專利名稱：用于分離水溶性生物物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于分離水溶性生物物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
因?yàn)榫哂猩砘钚缘纳镂镔|(zhì)例如以糖、核酸化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素或酸性化合物形式的物質(zhì)證實(shí)體內(nèi)的有效作用，幾乎所有這些物質(zhì)都是水溶性的，并且作為其結(jié)果，在反相條件下的層析方法頻繁應(yīng)用于分析幾乎所有這些物質(zhì)。另ー方面，近來已存在描述使用含有幾個(gè)百分比到40%的水的流動(dòng)相，通過含水正相層析來層析分離且分析這些生物水溶性生理活性物質(zhì)的嘗試的眾多報(bào)道(參見例如，非專利文件I)。這個(gè)含水正相層析稱為親水作用液相層析(HILIC)，并且視為提供可容易應(yīng)用于LC-MS的分析模式，因?yàn)樗谷醣Ａ羟译y以通過反相層析分離的化合物分離成為可能，并且僅使用揮發(fā)性有機(jī)溶劑和水用于流動(dòng)相，而不使用高度濃縮的鹽或離子對試劑。盡管大多數(shù)這些HILIC分離柱在大多數(shù)情況下使用ニ氧化硅、胺修飾的或酰胺修飾的分離劑，并且其他柱的例子包括聚胺、聚丙烯酸、聚こ烯、環(huán)糊精和兩性離子柱，但存在在具有多種官能團(tuán)、結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)的廣泛范圍的生物化合物的分離和分析過程中能夠更有效分離的HILIC分離劑的需要(參見例如，非專利文件2)。例如，層析技術(shù)例如高效液相層析(HPLC)已知作為用于分離單糖、多糖和糖醇等的方法。用于分離此類糖的分離劑的例子包括通過使聚丙烯酰胺與ニ氧化硅凝膠化學(xué)鍵合獲得的分離劑和通過將聚烷撐聚胺與ニ氧化硅凝膠化學(xué)鍵合獲得的分離劑(參見例如，專利文件I和2)。此外，用于分離糖的方法的已知例子包括將由水溶脹的纖維素填充到柱管內(nèi)，并且使用水和醇的混合物作為洗脫劑通過柱層析分離寡糖(參見例如，專利文件3)。另一方面，使用多糖衍生物例如纖維素的分離劑的已知例子是通過將纖維素或直鏈淀粉例如ニ甲基苯基氨基甲酸酯衍生物的多糖衍生物與ニ氧化硅凝膠化學(xué)鍵合獲得的用于光學(xué)異構(gòu)體分離的分離劑(參見例如，專利文件4)。[專利文件I]日本專利公開號(hào)2504005[專利文件2]日本專利公開號(hào)2558007日本專利公開號(hào)3885912[專利文件4]日本專利公開號(hào)2751004
[非專利文件 I] Journal of Chromatography A, 1994,第 676 卷，第 191-202 頁[非專利文件 2] Journal of Separation Science, 2006,第 29 卷,第 1784-1821 頁。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于分離水溶性生物物質(zhì)的新方法。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過將多糖與ニ氧化硅凝膠化學(xué)鍵合獲得的分離劑對于將水溶性生物物質(zhì)分離成個(gè)別化合物是優(yōu)異的，從而導(dǎo)致本發(fā)明的完成。

S卩，本發(fā)明提供了使用由載體和通過化學(xué)鍵合與載體表面結(jié)合的多糖組成的分離劑通過層析，用于從兩個(gè)或更多個(gè)類型的水溶性生物物質(zhì)的混合物中分離水溶性生物物質(zhì)的方法。此外，本發(fā)明提供了用于分離水溶性生物物質(zhì)的分離劑，其由載體和通過化學(xué)鍵合與載體表面結(jié)合的多糖組成。此外，本發(fā)明提供了上述方法和分離劑，其中水溶性生物物質(zhì)是其選自糖、核酸化合物、氨基酸、水溶性維生素、具有生理活性的酸性化合物及其衍生物、和寡肽的一個(gè)或多個(gè)類型。此外，本發(fā)明提供了上述方法和分離劑，其中多糖是纖維素或直鏈淀粉。因?yàn)楸景l(fā)明使用以由載體和通過化學(xué)鍵合與載體表面結(jié)合的多糖組成的分離劑形式的、先前未知具有將水溶性生物物質(zhì)分離成個(gè)別化合物的能力的分離劑，所以它能夠提供用于分離水溶性生物物質(zhì)的新方法。


