)，將用硅膠膜純化的各樣本(純化)和未精制的樣本(未純化)作為試樣溶液。就這一點(diǎn)而言，將IOOyW激光用于激發(fā)光，進(jìn)行3次光測(cè)量時(shí)間為20秒的測(cè)量。圖11示出在各樣本中檢測(cè)的脈沖數(shù)的平均值(條形圖)和標(biāo)準(zhǔn)差(誤差條)。如從圖中所理解的，雖然在未純化的樣品(未純化)中，在包含靶核酸的情況(探針-靶標(biāo))和不包含靶核酸的情況(探針)之間幾乎未發(fā)現(xiàn)脈沖數(shù)的差異，但在純化樣本(純化)中，與包含靶核酸的情況(探針-靶標(biāo))相比，不包含靶核酸的情況(探針)中的脈沖數(shù)基本上減少。即，這顯示出，通過借助物理純化(用硅膠膜純化)除去未反應(yīng)的發(fā)光探針，變得能夠選擇性地檢測(cè)要觀察顆粒。實(shí)施方案4利用熒光能暈轉(zhuǎn)移(FRET)的核酸檢測(cè)證實(shí)，在將當(dāng)彼此相互接近時(shí)引起熒光能量轉(zhuǎn)移的兩種熒光標(biāo)記的短核酸(供體肽核酸，受體肽核酸)作為發(fā)光探針與作為要觀察顆粒的核酸(靶核酸)結(jié)合，然后使得特 異性結(jié)合至未反應(yīng)的發(fā)光探針的光受體(猝滅探針)結(jié)合至未反應(yīng)的發(fā)光探針從而猝滅來自未反應(yīng)的發(fā)光探針的熒光標(biāo)簽的光的條件下，當(dāng)使得熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象在供體肽核酸和受體肽核酸之間發(fā)生時(shí)(參見圖12(a))，通過檢測(cè)來自受體肽核酸(用作能量受體的發(fā)光探針)的光可選擇性地檢測(cè)靶核酸，并可確定靶核酸的濃度(參見圖3(b)和(e))。具體地，制備包含O. l%Pluronic F-127 的試樣溶液(IOmM Tris-HCl (ρΗ8· O))，其中添加熒光能量供體肽核酸(PANAGENE)和受體肽核酸(PANAGENE)以使二者分別為200ρΜ，靶核酸(SIGMA GEN0SYS)添加為lpM、IOpM或ΙΟΟρΜ。還制備不包含靶核酸的試樣。然后，在各試樣溶液通過在95°C下加熱5分鐘而變性后，通過將液體溫度逐漸減少至20°C而形成靶核酸和肽核酸的締合體(溫度降低速度設(shè)為O.10C /sec.，在90°C 5分鐘；80°C 10分鐘；70°C 10分鐘；60°C 10分鐘；50°C 10分鐘；40°C 10分鐘；和30°C 10分鐘下進(jìn)行降溫處理。)。其后，供體肽核酸用猝滅探針(SIGMA GEN0SYS)和受體肽核酸用猝滅探針(SIGMAGEN0SYS)分別以InM添加，20°C下進(jìn)行溫育30分鐘。供體肽核酸、受體肽核酸、猝滅供體肽核酸用核酸、猝滅受體肽核酸用核酸和靶核酸的堿基序列分別如下供體妝核酸Alexa488-00_cctacgccaccagctccaac受體妝核酸agctgtatcgtcaaggcact-0-Lys_Alexa594猝滅供體肽核酸用核酸ggagctggtggcg-BHQl-dT-agg-BHQl猝滅受體肽核酸用核酸BHQ2-ag-BHQ2-dT-gccttgacgataca靶核酸atRactRaatataaacttRtRRtaRttRRaRctRRtRRCRtaRRcaaRaRtRccttRacRatacaRctaattcagaat在靶核酸中，左側(cè)下劃線為結(jié)合至供體肽核酸的序列，右側(cè)下劃線為結(jié)合至受體肽核酸的序列。Alexa488和Alexa594為熒光染料，BHQl和BHQ2分別為Alexa488和Alexa594的粹滅分子。接下來，使用上述試樣溶液，根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行光的測(cè)量、脈沖信號(hào)的檢測(cè)和計(jì)數(shù)。在測(cè)量中，將裝備有共焦熒光顯微鏡和光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)的光學(xué)系統(tǒng)的單分子熒光測(cè)量設(shè)備MF20 (Olympus，Inc.)用作光學(xué)分析裝置，以獲取各上述試樣溶液的時(shí)間序列光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。在該情況下，對(duì)于激發(fā)光，使用1-mW 488nm的激光(對(duì)應(yīng)于供體肽核酸的熒光染料Alexa488的激發(fā)波長(zhǎng))，并用長(zhǎng)通濾波器將檢測(cè)光的波長(zhǎng)設(shè)為615nm_ (對(duì)應(yīng)于受體肽核酸的熒光染料Alexa594的發(fā)光波長(zhǎng))。將在試樣溶液中的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)為67. 5mm/sec.，將ΒΙΝ ΜΕ設(shè)為10 μ sec.