專利名稱：由 hmgb 蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑及篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑及由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑或促進(jìn)劑的篩選方法。
背景技術(shù)：
在免疫應(yīng)答及其控制中，識別自己和非己是其根本。固有免疫體系及獲得性免疫(適應(yīng)性免疫)體系在根據(jù)其各自特有的機(jī)制而承擔(dān)該識別的同時(shí)，確立并維持不會對自己進(jìn)行應(yīng)答的結(jié)構(gòu)、即所謂的免疫耐受。已知固有免疫應(yīng)答的激活與獲得性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)也有關(guān)系，因此可以認(rèn)為固有免疫應(yīng)答的抑制對獲得性免疫應(yīng)答的抑制也有效。已知在獲得性免疫體系中，在構(gòu)建表達(dá)隨機(jī)的抗原受體的淋巴細(xì)胞庫后，絕大多數(shù)的自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞被中樞性耐受機(jī)制排除，還殘留在末梢的自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞被外周性耐受機(jī)制抑制。利用獲得性免疫體系進(jìn)行的抗原識別以利用淋巴細(xì)胞的抗原受體識別特異性分子結(jié)構(gòu)為特征，但在固有免疫體系中，是對病原體等所持有的分子模式進(jìn)行識別，以Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)為代表，已知有很多的固有免疫激活受體。特別是，由核酸引起的固有免疫激活對于病毒等病原體的排除是很重要的，同時(shí)與各種免疫病癥的發(fā)病或惡化也有關(guān) ，因此備受關(guān)注。但是，固有免疫體系中的核酸的識別機(jī)制中還有很多不清楚的地方，作為承擔(dān)由核酸所激活的免疫應(yīng)答的分子群，鑒定了 Toll樣受體(Toll-likereceptor, TLR) 3、TLR7、TLR9、RIG-1 樣受體(RIG-1-like receptor), DAI, AIM2 等受體分子群，但其全貌仍不清楚(例如參照非專利文獻(xiàn)I 3)。已知HMGB (high-mobility group box,高遷移率族)蛋白中存在 HMGBl、HMGB2 及HMGB3。這些HMGB蛋白多存在于核內(nèi)，認(rèn)為其與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或轉(zhuǎn)錄的控制有關(guān)。另外，已知其還存在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞外。專利文獻(xiàn)I中記載了阻礙分泌至細(xì)胞外的HMGBl蛋白與細(xì)胞表面的糖化終末產(chǎn)物受體(RAGE )結(jié)合的合成雙鏈核酸或核酸類似物分子。專利文獻(xiàn)2中記載了阻礙分泌至細(xì)胞外的HMGBl蛋白與RAGE的相互作用的HMGBl拮抗劑。非專利文獻(xiàn)4中記載了無堿基硫代磷酸酯脫氧核糖均聚體對TLR9及TLR7具有很高的親和性，它們作為TLR的拮抗劑發(fā)揮作用。非專利文獻(xiàn)5中記載了具有5’ -TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’(序列號37)的堿基序列的硫代磷酸寡核苷酸對小鼠的投予誘導(dǎo)了 IFN (干擾素)-Y應(yīng)答，而具有5’ -TCCATGAGCTTCCTGATGCT-3’(序列號38)的堿基序列的硫代磷酸寡核苷酸不會引起這種應(yīng)答?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:日本特表2008-504335號公報(bào)
專利文獻(xiàn)2:日本特表2009-517404號公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1:Kawai T.et al, Nat.Rev.Tmmunol 7:131-137,2006.
非專利文獻(xiàn)2:Yoneyama et al, J.Biol.Chem 282:15315-15318，2007.
非專利文獻(xiàn)3:Burckstummer T.et al, Nat.Tmmunol.10:266-272, 2009.
非專利文獻(xiàn)4:Haas T.et al, Immunity, 28:315-323, 2008.
非專利文獻(xiàn)5 =Cowdery JS.et al, J.1mmunol.156:4570-4575,1996.

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑及由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑或促進(jìn)劑的篩選方法。用于解決技術(shù)問題的手段本發(fā)明提供一種由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑，其由選自硫代磷酸寡核苷酸及其衍生物中的I種以上的化合物構(gòu)成，且通過與HMGB蛋白結(jié)合來抑制由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活。本發(fā)明還提供一種由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制方法，其包含對生物體投予選自硫代磷酸寡核苷酸及其衍生物中的I種以上的化合物的工序。本發(fā)明還提供一種選自硫代磷酸寡核苷酸及其衍生物中的I種以上的化合物的用于作為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑的用途。本發(fā)明還提供一種選自硫代磷酸寡核苷酸及其衍生物中的I種以上的化合物在由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng) 答激活的抑制劑中的應(yīng)用。發(fā)明人等明確了對于由核酸介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活，HMGB蛋白是必需的。即，發(fā)明人等明確了由核酸介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活由HMGB蛋白介導(dǎo)。發(fā)明人等還明確了上述化合物通過與HMGB蛋白牢固地結(jié)合，強(qiáng)有力地抑制了由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活。因此，上述化合物可以作為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑來利用。上述抑制劑不限于抑制由核酸介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活，還抑制由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活。上述化合物優(yōu)選為不含非甲基化CG序列且長度為5 40個(gè)堿基的硫代磷酸寡核苷酸，更優(yōu)選為下述的硫代磷酸寡核苷酸:(I)由序列號40所記載的堿基序列構(gòu)成，或者
(2)由下述堿基序列構(gòu)成:其是在序列號40所記載的堿基序列中缺失、取代或添加有I個(gè)或多個(gè)喊基的喊基序列，且是具有針對HMGB蛋白的結(jié)合能力的喊基序列。這些硫代磷酸寡核苷酸可作為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑來利用。上述化合物還可以為硫代磷酸寡核苷酸的衍生物，該衍生物可以為無堿基硫代磷酸酯脫氧核糖均聚體(以下有時(shí)也稱作“PS”)。PS是具有從硫代磷酸寡核苷酸除去了堿基部分的結(jié)構(gòu)的化合物。如實(shí)施例所示，PS可作為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑來利用。本發(fā)明的抑制劑通過在細(xì)胞內(nèi)阻礙激活免疫應(yīng)答的核酸與HMGB蛋白的結(jié)合來強(qiáng)有力地抑制由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活。即，本發(fā)明的抑制劑基于發(fā)明人等此次首次明確的機(jī)制而抑制細(xì)胞內(nèi)的由HMGB蛋白所介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活。作為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活，可例示出抗原特異性的獲得性免疫體系、多發(fā)性硬化癥、由死細(xì)胞導(dǎo)致的過剩的免疫應(yīng)答、器官移植排斥反應(yīng)、自身免疫疾病、炎癥性腸病、過敏、敗血癥、由炎癥導(dǎo)致的腫瘤增殖、由含核酸的病原體所引起的炎癥性疾病等。通過投予本發(fā)明的抑制劑，可以在人類或動物的生物體內(nèi)預(yù)防或治療(改善)這些癥狀。本發(fā)明還提供一種由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活的抑制用組合物，其含有上述抑制劑及藥學(xué)上可容許的載體。本發(fā)明還提供一種由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑或促進(jìn)劑的篩選方法，其包含:混合步驟，其中，在待測物質(zhì)的存在下及非存在下將HMGB蛋白和標(biāo)記核酸進(jìn)行混合； 定量步驟,其中,對與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白進(jìn)行定量；以及判定步驟，其中，當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量少于在待測物質(zhì)的非存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)，判定該待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑，當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量多于在待測物質(zhì)的非存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)，判定該待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的促進(jìn)劑。本發(fā)明還提供一種由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑或促進(jìn)劑的篩選方法，其包含:放置(孵育)步驟，其中，在待測物質(zhì)的存在下及非存在下將經(jīng)固相化的HMGB蛋白進(jìn)行放置；標(biāo)記核酸接觸步驟，其中，使標(biāo)記核酸與放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白接觸；定量步驟，其中，對與經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸進(jìn)行定量；以及判定步驟，其中，當(dāng)與在待測物質(zhì)的存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸的量少于與在待測物質(zhì)的非存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸的量時(shí)，判定該待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑，當(dāng)與在待測物質(zhì)的存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸的量多于與在待測物質(zhì)的非存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸的量時(shí)，判定該待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的促進(jìn)劑。本發(fā)明還提供一種由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑或促進(jìn)劑的篩選方法，其包含:接觸步驟，其中，在待測物質(zhì)的存在下及非存在下使經(jīng)固相化的核酸與HMGB蛋白接觸；定量步驟，其中，對與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白進(jìn)行定量；以及判定步驟，其中，當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量少于在待測物質(zhì)的非存在下與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)，判定該待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑，當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量多于在待測物質(zhì)的非存在下與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)，判定該待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的促進(jìn)劑。根據(jù)上述本發(fā)明的篩選方法，使由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑或促進(jìn)劑的篩選成為可能。這些篩選方法基于發(fā)明人等此次首次明確的免疫應(yīng)答的激活由HMGB蛋白介導(dǎo)這一新機(jī)制。通過這些篩選方法，可以簡單且高效地進(jìn)行篩選。發(fā)明效果通過本發(fā)明，可以提供由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活、即由死細(xì)胞導(dǎo)致的過剩的免疫應(yīng)答、器官移植排斥反應(yīng)、 自身免疫疾病、炎癥性腸病、過敏、敗血癥、由炎癥導(dǎo)致的腫瘤增殖、由含核酸的病原體所引起的炎癥性疾病等的基于新原理的抑制劑。另外，可提供由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑或促進(jìn)劑的篩選方法。


圖1為表示實(shí)施例1的結(jié)果的曲線圖。圖2為表示實(shí)施例2的結(jié)果的曲線圖。圖3為表示實(shí)施例3的結(jié)果的曲線圖。圖4為表示實(shí)施例4的結(jié)果的曲線圖。圖5為表示實(shí)施例5的結(jié)果的照片。圖6為表示實(shí)施例6的結(jié)果的照片。圖7為表示實(shí)施例7的結(jié)果的曲線圖。圖8為表示實(shí)施例8的結(jié)果的曲線圖。圖9為表示實(shí)施例9的結(jié)果的曲線圖。圖10為表示實(shí)施例10的結(jié)果的曲線圖。圖11為表示實(shí)施例11的結(jié)果的曲線圖。圖12為表示實(shí)施例12的結(jié)果的照片。圖13為表示實(shí)施例13的結(jié)果的照片。圖14為表示實(shí)施例14的結(jié)果的照片。圖15為表示實(shí)施例15的結(jié)果的照片。圖16為表示實(shí)施例16的結(jié)果的曲線圖。圖17為表示實(shí)施例17的結(jié)果的曲線圖。圖18為表示實(shí)施例18的結(jié)果的曲線圖。圖19為表示實(shí)施例19的結(jié)果的曲線圖。圖20為表示實(shí)施例20的結(jié)果的曲線圖。圖21為表示實(shí)施例21的結(jié)果的照片。圖22為表示實(shí)施例22的結(jié)果的曲線圖。圖23為表示實(shí)施例23的結(jié)果的照片。圖24為表示實(shí)施例24的結(jié)果的曲線圖。圖25為表示實(shí)施例25的結(jié)果的曲線圖。圖26為表示實(shí)施例26的結(jié)果的曲線圖。圖27為表示實(shí)施例27的結(jié)果的曲線圖。圖28為表示實(shí)施例28的結(jié)果的照片。