圖1是顯示使用實(shí)施例的分離劑I通過HPLC由RI檢測器獲得的糖分離的層析譜的
圖2是顯示使用實(shí)施例的分離劑I通過HPLC由UV檢測器獲得的糖分離的層析譜的
圖3是顯示使用實(shí)施例的分離劑2通過HPLC由RI檢測器獲得的糖分離的層析譜的
圖4是顯示使用實(shí)施例的分離劑2通過HPLC由UV檢測器獲得的糖分離的層析譜的
圖5是顯示使用實(shí)施例的分離劑I通過HPLC由UV檢測器獲得的核酸堿基分離的層析譜的 圖6是顯示使用實(shí)施例的分離劑2通過HPLC由UV檢測器獲得的核酸堿基分離的層析譜的 圖7是顯示使用實(shí)施例的分離劑I通過HPLC由UV檢測器獲得的核苷分離的層析譜的
圖8是顯示使用實(shí)施例的分離劑2通過HPLC由UV檢測器獲得的核苷分離的層析譜的
圖9是顯示使用實(shí)施例的分離劑I通過HPLC由UV檢測器獲得的水溶性維生素分離的層析譜的 圖10是顯示使用實(shí)施例的分離劑2通過HPLC由UV檢測器獲得的水溶性維生素分離的層析譜的 圖11是顯示使用實(shí)施例的分離劑I通過HPLC由UV檢測器獲得的氨基酸分離的層析譜的 圖12是顯示使用實(shí)施例的分離劑2通過HPLC由UV檢測器獲得的氨基酸分離的層析譜的 圖13是顯示使用實(shí)施例的分離劑I通過HPLC由UV檢測器獲得的具有生理活性的酸性化合物及其衍生物分離的層析譜的 圖14是顯示使用實(shí)施例的分離劑2通過HPLC由UV檢測器獲得的具有生理活性的酸性化合物及其衍生物分離的層析譜的圖；圖15是顯示使用實(shí)施例的分離劑2通過HPLC由UV檢測器獲得的核酸堿基和核苷混合物分離的層析譜的 圖16是顯示使用商購可得的ODS柱通過HPLC由UV檢測器獲得的核酸堿基分離的層析譜的 圖17是顯示使用商購可得的ODS柱通過HPLC由UV檢測器獲得的核苷分離的層析譜的 圖18是顯示使用商購可得的ODS柱通過HPLC由UV檢測器獲得的水溶性維生素分離的層析譜的 圖19是顯示使用商購可得的ODS柱通過HPLC由UV檢測器獲得的氨基酸分離的層析譜的 圖20是顯示使用商購可得的ODS柱通過HPLC由UV檢測器獲得的具有生理活性的酸性化合物及其衍生物分離的層析譜的 圖21是顯示使用實(shí)施例的分離劑I通過HPLC由UV檢測器獲得的ニ肽和三肽混合物分離的層析譜的 圖22是顯示使用實(shí)施例的分離劑2通過HPLC由UV檢測器獲得的ニ肽和三肽混合物分離的層析譜的圖；和
圖23是顯示使用商購可得的ODS柱通過HPLC由UV檢測器獲得的ニ肽和三肽混合物分離的層析譜的圖。
具體實(shí)施例方式 在本發(fā)明中，使用由載體和通過化學(xué)鍵合與載體表面結(jié)合的多糖組成的用于水溶性生物物質(zhì)的分離劑。在本發(fā)明用于分離水溶性生物物質(zhì)的方法中，個(gè)別水溶性生物物質(zhì)使用上文提及的本發(fā)明的分離劑通過層析從兩個(gè)或更多個(gè)類型的水溶性生物物質(zhì)的混合物中分離。通常用作用于層析的分離劑的載體的載體可以用于上文提及的載體。上文提及的載體優(yōu)選多孔載體。此類多孔載體的例子包括多孔無機(jī)載體和多孔有機(jī)載體。多孔無機(jī)載體的例子包括ニ氧化硅凝膠、硅藻土、多孔玻璃、羥磷灰石、氧化鋁、氧化鈦和氧化鎂。多孔有機(jī)載體的例子包括聚丙烯酰胺和聚丙烯酸酷。上文提及的載體可以以通常用于柱層析的形式使用。此類形式的例子包括填充到柱管內(nèi)的顆粒、在柱管中含有的多孔圓柱體、和在薄膜分離中使用的多孔薄膜。從通用性和分離劑的容易制備的觀點(diǎn)來看，上文提及的載體優(yōu)選是ニ氧化硅凝膠。從所得到的峰理論塔板數(shù)和壓カ損失之間的平衡的觀點(diǎn)來看，ニ氧化硅凝膠的粒徑優(yōu)選I Pm -1，000 um,且更優(yōu)選2 um - 100 Um0從比表面積和高分子量化合物滲透到孔內(nèi)之間的平衡的觀點(diǎn)來看，ニ氧化娃凝膠的平均孔徑優(yōu)選I nm - 100 iim,且更優(yōu)選2 nm - 500 nm。具有還原末端的多糖可以用于上文提及的多糖。此類多糖可以選自合成多糖和天然存在的多糖。從識(shí)別分析靶的形狀的觀點(diǎn)來看，具有高度規(guī)則鍵合結(jié)構(gòu)的多糖優(yōu)選用于上文提及的多糖。