，測(cè)量時(shí)間設(shè)為2秒。另外，各試樣進(jìn)行五次測(cè)量。在測(cè)量光強(qiáng)度后，類似于實(shí)施方案1，在所獲取的各試樣溶液的時(shí)間序列光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)上進(jìn)行脈沖信號(hào)的檢測(cè)和計(jì)數(shù)。并且，計(jì)算那些檢測(cè)的脈沖數(shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。圖12 (B)示出在具有上述各濃度靶核酸的試樣溶液中檢測(cè)的脈沖數(shù)的平均值(條形圖)和標(biāo)準(zhǔn)差(誤差條)。參照附圖，IpM以上濃度中，脈沖數(shù)隨著靶核酸濃度的增加而增加。這表明，通過使引起熒光能量轉(zhuǎn)移的兩種發(fā)光探針結(jié)合至要觀察顆粒并檢測(cè)為能量受體的發(fā)光探針的光，使要觀察顆粒的選擇性檢測(cè)和其濃度的測(cè)定變得可能。實(shí)施方案5利用熒光猝滅法的核酸(要觀察顆粒)檢測(cè) 證實(shí)，在使熒光標(biāo)記的短核酸(熒光標(biāo)記探針)作為發(fā)光探針結(jié)合至為要觀察顆粒的核酸(靶核酸)后，將標(biāo)記有熒光猝滅分子的核酸(猝滅探針)應(yīng)用于未反應(yīng)的熒光標(biāo)記探針，根據(jù)本發(fā)明的方法，可在試樣溶液中檢測(cè)靶核酸(參見圖3 (b))。具體地，將其5'端被熒光染料Alexa488修飾的單鏈核酸(熒光探針)和其3'端被猝滅分子BHQl修飾的單鏈核酸(猝滅探針)分別以5nM和2M溶解在IOOmMTris-HCl (pH8. O)溶液(Tris緩沖液)中。另外，類似地，將雙鏈核酸(靶核酸)以IOOpM,InM和IOnM溶解在Tris緩沖液中。接下來，混合5 μ L熒光探針溶液、5 μ L猝滅探針溶液、5 μ L各靶核酸溶液和35 μ L Tris緩沖液。用熱循環(huán)儀將這些溶液的溫度升至95°C，然后經(jīng)90分鐘降至20°C，以使熒光探針與靶核酸雜交。熒光探針、猝滅探針和靶核酸的堿基序列如下(以5' —3'方向表示)突光探針aaacttgtggtagttggagctgttggcgtagg粹滅探針aacagctccaactaccacaagttt靶核酸gaagtacagttcattacgatacacgtctgcagtcaactggaattttcatgattgaattttgtaaggtattttgaaataatttttcatataaaggtgagtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttcattatttttattataaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaataggggtaaatcttgttttaatatgcatattactggtgcaggaccattctttgatacagataaaggtttctctgaccattttcatgagtacttattacaagataattatgctgaaagttaagttatctgaaatgtaccttgggtttcaagttatatgtaaccattaatatgggaactttact在上述試樣溶液中，由于存在大量猝滅探針，所有未結(jié)合至靶核酸的熒光探針結(jié)合至猝滅探針，從而使來自結(jié)合至猝滅探針的熒光探針的熒光基本上被猝滅(參見圖13 ⑷)。然后，根據(jù)本發(fā)明的方法，使用上述試樣溶液進(jìn)行光的測(cè)量、脈沖信號(hào)的檢測(cè)和計(jì)數(shù)。在測(cè)量中，將裝備有共焦熒光顯微鏡和光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)的光學(xué)系統(tǒng)的單分子熒光測(cè)量設(shè)備MF20 (Olympus，Inc.)用作光學(xué)分析裝置，以獲取各上述試樣溶液的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù))。在該情況下，對(duì)于激發(fā)光，使用200yW488nm的激光，并用帶通濾波器測(cè)量波長(zhǎng)帶域?yàn)?10-560nm的光，并產(chǎn)生時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)。試樣溶液中的光檢測(cè)區(qū)域以15mm/秒的移動(dòng)速度旋轉(zhuǎn)，BIN TIME設(shè)為10 μ sec.，測(cè)量2秒，進(jìn)行5次。然后，類似于實(shí)施方案1，在使通過測(cè)量獲得的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)平滑化后，通過微分完成峰的檢測(cè)。在能夠被看作是脈沖信號(hào)的區(qū)域中，計(jì)數(shù)可大致具有高斯函數(shù)并具有I以上強(qiáng)度的脈沖。