圖29為表示實(shí)施例29的結(jié)果的曲線圖。圖30為表示實(shí)施例30的結(jié)果的曲線圖。圖31為表示實(shí)施例31的結(jié)果的曲線圖。圖32為表示實(shí)施例32的結(jié)果的曲線圖。圖33為表示實(shí)施例33的結(jié)果的曲線圖。圖34為表示實(shí)施例34的結(jié)果的曲線圖。圖35為表示實(shí)施例35的結(jié)果的曲線圖。圖36為表示實(shí)施例36的結(jié)果的曲線圖。圖37為表示實(shí)施例37的結(jié)果的曲線圖。
·
圖38為表示實(shí)施例38的結(jié)果的曲線圖。圖39為表示實(shí)施例39的結(jié)果的曲線圖。圖40為表示實(shí)施例40的結(jié)果的曲線圖。圖41為表示實(shí)施例41的結(jié)果的照片。圖42為表示實(shí)施例42的結(jié)果的照片。圖43為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活的概略圖。圖44為表示由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑的篩選方法的一個(gè)方式的圖。圖45為表示實(shí)施例43的結(jié)果的照片(a)及曲線圖(b)。圖46 為表示 CpG-B CS), CpG-Rev CS), CpG-M (S)及 PS 的結(jié)構(gòu)的圖。圖47為表示實(shí)施例44的結(jié)果的照片。圖48為表示實(shí)施例45的結(jié)果的曲線圖。圖49為表示實(shí)施例46的結(jié)果的曲線圖。圖50為表示實(shí)施例47的結(jié)果的曲線圖。圖51為表示實(shí)施例48的結(jié)果的曲線圖。圖52為表示實(shí)施例49的結(jié)果的曲線圖。圖53為表示實(shí)施例50的結(jié)果的曲線圖。圖54為表示實(shí)施例51的結(jié)果的曲線圖。圖55為表示實(shí)施例52的結(jié)果的照片。圖56為表示實(shí)施例53的結(jié)果的照片。圖57為表示實(shí)施例54的結(jié)果的曲線圖。圖58為表示實(shí)施例55的結(jié)果的曲線圖。圖59為表示實(shí)施例56的結(jié)果的曲線圖。圖60為表示實(shí)施例57的結(jié)果的曲線圖。圖61為表示實(shí)施例58的結(jié)果的曲線圖。圖62為表示實(shí)施例59的結(jié)果的曲線圖。
具體實(shí)施例方式提供一種基于發(fā)明人等新闡明的機(jī)制的由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制齊U。該抑制劑由選自硫代磷酸寡核苷酸及其衍生物中的I種以上的化合物構(gòu)成。
硫代磷酸寡核苷酸是指寡脫氧核糖核苷酸中的磷酸二酯鍵轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼姿狨ユI的寡核苷酸衍生物。抑制劑優(yōu)選由不含非甲基化CG序列且長度為5 100個(gè)堿基的硫代磷酸寡核苷酸構(gòu)成。硫代磷酸寡核苷酸的長度更優(yōu)選為10 40個(gè)堿基，進(jìn)一步優(yōu)選為15 30個(gè)堿基，特別優(yōu)選為15 20個(gè)堿基。這種硫代磷酸寡核苷酸通過與HMGB蛋白結(jié)合而遮掩HMGB蛋白，從而可以抑制由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活。非甲基化胞嘧啶鳥嘌呤(CG)序列是指5’ -CG-3’的堿基序列，是未被甲基化的序列。不含非甲基化CG序列的5 100個(gè)堿基的寡核苷酸不會激活由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。而超過100個(gè)堿基的長度的寡核苷酸有時(shí)會激活免疫應(yīng)答。上述硫代磷酸寡核苷酸更優(yōu)選為下述的硫代磷酸寡核苷酸:由序列號40所記載的堿基序列所構(gòu)成，或者由下述堿基序列所構(gòu)成:其是在序列號40所記載的堿基序列中缺失、取代或添加有I個(gè)或多個(gè)堿基的堿基序列，且是具有針對HMGB蛋白的結(jié)合能力的堿基序列。序列號40的堿基序列為5’-TCCATGAGSTTCCTGATGCT-3’，這里，S表示G或C。另外，由S為C時(shí)的堿基序列構(gòu)成的硫代磷酸寡核苷酸對應(yīng)于后述的CpG-Rev (S)(序列號38)、由S為G時(shí)的堿基序列構(gòu)成的硫代磷酸寡核苷酸對應(yīng)于后述的CpG-M(S)(序列號39)。另夕卜，I個(gè)或多個(gè)是指I 10個(gè)，更優(yōu)選為I 5個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選為I 3個(gè)，特別優(yōu)選為I或2個(gè)。硫代磷酸寡核苷酸更優(yōu)選由序列號40所記載的堿基序列所構(gòu)成。由這種堿基序列構(gòu)成的硫代磷酸寡核苷酸可以強(qiáng)有力地抑制由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活。作為硫代磷酸寡核苷酸的衍生物，只要是具有針對HMGB蛋白的結(jié)合能力的物質(zhì)則無特別限定，可以例示出將硫代磷酸寡核苷酸的骨架的至少一部分轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿岫ユI的物質(zhì)、將至少一部分的脫氧核糖轉(zhuǎn)變?yōu)楹颂堑奈镔|(zhì)、將至少一部分的堿基除去的物質(zhì)、將至少一部分轉(zhuǎn)變?yōu)镻NA (peptide nucleic acid,肽核酸)的物質(zhì)、將至少一部分轉(zhuǎn)變?yōu)長NA(Locked nucleic acid,鎖核酸)的物質(zhì)、將至少一部分的堿基轉(zhuǎn)變?yōu)閴A基類似物的物質(zhì)等。這些衍生物中，優(yōu)選無堿基硫代磷 酸酯脫氧核糖均聚體(PS)。PS是指化學(xué)式(C5H8O4PS)n所示的化合物，具有從硫代磷酸寡核苷酸除去全部堿基部分的結(jié)構(gòu)。η優(yōu)選為10 100，更優(yōu)選為15 25。上述硫代磷酸寡核苷酸、PS或它們的衍生物可以是使用核酸合成裝置等合成的物質(zhì)，也可以是從北海道System Science或Fasmac等生產(chǎn)廠家購入的物質(zhì)。如實(shí)施例所示，PS通過在體外以0.1 50 μ Μ、更優(yōu)選I 10 μ Μ、特別優(yōu)選5 μ M的濃度進(jìn)行投予，可以抑制由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活。該結(jié)果也可直接適用于體內(nèi)。CpG-B ODN如實(shí)施例所示，在使用了缺失TLR9 (Toll樣受體9)的細(xì)胞或TLR9的表達(dá)量少的MEF等細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)中，通過以0.1 10 μ M、更優(yōu)選0.3 3μΜ、特別優(yōu)選I μ M的濃度進(jìn)行投予，可以抑制由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活。該結(jié)果也可直接適用于體內(nèi)。在臨床上使用由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑時(shí)，還可以是在抑制劑中適當(dāng)混合了賦形劑、穩(wěn)定化劑、保存劑、緩沖劑、溶解輔助劑、乳化劑、稀釋劑、張度劑等添加劑的組合物的形態(tài)。由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活的抑制用組合物除了作為必需成分的上述抑制劑之外，還包含藥學(xué)上可容許的載體。作為藥學(xué)上可容許的載體，可舉出在藥品等中通常使用的各種成分，即水、低級醇、多元醇、油劑、表面活性劑、保濕劑、水溶性高分子化合物、增粘劑、覆膜劑、粉體、螯合劑、PH調(diào)節(jié)劑、動植物/微生物來源的抽提物、糖類、氨基酸類、有機(jī)胺類、合成樹脂乳液、皮膚營養(yǎng)劑、維生素類、抗氧化劑、抗氧化輔助劑、香料、各種藥效劑等，可以在不損害上述抑制劑的效果的范圍內(nèi)適當(dāng)添加。作為投予方式，可舉出利用片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑等的經(jīng)□劑，利用注射劑、栓劑、液劑等的非經(jīng)口劑，或者利用軟膏劑、霜?jiǎng)①N敷劑等的局部投予等。抑制劑的使用量根據(jù)癥狀、年齡、體重、投予方法等來適當(dāng)選擇。在一個(gè)實(shí)施方式中，上述抑制劑所抑制的由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活是由核酸介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活。激活免疫應(yīng)答的核酸是指雙鏈RNAMouble-stranded RNA、dsRNA)、單鏈 RNA (single-stranded RNA、ssRNA)、5’三憐酸化 RNA、microRNA、病毒 RNA、病毒DNA、微生物DNA (微生物來源的DNA)、真核生物DNA、B-DNA (具有通常的DNA立體結(jié)構(gòu)的合成DNA、B型DNA)、ISD (IFN-stimulatory DNA、干擾素活化DNA)、非甲基化寡核苷酸等。ISD是指45個(gè)堿基的合成DNA (序列號36)，當(dāng)將ISD導(dǎo)入至細(xì)胞內(nèi)時(shí)，引起I型IFN誘導(dǎo)，但這是TLR非依賴性地、介由IRF-3的激活所進(jìn)行的。本說明書中，有時(shí)將這些激活免疫應(yīng)答的核酸統(tǒng)稱為“全部的免疫原性核酸”。另外，本說明書中，用語“免疫應(yīng)答”包含“固有免疫應(yīng)答”及“獲得性免疫應(yīng)答”這兩者。在一個(gè)實(shí)施方式中，上述抑制劑所抑制的由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活并非是由核酸介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活，而是基于HMGB蛋白的作為細(xì)胞因子的功能的免疫應(yīng)答的激活。通過上述抑制 劑與HMGB蛋白結(jié)合，可以抑制基于HMGB蛋白的作為細(xì)胞因子的功能的免疫應(yīng)答的激活。作為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活，可例示出抗原特異性的獲得性免疫體系、多發(fā)性硬化癥、由死細(xì)胞導(dǎo)致的過剩的免疫應(yīng)答、器官移植排斥反應(yīng)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫疾病、炎癥性腸病、過敏、敗血癥、由炎癥導(dǎo)致的腫瘤增殖、由含核酸的病原體所引起的炎癥性疾病等。這些免疫應(yīng)答是帶來不利的例子。這里，過剩的免疫應(yīng)答是指如肝臟的壞死性炎癥那樣因病毒感染、循環(huán)異?；虼x異常、單純炎癥反應(yīng)等外部要因而壞死的細(xì)胞誘發(fā)炎癥、進(jìn)而該炎癥引起新的細(xì)胞壞死的負(fù)面連鎖反應(yīng)。另外，死細(xì)胞優(yōu)選為壞死細(xì)胞。另外，含核酸的病原體是指病毒、微生物、寄生蟲等。已知當(dāng)使用Lipofectamine (商品名，Invitrogen 公司)或 DOTAP (商品名，Roche公司)等陽離子性脂質(zhì)將激活上述免疫應(yīng)答的核酸投予至包括人細(xì)胞的動物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)時(shí)，會誘發(fā)IFN-β、IFN_a l、IFN_a4等I型IFN (干擾素)或趨化因子、炎癥性細(xì)胞因子的基因表達(dá)，從而引起免疫應(yīng)答。作為非甲基化寡核苷酸，有時(shí)使用CpG寡脫氧核糖核苷酸(以下有時(shí)稱作CpG0DN)，作為dsRNA，有時(shí)使用poly (1:C)，作為ssRNA，有時(shí)使用poly (U)，作為B-DNA，有時(shí)使用 poly (dA:dT) / (dT:dA)等。CpG ODN是指在細(xì)菌DNA中出現(xiàn)頻率高的包含非甲基化CG序列(5’ _CG_3’ )的合成寡核苷酸。CpG ODN中存在具有多聚G尾的CpG-A ODN (也稱作D型)或強(qiáng)有力地激活B細(xì)胞、誘導(dǎo)Thl型細(xì)胞因子的產(chǎn)生的CpG-B ODN (也稱作K型)等。作為CpG-B 0DN，例如可使用具有5’ -TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’(序列號I)等序列者。另外,作為CpG-A 0DN，例如可使用具有5’-GGTGCATCGATGCAGGGGGG-3’(序列號2)等序列者。這些CpG ODN還可以具有將磷酸二酯鍵部分地轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼姿狨ユI等的結(jié)構(gòu)。CpG ODN優(yōu)選為10聚體 30聚體，poly(1:C)優(yōu)選為10聚體 10000聚體，poly(U)優(yōu)選為10聚體 10000聚體，poly (dA:dT)/ (dT:dA)優(yōu)選為10聚體 10000聚體。本發(fā)明提供一種由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑或促進(jìn)劑的篩選方法。該篩選方法的第I實(shí)施方式包含:混合步驟，其中，在待測物質(zhì)的存在下及非存在下將HMGB蛋白和標(biāo)記核酸進(jìn)行混合；定量步驟，其中，對與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白進(jìn)行定量；以及判定步驟，其中，對在待測物質(zhì)的存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量與在待測物質(zhì)的非存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量進(jìn)行比較，當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量少于在待測物質(zhì)的非存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)，判定待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑，當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量多于在待測物質(zhì)的非存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)，判定待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的促進(jìn)劑。在混合步驟中，作為HMGB蛋白，HMGBl、2或3的重組體均可優(yōu)選使用。發(fā)明人等首次發(fā)現(xiàn)了 HMGB蛋白會與全部的免疫原性核酸結(jié)合。作為標(biāo)記核酸并無特別限定，可例示出CpG ODN、poly (1:C)、poly (U)、B-DNA,5’三磷酸化RNA、microRNA等合成核酸，HSV-1或牛痘病毒DNA等病毒DNA、微生物DNA、牛胸腺DNA等。但是，合成核酸由于其更為均質(zhì)而更為優(yōu)選。上述合成核酸優(yōu)選為10聚體 100聚體，更優(yōu)選為15聚體 25聚體。標(biāo)記并無特別限定，可利用生物素、FITC等熒光色素、洋地黃毒苷(digoxigenin)、放射性同位元素等進(jìn)行。作為待測物質(zhì)，當(dāng)利用待測物質(zhì)單體刺激包含人細(xì)胞的動物細(xì)胞時(shí),只要是不會激活免疫應(yīng)答則無特別限定，可以使用核酸、核酸類似物、蛋白質(zhì)、低分子化合物等。利用待測物質(zhì)刺激動物細(xì)胞 時(shí)是否激活了免疫應(yīng)答可通過對在待測物質(zhì)的刺激下IFN-β、IFN-α 1、IFN- α 4等I型IFN (干擾素)或趨化因子、炎癥性細(xì)胞因子等的表達(dá)是否增加進(jìn)行測定來研究。當(dāng)這些基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)增加時(shí)，可判斷免疫應(yīng)答發(fā)生了激活。