此類多糖的例子包括a -1, 4-葡聚糖(直鏈淀粉)、^ -1, 4-葡聚糖(纖維素)、a-1,6-葡聚糖( 葡聚糖)、￠-1, 6-葡聚糖(石耳素)、a-1,3-葡聚糖、P _1，3_葡聚糖(例如凝乳聚糖(curdlan)或西佐糖(sizofiran))、a-1,2-葡聚糖、￠-1,2-葡聚糖、￠-1, 4-殼聚糖、P-l，4-N-こ酰殼聚糖(殼多糖)、￠-1, 4-半乳聚糖、a-1，6-半乳聚糖、β-1, 2-果聚糖(菊粉)、β-2, 6-果聚糖(果聚糖)、β-1, 4-木聚糖、β-1, 3-木聚糖、β -1, 4-甘露聚糖、a -1, 6-甘露聚糖、支鏈淀粉、瓊脂糖、海藻酸和具有高直鏈淀粉含量的淀粉。從使高度純化的多糖能夠容易獲得的觀點(diǎn)來看，上文提及的多糖優(yōu)選纖維素、直鏈淀粉、￠-1, 4-殼聚糖、殼多糖、β-1, 4-甘露聚糖β-1, 4-木聚糖、菊粉或凝乳聚糖，且更優(yōu)選纖維素或直鏈淀粉。從通過單體的重復(fù)聚合作用構(gòu)建規(guī)則高階結(jié)構(gòu)的觀點(diǎn)來看，上文提及的多糖的數(shù)目平均聚合度優(yōu)選11或更多。盡管不存在關(guān)于多糖的數(shù)目平均聚合度的特定上限，但從處理容易的觀點(diǎn)來看，500或更少的值是優(yōu)選的。在本發(fā)明中，多糖通過化學(xué)鍵合與載體結(jié)合。多糖可以通過化學(xué)鍵合例如共價(jià)鍵合或離子鍵合與載體表面直接結(jié)合，或可以經(jīng)由固定在載體表面上的間隔物分子結(jié)合。此類間隔物分子可以根據(jù)載體的類型適當(dāng)?shù)剡x擇。例如，具有與ニ氧化硅凝膠表面上的硅烷醇基鍵合的第一個(gè)官能團(tuán)和與多糖的還原末端化學(xué)鍵合的第二個(gè)官能團(tuán)的化合物可以用作用于ニ氧化硅凝膠的上文提及的間隔物分子。第一個(gè)官能團(tuán)的例子包括硅烷基和硅烷氧基(silanoxy)。第二個(gè)官能團(tuán)的例子包括こ烯基、氨基、羥基、羧基、醛基、異氰酸根基團(tuán)、硫氰酸根基團(tuán)、異硫氰酸根基團(tuán)、硫醇基、硅烷醇基、環(huán)氧基、醚基、酷基、酰胺基和鹵素原子。上文提及的間隔物分子優(yōu)選含有用于第一個(gè)官能團(tuán)的氨基的化合物，且優(yōu)選伯胺化合物。可以使用的此類間隔物分子的例子包括商購可得的硅烷偶聯(lián)劑和其中氨基已引入這些硅烷偶聯(lián)劑內(nèi)的化合物。上文提及的分離劑可以通過例如用間隔物分子表面處理載體或化學(xué)鍵合表面處通的載體和多糖獲得。在載體是ニ氧化硅凝膠的情況下，例如用間隔物分子的載體表面處理可以通過使用已知方法使具有氨基的硅烷偶聯(lián)劑例如3-氨基丙基三こ氧基硅烷與ニ氧化硅凝膠的表面化學(xué)鍵合執(zhí)行。在表面處理的載體和多糖之間的化學(xué)鍵合可以通過還原胺化執(zhí)行，通過例如將具有還原末端的多糖溶解于溶劑例如ニ甲基亞砜(DMSO)或氯化鋰-ニ甲基こ酰胺(DMA/LiCl)中，加入還原劑，并且在50°C - 80°C反應(yīng)12小時(shí)，以使上文提及的表面處理的ニ氧化硅凝膠表面上存在的氨基與多糖的還原末端化學(xué)鍵合。合適的化合物可以選自用于上文提及的還原劑的已知還原劑中，并且其例子包括NaBH4 (硼氫化鈉)、NaBH3CN (氰基硼氫化鈉)和硼烷化合物例如硼烷-吡啶絡(luò)合物、硼烷_ ニ甲胺絡(luò)合物或硼烷三甲胺。還原胺化可以通過進(jìn)ー步將こ酸加入反應(yīng)系統(tǒng)中在中性條件下在pH 6 - pH 8附近執(zhí)行。盡管對其不存在具體限制，但通常用于形成分離劑的多糖的量優(yōu)選基于使用的載體的量按重量計(jì)約5% -按重量計(jì)50%。此外，從抑制殘留硅烷醇基的作用的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選對分離劑實(shí)施封端處理。封端可以根據(jù)已知方法執(zhí)行，并且由于這種處理，分離劑的分離能力可以進(jìn)ー步得到穩(wěn)定或改善。如本發(fā)明中提及的“水溶性”物質(zhì)指當(dāng)水用作溶劑時(shí)，溶解于水中的那種，并且在本發(fā)明中分離的上文提及的水溶性生物物質(zhì)包括具有相當(dāng)?shù)偷姆肿恿炕蚨鄠€(gè)氫鍵的極性分子晶體，以及在水溶液中貢獻(xiàn)或接受質(zhì)子的那些。此外，如本發(fā)明中提及的“水溶性的”指在水中具有0.001% (10 ppm)或更多的溶解度。水溶性生物物質(zhì)的分子量包括大致30 -