從各試樣溶液獲得的脈沖數(shù)(五次測(cè)量的平均值)示于圖13⑶。如從圖中所理解的，脈沖數(shù)隨著靶核酸濃度的增加而增加。特別地，在OM和IOOpM的情況之間的五次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)差中無重疊這表明，根據(jù)本實(shí)施方案的方法，能夠測(cè)量IOOpM以上的核酸濃度。實(shí)施方案6利用QUAL反應(yīng)的核酸檢測(cè)證實(shí),根據(jù)本發(fā)明的方法,利用QUAL (粹滅自連接，Quenched auto-ligation)反應(yīng)(非專利文獻(xiàn)4)可檢測(cè)具有特定堿基序列的核酸分子。如圖14(A)所示，在QUAL反應(yīng) 中，當(dāng)將其中5'端標(biāo)記有彼此相互接近的熒光分子(白色圓)和猝滅分子(黑色圓)的單鏈核酸(E探針-發(fā)光探針)和其中3'端被磷酰硫酸鹽(phosphosulfate)修飾的單鏈核酸(N探針)在彼此接近的E探針的5'端與N探針的3'端的情況下結(jié)合至具有要試驗(yàn)的堿基序列的單鏈核酸(靶核酸-要觀察顆粒)上時(shí)(圖14(A)較上行)，E探針和N探針彼此結(jié)合(在圖中，指定為X的部位)，同時(shí)釋放5'端上的猝滅分子(圖14(A)較下行)，以致5'端的熒光分子發(fā)光，從而變得能夠檢測(cè)具有特定堿基序列的核酸的存在。即，這是其中發(fā)光效率依賴于要觀察顆粒的種類而改變的反應(yīng)實(shí)例(參見圖3(h))。具體地,將5'端被粹滅分子Dabcyl修飾和自5'端起第三個(gè)堿基t被突光分子Alexa488修飾的單鏈核酸(E探針,Japan bio-service)和3'端被磷酰硫酸鹽修飾的單鏈核酸(N 探針，Japan bio-service)分別以 IOnM 和 IOOnM 溶解在 IOOmM Tris-HCl (pH8. 0)溶液中。另外，類似地，將單鏈核酸(靶核酸)分別以10pM、100pM、lnM和IOnM溶解在IOOmMTris-HCl (pH8. 0)溶液中。然后，混合3yL E探針溶液、3 μ L N探針溶液、3 μ L各靶核酸溶液和21 μ L包含400mM NaCl的IOOmM Tris-HCl (pH8. 0)溶液，用熱循環(huán)儀將這些溶液的溫度升至95°C，并隨后在50°C下進(jìn)行反應(yīng)I小時(shí)。E探針、N探針和靶核酸的堿基序列如下E 探針tcttgcctacgccaccagctccaacN 探針 ttctgaattagctgtatcgtcaaggcac靶核酸gttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgaegataeagctaatteagaa因此，僅當(dāng)E探針和N探針結(jié)合至靶核酸并釋放E探針上的猝滅分子Dabcyl時(shí)，才會(huì)檢測(cè)到E探針上的Alexa488的光。接下來，根據(jù)本發(fā)明的方法，使用上述試樣溶液進(jìn)行光的測(cè)量、脈沖信號(hào)的檢測(cè)和計(jì)數(shù)。在測(cè)量中，將裝備有共焦熒光顯微鏡和光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)的光學(xué)系統(tǒng)的單分子熒光測(cè)量設(shè)備MF20 (Olympus，Inc.)用作光學(xué)分析裝置，以獲取各上述試樣溶液的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù))。在該情況下，對(duì)于激發(fā)光，使用200 μ W480nm的激光并用帶通濾波器測(cè)量波長(zhǎng)帶域?yàn)?10-560nm的光，并產(chǎn)生時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)。試樣溶液中的光檢測(cè)區(qū)域以15mm/秒的移動(dòng)速度旋轉(zhuǎn)，BIN TIME設(shè)為10 μ sec.，測(cè)量2秒，進(jìn)行5次。然后，類似于實(shí)施方案1，在使通過測(cè)量獲得的時(shí)間序列光強(qiáng)度數(shù)據(jù)平滑化后，通過微分完成峰的檢測(cè)。在能夠被看作是脈沖信號(hào)的區(qū)域中，計(jì)數(shù)可大致具有高斯函數(shù)并具有I以上的強(qiáng)度的脈沖。如圖14⑶所示，脈沖數(shù)隨著靶核酸濃度的增加而增加。特別地，在OM和IOpM的情況之間的五次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)差中無重疊這表明，根據(jù)本實(shí)施方案的方法，能夠測(cè)量IOpM以上的核酸濃度。