在混合步驟中，待測物質(zhì)的濃度優(yōu)選為0.1 100 μ M0另外，HMGB蛋白的濃度優(yōu)選為I 200μ g/ml。另外，標(biāo)記核酸的濃度優(yōu)選為0.1 100 μ M。優(yōu)選在含有適當(dāng)?shù)牡鞍酌缸璧K劑的緩沖液等溶媒中將它們混合并使其反應(yīng)0.5 24小時(shí)。定量步驟可通過使用了鏈霉親和素結(jié)合磁性珠?；蚩笷ITC抗體結(jié)合磁性珠粒等的拉下分析來進(jìn)行，也可通過電泳遷移率變動分析(Electrophoretic Mobility ShiftAssay, EMSA)等來進(jìn)行。例如，當(dāng)標(biāo)記核酸使用生物素標(biāo)記核酸來進(jìn)行使用了鏈霉親和素結(jié)合磁性珠粒的拉下分析時(shí)，在通過混合步驟獲得的樣品中添加鏈霉親和素結(jié)合磁性珠粒，使樣品中的生物素標(biāo)記核酸結(jié)合在鏈霉親和素結(jié)合磁性珠粒上。接著，利用磁性珠粒的磁力，將與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白回收。將所回收的樣品供至例如SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，將凝膠上的HMBG蛋白轉(zhuǎn)印至例如PVDF膜上，使用抗HMGB抗體進(jìn)行染色后，可以通過光密度測定解析等進(jìn)行定量。在判定步驟中，將在待測物質(zhì)的存在下及非存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量進(jìn)行比較，當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量少于在待測物質(zhì)的非存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)，判定待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑。另外，當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量多于在待測物質(zhì)的非存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)，判定待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的促進(jìn)劑。在第I實(shí)施方式的篩選方法中，可進(jìn)行以下變形。作為標(biāo)記核酸，使用選自硫代磷酸寡核苷酸及其衍生物中的化合物、例如由序列號40所記載的堿基序列構(gòu)成的硫代磷酸寡核苷酸。這里，將上述的標(biāo)記核酸和HMGB蛋白分別預(yù)先用具有相互間引起FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer,突光共振能量轉(zhuǎn)移)的關(guān)系的突光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。作為具有這種關(guān)系的熒光物質(zhì)對，例如可舉出N，N，N’，N”-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)和5-羧基熒光素(FAM)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)和FAM、BHQ-1和2’，7’ - 二甲氧基-4’，5’ - 二氯-6-羧基熒光素(JOE)等。由此，當(dāng)上述化合物與HMGB蛋白發(fā)生結(jié)合時(shí)則引起FRET，對激發(fā)波長所產(chǎn)生的熒光波長發(fā)生變化。因此，通過觀察試樣的熒光，可以容易地檢測出上述化合物與HMGB蛋白是否發(fā)生了結(jié)合。在混合步驟中，在待測物質(zhì)的存在下及非存在下將經(jīng)標(biāo)記的標(biāo)記核酸與經(jīng)標(biāo)記的HMGB蛋白進(jìn)行混合。然后，在定量步驟中，通過利用熒光觀察測定是否發(fā)生了 FRET，定量地評價(jià)標(biāo)記核酸與HMGB蛋白的結(jié)合程度，從而對與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白進(jìn)行定量。接著，在判定步驟中，將在待測物質(zhì)的存在下及非存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量進(jìn)行比較，當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量少于在待測物質(zhì)的非存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)，判定待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑。另外，當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量多于在待測物質(zhì)的非存在下與標(biāo)記核Ife結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)，判定待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的促進(jìn)劑。

通過這種變形，可以更為簡單、高效地進(jìn)行由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑或促進(jìn)劑的篩選。由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑或促進(jìn)劑的篩選方法的第2實(shí)施方式包含:放置(孵育)步驟，其中，在待測物質(zhì)的存在下及非存在下將經(jīng)固相化的HMGB蛋白進(jìn)行放置；標(biāo)記核酸接觸步驟，其中，使標(biāo)記核酸與放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白接觸；定量步驟，其中，對與經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸進(jìn)行定量；以及判定步驟，其中，當(dāng)與在待測物質(zhì)的存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸的量少于與在待測物質(zhì)的非存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸的量時(shí)，判定待測物質(zhì)是由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑，當(dāng)與在待測物質(zhì)的存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸的量多于與在待測物質(zhì)的非存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸的量時(shí)，判定待測物質(zhì)是由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的促進(jìn)劑。通過該篩選方法，可以更為簡單、高效地進(jìn)行由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑或促進(jìn)劑的篩選。在放置步驟中，在待測物質(zhì)的存在下及非存在下將經(jīng)固相化的HMGB蛋白進(jìn)行放置。作為HMGB蛋白，HMGB1、2或3的重組體均可優(yōu)選使用。HMGB蛋白預(yù)先固相化在固相載體上后使用。作為固相載體并無特別限定，例如可以利用由玻璃、陶瓷、金屬氧化物等無機(jī)物質(zhì)、天然高分子、合成高分子等構(gòu)成的微孔板、微芯片、珠粒、薄膜、薄片等形態(tài)的載體。固相載體的表面可用氨基(-NH2)、羧基(-C00H)等官能團(tuán)修飾。例如，作為固相載體使用96孔微孔板時(shí)，將以I 100 μ g/ml的濃度溶解于磷酸緩沖生理鹽水(PBS)等緩沖液中的HMGB蛋白的溶液注入到微孔板的各孔中，在4 37°C下放置0.5 24小時(shí)，從而可以將HMGB蛋白固相化。優(yōu)選該微孔板在使用前用PBS等緩沖液進(jìn)行洗滌以將未結(jié)合的HMGB蛋白除去。另外，為了抑制非特異性吸附，優(yōu)選添加含2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS (2%BSA-PBS)等緩沖液進(jìn)行封閉。作為待測物質(zhì)，只要·是當(dāng)利用待測物質(zhì)單體刺激包括人細(xì)胞的動物細(xì)胞時(shí)不會激活免疫應(yīng)答的物質(zhì)則無特別限定，可以使用核酸、核酸類似物、蛋白質(zhì)、低分子化合物等。作為待測物質(zhì)的溶媒，可以使用PBS等緩沖液。在待測物質(zhì)的非存在下進(jìn)行放置步驟時(shí)，僅使用不含待測物質(zhì)的緩沖液即可。放置步驟中的待測物質(zhì)的濃度優(yōu)選為0.1 100 μ M。另夕卜，在放置步驟中，還可設(shè)置在對照物質(zhì)的存在下進(jìn)行放置步驟的試驗(yàn)組。作為對照物質(zhì)，可以使用已知與HMGB蛋白結(jié)合了的核酸或已知未與HMGB蛋白結(jié)合的化合物等，例如作為已知與HMGB蛋白結(jié)合了的物質(zhì)，可以使用B-DNA。放置步驟優(yōu)選在4 37°C下進(jìn)行0.5 24小時(shí)。優(yōu)選在放置步驟后用PBS等緩沖液進(jìn)行洗滌以將未反應(yīng)的待測物質(zhì)或?qū)φ瘴镔|(zhì)除去。在標(biāo)記核酸接觸步驟中，使標(biāo)記核酸與放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白接觸。作為標(biāo)記核酸并無特別限定，可例示出CpG ODN、poly (1:C)、poly (U)、B_DNA、5，三磷酸化RNA、microRNA等合成核酸、HSV-1或牛痘病毒DNA等的病毒DNA、微生物DNA、牛胸腺DNA等。但是，合成核酸由于其更為均質(zhì)而更為優(yōu)選。上述合成核酸優(yōu)選為10聚體 100聚體，更優(yōu)選為15聚體 25聚體。當(dāng)HMGB蛋白為HMGBl時(shí)，標(biāo)記核酸可以為RNA。標(biāo)記并無特別限定，可利用生物素、FITC等熒光色素、洋地黃毒苷(digoxigenin)、放射性同位元素等進(jìn)行。優(yōu)選在標(biāo)記核酸接觸步驟后用PBS等緩沖液進(jìn)行洗滌以將未反應(yīng)的標(biāo)記核酸除去。這里，在放置步驟中添加的待測物質(zhì)有時(shí)會阻礙標(biāo)記核酸與HMGB蛋白的結(jié)合，進(jìn)行這種阻礙的待測物質(zhì)即為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑。在定量步驟中，對結(jié)合在經(jīng)固相化的HMGB蛋白的標(biāo)記核酸進(jìn)行定量。標(biāo)記核酸的定量方法并無特別限定。例如，在用生物素對標(biāo)記核酸進(jìn)行了標(biāo)記時(shí)，使利用辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)等標(biāo)記了的抗生物素抗體發(fā)生反應(yīng)，將未反應(yīng)的抗體洗滌后，使與結(jié)合于抗體的HRP或AP等酶相對應(yīng)的底物發(fā)生反應(yīng)，獲得發(fā)光或發(fā)色。使用酶標(biāo)儀等對所得的發(fā)光或發(fā)色進(jìn)行定量?；蛘?，在用生物素對標(biāo)記核酸進(jìn)行了標(biāo)記時(shí)，還可代替抗生物素抗體而使用用HRP或AP進(jìn)行了標(biāo)記的鏈霉親和素。例如，當(dāng)用FITC對標(biāo)記核酸進(jìn)行了標(biāo)記時(shí)，可以使抗FITC抗體反應(yīng)后對標(biāo)記核酸進(jìn)行定量，還可以對標(biāo)記核酸的FITC照射激發(fā)光并使用熒光酶標(biāo)儀等對所產(chǎn)生的熒光進(jìn)
行定量。例如，當(dāng)用放射性同位元素對標(biāo)記核酸進(jìn)行了標(biāo)記時(shí)，可以使用微孔板閃爍計(jì)數(shù)器等對標(biāo)記核酸進(jìn)行定量。在判定步驟中，將與在待測物質(zhì)的存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸的量和與在待測物質(zhì)的非存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸的量進(jìn)行比較，當(dāng)與在待測物質(zhì)的存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸的量少于與在待測物質(zhì)的非存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸的量時(shí)，判定待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑。另外，當(dāng)與在待測物質(zhì)的存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸的量多于與在待測物質(zhì)的非存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸的量時(shí)，判定待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的促進(jìn)劑。圖44示出由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑或促進(jìn)劑的篩選方法的一個(gè)方式。在放置步驟(圖44a)中，在待測物質(zhì)3的存在下及非存在下以及陽性對照物質(zhì)2的存在下，將經(jīng)固相化的HMGB蛋白I進(jìn)行放置。接著，在標(biāo)記核酸接觸步驟(圖44b)中，使生物素標(biāo)記B-DNA4接觸。接著，在定量步驟(圖44c及圖44d)中，對與經(jīng)固相化的HMGB蛋白I結(jié)合的生物素標(biāo)記B-DNA4進(jìn)行定量。圖44c中，使酶標(biāo)記的抗生物素抗體5反應(yīng)。接著，添加酶的底物6 (圖44d)并使用酶標(biāo)儀等對發(fā)光或發(fā)色進(jìn)行定量。在待測物質(zhì)3的非存在下(陰性對照)進(jìn)行了放置步驟的樣品中，標(biāo)記核酸與經(jīng)固相化的HMGB蛋白I結(jié)合。而在陽性對照物質(zhì)2的存在下進(jìn)行了放置步驟的樣品中，標(biāo)記核酸對經(jīng)固相化的HMGB蛋白I的結(jié)合被阻礙。在圖44的待測物質(zhì)3的情況下，在待測物質(zhì)3的存在下進(jìn)行了放置步驟的樣品中，生物素標(biāo)記B-DNA4 (標(biāo)記核酸)對經(jīng)固相化的HMGB蛋白I的結(jié)合被阻礙。于是，由于與結(jié)合于在待測物質(zhì)3的存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白I上的生物素標(biāo)記B-DNA4的量相比，結(jié)合于在待測物質(zhì)3的非存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白I上的生物素標(biāo)記B-DNA4的量少，因此判定待測物質(zhì)3為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑。`由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑或促進(jìn)劑的篩選方法的第3實(shí)施方式包含:接觸步驟，其中，在待測物質(zhì)的存在下及非存在下使經(jīng)固相化的核酸與HMGB蛋白接觸；定量步驟，其中，對與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白進(jìn)行定量；以及判定步驟，當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量少于在待測物質(zhì)的非存在下與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)，判定待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑，當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量多于在待測物質(zhì)的非存在下與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)，判定待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的促進(jìn)劑。