10,000的分子量。如本發(fā)明中提及的“水溶性生物物質(zhì)”包括組成機(jī)體(body)的水溶性物質(zhì)，在由機(jī)體代謝中使用的水溶性物質(zhì)，和具有生理活性的水溶性物質(zhì)。此類水溶性生物物質(zhì)的具體例子包括核酸化合物包括核酸堿基和核苷、水溶性維生素、氨基酸、具有生理活性的酸性化合物及其衍生物、和寡肽。屬于下文列出相同范疇的僅充當(dāng)分析靶的那些水溶性生物物質(zhì)可以靶向用于分析，或其中含有屬于不同范疇的那些物質(zhì)的混合物可以靶向用于分析。在本發(fā)明中分離的上文提及的核酸化合物的例子包括核酸堿基，包括胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鳥嘌呤，和以核糖核苷形式的核苷，包括5-甲基尿苷、尿苷、腺苷、胞苷和鳥苷，和以脫氧核糖核苷形式的核苷，包括胸苷、脫氧尿苷、脫氧腺苷、脫氧胞苷和脫氧鳥苷。在本發(fā)明中分離的上文提及的水溶性維生素的例子包括維生素C、維生素B1、維生素B2、維生素B3包括煙酸和煙酰胺、維生素B5、維生素B6、維生素B7、維生素B9和維生素 B12。在本發(fā)明中分離的上文提及的氨基酸優(yōu)選a-氨基酸，并且組成蛋白質(zhì)的其例子包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。在本發(fā)明中分離的上文提及的具有生理活性的酸性化合物及其衍生物優(yōu)選具有1-500個(gè)碳原子且更優(yōu)選具有1- 300個(gè)碳原子和羧基。如本發(fā)明中提及的“生理活性”指由作用于機(jī)體的特定生理調(diào)節(jié)功能的物質(zhì)具有的那種。上文提及的酸性化合物及其衍生物的例子包括吡啶甲酸及其中含氮六元環(huán)的任意氫原子由羥基取代的其衍生物，其中羧基由具有1- 3個(gè)碳原子的醇酯化的衍生物，和其中含氮六元環(huán)的任意氫原子由羥基取代和羧基被酯化的衍生物。具體例子包括煙酸、煙酸甲酷、6-羥基煙酸和5-羥基煙酸。此外，在以甲酸、こ酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蘧酸、十五酸、棕櫚酸、十七酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、結(jié)核硬脂酸(tuberculostearic acid)、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山箭酸、二十ニ碳六烯酸、二十四燒酸、臘酸、褐煤酸(montanoic acid)和蜂花酸(mellisic acid)的形式的脂肪酸和不飽和脂肪酸的情況下，其反式和順式異構(gòu)體也是分析靶的具體例子。在本發(fā)明中分離的上文提及的寡肽的例子優(yōu)選具有5個(gè)或更少氨基酸殘基，并且更優(yōu)選三肽或ニ肽。組成肽的氨基酸殘基的例子包括上文提及的a-氨基酸。在本發(fā)明中分離的上文提及的糖的例子包括單糖例如葡萄糖、木糖或果糖，ニ糖例如麥芽糖、乳糖或蔗糖，和糖醇例如甘油。上文提及的分離劑可以用作層析中的分離劑，所述層析使用微粒、圓柱狀或薄膜樣分離劑。此類層析的例子包括氣相層析、液相層析、薄層層析、模擬移動(dòng)床層析和超臨界流體層析。這些層析方法可以通過普通方法執(zhí)行，除了使用上文提及的分離劑外。在這些層析方法中，液體例如水或多個(gè)類型的溶劑，或已知流體例如超臨界流體或亞臨界流體可以用于流動(dòng)相。例如，在超臨界流體層析的情況下，由超臨界ニ氧化碳組成的超臨界流體、由亞臨界ニ氧化碳組成的亞臨界流體、或超臨界ニ氧化碳和添加劑的混合流體可以用于流動(dòng)相。上文提及的添加劑的例子包括具有1- 8個(gè)碳原子的醇、こ腈、丙酮、四氫呋喃、氯仿、ニ氯甲烷、こ酸酷、叔丁基甲醚和水?？梢允褂靡粋€(gè)類型或兩個(gè)或更多個(gè)類型的添加剤。使用類似于普通層析那種的程序，除了在適合于分離水溶性生物物質(zhì)的條件下執(zhí)行外，使用上文提及的分離劑的層析可以用于分析樣品中的水溶性生物物質(zhì)，或從混合物中分離特定糖。用于分離水溶性生物物質(zhì)的已知條件可以像這樣使用，或由此類已知條件進(jìn)ー步衍生的條件可以用于水溶性生物物質(zhì)的分離條件。