因此，根據(jù)上述本發(fā)明的方法，通過在試樣溶液中移動(dòng)微小區(qū)域即光檢測(cè)區(qū)域的位置，即，掃描試樣溶液內(nèi)部并單獨(dú)檢測(cè)穿過光檢測(cè)區(qū)域的顆粒或在不包括FCS、FIDA等中進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理例如熒光強(qiáng)度波動(dòng)的計(jì)算的情況下進(jìn)行顆粒的計(jì)數(shù)，變得能夠檢測(cè)要觀察顆粒的濃度或數(shù)密度低于FCS、FIDA等中所使用的水平的試樣溶液中的要觀察顆粒的狀態(tài)或特性。就這一點(diǎn)而言，由于本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)基本上使用與FCS、FIDA等相同的光學(xué)系統(tǒng)，所以其可與FCS、FIDA等一起進(jìn)行。例如，在檢測(cè)包含兩種或更多種物質(zhì)的溶液中這些物質(zhì)之間的相互作用等的情況下，當(dāng)物質(zhì)之間的濃度差大時(shí)，例如，當(dāng)一種物質(zhì)的濃度為nM級(jí)，另一物質(zhì)的濃度為pM級(jí)時(shí)，可以以如下方式進(jìn)行對(duì)于較高濃度的物質(zhì)通過FCS或FIDA進(jìn)行測(cè)量和分析，而對(duì)于較低濃度的物質(zhì)通過本發(fā)明的光學(xué)分析技術(shù)進(jìn)行測(cè)量和分析。在此情況下，如圖1(A)所示，有利于制備兩種或更多種光檢測(cè)器。
權(quán)利要求
1.一種光學(xué)分析方法，其通過使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)來檢測(cè)來自結(jié)合至在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的顆粒的發(fā)光探針的光從而檢測(cè)所述顆粒，所述方法的特征在于包括以下步驟制備包含所述顆粒和所述發(fā)光探針的試樣溶液，通過改變所述光學(xué)系統(tǒng)的光學(xué)通路而在所述試樣溶液中移動(dòng)所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置；在所述試樣溶液中移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域的位置時(shí)，檢測(cè)來自所述光檢測(cè)區(qū)域的光；和在所述檢測(cè)光中單獨(dú)檢測(cè)來自已結(jié)合至各所述顆粒的所述發(fā)光探針的光信號(hào)，從而單獨(dú)檢測(cè)所述顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于進(jìn)一步包括以下步驟對(duì)所述單獨(dú)檢測(cè)的顆粒的數(shù)量計(jì)數(shù)，從而對(duì)移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域的位置的過程中所檢測(cè)的所述顆粒的數(shù)目計(jì)數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的步驟中，所述光檢測(cè)區(qū)域的位置以預(yù)設(shè)的速度移動(dòng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在所述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的步驟中，所述光檢測(cè)區(qū)域的位置以比已結(jié)合至所述顆粒的所述發(fā)光探針的擴(kuò)散移動(dòng)速率快的速率移動(dòng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在所述單獨(dú)檢測(cè)來自已結(jié)合至各所述顆粒的所述發(fā)光探針的所述光信號(hào)從而單獨(dú)檢測(cè)所述顆粒的步驟中，基于檢測(cè)的時(shí)間序列光信號(hào)的形狀來檢出一個(gè)顆粒進(jìn)入所述光檢測(cè)區(qū)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述制備所述試樣溶液的步驟包括從所述試樣溶液中分離未結(jié)合至所述顆粒的發(fā)光探針的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述制備所述試樣溶液的步驟包括使吸收來自所述發(fā)光探針的光的受體與未結(jié)合至所述顆粒的所述發(fā)光探針結(jié)合的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述發(fā)光探針為當(dāng)所述發(fā)光探針結(jié)合至所述顆粒時(shí)其發(fā)光特性改變的物質(zhì)，和所述檢測(cè)光為從已結(jié)合至所述顆粒的所述發(fā)光探針發(fā)出的光。