通過該篩選方法，可以更為簡單、高效地進(jìn)行由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑或促進(jìn)劑的篩選。在接觸步驟中，在待測物質(zhì)的存在下及非存在下使經(jīng)固相化的核酸與HMGB蛋白接觸。作為核酸，例如可以使用由序列號40所記載的堿基序列構(gòu)成的硫代磷酸寡核苷酸。核酸的固相化方法并無特別限定，例如可通過使進(jìn)行了生物素標(biāo)記的上述核酸與被覆有鏈霉親和素的多孔板結(jié)合等來進(jìn)行。作為HMGB蛋白，HMGB1、2或3的重組體均可優(yōu)選使用。作為待測物質(zhì)，只要是利用待測物質(zhì)單體刺激包括人細(xì)胞的動物細(xì)胞時(shí)不會激活免疫應(yīng)答的物質(zhì)則無特別限定，可以使用核酸、核酸類似物、蛋白質(zhì)、低分子化合物等。作為待測物質(zhì)的溶媒，可以使用PBS等緩沖液。接觸步驟中的待測物質(zhì)的濃度優(yōu)選為0.1 100 μ M0接觸步驟優(yōu)選在4 37°C下進(jìn)行0.5 24小時(shí)。優(yōu)選在接觸步驟后用PBS等緩沖液進(jìn)行洗滌以將未反應(yīng)的待測物質(zhì)或?qū)φ瘴镔|(zhì)除去。接觸步驟中添加的待測物質(zhì)有時(shí)會阻礙核酸與HMGB蛋白的結(jié)合，進(jìn)行這種阻礙的待測物質(zhì)即為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑。在定量步驟中，對與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白進(jìn)行定量。標(biāo)記核酸的定量方法并無特別限定。例如可以預(yù)先用熒光物質(zhì)標(biāo)記HMGB蛋白后對該熒光進(jìn)行定量?；蛘哌€可使用針對HMGB蛋白的抗體對HMGB蛋白進(jìn)行定量。在判定步驟中，將在待測物質(zhì)的存在下與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量和在待測物質(zhì)的非存在下與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量進(jìn)行比較，當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量少于在待測物質(zhì)的非存在下與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)，判定待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑。另外，當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量多于在待測物質(zhì)的非存在下與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)，判定待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的促進(jìn)劑。通過上述篩選方法獲得的由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活的促進(jìn)劑可以以激活由病毒、微生物、寄生蟲等導(dǎo)致的感染癥的防御機(jī)制、增大抗病毒活性、控制免疫細(xì)胞的分化平衡以改善過敏病癥、激活抗腫瘤應(yīng)答等的目的來進(jìn)行使用。這些免疫應(yīng)答是帶來有利效果的例子。實(shí)施例 (拉下分析)在質(zhì)量分析前，用poly (dA:dT) / (dT:dA) (B-DNA，10 μ g/ml)刺激小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast、MEFs) 4小時(shí)。在刺激后，使用Dounce型勻漿機(jī)(Wheaton science 公司)在勻漿緩沖液(20mM HEPES ρΗ7.4、20% 甘油、50mM KCl、2mMMgCl2UmM PMSFUO μ g/ml抑酶肽、10 μ g/ml亮抑酶肽)中將細(xì)胞勻漿。細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提物是通過將勻漿后的樣品在14500rpm下離心30分鐘而制備的。將細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提物與對5’末端進(jìn)行了生物素標(biāo)記的B-DNA1.4μ g/ml —起孵育后，添加鏈霉親和素結(jié)合磁性珠粒(Invitrogen公司)并在4°C下孵育15分鐘。在反應(yīng)緩沖液(20mM Tris-Cl pH8.4、20mMMgCl2、50mM KCl)中使拉下的樣品與DNase I (Invitrogen公司)反應(yīng),將上清供至銀染色(Invitrogen公司)或質(zhì)量分析。體外拉下分析如下進(jìn)行。首先在競爭物質(zhì)的存在下或非存在下、在室溫下將HMGBl、2或3的重組體處理30分鐘。將上清與生物素標(biāo)記B-DNA在4°C下混合30分鐘后，添加鏈霉親和素結(jié)合磁性珠粒(Invitrogen公司),在結(jié)合緩沖液(50mM Tris-Cl pH7.5、150mM NaClUmM EDTA、1%NP_40、100 μ g/ml 亮抑酶肽、ImM PMSFUmM Na3VO4)中進(jìn)行孵育。接著，用結(jié)合緩沖液充分地洗滌混合物，利用SDS-PAGE分離后，使用抗HMGB1、2或3抗體進(jìn)行免疫印跡。(小鼠、細(xì)胞、試劑)除了帶有Balb/c遺傳背景的Τ1Γ9+小鼠以外，使用帶有C57BL/6遺傳背景的小鼠。Tlrf' Hmgbl+、Hmgb2_/_ 小鼠的制作通過常規(guī)方法進(jìn)行。MEFs、RAW264.7、NIH3T3、HEK293T 細(xì)胞、Tlr9+小鼠的骨髓來源 cDCs (conventional dendritic cells,常規(guī)樹突狀細(xì)胞)及pDCs (plasmacytoid dendritic cell precursors,衆(zhòng)細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞前體)的維持通過常規(guī)方法進(jìn)行。Hmgbl+巨噬細(xì)胞、cDCs及pDCs如下制備:將胎兒肝臟造血前體細(xì)胞(利用Miltenyi公司的MACS Lineage depletion kit對無分化標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)行了純化的產(chǎn)物)在SCF (20ng/ml)、IL-3 (10ng/ml)及IL-6 (10ng/ml)的存在下培養(yǎng)2天后，在 20ng/ml M-CSF (巨噬細(xì)胞)、20ng/ml GM-CSF (cDCs)、100ng/ml 人 Flt3L (pDCs)的存在下培養(yǎng)6天，從而制備。SCF、IL-3及IL-6由P印roTech公司購入。IFN-Y及TNF-α由R&D SYSTEMS購入。IFN-β也由Toray株式會社熱心地提供。B-DNA及牛胸腺DNA由Sigma公司購入。生物素標(biāo)記poly (dA:dT) / (dT:dA)由北海道System Science公司購入。ISD (IFN-stimulatory DNA)、CpG ODN、FITC標(biāo)記無堿基硫代磷酸酯脫氧核糖均聚體(PS，20聚體)及FITC標(biāo)記無堿基天然脫氧核糖均聚體(PD，20聚體)由Fasmac公司購入。H)是指將PS的硫代磷酸酯鍵轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿岫ユI的物質(zhì)。純化牛痘病毒DNA(M0株)由A.Kato及M.Kidokoro提供。HSV DNA也由Y.Kawaguchi熱心地提供。5’ -三憐酸RNA由C.Reis e Sousa 及 J.Rehwinkel 提供。大腸桿菌 DNA (微生物 DNA)及 R837 由 Invitrogen公司購入。poly (U)及脂多糖(LPS)由Sigma公司購入。poly (I:C)由GE HEALTHCAREBIOSCIENCE公司購入。B-DNA、poly(1:C)及其他的核酸配體只要無特別記載，則以IOyg/ml的濃度進(jìn)行使用。CpG-A ODN和DOTAP (Roche公司)的復(fù)合體形成通過常規(guī)方法進(jìn)行。MitoTracker Deep Red633 由 Invitrogen 公司購入。抗HMGBl 抗體及抗HMGB2 抗體由 Abcam公司購入。抗HMGB3抗體由Transgenic公司購入?？笽RF3抗體(ZM3)由Zymed公司購入?？功?-肌動蛋白抗體(AC-15)由Sigma公司購入。抗NF-κ B ρ65抗體(C20)由Santa CruzBiotechnology公司購入?？沽姿峄疭TATl抗體(58D6)由Cell Signaling公司購入。(質(zhì)粒構(gòu)建)
小鼠HMGB cDNA以MEFs來源的總RNA為基礎(chǔ)，克隆至通過RT-PCR獲得的pGEX4T3載體(GE HEALTHCARE BIOSCIENCE公司)的Sal I及Not I位點(diǎn)。帶有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽的HMGB蛋白使用谷胱甘肽瓊脂糖珠粒(GE HEALTHCARE BIOSCIENCE公司)進(jìn)行純化。HMGB蛋白及GST蛋白通過凝血酶(Novagen公司)處理進(jìn)行分離。小鼠RIG-1 (序列號3)、HMGBl (序列號4)及Rab5 (序列號5)的cDNA通過伴有相對于MEF來源的總RNA的逆轉(zhuǎn)錄的聚合酶鏈反應(yīng)(以下有時(shí)也稱作RT-PCR)獲得，分別克隆至 pCAGGS-CFP、pCAGGS-YFP 及 pCAGGS-RFP 載體(參照 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA、101、15416-15421,2004)的 XhoI 及 NotI 識別部位，獲得 CFP-RIG-1、YFP-HMGBI 及 RFP_Rab5。(免疫印跡解析)細(xì)胞溶解及免疫印跡解析通過常規(guī)方法進(jìn)行。IRF 二聚體通過使用了Native-PAGE及之后的抗小鼠IRF3抗體的免疫印跡解析來進(jìn)行。IRF3 二聚體的定量通過NIH Image軟件來進(jìn)行。通過3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)獲得了相同的結(jié)果。(RNA 解析) RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)通過常規(guī)方法進(jìn)行。實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析(定量RT-PCR)使用 LightCycler480 (商品名，Roche 公司)及 SYBR Green System (Roche 公司)來進(jìn)行。所有數(shù)據(jù)用使用對甘油醛三磷酸脫氫酶(GAPDH)基因獲得的結(jié)果進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化而得到的相對表達(dá)單位來表示。數(shù)據(jù)測定3次，表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差。對于所有的數(shù)據(jù)，在2次以上的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得了相同的結(jié)果。用于定量RT-PCR 的引物序列如下。HMGBl 正義鏈 5’ -CCAAAGGGGAGACCAAAAAG-3’(序列號 6)、HMGBl 反義鏈 5’ -TCATAGGGCTGCTTGTCATCT-3’(序列號 7)、HMGB2 正義鏈5’ -TGCCTTCTTCCTGTTTTGCT-3’(序列號 8)、HMGB2 反義鏈 5’ -GGACCCTTCTTTCCTGCTTC-3’(序列號 9)、HMGB3 正義鏈 5’ -GGAGATGAAAGATTATGGACCAG-3’(序列號 10)、HMGB3 反義鏈 5’ -CTTTGCTGCCTTGGTG-3’(序列號 11)、GBPl 正義鏈 5’ -CTCAGCAGCAGTGCAAAAGG-3’(序列號 12)、GBPl 反義鏈 5’ -GCTCCTGGAGGGTTTCTGTG-3，(序列號 13)、IRF7 正義鏈5’ -GCAAGGGTCACCACACTA-3’(序列號 14)、IRF7 反義鏈 5’ -CAAGCACAAGCCGAGACT-3’(序列號 15)、IL-12p40 正義鏈 5’ -GACACGCCTGAAGAAGATGAC-3’(序列號 16)、IL-12p40 反義鏈 5’ -TAGTCCCTTTGGTCCAGTGTG-3’(序列號 17)、GAPDH 正義鏈5’ -CTCATGACCACAGTCCATGC-3’(序列號 18)、GAPDH 反義鏈 5’ -CACATTGGGGGTAGGAACAC-3 ’(序列號 19)、IL-6 正義鏈 5’ -ATGAAGTTCCTCTCTGCAAGAGACT-3’(序列號 20)、IL-6 反義鏈 5’ -CACTAGGTTTGCCGAGTAGATCTC-3’(序列號 21)、RANTES 正義鏈 5’ -ACGTCAAGGAGTATTTCTACAC-3’(序列號 22)、RANTES 反義鏈5’ -GATGTATTCTTGAACCCACT-3’(序列號 23)、I κ B-α 正義鏈 5’ -TTGGTGACTTTGGGTGCT-3’(序列號 24)、IkB-α 反義鏈 5’ -TGACATCAGCCCCACATTT-3’(序列號 25)、IFN- α I 正義鏈 5’ -GCCTTGACACTCCTGGTACAAATGAG-3’(序列號 26)、IFN-α I反義鏈 5’ -CAGCACATTGGCAGAGGAAGACAG-3’(序列號 27)、IFN-α 4 正義鏈5’-GACGACAGCCAAAGAAGTGA-3’(序列號 28)、IFN_a 4 反義鏈 5 ’-GAGCTATGTCTTGGCCTTCC-3 ’(序列號 29)、IFN-β 正義鏈 5’-CCACCACAGCCCTCTCCATCAACTAT-3’(序列號 30)、IFN-β 反義鏈 5，-CAAGTGGAGAGCAGTTGAGGACATC-3 ’(序列號 31)。

但實(shí)施例50、54及56的定量RT-PCR中使用的引物的堿基序列如下。Ifna4 正向鏈(Fw) 5’ -CAATGACCTCAAAGCCTGTGTG-3’(序列號 47)、Ifna4 反向鏈(Rv ) 5 ’ -CACAGTGATCCTGTGGAAGT-3 ’(序列號 48)、Ifnbl (Fw) 5，-CCACCACAGCCCTCTCCATCAACTAT-3，(序列號 49)、Ifnbl (Rv) 5，-CAAGTGGAGAGCAGTTGAGGACATC-3’(序列號 50)、116 (Fw)5’ -ACGATGATGCACTTGCAGAA-3’(序列號 51)、116 (Rv) 5，-GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC-3，(序列號 52)、Tnfa (Fw) 5’ -TCATACCAGGAGAAAGTCAACCTC-3’(序列號 53)、Tnfa (Rv) 5，-GTATATGGGCTCATACCAGGGTTT-3，(序列號 54)、Ccl5 (RANTES)(Fw) 5，-ACGTCAAGGAGTATTTCTACAC-3，(序列號 22)、Ccl5 (RANTES) (Rv)5，-GATGTATTCTTGAACCCACT-3’(序列號 23)、Gapdh (Fw) 5，-CTCATGACCACAGTCCATGC-3，(序列號 18)、Gapdh (Rv) 5’-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3’(序列號 19)。(統(tǒng)計(jì)解析)對照組及試驗(yàn)組的結(jié)果利用Student’ s t檢驗(yàn)進(jìn)行評價(jià)。(ELISA)小鼠IFN-β、IL-6 及 IL-1 β 利用 ELISA 進(jìn)行測定。IFN-β ELISA 試劑盒由 PBLBIO MEDICAL LABORATORIES 公司購入。IL-6 及 IL-1 β ELISA 試劑盒由 R&D SYSTEMS 公司購入。對于所有數(shù)據(jù)，在追加的獨(dú)立的2次試驗(yàn)中獲得了相同的結(jié)果。