實(shí)施例將12 mL脫水苯和I mL脫水吡啶加入10 g通過在180°C真空干燥2小時(shí)初步活化的ニ氧化硅凝膠(FUJI SILYSIA CHEMICAL LTD.，平均孔徑:50 nm，粒徑:5 Pm)中，隨后加入0.7 mL 3-氨基丙基三こ氧基硅烷，并且在90°C反應(yīng)12小吋。在用甲醇、丙酮和己烷洗滌這個(gè)表面處理的ニ氧化硅凝膠后，將ニ氧化硅凝膠在60°C真空干燥2小吋，以獲得其中氨基丙基與其表面結(jié)合的表面處理的ニ氧化硅凝膠。將通過使1.0 g直鏈淀粉(平均聚合度:160)溶解于8 mL脫水DMSO中獲得的溶液加入所得到的表面處理的ニ氧化硅凝膠中，并且將通過將30 mgこ酸加入經(jīng)由使150 mgNaBH3CN溶解于5 mL脫水DMSO中獲得的溶液中而獲得的溶液加入所得到的漿中，隨后在氮的存在下在50°C反應(yīng)12小時(shí)，以使表面處理的ニ氧化硅凝膠的氨基與直鏈淀粉的還原末端化學(xué)鍵合，且獲得直鏈淀粉鍵合的ニ氧化硅凝膠。使用G4玻璃濾器將所得到的直鏈淀粉鍵合的ニ氧化硅凝膠過濾，并且將殘?jiān)肈MS0、四氫呋喃、甲醇、丙酮和己烷洗滌，以從直鏈淀粉鍵合的ニ氧化硅凝膠中去除未結(jié)合的直鏈淀粉等，隨后在60°C真空干燥2小吋，以獲得通過經(jīng)由化學(xué)鍵合使直鏈淀粉與ニ氧化硅凝膠表面鍵合獲得的分離劑I。分離劑I的元素分析值由C:4.29%，H:0.90%和N:0.22%組成。此外，將通過使l.0g纖維素(由MERCK制造，平均聚合度:200)溶解于21 mL脫水DMA/LiCl中獲得的溶液加入上文提及的表面處理的ニ氧化硅凝膠中，并且將通過將30mgこ酸加入經(jīng)由使150 mg NaBH3CN溶解于5 mL脫水DMA/LiCl中獲得的溶液中而獲得的溶液加入所得到的漿中，隨后在氮的存在下在50°C反應(yīng)36小時(shí)，以使表面處理的ニ氧化硅凝膠的氨基與纖維素的還原末端化學(xué)鍵合，且獲得纖維素鍵合的ニ氧化硅凝膠。使用G4玻璃濾器將所得到的纖維素鍵合的ニ氧化硅凝膠過濾，并且將殘?jiān)肈MA/LiCl、四氫呋喃、甲醇、丙酮和己烷洗滌，以從纖維素鍵合的ニ氧化硅凝膠中去除未結(jié)合的纖維素等，隨后在60°C真空干燥2小吋，以獲得通過經(jīng)由化學(xué)鍵合使纖維素與ニ氧化硅凝膠表面鍵合獲得的分離劑2。分離劑2的元素分析值由C:2.12%,H:0.56%和N:0.15%組成。通過勻漿填充將分離劑I和2分別填充到具有0.46 cm內(nèi)徑和25 cm長度的不銹鋼空柱，以分別獲得含有填充的分離劑I的柱I和含有填充的分離劑2的柱2。此外，由KYOTO CHR0MAT0制造的PSlO和PS-20自動(dòng)填充系統(tǒng)用于將分離劑填充到柱內(nèi)。
使用這些柱I和2通過HPLC評估分離劑I和2分離由葡萄糖、木糖、果糖、甘油、麥芽糖、乳糖和蔗糖組成的總共七個(gè)類型的糖的能力。通過將七個(gè)類型的糖以約4，000 ppm的濃度溶解于流動(dòng)相中獲得的溶液用于樣品溶液。水和こ腈的混合物(水/こ腈=25/75(體積比))用于流動(dòng)相。流動(dòng)相的流速是0.5 mL/分鐘，并且柱溫是25°C，并且樣品溶液的注射量是20 UL，并且RI檢測器和UV檢測器用于檢測器。UV檢測器的檢測波長是190nm。使用RI檢測器用分離劑I的糖分離的層析譜顯示于圖1中，使用UV檢測器用分離劑I的糖分離的層析譜顯示于圖2中，使用RI檢測器用分離劑2的糖分離的層析譜顯示于圖3中，并且使用UV檢測器用分離劑2的糖分離的層析譜顯示于圖4中。<核酸堿基的分離>
使用上文提及的柱I和2通過HPLC評估分離劑I和2分離由胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤和胞嘧啶組成的總共四個(gè)類型的核酸堿基的能力。樣品溶液含有各自以50 ppm濃度的四個(gè)類型的核酸堿基。10 mMこ酸銨水溶液和こ腈的混合物(10 mM AcONH4aq/CH3CN = 10/90(體積比))用于流動(dòng)相。流動(dòng)相的流速是1.0 mL/分鐘，并且柱溫是25°C，并且樣品溶液的注射量是I UL，并且UV檢測器(254 nm)用于檢測器。用分離劑I的核酸堿基分離的層析譜顯示于圖5中，并且用分離劑2的核酸堿基分離的層析譜顯示于圖6中。洗脫次序?qū)τ诜蛛x劑I和2是相同的。(核酸堿基的分離:比較實(shí)施例)