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述發(fā)光探針為具有能量供體部位和能量受體部位的物質(zhì)，當(dāng)所述能量供體部位和能量受體部位相互接近時(shí)引起熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，其中所述能量供體部位和所述能量受體部位的距離在所述物質(zhì)已結(jié)合至所述顆粒時(shí)的狀態(tài)和在所述物質(zhì)未結(jié)合至所述顆粒時(shí)的狀態(tài)之間不同，從所述物質(zhì)發(fā)出的光的波長(zhǎng)特性在所述物質(zhì)已結(jié)合至所述顆粒時(shí)的狀態(tài)和在所述物質(zhì)未結(jié)合至所述顆粒時(shí)的狀態(tài)之間不同；和所述檢測(cè)光為從所述已結(jié)合至所述顆粒的發(fā)光探針發(fā)出的光。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述發(fā)光探針具有引起熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的能量供體部位和能量受體部位；所述制備所述試樣溶液的步驟包括進(jìn)行將已結(jié)合至所述顆粒的所述發(fā)光探針分解的反應(yīng)的步驟；和所述檢測(cè)光為從通過所述反應(yīng)分解的所述發(fā)光探針發(fā)出的光。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述發(fā)光探針包括作為在熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象中的能量供體的第一探針和作為在熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象中的能量受體的第二探針；和所述檢測(cè)光為通過在所述第一和第二探針已結(jié)合至所述顆粒的狀態(tài)下發(fā)生的所述熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象而發(fā)出的所述第二探針的光。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述顆粒具有作為由所述發(fā)光探針發(fā)出的光的能量受體的部位；和所述檢測(cè)光為通過在所述發(fā)光探針結(jié)合至所述顆粒時(shí)發(fā)生的熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象而從所述顆粒的能量受體部位發(fā)出的光。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述顆粒具有發(fā)光部位；所述發(fā)光探針具有作為所述顆粒的發(fā)光部位發(fā)出的光的能量受體的部位；和所述檢測(cè)光為通過在所述發(fā)光探針結(jié)合至所述顆粒時(shí)發(fā)生的熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象而從所述發(fā)光探針發(fā)出的光。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述顆粒為核酸，所述發(fā)光探針為核酸結(jié)合蛋白。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述發(fā)光探針為由至少兩種組分組成并且當(dāng)結(jié)合至所述顆粒且所述至少兩種組分的相互位置變化時(shí)發(fā)出熒光的物質(zhì)。
全文摘要
公開了一種光學(xué)分析技術(shù)，其可使用發(fā)光探針檢測(cè)試樣溶液中的靶顆粒的狀態(tài)或性質(zhì)，所述試樣溶液具有低濃度或數(shù)密度的所述靶顆粒。所述光學(xué)分析技術(shù)使用可檢測(cè)來自溶液微小區(qū)域中的光的光學(xué)系統(tǒng)如共焦顯微鏡或多光子顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，從而在改變?cè)嚇尤芤褐形⑿^(qū)域的位置時(shí)(即，在借助微小區(qū)域掃描試樣溶液時(shí))，檢測(cè)來自結(jié)合至靶顆粒的發(fā)光探針的光，結(jié)果，單獨(dú)檢測(cè)穿過微小區(qū)域的顆粒，使得能夠計(jì)數(shù)所述顆粒并獲得所述顆粒的濃度或數(shù)密度的信息。
文檔編號(hào)G01N21/64GK103026205SQ201180036710
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月26日
發(fā)明者田邊哲也, 中田秀孝, 葉梨拓哉, 堀邦夫, 西川和孝 申請(qǐng)人:奧林巴斯株式會(huì)社