(RNA 干涉)siRNA載體通過將寡核苷酸插入到pSUPER.retro, puro逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體的EcoRI及HindIII位點(diǎn)而得以構(gòu)建。小鼠HMGB1、2及3 (pan-HMGB-siRNA,以下有時(shí)稱作HMBG-si)、HMGB2、及海腎螢光素酶(Renilla Iuciferase)(對照，以下有時(shí)稱作 Ctrl-si)的 siRNA 的靶序列分別為 5，-GTATGAGAAGGATATTGCT-3’(序列號 32)、5 ’ -GCGTTACGAGAAACCAGTT-3 ’(序列號 33 )及 5 ’ -GTAGCGCGGTGTATTATACA-3 ’(序列號 34 )。轉(zhuǎn)基因的MEFs細(xì)胞用Puromycin (Sigma公司)2 μ g/ml選擇48小時(shí)，RAW264.7細(xì)胞用Puromyc η4 μ g/ml 選擇 48 小時(shí)。電泳遷移率變動分析(Electrophoreticmobility shift assay) (EMSA)EMSA通過常規(guī)方法進(jìn)行。使用NF- κ B的共有序列(5，-TCGACCCGGGACTTTCCGCCGGGACTTTCCGCCGGGACTTTCCGG-3’，序列號35)。在NF- κ B-DNA復(fù)合體中存在的ρ65的存在通過使用了抗Ρ65抗體的超遷移帶的檢測來進(jìn)行確認(rèn)。(病毒感染)使MOI (multiplicity of infection,感染復(fù)數(shù))為 1.0 的 HSV-1 或 VSV 感染細(xì)胞12小時(shí)。在測定HSV-1及VSV的收率時(shí)，通過常規(guī)方法進(jìn)行空斑形成試驗(yàn)。對于所有數(shù)據(jù)，在追加的獨(dú)立的2次試驗(yàn)中獲得了相同的結(jié)果。病毒的制備通過常規(guī)方法進(jìn)行。(熒光顯微鏡觀察)在底面為玻璃制的35mm組織培養(yǎng)皿(松浪硝子工業(yè)株式會社)上培養(yǎng)HeLa細(xì)胞(5X104個(gè))。熒光顯微鏡觀察使用激光掃描型共聚焦顯微鏡1X81 (奧林巴斯株式會社)來進(jìn)行。2層及3層彩色圖像通過連續(xù)獲取模式進(jìn)行拍攝而防止了交叉激發(fā)。(寡核苷酸) 使用作為硫代磷酸寡核苷酸的CpG-B (序列號37，以下有時(shí)標(biāo)記為“CpG_B (S)”)、CpG-Rev (序列號38，以下有時(shí)標(biāo)記為“CpG-Rev (S)，，)及CpG-M (序列號39，以下有時(shí)標(biāo)記為“CpG-M (S)”)以及PS。將這些化合物的堿基序列示于圖46。圖46中，帶有下劃線的CG (CpG-B (S)), GC (CpG-Rev (S))及GG (CpG-M (S))是各硫代磷酸寡核苷酸中的特征堿基序列。另外，除上述之外，還使用下面的硫代磷酸寡核苷酸。CpG0DN1018 (S)5 ’ -TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3 ’(序列號 55 )、0DN1019 (S )5 ’ -TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA-3 ’(序列號56)。另外，還使用下面的寡核苷酸。CpG-A5’ -ggTGCATCGATGCAgggggG-3’(序列號2)。CpG-A的小寫文字標(biāo)記的堿基帶有硫代磷酸酯骨架、大寫文字標(biāo)記的堿基帶有磷酸二酯骨架。(小鼠脾細(xì)胞的制備)摘出C57BL/6J小鼠的脾臟，向其中用25G的注射針(Nipro)注入帶有DNase I.collagenase D的PBS,將滲出的細(xì)胞懸浮液回收。進(jìn)而，在新的帶有DNase1-collagenase D的PBS中將脾臟切碎，將其回收進(jìn)行37°C孵育(30分鐘)。將兩者通入細(xì)胞篩網(wǎng)(篩孔尺寸40 μ m，BD)，用PFE(在PBS pH7.2(Invitrogen)中添加有 ImM EDTACGIBCO)及 2%FCS (HyClone)的溶液)進(jìn)行洗漆后，混懸在 I XRBC Lysis Buffer (eBioscience)中，使紅細(xì)胞溶血。用PFE對所得細(xì)胞再洗滌2次后，再次通入至細(xì)胞篩網(wǎng)(篩孔尺寸40 μ m,BD)中，混懸在RPMI培養(yǎng)基中。(利用westernblotting解析信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活)
實(shí)施例53中，作為一抗使用以下的抗體。兔抗IRF3多克隆抗體(Invitrogen)、兔抗磷酸化 IRF3 (Ser396) (4D4G)抗體(Cell Signaling)、小鼠抗 I κ B a (L35A5)抗體(Cell Signaling)、兔抗磷酸化 I κ B a (Ser32) (14D4)抗體(Cell Signaling)、兔抗 JNK 抗體(Cell Signaling)、兔抗磷酸化 JNK (Thrl83/Tyrl85) (81E11)抗體(CellSignaling)、兔抗 p38MAP 激酶抗體(Cell Signaling)、兔抗磷酸化 p38MAP 激酶(Thrl80/Tyrl82)抗體(CellSignaling)。另外,作為二抗使用以下的抗體。抗兔IgG HRP結(jié)合抗體(GEHealthcare)、抗小鼠 IgG HRP 結(jié)合抗體(GE Healthcare)。(被細(xì)胞質(zhì)DNA或RNA激活的免疫應(yīng)答中的HMGB的作用)(實(shí)施例1)利用B-DNA (圖1a)或 poly (I:C)(圖 lb)刺激 Hmgbl+/+MEF 細(xì)胞或 HmgblvIffiF細(xì)胞6小時(shí)，或者用脂多糖(LPS) (200ng/ml)(圖1c)刺激Hmgb 1+/+MEF細(xì)胞或HmgblvIffiF細(xì)胞2小時(shí)。利用定量RT-PCR對IFN-PmRNA的誘導(dǎo)水平進(jìn)行測定。將結(jié)果示于圖1。表示與Hmgbl+/+MEF細(xì)胞比較時(shí)p < 0.01。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。ND表示未檢測到。Hmgbr7^MEF細(xì)胞中，由DNA或RNA向細(xì)胞質(zhì)的傳遞所導(dǎo)致的IFN-β誘導(dǎo)降低。(實(shí)施例2)利用B-DNA (圖 2a)或 poly (I:C)(圖 2b)刺激 Hmgb2+/+MEF 細(xì)胞或 Hmgb2+MEF細(xì)胞6小時(shí)，或者用LPS (200ng/ml)(圖2c)刺激Hmgb2+/+MEF細(xì)胞或HmgbZ+MEF細(xì)胞2小時(shí)。利用定量RT-PCR對IFN-PmRNA的誘導(dǎo)水平進(jìn)行測定。將結(jié)果示于圖2。表示與Hmgb2+/+MEF細(xì)胞比較時(shí)P < 0.001。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。ND表示未檢測到。
`
HmgbZ+MEF細(xì)胞中的IFN-β誘導(dǎo)的降低通過DNA向細(xì)胞質(zhì)的傳遞而觀察到，但通過RNA的傳遞未觀察到。(實(shí)施例3)將B-DNA或poly(1:C)脂質(zhì)導(dǎo)入(脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)到通過表達(dá)以所有HMGB為靶的siRNA(HMBG-si)或?qū)φ誷iRNA (Ctrl-si)的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的MEF中。接著，利用定量RT-PCR 測定 IFN-β (圖 3a 及 e)、IFN-α 4 (圖 3b 及 f)、IL_6 (圖 3c 及 g)、RANTES (圖 3d及h)的mRNA的表達(dá)水平。將結(jié)果示于圖3。表示與Ctrl-s1-MEF比較時(shí)P <0.01。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。ND表示未檢測到。缺失了全部HMGB的MEF缺損了對細(xì)胞質(zhì)DNA或RNA的免疫應(yīng)答。(實(shí)施例4)通過將由各種供給源制備的核酸、S卩HSV-1DNA (圖4a)、牛痘病毒DNA (圖4b)、5’-三磷酸RNA (圖4c)、微生物DNA (圖4d)、牛胸腺DNA (圖4e)、ISD (圖4f)脂質(zhì)導(dǎo)入至缺失了全部HMGB的MEF中，傳遞至細(xì)胞質(zhì)。ISD的堿基序列為5’-TACAGATCTACTAGTGATCTATGACTGATCTGTACATGATCTACA-3’(序列號36)。作為對照，還進(jìn)行了利用LPS的刺激(圖4g)。利用定量RT-PCR測定脂質(zhì)導(dǎo)入6小時(shí)后的IFN-PmRNA的表達(dá)量。將結(jié)果示于圖4。表示與Ctrl-s1-MEF比較時(shí)p <0.01。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。ND表示未檢測到。利用LPS(200ng/ml)將缺失了全部HMGB的MEF刺激2小時(shí)的結(jié)果是誘導(dǎo)了 IFN-β(圖4g)。而缺失了全部HMGB的MEF缺損了由各種供給源制備的核酸傳遞至細(xì)胞質(zhì)的6小時(shí)后的IFN-β誘導(dǎo)(圖4a h)。(由細(xì)胞質(zhì)核酸受體所媒介的信號通路的激活及抗病毒免疫應(yīng)答中的HMGB的必要性)(實(shí)施例5)將B-DNA或poly (1:C)脂質(zhì)導(dǎo)入(脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)至通過表達(dá)以全部HMGB為靶的siRNA (HMBG-si)或?qū)φ誷iRNA (Ctrl-si)的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的MEF中。通過Native-PAGE及后續(xù)的免疫印跡評價(jià)IRF3的二聚體化。將結(jié)果示于圖5。(實(shí)施例6)將B-DNA或poly(1:C)脂質(zhì)導(dǎo)入(脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)至通過表達(dá)以全部HMGB為靶的siRNA(HMBG-si)或?qū)φ誷iRNA (Ctrl-si)的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的MEF中。通過EMSA評價(jià)NF-κ B的激活。將結(jié)果示于圖6。(實(shí)施例7)探討了利用病毒感染進(jìn)行的I型IFN的誘導(dǎo)。使VSV或HSV-1感染至通過表達(dá)以全部HMGB為靶的siRNA (HMBG-si)或?qū)φ誷iRNA (Ctrl-si)的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的MEF。利用定量RT-PCR測定I型IFN、即IFN-β (圖7a及b)、IFN-α I (圖7c及d)、IFN- α 4 (圖7e及f)的mRNA的表 達(dá)水平。將結(jié)果示于圖7。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。ND表示未檢測到。表示與Ctrl-s1-MEF比較時(shí)p < 0.01?！?*”表示與Ctrl-s1-MEF 比較時(shí) p < 0.05。(實(shí)施例8)已知在作為樹突狀細(xì)胞(DCs)亞型之一的漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞的前體細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cell precursors, pDCs)中，介由 TLR9 可誘導(dǎo)大量的 I 型 IFN的產(chǎn)生。據(jù)報(bào)道，在脾臟來源的PDCs中，當(dāng)通過作為DNA病毒的I型單純皰疹病毒(herpessimplex virustype 1,HSV_1)受到感染時(shí),介由TLR9可誘導(dǎo)I型IFN的表達(dá),而在骨髄來源的pDCs或cDCs (conventional DCs，常規(guī)樹突狀細(xì)胞)中，在利用HSV-1的I型IFN的表達(dá)誘導(dǎo)中也存在TLR9非依賴性的通路。利用TLR 配體、即 poly (I:C)(圖 8a 及 b)、CpG_B ODN (圖 8c 及 d)刺激 Hmgbl+/+或Hmgbl+cDCs。作為對照，還進(jìn)行了利用LPS的刺激(圖8e及f)。接著，利用定量RT-PCR測定IL-6 (圖8a、c、e)及TNF-α (圖8b、d、f)的mRNA的表達(dá)水平。將結(jié)果示于圖8。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。ND表示未檢測到。表示與野生型細(xì)胞比較時(shí)P < 0.0l0(實(shí)施例9)利用TLR 配體、即 CpG-B ODN (圖 9a)及 poly (U)(圖 9b)刺激 Hmgbl+/+ 或Hmgbl^pDCs0作為對照，還進(jìn)行了利用R837 (TLR7激動劑)的刺激(圖9c)。接著，利用定量RT-PCR測定IFN-β的mRNA的表達(dá)水平。將結(jié)果示于圖9。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。表示與野生型細(xì)胞比較時(shí)P < 0.01。(使用了對HMGB的高結(jié)合親和性核酸類似物的由核酸激活的免疫應(yīng)答的干涉)(實(shí)施例10)已知MEF中TLR9的表達(dá)量很少。在有無利用I μ M的CpG-B ODN進(jìn)行的30分鐘前處理之后，通過B-DNA (圖10a)、poly (I:C)(圖10b)或LPS (圖10c)向細(xì)胞質(zhì)的傳遞來刺激MEF。利用定量RT-PCR測定IFN-β的mRNA的表達(dá)水平。將結(jié)果示于圖10。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。ND表示未檢測到。表示經(jīng)前處理的細(xì)胞的結(jié)果相對于未經(jīng)前處理的細(xì)胞的結(jié)果為P < 0.01。(實(shí)施例11)在有無利用5 μ M PS或I μ M CpG-B ODN進(jìn)行的30分鐘前處理之后，通過I μ g/ml的poly (U)(圖1la)的脂質(zhì)導(dǎo)入或25 μ g/ml的R837 (圖1lb)的任一種對骨髄來源的Tlrg+pDCs刺激8小時(shí)。利用定量·RT-PCR測定IFN-β的mRNA的表達(dá)。將結(jié)果示于圖11。
表示經(jīng)前處理的細(xì)胞的結(jié)果相對于未經(jīng)前處理的細(xì)胞的結(jié)果為P < 0.01。(HMGB的鑒定及其對DNA及RNA的結(jié)合)(實(shí)施例12)對HMGB進(jìn)行鑒定。將利用B-DNA刺激4小時(shí)后的MEF的細(xì)胞質(zhì)抽提物供至使用了生物素結(jié)合B-DNA及鏈霉親和素結(jié)合磁性珠粒的拉下分析。利用DNase I處理將結(jié)合于B-DNA的蛋白洗脫。洗脫的蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE及后續(xù)的銀染色被可視化(圖12a)，接著利用質(zhì)量分析進(jìn)行解析。圖12a表示銀染色的結(jié)果。圖12b表示使用了針對HMGBl、2及3的抗體的免疫印跡解析的結(jié)果。(實(shí)施例13)探討HMGB對DNA、RNA及無堿基硫代磷酸酯脫氧核糖均聚體(PS)的結(jié)合。將結(jié)果示于圖 13。在 1、3、10、30、100μ g/ml 的非標(biāo)記核酸(B_DNA、poly (1:C)、poly (U)、牛胸腺DNA、微生物0嫩)、卩837(1、3、10、30、1001^/1111)(上及中段框)、無堿基天然脫氧核糖均聚體(PD ；0.01,0.1,0.3、1、3 μ g/ml ;下段框)及無堿基硫代磷酸酯脫氧核糖均聚體(PS ；0.01、