使用商購可得的ODS柱(商品名稱:L柱，Chemicals Evaluation and ResearchInstitute,日本)通過HPLC評估用ODS柱分離由胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤和胞嘧啶組成的總共四個(gè)類型的核酸堿基的能力。樣品溶液含有各自以250 ppm濃度的四個(gè)類型的核酸堿基。10 mMこ酸銨水溶液和こ腈的混合物(10 mM AcONH4aq/CH3CN = 90/10 (體積比))用于流動(dòng)相。流動(dòng)相的流速是1.0 mL/分鐘，并且柱溫是25°C，并且樣品溶液的注射量是I UL，并且UV檢測器(254 nm)用于檢測器。用ODS柱的核酸堿基分離的層析譜顯示于圖16中。ODS柱不能保留核酸堿基化合物。<核苷的分離>
使用上文提及的柱I和2通過HPLC評估分離劑I和2分離由胸苷、尿苷、腺苷、胞苷和鳥苷組成的核苷的能力。樣品溶液含有各自以200 ppm濃度的五個(gè)類型的核苷。10 mMこ酸銨水溶液和こ腈的混合物(10 mM AcONH4aq/CH3CN = 10/90 (體積比))用于流動(dòng)相。流動(dòng)相的流速是1.0 mL/分鐘，并且柱溫是25°C，并且樣品溶液的注射量是I UL，并且UV檢測器(254 nm)用于檢測器。用分離劑I的核苷分離的層析譜顯示于圖7中，并且用分離劑2的核苷分離的層析譜顯示于圖8中。洗脫次序?qū)τ诜蛛x劑I和2是相同的。(核苷的分離:比較實(shí)施例)
使用商購可得的ODS柱(商品名稱:L柱，Chemicals Evaluation and ResearchInstitute,日本)通過HPLC評估用ODS柱分離由胸苷、尿苷、腺苷、胞苷和鳥苷組成的核苷的能力。樣品溶液含有各自以200 ppm濃度的五個(gè)類型的核苷。10 mMこ酸銨水溶液和こ腈的混合物(10 mM AcONH4aq/CH3CN = 10/90 (體積比))用于流動(dòng)相。流動(dòng)相的流速是1.0mL/分鐘，并且柱溫是25°C，并且樣品溶液的注射量是I UL，并且UV檢測器(254 nm)用于檢測器。用ODS柱的核苷分離的層析譜顯示于圖17中。ODS柱不能保留核苷。<水溶性維生素的分離的實(shí)施例> 使用上文提及的柱I和2通過HPLC評估分離劑I和2分離由煙酰胺、維生素B6、維生素B1、維生素B12和維生素C組成的水溶性維生素的能力。樣品溶液含有各自以160ppm濃度的五個(gè)類型的水溶性維生素。10 mMこ酸銨水溶液和こ腈的混合物(液體A:10mM AcONH4aq,液體B =CH3CN,液體B:0分鐘至10分鐘(90% — 50%), 10.01分鐘至30分鐘(50%))用于流動(dòng)相。流動(dòng)相的流速是1.0 mL/分鐘，并且柱溫是25°C，并且樣品溶液的注射量是5 UL，并且UV檢測器(254 nm)用于檢測器。用分離劑I的水溶性維生素分離的層析譜顯示于圖9中，并且用分離劑2的水溶性維生素分離的層析譜顯示于圖10中。洗脫次序?qū)τ诜蛛x劑I和2是相同的。(水溶性維生素的分離:比較實(shí)施例)
使用商購可得的ODS柱(商品名稱:L柱，Chemicals Evaluation and ResearchInstitute,日本)通過HPLC評估用ODS柱分離由煙酰胺、維生素B6、維生素B1、維生素B12和維生素C組成的水溶性維生素的能力。樣品溶液含有各自以160 ppm濃度的五個(gè)類型的水溶性維生素。10 mMこ酸銨水溶液和こ腈的混合物(10 mM AcONH4aq/CH3CN = 90/10 (體積比))用于流動(dòng)相。流動(dòng)相的流速是1.0 mL/分鐘，并且柱溫是25°C，并且樣品溶液的注射量是3 UL，并且UV檢測器(254 nm)用于檢測器。用ODS柱的核苷分離的層析譜顯示于圖18中。ODS柱不能保留水溶性維生素。<氨基酸的分離>
使用柱I和2通過HPLC評估分離劑I和2分離由色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和絲氨酸組成的氨基酸的能力。樣品溶液含有以8 ppm濃度的色氨酸和各自以800 ppm濃度的另外六個(gè)類型的氨基酸。20 mM磷酸鹽緩沖液(pH = 6.2)和こ腈的混合物(20 mM H3PO4 (pH = 6.2)緩沖液/CH3CN = 25/75 (體積比))用于流動(dòng)相。流動(dòng)相的流速是1.0 mL/分鐘，并且柱溫是40°C，并且樣品溶液的注射量是5 yL，并且UV檢測器(200 nm)用于檢測器。用分離劑I的氨基酸分離的層析譜顯示于圖11中，并且用分離劑2的氨基酸分離的層析譜顯示于圖12中。洗脫次序?qū)τ诜蛛x劑I和2是相同的。(氨基酸的分離:比較實(shí)施例)
使用商購可得的ODS柱(商品名稱:L柱，Chemicals Evaluation and ResearchInstitute,日本)通過HPLC評估用ODS柱分離由色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和絲氨酸組成的氨基酸的能力。樣品溶液含有以8 ppm濃度的色氨酸和各自以800 ppm濃度的另外六個(gè)類型的氨基酸。20 mM磷酸鹽緩沖液(pH = 6.2)和こ腈的混合物(20 mM H3PO4 (pH = 6.2)緩沖液/CH3CN = 25/75 (體積比))用于流動(dòng)相。流動(dòng)相的流速是
1.0 mL/分鐘，并且柱溫是40°C，并且樣品溶液的注射量是5 y L，并且UV檢測器(200 nm)用于檢測器。用ODS柱的氨基酸分離的層析譜顯示于圖19中。ODS柱不能保留氨基酸。<具有生理活性的酸性化合物及其衍生物的分離>
使用柱I和2通過HPLC評估分離劑I和2分離煙酸甲酷、煙酸、6-羥基煙酸和5-羥基煙酸的能力。樣品溶液含有以100 ppm濃度的煙酸甲酯和以250 ppm濃度的具有生理活性的另外酸性化合物及其衍生物。10 mMこ酸銨和こ腈的混合物(10 mM AcONH4/CH3CN =10/90 (體積比))用于流動(dòng)相。流動(dòng)相的流速是1.0 mL/分鐘，并且柱溫是40°C，并且樣品溶液的注射量是5 UL，并且UV檢測器(220 nm)用于檢測器。用分離劑I的具有生理活性的酸性化合物及其衍生物的分離的層析譜顯示于圖13中，并且用分離劑2的具有生理活性的酸性化合物及其衍生物的分離的層析譜顯示于圖14中。洗脫次序?qū)τ诜蛛x劑I和2是相同的。(具有生理活性的酸性化合物及其衍生物的分離:比較實(shí)施例)
使用商購可得的ODS柱(商品名稱:L柱，Chemicals Evaluation and ResearchInstitute,日本)通過HPLC評估用ODS柱分離煙酸甲酷、煙酸、6-羥基煙酸和5-羥基煙酸的能力。樣品溶液含有以100 ppm濃度的煙酸甲酯和以250 ppm濃度的具有生理活性的另外酸性化合物及其衍生物。10 mMこ酸銨和こ腈的混合物(10 mM AcONH4/CH3CN = 10/90(體積比))用于流動(dòng)相。流動(dòng)相的流速是1.0 mL/分鐘，并且柱溫是25°C，并且樣品溶液的注射量是5 UL，并且UV檢測器(220 nm)用于檢測器。用ODS柱的氨基酸分離的層析譜顯示于圖20中。ODS柱不能保留具有生理活性的酸性化合物及其衍生物。<核酸堿基和核苷的混合物的分離>
使用柱2通過HPLC評估分離劑2分離總共九種化合物的能力，所述總共九種化合物包括由胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤和胞嘧啶組成的四個(gè)類型的核酸堿基和由胸苷、尿苷、腺苷、胞苷和鳥苷組成的五個(gè)類型的核苷。樣品溶液含有各自以100 ppm濃度的四個(gè)類型的核酸堿基和各自以120 ppm濃度的五個(gè)類型的核苷。10 mMこ酸銨水溶液和こ腈的混合物(液體A:10 mM AcONH4aq,液體 B =CH3CN,液體 B:0 分鐘至 20 分鐘(95% — 70%), 20.01 分鐘至 30分鐘(70%))用于流動(dòng)相。流動(dòng)相的流速是1.0 mL/分鐘，并且柱溫是25°C，并且樣品溶液的注射量是I UL，并且UV檢測器(254 nm)用于檢測器。用分離劑2的核酸堿基和核苷混合物分離的層析譜顯示于圖15中。< ニ肽和三肽的分離>
使用柱I和2通過HPLC評估分離劑I和2分離由H-Trp-Phe-OH, H-Ala-Leu-OH,H-Glu-Tyr-Glu-OH和H-Glu-Glu-OH組成的ニ肽和三肽的能力。樣品溶液含有以70 ppm濃度的H-Trp-Phe-OH和各自以290 ppm濃度的另外三種樣品。20 mM磷酸鹽緩沖液(pH =6.2)和こ腈的混合物(20 mM H3PO4 (pH = 6.2)緩沖液/CH3CN = 40/60 (體積比))用于流動(dòng)相。流動(dòng)相的流速是1.0 mL/分鐘，并且柱溫是40°C，并且樣品溶液的注射量是3 u L,并且UV檢測器(200 nm)用于檢測器。用分離劑I的ニ肽和三肽分離的層析譜顯示于圖21中，并且用分離劑2的ニ肽和三肽分離的層析譜顯示于圖22中。洗脫次序?qū)τ诜蛛x劑I和2是相同的。(ニ肽和三肽的分離:比較實(shí)施例)