0.1、0.3、1、3μ g/ml ;下段框)的存在下進(jìn)行使用了重組HMGBl或2以及生物素結(jié)合B-DNA的體外拉下分析。在下段框中，還使用階段性增加的非標(biāo)記B-DNA或CpG-B ODNC0.1、0.3、
1、3μg/ml)。CpG-B ODN及PS的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)相比較于非標(biāo)記B-DNA的半數(shù)抑制濃度分別為1/150及1/100。(實(shí)施例14)使用重組HMGBl及生物素結(jié)合poly(U)，在階段性增加的非標(biāo)記CpG-B ODN,PS或R837 (0.1、1或10 μ g/ml)的存在下進(jìn)行體外拉下分析。將結(jié)果示于圖14。(實(shí)施例15)使用重組HMGB3及生物素結(jié)合B-DNA，在I或10 μ g/ml的非標(biāo)記B-DNA或poly(I:C)的存在下或非存在下進(jìn)行體外拉下分析。將結(jié)果示于圖15。(由核酸激活的免疫應(yīng)答中的HMGB的必需的作用)(實(shí)施例16)在Hmgb 1+/+或 HmgblvIffiF 中脂質(zhì)導(dǎo)入(脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)B-DNA (圖 16a、b、c)或 poly(I:C)(圖 16d、e、f)。接著，利用定量 RT-PCR 測定 IFN- α 4 (圖 16a 及 d)、IL_6 (圖 16b 及e),RANTES (圖16c及f)的mRNA的表達(dá)水平。將結(jié)果示于圖16。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。ND表示未檢測到。表示與Hmgbl+/+MEF細(xì)胞比較時(shí)P < 0.01。在HMGBl的非存在下，各種細(xì)胞因子及趨化因子基因的誘導(dǎo)降低。(實(shí)施例17)
利用階段性增加的B-DNA (0.1、1、5、10 μ g/ml)(圖 17a 及 b)或 poly (I:C) (0.1、1、5、10μ g/ml)(圖17c及d)對野生型及同一窩仔來源的Hmgbl+MEF刺激6小時(shí)，或者利用LPS (10、50、100、500ng/ml)(圖17e及f )對野生型及同一窩仔來源的Hmgbl+MEF刺激2小時(shí)。利用定量RT-PCR測定IFN-β (圖17a、C、e)及IL-6 (圖17b、d、f)的mRNA的表達(dá)。將結(jié)果不于圖17。(實(shí)施例18)在Hmgbl+7+或 Hmgbl+cDCs (conventional dendritic cells)中脂質(zhì)導(dǎo)入(月旨質(zhì)轉(zhuǎn)染)B-DNA (圖18a、b、c)或poly (I:C)(圖18d、e、f)。接著，利用定量RT-PCR測定IFN-β (圖 18a 及 d)、IFN-α 4 (圖 18b 及 e)、IL-6 (圖 18c 及 f)的 mRNA 的表達(dá)水平。將結(jié)果示于圖18。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。ND表示未檢測到。表示與 Hmgbl+/+cDCs 細(xì)胞比較時(shí) p < 0.01。在HMGBl的非存在下，各種細(xì)胞因子及趨化因子基因的誘導(dǎo)降低。認(rèn)為對cDCs的poly (1:C)的應(yīng)答由RLR及TLR3這兩者媒介。(實(shí)施例19)探討在HMGB2的非存在下的細(xì)胞因子基因的誘導(dǎo)。利用階段性增加的B_DNA(0.1、1>5>10 μ g/ml)(圖 19a 及 b)或 poly (I:C) (0.1、1、5、10 μ g/ml)(圖 19c 及 d)對野生型及同一窩仔來源的Hmgbl+MEF刺激6小時(shí)，或者利用LPS (10、50、100、500ng/ml)(圖19e及f )對野生型及同 一窩仔來源的Hmgbl+MEF刺激2小時(shí)。利用定量RT-PCR測定IFN- β(圖19a、c、e)及IL-6 (圖19b、d、f)的mRNA的表達(dá)。將結(jié)果示于圖19。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。(實(shí)施例2O)探討Hmgbl+MEF中的HMGB2的敲除的影響。利用B-DNA(圖20a及b)或poly(I:C)(圖20c及d)對通過表達(dá)以HMGB2為靶的siRNA (HMBG2_si)或?qū)φ誷iRNA (Ctrl-si)的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的HmgbIvIffiF進(jìn)行刺激，利用定量RT-PCR測定IFN-β (圖20a及c)或IFN- α 4 (圖20b及d)的mRNA的表達(dá)。對于表達(dá)對照siRNA (Ctrl-si)的Hmgbl+/+，為了比較也進(jìn)行了解析。將結(jié)果示于圖20。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。
表示與表達(dá)對照siRNA (Ctrl-si)的細(xì)胞比較時(shí)P < 0.01。(實(shí)施例21)探討以HMGB2為靶的siRNA的效果。將野生型的MEF通過所示的siRNA逆轉(zhuǎn)錄酶病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并通過免疫印跡解析對各HMGB蛋白的表達(dá)進(jìn)行了解析。將結(jié)果示于圖21。(實(shí)施例22)探討以全部HMGB為靶的siRNA的效果。將野生型的MEF通過表達(dá)以全部HMGB為靶的siRNA (HMBG2-si)或?qū)φ誷iRNA (Ctrl-si)的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并利用定量RT-PCR解析HMGBl (圖22a)、HMGB2 (圖22b)及HMGB3 (圖22c)蛋白的表達(dá)。將結(jié)果示于圖22。表示與導(dǎo)入了 Ctrl-si的MEF比較時(shí)p < 0.01。(實(shí)施例23)探討以全部HMGB為靶的siRNA的效果。將野生型的MEF通過表達(dá)以全部HMGB為靶的siRNA (HMBG2-si)或?qū)φ誷iRNA (Ctrl-si)的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并利用免疫印跡解析對各HMGBl蛋白的表達(dá)進(jìn)行解析。將結(jié)果示于圖23。
(實(shí)施例24)探討HMGB缺失細(xì)胞中對由各種核酸產(chǎn)生的細(xì)胞質(zhì)刺激的免疫應(yīng)答的缺損。利用HSV-1DNA (圖24a)、牛痘病毒DNA (圖24b)、5’-三磷酸RNA (圖24c)、微生物DNA (圖24d)、牛胸腺DNA (圖24e)、ISD (圖24f)所示的核酸對通過表達(dá)以全部HMGB為靶的siRNA(HMBG-si)或?qū)φ誷iRNA (Ctrl-si)的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的MEF刺激6小時(shí)，或者利用LPS (200ng/ml)(圖24g)對通過表達(dá)以全部HMGB為靶的siRNA (HMBG-si)或?qū)φ誷iRNA(Ctrl-si)的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的MEF刺激2小時(shí)。利用定量RT-PCR測定IL-6基因的mRNA表達(dá)水平。將結(jié)果示于圖24。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。表示與導(dǎo)入了 Ctrl-si的MEF比較時(shí)ρ < 0.01。(實(shí)施例25 )探討HMGB缺失細(xì)胞中對各種濃度的核酸配體的免疫應(yīng)答的缺損。利用階段性增加的 B-DNA (0.1、1、5、10μ g/ml)(圖 25a、d)或 poly (I:C) (0.1、1、5、10 μ g/ml)(圖25b、e)對表達(dá)以全部HMGB為靶的siRNA (HMBG-si)或?qū)φ誷iRNA (Ctrl-si)的MEF刺激6小時(shí)，或者利用LPS (10、50、100、500ng/ml)(圖25c、f)對表達(dá)以全部HMGB為靶的siRNA(HMBG-si)或?qū)φ誷iRNA (Ctrl-si)的MEF刺激2小時(shí)。利用定量RT-PCR測定IFN-β (圖25a、b、c)或IL-6 (圖25d、e、f)的mRNA的表達(dá)。將結(jié)果示于圖25。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。(實(shí)施例26)探討HMGB缺失細(xì)胞中對各種濃度的核酸配體的免疫應(yīng)答的缺損。利用階段性增加的 B-DNA (0.1、1、5、10μ g/ml)(圖 26a、c)或 poly (I:C) (0.1、1、5、10 μ g/ml)(圖26b、d)對表達(dá)以全部HMGB為靶的siRNA (HMBG-si)或?qū)φ誷iRNA (Ctrl-si)的MEF刺激6小時(shí)，或者利用LPS (10、50、100、500ng/ml)(圖26e)對表達(dá)以全部HMGB為靶的siRNA(HMBG-si)或?qū)φ?siRNA (Ctrl-si)的 MEF 刺激 2 小時(shí)。利用 ELISA 測定 IFN-β (圖 26a及b)或IL-6 (圖26c、d、 e)的表達(dá)。將結(jié)果不于圖26。數(shù)據(jù)全部表不為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。(實(shí)施例27)探討HMGB缺失細(xì)胞對各種細(xì)胞因子刺激的應(yīng)答。將表達(dá)以全部HMGB為靶的siRNA(HMBG-si)或?qū)φ?siRNA (Ctrl-si)的 MEF 用 B-DNA (10 μ g/ml)刺激 6 小時(shí)、用 IFN-β (500單位/ml)刺激6小時(shí)(圖27b)、用IFN-Y (I單位/ml)刺激2小時(shí)(圖27c)或用TNF-α(10ng/ml)刺激 2 小時(shí)(圖 27d)。利用定量 RT-PCR 測定 IFN-β (圖 27a)、IRF7 (圖 27b)、GBPl (圖27c)及IkB-α (圖27d)的mRNA的表達(dá)量。將結(jié)果示于圖27。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。基本上，即便這些配體為不同的量，也獲得了相同的結(jié)果。(實(shí)施例28)探討HMGB缺失細(xì)胞中被IFN- Y誘導(dǎo)的STATl的激活。利用IFN- Y (I或10單位/ml)對表達(dá)以全部HMGB為靶的siRNA (HMBG-si)或?qū)φ誷iRNA (Ctrl-si)的MEF刺激30分鐘。利用抗磷酸化STATl (p-STATl)及抗β -肌動蛋白抗體分別檢測被磷酸化的STATl及β_肌動蛋白。將結(jié)果示于圖28。(實(shí)施例29)探討HMGB缺失RAW264.7細(xì)胞中對由核酸產(chǎn)生的細(xì)胞質(zhì)刺激的免疫應(yīng)答的缺損。利用B-DNA (圖29a)或poly (I:C)(圖29b)對表達(dá)以全部HMGB為靶的siRNA (HMBG-si)或?qū)φ誷iRNA (Ctrl-si)的RAW264.7細(xì)胞刺激所示時(shí)間。利用定量RT-PCR測定IFN-β基因的mRNA表達(dá)量。將結(jié)果示于圖29。表示與Ctrl-si表達(dá)細(xì)胞比較時(shí)p < 0.01。(實(shí)施例30)利用階段性增加的B-DNA (0.1、1、5、10 μ g/ml)(圖 30a 及 d)或 poly (I:C) (0.1、1、5、10μ g/ml)(圖30b及e)對表達(dá)HMBG-si或Ctrl-si的RAW264.7細(xì)胞刺激6小時(shí)，或者利用 LPS (10、50、100、500ng/ml)(圖 30c 及 f)對表達(dá) HMBG-si 或 Ctrl-si 的 RAW264.7細(xì)胞刺激2小時(shí)。利用定量RT-PCR測定所示的細(xì)胞因子基因的mRNA表達(dá)量。將結(jié)果示于圖30。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 3)。(實(shí)施例31)探討HMGB缺失ΝΙΗ3Τ3細(xì)胞中對由核酸產(chǎn)生的細(xì)胞質(zhì)刺激的免疫應(yīng)答。利用B-DNA(圖31a)或poly (I:C)(圖3lb)對表達(dá)以全部HMGB為靶的siRNA (HMBG-si)或?qū)φ誷iRNA(Ctrl-si)的NIH3T3細(xì)胞刺激所示時(shí)間。利用定量RT-PCR測定IFN-β基因的mRNA表達(dá)量。將結(jié)果示于圖31。"*"表示與Ctrl-si表達(dá)細(xì)胞比較時(shí)P < 0.01。(實(shí)施例32)利用階段性增加的B-DNA (0.1、1、5、10 μ g/ml)(圖 32a 及 c)或 poly (I:C) (0.1、
1、5、10 μ g/ml)(圖32b及d)對表達(dá)HMBG-si或Ctrl-si的NIH3T3細(xì)胞刺激6小時(shí)，或者利用 LPS (10、50、100、500ng/ml)(圖 32e)對表達(dá) HMBG-si 或 Ctrl-si 的 NIH3T3 細(xì)胞刺激2小時(shí)。利用定量RT-PCR測定IFN-β (圖32a及b)或IL-6 (圖32c、d、e)的mRNA表達(dá)量。將結(jié)果示于圖32。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 3)。(實(shí)施例33 )探討由B-DNA刺激導(dǎo)致的炎性體(infIammasome)通路的激活與細(xì)胞死亡中的HMGB的關(guān)系。在Hmgb 1+/+或Hmgbl-/-胎兒肝臟造血前體細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞(圖33a)及表達(dá)以全部 HMGB 為靶的 siRNA (HMBG-si)或?qū)φ?siRNA (Ctrl-si)的 RAW264.7 細(xì)胞(圖 33b)中脂質(zhì)導(dǎo)入B-DNA，利用ELISA對12小時(shí)后分泌的成熟IL-1 β的量進(jìn)行測定。RAW264.7細(xì)胞通過用50ng/ml的LPS刺激16小時(shí)，激活炎性體。將結(jié)果示于圖33。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 3)。結(jié)果示于圖33。表示與野生型細(xì)胞或Ctrl-si表達(dá)細(xì)胞比較時(shí)P <0.01。ND表示未檢測到。利用階段性增加的B-DNA刺激表達(dá)HMBG-si或Ctrl-si的RAW264.7細(xì)胞。細(xì)胞在24小時(shí)的刺激后回收，利用臺盼藍(lán)進(jìn)行染色。計(jì)算相對于未處理細(xì)胞的活細(xì)胞的百分率。將結(jié)果示于圖33c。表達(dá)HMGB-si的RAW264.7細(xì)胞相對于被DNA誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡更有耐受性。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(n= 3)。(實(shí)施例34)使VSV (圖34a)或HSV-1 (圖34b)感染表達(dá)以全部HMGB為靶的siRNA (HMBG-si)或?qū)φ誷iRNA (Ctrl-si)的MEF，在24小時(shí)后測定病毒滴度。將結(jié)果示于圖34。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 3)。表示與Ctrl-si表達(dá)細(xì)胞比較時(shí)p < 0.01。(實(shí)施例35)使VSV (圖35a、b、c)或HSV-1 (圖35d、e、f)感染表達(dá)以全部HMGB為靶的siRNA(HMBG-si)或?qū)φ?siRNA (Ctrl-si)的 RAW264.7 細(xì)胞。接著，測定 IFN-β (圖 35a 及 d)、IFN- α I (圖35b及e)及IFN-α 4 (c及f)的mRNA表達(dá)量。將結(jié)果示于圖35。表示與Ctrl-si表達(dá)細(xì)胞比較時(shí)P <0.01?！?*”表示與Ctrl-si表達(dá)細(xì)胞比較時(shí)P <0.05。ND表示未檢測到。(實(shí)施例36)使VSV或HSV-1感染表達(dá)以全部HMGB為靶的siRNA (HMBG-si)或?qū)φ誷iRNA(Ctrl-si)的RAW264.7細(xì)胞。接著，測定病毒滴度。將結(jié)果示于圖36。表示與Ctrl-si表達(dá)細(xì)胞比較時(shí)P < 0.01。(在由核酸所媒介的TLR的激活中HMGB是必要的)(實(shí)施例37)利用poly (I:C)(圖37a及b)或CpG_B ODN (圖37c及d)刺激表達(dá)以全部HMGB為靶的 siRNA (HMBG-si)或?qū)φ?siRNA (Ctrl-si)的 RAW264.7 細(xì)胞，利用定量 RT-PCR 測定IL-6 (圖37a及c)及TNF-α (圖37b及d)的mRNA表達(dá)量。將結(jié)果示于圖37。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。表示與Ctrl-si表達(dá)細(xì)胞比較時(shí)P <0.01。ND表示未檢測到。(實(shí)施例38)利用CpG-A ODN以及CpG-A ODN和DOTAP對表達(dá)以全部HMGB為靶的siRNA(HMBG-si)或?qū)φ誷iRNA (Ctrl-si)的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行刺激，利用定量RT-PCR測定IFN-β (圖 38a)及 IFN-a 4 (圖 38b)的 mRNA 表達(dá)量。DOTAP (商品名、Roche Diagnostics株式會社)是用于介由陽離子脂質(zhì)體將DNA、RNA等帶負(fù)電的分子導(dǎo)入至真核細(xì)胞中的試劑。將結(jié)果示于圖38。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。表示與Ctrl-si表達(dá)細(xì)胞比較時(shí)P < 0.01。 (實(shí)施例39)探討通過使用核酸類似物的刺激對被核酸激活的免疫應(yīng)答的阻礙。在MEF中脂質(zhì)導(dǎo)入B-DNA后，利用I μΜ CpG-B ODN共刺激0、1、2、3小時(shí)，利用ELISA測定IFN-β的誘導(dǎo)。將結(jié)果示于圖39。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。表示與未伴有CpG-BODN刺激的由B-DNA產(chǎn)生的刺激進(jìn)行比較時(shí)P < 0.01。(實(shí)施例40)在有無利用5 μ M PS或I μ M CpG-B ODN進(jìn)行的30分鐘前處理之后，利用50 μ g/ml的poly (I:C)(無脂質(zhì)導(dǎo)入)(圖40a)或25 μ g/ml的R837 (圖40b)對骨髄來源的Tlr9^cDCs刺激4小時(shí)。利用定量RT-PCR測定IL_12p40mRNA的表達(dá)量。將結(jié)果示于圖40。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。表示未經(jīng)前處理的細(xì)胞的結(jié)果相對于經(jīng)前處理的細(xì)胞的結(jié)果為P < 0.01。ND表示未檢測到。(實(shí)施例41)探討HMGBl及RIG-1的細(xì)胞內(nèi)分布。將帶有CFP標(biāo)簽的RIG-1 (CFP-RIG-1)及帶有YFP標(biāo)簽的HMGBl (YFP-HMGBI)的表達(dá)載體與帶有RFP標(biāo)簽的Rab5 (RFP_Rab5) —起或者在沒有RFP-Rab5的情況下導(dǎo)入到HeLa細(xì)胞中。在從基因?qū)氲?6小時(shí)后，利用poly(I:C)刺激細(xì)胞2小時(shí)，使用激光掃描型共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。圖41示出共導(dǎo)入了表達(dá)載體(CFP-RIG-1、YFP-HMGBK RFP_Rab5)的細(xì)胞的熒光顯微鏡照片。圖41的上段及下段表示分別單獨(dú)的(從左至右為RIG-1、HMGBU Rab5)及重合的(從左至右為 CFP-RIG-1+YFP-HMGB1、CFP-RIG_I+RFP_Rab5、YFP-HMGBI+RFP-Rab5,CFP-RIG-1+YFP-HMGB1+RFP-Rab5)的照片。比例尺表示5 μ m。表示在多個(gè)細(xì)胞中觀察到的代表性結(jié)果。RIG-1及HMGBl這兩者部分地與Rab5重合，這表示RIG-1及HMGBl向核內(nèi)體膜的動員以及大概是由HMGB導(dǎo)致的RIG-1的激活。(實(shí)施例42)在poly (I:C)刺激后，利用 MitoTracker Deep Red633 (mitoTR, Invitrogen公司)將共導(dǎo)入有CFP-RIG-1及YFP-HMGBI表達(dá)載體的細(xì)胞進(jìn)行染色，使用激光掃描型共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。圖42表示細(xì)胞的熒光顯微鏡照片。圖42的上段及下段分別表示分別單獨(dú)的(從左至右為CFP-RIG-1、YFP-HMGBU mitoTR)及重合的(從左至右為 CFP-RIG-1+YFP-HMGB1、CFP-RIG-1+mitoTR、YFP-HMGBl+mitoTR、CFP-RIG-1+YFP-HMGBl+mitoTR)的照片。比例尺表示 5 μ m。如此處所示，RIG-1與mitoTR重合，在HMGBl及mitoTR之間完全觀察不到重合。與實(shí)施例41所示的結(jié)果一起，該結(jié)果可如下解釋。在利用HMGBl的poly (1:C)識別后，RIG-1被激活，集中分布在線粒體中，因此與IPS-1/MAVS發(fā)生相互作用。這些觀察為核酸識別及免疫應(yīng)答激活的一系列活動中的“快照”，在此觀察中，RIG-1的一些部分與HMGBl發(fā)生相互作用，而其他部分從HMGBl解離而與IPS-1/MAVS相結(jié)圖43表示基于上述實(shí)施例的結(jié)果`制成的由核酸介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活、SP由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活的概略圖。全部的免疫原性核酸結(jié)合在HMGB上(promiscuous sensing,廣范性識別),這對于之后的利用用于激活免疫應(yīng)答的特異性模式識別受體所進(jìn)行的識別(discriminative sensing,特異性識別)是必要的。(實(shí)施例43) 對使用了利用微孔板固相化的HMGB蛋白的由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑的篩選方法進(jìn)行評價(jià)。每孔100 μ I地將以5 μ g/ml的濃度溶解于PBS的重組HMGBl蛋白注入到96孔板中，在25°C下放置I小時(shí)進(jìn)行固相化。利用PBS溶液洗滌各孔2次后，每孔100 μ I地添加2%BSA-PBS溶液，在25°C下放置I小時(shí)進(jìn)行封閉。利用PBS溶液洗滌各孔2次后，每孔100 μ I地添加僅PBS溶液、溶解有75 μ g/ml的B-DNA, 100 μ g/ml的poly (I:C)、100ng/ml的LPS及25 μ g/ml的R837的PBS溶液，在25°C下放置I小時(shí)。接著，用PBS溶液洗滌各孔2次后，每孔100 μ I地添加I μ M的對5’末端進(jìn)行了生物素標(biāo)記的B-DNA或僅PBS溶液，在25°C下放置I小時(shí)。接著，利用PBS溶液洗滌各孔2次后，每孔100 μ I地添加用PBS溶液稀釋了 200倍的HRP標(biāo)記抗生物素抗體(R & D公司)，在25°C下放置I小時(shí)。利用PBS溶液洗滌各孔2次后，每孔100 μ I地添加HRP的底物溶液(BD Biosciences公司)，在25°C下使其發(fā)色15分鐘。利用酶標(biāo)儀(Model 680，Bio-rad公司)對各孔的吸光度進(jìn)行定量。圖45 (a)表示發(fā)色后的微孔板的照片，圖45 (b)表示各樣品的吸光度的曲線圖。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。(硫代磷酸寡核苷酸及PS對由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活的效果)進(jìn)行使用了作為硫代磷酸寡核苷酸的CpG-B (S)、CpG-Rev (S)及CpG-M (S)以及PS的實(shí)驗(yàn)。將這些化合物的堿基序列示于圖46。在圖46中，帶有下劃線的CG (CpG-B(S)),GC (CpG-Rev (S))及GG (CpG-M (S))是各硫代磷酸寡核苷酸中特征性的堿基序列。(體外拉下分析)(實(shí)施例44)與實(shí)施例13 同樣操作，以 0.1、0.5、2.5、12.5,62.5 μ g/ml 的 CpG-B (S)XpG-Rev(S)XpG-M (S)及PS作為競爭物質(zhì)，進(jìn)行使用了重組HMGBl及生物素結(jié)合B-DNA的體外拉下分析。將結(jié)果示于圖47。CpG-Rev (S)及CpG-M (S)(未顯示數(shù)據(jù))顯示了強(qiáng)于PS的競爭性。(由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活的抑制)
(實(shí)施例45)在MEF 的培養(yǎng)基中添加 0.1、0.25、0.5、0.75、1μΜ 濃度的 CpG-B (S)XpG-Rev (S)或PS，處理I小時(shí)。接著，在這些MEF中脂質(zhì)導(dǎo)入5 μ g/ml的B-DNA或5 μ g/ml的poly(I:C)并刺激24小時(shí)，利用ELISA法測定IFN-β的產(chǎn)生。將結(jié)果示于圖48。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。(a) (c)表示用B-DNA刺激的結(jié)果，Cd) (f)表示用poly(1:C)刺激的結(jié)果。結(jié)果，在利用CpG-B (S)(圖48a及d)或CpG-Rev (S)(圖48b及e)處理過的MEF中，IFN-β的產(chǎn)生明顯減弱。另外可知，在此次試驗(yàn)的濃度下，使用PS時(shí)的MEF的IFN-β產(chǎn)生抑制比使用CpG-B (S)或CpG-Rev (S)時(shí)弱(圖48c及f)。由以上的結(jié)果可知，在MEF的IFN-β產(chǎn)生抑制中，堿基部分的存在是重要的。已知在介由TLR9的免疫應(yīng)答的激活中CpG-B (序列號I)的第8個(gè)及第9個(gè)堿基為CG的序列是重要的，在利用將該序列轉(zhuǎn)變?yōu)镚C、將磷酸二酯鍵全部置換成硫代磷酸酯鍵的CpG-Rev (S)(序列號38)進(jìn)行了處理的MEF中，IFN-β的產(chǎn)生明顯減弱。由此結(jié)果可知,在由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活的抑制中，非甲基化CG序列(5’-CG-3’)并不重要，重要的是(I)具有硫代磷酸酯鍵及(2)具有堿基。(實(shí)施例46)將野生型小鼠來源的骨髄細(xì)胞如上所述地通過人Flt3L進(jìn)行分化誘導(dǎo)而獲得pDCs。將該pDCs (以下有時(shí)稱作“Flt3-DCs”)在3 μ M的CpG-M (S)的存在下處理I小時(shí)后，脂質(zhì)導(dǎo)入I μ M的CpG-A (TLR9激動劑)或5 μ g/ml的poly (U) (TLR7激動劑)并刺激24小時(shí)，利用ELISA法測定IFN-α及IFN-β的產(chǎn)生。將結(jié)果示于圖49。(a)及(b)表示IFN-α產(chǎn)生量的測定結(jié)果，(c)及(d)表示IFN-β產(chǎn)生量的測定結(jié)果。另外，(a)及(c)表示用CpG-A刺激的結(jié)果，(b)及(d)表示用poly (U)刺激的結(jié)果。數(shù)據(jù)全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。結(jié)果可知，F(xiàn)lt3-DCs通過利用CpG-M (S)的處理，顯著地抑制了利用CpG-A或poly (U)刺激時(shí)的IFN-α及IFN-β的產(chǎn)生。(體內(nèi)敗血癥模型)(實(shí)施例47)將對小鼠的LPS投予作為敗血癥的模型使用。將致死量的LPS投予至小鼠時(shí)，血中的炎癥性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1 β、IL-6的濃度在LPS投予后立刻上升，在2 3小時(shí)后迎來峰值，之后數(shù)小時(shí)內(nèi)返回至基底濃度。另一方面，當(dāng)追尋小鼠的生存經(jīng)過時(shí)，多個(gè)個(gè)體至達(dá)到死亡，從LPS投予開始需要經(jīng)過12 48小時(shí)。該時(shí)期中，作為在血中高濃度存在的細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)的是HMGBl。HMGBl的血中濃度在LPS投予后的8小時(shí)內(nèi)未見變化，之后上升，在投予后的16 36小時(shí)后維持高濃度。由于血中的HMGBl濃度與敗血癥的嚴(yán)重程度相關(guān)、投予HMGBl的中和抗體時(shí)存活率會提高，因此可以看出HMGBl有助于敗血癥的致死性的重要性。另外，已知在敗血癥模型中肝細(xì)胞會發(fā)生壞死，認(rèn)為由壞死細(xì)胞釋放出的核酸等DAMPs有可能惡化癥狀。對通過阻礙這些所謂的炎癥介質(zhì)而能改善癥狀的可能性進(jìn)行了探討。在對C57BL/6小鼠腹腔投予LPS1.25mg/只時(shí)所引起的敗血癥模型中，探討了CpG-M (S)的效果。在投予LPS的I小時(shí)前，尾靜脈投予100 μ g/只的CpG-M (S)或生理鹽水，測定小鼠的存活率。將結(jié)果示于圖50。在投予了 CpG-M (S)的小鼠中，可見存活率的改善。通過LPS的投予，在肝臟等中發(fā)生細(xì)胞死亡，釋放出核酸，通過這些核酸，誘導(dǎo)了由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活。雖然并不拘泥于特定的理論，但通過CpG-M (S)的投予，認(rèn)為可抑制這種由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活。如圖50所示，在未進(jìn)行CpG-M (S)投予的對照組(η = 10)中，在LPS注射后12 48小時(shí)后所有個(gè)體死亡，而投予CpG-M (S)后注射了 LPS的樣品組(η = 10)中，70%存活。(堿基序列的探討)(實(shí)施例48)對MEF以ΙμΜ前處理具有5聚體、10聚體(序列號41)、15聚體(序列號42)及20聚體(序列號43)堿基數(shù)的poly (dA)(嘌呤堿基)堿基序列的硫代磷酸寡核苷酸(以下有時(shí)標(biāo)記為“poly (dA) (S)”)或具有5聚體、10聚體(序列號44)、15聚體(序列號45)及20聚體(序列號46)堿基數(shù)的poly (dC)(嘧啶堿基)堿基序列的硫代磷酸寡核苷酸(以下有時(shí)標(biāo)記為“poly (dC) (S)”)l小時(shí)。接著，通過脂質(zhì)導(dǎo)入5 μ g/ml濃度的B-DNA，刺激前處理后的MEF，使用RT-PCR探討3小時(shí)后或6小時(shí)后的IFN- β的mRNA誘導(dǎo)。將結(jié)果示于圖51。數(shù)據(jù) 全部表示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。(a)表示poly(dA)(S)的結(jié)果，(b)表示poly (dC) (S)的結(jié)果。作為陽性對照，使用通過CpG-M (S)進(jìn)行了前處理者，作為陰性對照使用不添加寡核苷酸而進(jìn)行了前處理者。poly (dA) (S)及poly(dC) (S)均抑制了由B-DNA刺激所引起的IFN- β mRNA的誘導(dǎo)。特別是使用了作為嘌呤堿基的poly (dA) (S)時(shí)的IFN-PmRNA的誘導(dǎo)抑制是顯著的。另外，15聚體以上長度的硫代磷酸寡核苷酸的IFN- β mRNA誘導(dǎo)抑制效果較大。(阻礙核酸識別受體信號的非免疫原性寡脫氧核苷酸的探索)(各種寡脫氧核苷酸(ODN)的I型IFN產(chǎn)生抑制功能的比較)(實(shí)施例49)有報(bào)告指出，當(dāng)通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法將poly (dA:dT) / (dT:dA)(采用B型結(jié)構(gòu)的dsDNA,以下稱作“B-DNA”)、作為dsRNA的poly (I:C)導(dǎo)入至小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)的細(xì)胞內(nèi)時(shí)，會產(chǎn)生I型IFN (IFN-α/β )及炎癥性細(xì)胞因子。因此，首先以利用核酸刺激導(dǎo)致的I型IFN產(chǎn)生量為指標(biāo)，探討在培養(yǎng)基中預(yù)先添加ODN (以下稱作“0DN前處理”)所導(dǎo)致的免疫應(yīng)答抑制。對于在核酸刺激的I小時(shí)前進(jìn)行了或未進(jìn)行利用各種ODN的前處理的情況，使用ELISA對MEF中的I型IFN產(chǎn)生量進(jìn)行定量。結(jié)果是，在前處理中使用CpG-BCS),CpG-Rev CS),CpG-M (S)、CpG 0DN1018 (S)、0DN 1019 (S)時(shí)，依賴于培養(yǎng)基中的 ODN濃度上升，抑制了 I型IFN的產(chǎn)生。另外，沒有堿基、僅由硫代磷酸酯骨架構(gòu)成的ODN (PS)與利用具有上述堿基的ODN進(jìn)行前處理的情況相比，I型IFN產(chǎn)生抑制能力更低。將結(jié)果示于圖52。更詳細(xì)地說，在MEF 中，在利用各種 ODN (CpG-B (S)、CpG-Rev (S)、CpG-M (S)、CpG ODN 1018 (S)、0DN 1019 (S)、PS)的前處理的 I 小時(shí)后，利用 5 μ g/mL B-DNA (A-F)或5 μ g/mL polyCl:C)(G_L)進(jìn)行刺激，利用ELISA對24小時(shí)后的培養(yǎng)液上清中的IFN-β進(jìn)行定量。使用各自獨(dú)立的2個(gè)樣品，示出平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖52中，表示P <0.05、