使用商購可得的ODS柱(商品名稱:L柱，Chemicals Evaluation and ResearchInstitute,日本)通過 HPLC 評估用 ODS 柱分離由 H-Trp-Phe-OH、H-Ala-Leu-OH、H-Glu-Tyr-Glu-OH和H-Glu-Glu-OH組成的ニ肽和三肽的能力。樣品溶液含有以70 ppm濃度的H-Trp-Phe-OH和各自以290 ppm濃度的另外三種樣品。20 mM磷酸鹽緩沖液(pH =
6.2)和こ腈的混合物(20 mM H3PO4 (pH = 6.2)緩沖液/CH3CN = 90/10 (體積比))用于流動(dòng)相。流動(dòng)相的流速是1.0 mL/分鐘，并且柱溫是40°C，并且樣品溶液的注射量是3 y L，并且UV檢測器(200 nm)用于檢測器。用ODS柱的ニ肽和三肽分離的層析譜顯示于圖23中。ODS柱不適合分離ニ肽和三肽。如由圖1-15以及圖21和圖22明確的是，分離劑I和2都致使能夠充分分離糖、核酸化合物、氨基酸、水溶性維生素、酸性化合物及其衍生物和寡肽。此外，上文提及的分析靶的洗脫次序?qū)τ诜蛛x劑I和2是相同的。分離劑I證實(shí)比分離劑2更短的總洗脫時(shí)間，而分離劑2證實(shí)比分離劑I更大的在峰之間的距離。相應(yīng)地，分離劑I預(yù)期應(yīng)用于上文提及的分析靶的分析，而分離劑2預(yù)期應(yīng)用于上文提及的分析靶的分離。エ業(yè)實(shí)用件
在此類領(lǐng)域如食品、化妝品、藥物和農(nóng)用化學(xué)品中，存在在體內(nèi)證實(shí)有效作用的眾多親水或極性化合物，并且關(guān)于不由ODS柱保留的化合物的有效分離技術(shù)預(yù)期變得越來越復(fù)雜。相應(yīng)地，本發(fā)明預(yù)期促進(jìn)此類領(lǐng)域中的糖、核酸化合物、氨基酸、水溶性維生素、具有生理活性的酸性化合物及其衍生物和寡肽的改善生產(chǎn)率和更快速的分析，并且預(yù)期促成這些領(lǐng)域中的進(jìn)ー步進(jìn)展。符號(hào)的說明 I甘油
2木糖 3果糖 4葡萄糖 5蔗糖 6麥芽糖 7乳糖 8胸腺嘧啶 9尿嘧啶 10腺嘌呤 11胞嘧啶 12胸苷 13尿苷 14腺苷 15胞苷 16鳥苷 17煙酰胺 18維生素B6 19維生素BI 20維生素B12 21維生素C 22色氨酸 23亮氨酸 24脯氨酸 25丙氨酸 26谷氨酸 27天冬氨酸 28絲氨酸 29煙酸甲酯30煙酸
316-羥基煙酸
325-羥基煙酸
33H-Trp-Phe-OH
34H-Ala-Leu-OH
35H-Glu-Tyr-Glu-OH
36H-Glu-Glu-OH
權(quán)利要求
1.一種用于從兩個(gè)或更多個(gè)類型的水溶性生物物質(zhì)的混合物中分離水溶性生物物質(zhì)的方法，其使用由載體和通過化學(xué)鍵合與載體表面結(jié)合的多糖組成的分離劑通過層析進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述水溶性生物物質(zhì)是選自糖、核酸化合物、氨基酸、水溶性維生素、具有生理活性的酸性化合物及其衍生物、和寡肽的ー個(gè)或多個(gè)類型。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述多糖是纖維素或直鏈淀粉。
4.一種用于分離水溶性生物物質(zhì)的分離劑，其由載體和通過化學(xué)鍵合與所述載體表面結(jié)合的多糖組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的分離劑，其中所述水溶性生物物質(zhì)是選自糖、核酸化合物、氨基酸、水溶性維生素、具有生理活性的酸性化合物及其衍生物、和寡肽的ー個(gè)或多個(gè)類型。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的分離劑，其中所述多糖是纖維素或直鏈淀粉。
全文摘要
提供的是用于分離水溶性生物物質(zhì)的新方法。分離劑通過經(jīng)由化學(xué)鍵合使多糖例如纖維素或直鏈淀粉與載體表面結(jié)合而構(gòu)成，并且使用分離劑通過層析從兩個(gè)或更多個(gè)類型的水溶性生物物質(zhì)的混合物中分離水溶性生物物質(zhì)。
文檔編號(hào)G01N30/88GK103097887SQ201180043468
公開日2013年5月8日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月9日
發(fā)明者大西敦, 濱崎亮太 申請人:株式會(huì)社大賽璐