表示P < 0.01，表示在CpG-M (S) ( + )和CpG-M (S) (_)的值間存在顯著性差異。(實(shí)施例50)探討蛋白質(zhì)的合成障礙是由ODN產(chǎn)生免疫應(yīng)答抑制的原因的可能性。對于CpG-B(S)及CpG-M (S)，使用定量RT-PCR探討MEF中的I型IFN及炎癥性細(xì)胞因子的mRNA的誘導(dǎo)。結(jié)果如圖53所示，當(dāng)將CpG-B (S)或CpG-M (S)用于前處理時(shí)，I型IFN及炎癥性細(xì)胞因子均抑制了 mRNA的表達(dá)誘導(dǎo)。因此，說明這些ODN以比mRNA表達(dá)誘導(dǎo)更上游為靶進(jìn)行免疫應(yīng)答抑制。另外，當(dāng)將具有與CpG-M (S)相同的堿基序列且由磷酸二酯骨架構(gòu)成的ODN (CpG-M)用于前處理時(shí)，未見利用CpG-M (S)進(jìn)行前處理時(shí)的I型IFN及炎癥性細(xì)胞因子的表達(dá)誘導(dǎo)的抑制。更詳細(xì)地說，在MEF中，在利用各種ODN (與CpG-B (S)、CpG-M (S)、CpG-M (S)相同的序列、具有磷酸二酯骨架的ODN (CpG-M))的前處理的I小時(shí)后，將5μ g/mL B-DNA或5 μ g/mL poly (1:C)導(dǎo)入至細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行刺激。在刺激后的3、6小時(shí)后將總RNA回收，利用定量RT-PCR對(A) Ifna4、(B) IfnbU(C) I16、(D)Ccl5的mRNA誘導(dǎo)進(jìn)行定量。使用各自獨(dú)立的2個(gè)樣品，示出平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖53中，N.D.表示無法檢測。為P < 0.05，
為P <0.01，表示在與CpG-M (S) (_)的值之間具有顯著性差異。(核酸的攝入效率的解析)(實(shí)施例51)根據(jù)實(shí)施例50的解析可知，通過對MEF實(shí)施ODN前處理，可以抑制由B_DNA、poly(1:C)刺激所導(dǎo)致的IFN產(chǎn)生。對該情況，探討ODN是通過何種機(jī)制抑制了 IFN產(chǎn)生。使用B-DNA.poly (1:C)刺激細(xì)胞時(shí)，有必要通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入核酸。因此，在實(shí)施例50中考慮到了下述可能性:由于ODN阻礙了利用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染所進(jìn)行的B-DNA、poly (I:C)向細(xì)胞內(nèi)的攝入，作為結(jié)果，抑制了 IFN產(chǎn)生。因此，對于當(dāng)使5’末端經(jīng)FITC標(biāo)記的B-DNA攝入到細(xì)胞內(nèi)時(shí)、被認(rèn)為不會激活TLR9的CpG-Rev CS), CpG-M CS), ODN 1019 (S)的前處理的有無對B-DNA攝入所造成的影響進(jìn)行了探討。將結(jié)果示于圖54。在導(dǎo)入了 FITC標(biāo)記B-DNA的MEF中，使用流式細(xì)胞儀觀測FITC來源的熒光。流式細(xì)胞儀解析使用FACSCalibur(BD)進(jìn)行。在該條件下，在利用阻礙IFN產(chǎn)生的CpG-B CS), CpG-Rev CS), CpG-M (S)進(jìn)行了前處理的樣品(圖54C、D、E)中，觀測到與未處理的對照(圖54B)相比為同等程度或更強(qiáng)的熒光，可知沒有阻礙B-DNA的攝入。另一方面，在利用ODN 1019 (S)進(jìn)行了前處理的MEF (圖54F)中，與對照的細(xì)胞組(圖54B)相比，發(fā)出FITC來源的熒光的細(xì)胞更少，因此可知ODN1019 (S)阻礙了利用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染進(jìn)行的B-DNA在MEF中攝入。更詳細(xì)地說，對于不進(jìn)行利用各種ODN的前處理、未導(dǎo)入FITC標(biāo)記B-DNA的MEF(A)、僅導(dǎo)入 3μ g/mL FITC 標(biāo)記 B-DNA 的 MEF (B)及利用 ΙμΜ CpG-B(S)(C)UuM CpG-Rev(S) (D)UuM CpG-M (S) (E)UuM ODN 1019 (S) (F)進(jìn)行前處理 I 小時(shí)后導(dǎo)入 3 μ g/mLFITC標(biāo)記B-DNA的MEF，利用流式細(xì)胞儀檢測攝入到細(xì)胞內(nèi)的FITC標(biāo)記B-DNA來源的熒光。以FITC來源的熒光的熒光強(qiáng)度作為橫軸，用直方圖示出細(xì)胞數(shù)。圖54中，各框中的數(shù)值表示FITC陽性細(xì)胞在整體中所占的比例。ODN 1019 (S)是如何阻礙利用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的核酸向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)導(dǎo)入的機(jī)制是不清楚的，但這種抑制作用的解析在這里并非重點(diǎn)。因此，本說明書中，關(guān)于ODN 1019 (S)對攝入的阻礙機(jī)制不進(jìn)行更多的解析，在以下實(shí)驗(yàn)中使用與CpG-B (S)同樣地不阻礙核酸攝入的CpG-M (S)。(CpG-M (S)與HMGB蛋白質(zhì)的結(jié)合及核酸受體信號通路的抑制)(實(shí)施例52)由上述結(jié)果可知，·利用CpG-M (S)的IFN產(chǎn)生抑制并不是由于核酸的攝入阻礙所導(dǎo)致的。因此，對利用CpG-M (S)的抑制的作用點(diǎn)為何進(jìn)行了探討。著眼于與核酸識別有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子進(jìn)行了解析。已知通過B-DNA或poly (1:C)的刺激不僅可激活I(lǐng)型IFN的誘導(dǎo)、還可激活NF- κ B通路及MAP激酶通路，對通過阻礙B-DNA或poly (1:C)與HMGB蛋白質(zhì)的結(jié)合而可抑制這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活的可能性進(jìn)行了探討。對于CpG-M (S)與HMGB蛋白質(zhì)的結(jié)合，使用體外拉下分析進(jìn)行了探討。對HMGBl的重組蛋白質(zhì)進(jìn)行純化并與生物素標(biāo)記B-DNA進(jìn)行混合時(shí)，如圖55A所示，HMGBl與B-DNA結(jié)合。該結(jié)合通過添加CpG-B(S)作為競爭物而被完全阻礙。接著，探討是否能夠通過CpG-M(S)來阻礙該HMGBI與CpG-B(S)的牢固結(jié)合。如圖55B所示，將生物素標(biāo)記CpG-B (S)與HMGBl蛋白質(zhì)混合，在其中添加CpG-M (S)時(shí)，可以用量依賴性地阻礙CpG-B (S)與HMGBl的牢固結(jié)合。由于與添加未經(jīng)生物素標(biāo)記的CpG-B (S)時(shí)同等地阻礙結(jié)合，因此說明CpG-M (S)與CpG-B (S)同等程度地牢固地與HMGBl結(jié)合。另外，同時(shí)，如圖55B所示，CpG-M (S)與僅為沒有堿基的硫代磷酸酯骨架的ODN (PS)及與CpG-M (S)為相同序列并具有磷酸二酯骨架的ODN (CpG-M)相t匕，更加牢固地與HMGBl結(jié)合。更詳細(xì)地說，對HMGBl的重組蛋白質(zhì)2 μ g和終濃度為2.5 μ g/mL的生物素標(biāo)記 B-DNA，添加終濃度為 0、0.1、0.5、2.5、12.5、62.5μ g/mL 的 CpG-B (S)作為競爭物(Competitor)，進(jìn)行孵育(室溫，30分鐘)。使用鏈霉親和素結(jié)合磁性珠粒將生物素標(biāo)記B-DNA拉下,對于共沉淀的蛋白質(zhì),使用抗HMGBl抗體并利用western blotting對HMGBl進(jìn)行檢測。將結(jié)果示于圖55A。另外，對HMGBl的重組蛋白質(zhì)2μ g和終濃度為0.2μ M的生物素標(biāo)記CpG-B (S)，添加終濃度為0、1、2、4、8、16、32μΜ的未進(jìn)行生物素標(biāo)記的CpG-B(S)XpG-M (S)、僅為沒有堿基的硫代磷酸酯骨架的ODN (PS)、與CpG-M (S)為相同序列且具有磷酸二酯骨架的ODN (CpG-M)作為競爭物。使用鏈霉親和素結(jié)合磁性珠粒將生物素標(biāo)記CpG-B拉下,對于共沉淀的蛋白質(zhì),使用抗HMGBl抗體并利用western blotting對HMGBl進(jìn)行檢測。將結(jié)果示于圖55B。(實(shí)施例53)在實(shí)施例49的探討中，被認(rèn)為對HMGBl具有高結(jié)合親和性的CpG-M (S)與僅為硫代磷酸酯骨架的PS相比，利用核酸刺激的IFN誘導(dǎo)的抑制能力更強(qiáng)，在實(shí)施例50的探討中，考慮到CpG-M (S)抑制I型IFN及炎癥性細(xì)胞因子的mRNA誘導(dǎo)、而CpG-M并不抑制，認(rèn)為是否是由于利用CpG-M (S)的免疫應(yīng)答抑制作用通過CpG-M (S)與HMGB蛋白質(zhì)牢固地結(jié)合而阻礙了由于免疫原性核酸與HMGB蛋白質(zhì)的結(jié)合所導(dǎo)致的與下游免疫受體的結(jié)合及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。根據(jù)該假說，CpG-M (S)的抑制作用不僅止于I型IFN的誘導(dǎo)，還波及到NF-κ B和MAP激酶的激活通路。因此，接著對CpG-M (S)對利用核酸刺激的這些轉(zhuǎn)錄因子或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的激活的抑制作用進(jìn)行了探討。據(jù)報(bào)道，在利用B-DNA或poly(1:C)等核酸刺激的I型IFN的誘導(dǎo)中，作為轉(zhuǎn)錄因子的IFN regulatory factor 3 (干擾素調(diào)節(jié)因子3、IRF3)發(fā)揮著重要的作用。已知IRF3在無刺激時(shí)作為單體存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而通過磷酸化等受到激活時(shí)，則形成均二聚體移向核內(nèi)。因此，以磷酸化為指標(biāo)探討了 IRF3的激活。將結(jié)果示于圖56?？芍煤怂岽碳さ腎RF3的磷酸化通過CpG-M (S)的前處理而被顯著抑制。接著，以I κ Ba的磷酸化為指標(biāo)探討了 NF-κ B通路的激活,還以c-Jun N-terminal kinase (c_Jun氨基末端激酶、JNK)、p38的磷酸化為指標(biāo)探討了 MAP激酶通路的激活。結(jié)果可知，通過CpG-M (S)的前處理，這些轉(zhuǎn)錄因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的激活也還是顯著減弱。由以上結(jié)果教導(dǎo)了 =CpG-M (S)通過與HMGB蛋白質(zhì)相結(jié)合，阻礙了 B-DNA或poly (1:C)與HMGB蛋白質(zhì)的結(jié)合，抑制了利用它們的固有免疫受體刺激所產(chǎn)生的信號通路。更詳細(xì)地說，對于進(jìn)行了或未進(jìn)行利用ΙμΜ CpG-M (S)的I小時(shí)前處理的C57BL/6J 小鼠來源的 MEF，將 lyg/mL B-DNA (A)或 I μ g/mL poly (I:C) (B)導(dǎo)入至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行刺激。將刺激后0.5、1、1.5、2、3、4小時(shí)后的蛋白質(zhì)樣品回收，通過westernblotting 檢測 IRF3、I κ Ba、JNK、p38 的磷酸化(P-1RF3、ρ_Ι κ Ba、p-JNK、ρ-ρ38)。(CpG-M (S)抑制作用中TLR9的相關(guān)性的探討)(實(shí)施例54)
由上述結(jié)果可知，CpG-M (S)對B-DNA在細(xì)胞內(nèi)的攝入并無影響，而是阻礙細(xì)胞內(nèi)核酸識別受體下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。這強(qiáng)烈教導(dǎo)了 CpG-M(S)以HMGB蛋白質(zhì)為靶抑制了免疫應(yīng)答。然而，CpG-M (S)具有與作為TLR9激動劑的CpG-B (S)僅I個(gè)堿基不同的序列。因此，對于在TLR9所表達(dá)的細(xì)胞種類中CpG-M (S)是否仍能抑制核酸刺激所導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)的激活進(jìn)行了探討。另外，對于CpG-M (S)自身被TLR9識別而作為激動劑發(fā)揮作用的可能性進(jìn)行了探討。使用Tlr9基因缺損(Τ1Γ9+)小鼠及對照(Tlr9+/_)小鼠來源的cDC探討了針對細(xì)胞內(nèi)核酸刺激的應(yīng)答是否被CpG-M (S)前處理所抑制。如圖57所示，當(dāng)利用B-DNA或poly (1:C)刺激這些小鼠來源的cDC時(shí)，在兩種cDC中同等地誘導(dǎo)了 I型IFN及炎癥性細(xì)胞因子的基因的表達(dá)。此時(shí)，通過CpG-M (S)的前處理，在Tlr9+/_cDC、TIrg+cDC的任一情況下均抑制了 I型IFN及炎癥性細(xì)胞因子基因的表達(dá)誘導(dǎo)。由以上可知，在MEF以外的細(xì)胞種類中CpG-M (S)也抑制了核酸刺激所導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)活性。另外，該抑制作用不依賴于TLR9的信號，推測是通過比TLR9更上游的、大概是HMGB蛋白質(zhì)與CpG-M (S)的結(jié)合所引起的。進(jìn)而，在不通過B-DNA或poly (1:C)進(jìn)行刺激、僅添加CpG-M (S)時(shí)，既不會誘導(dǎo)I型IFN也不會誘導(dǎo)炎癥性細(xì)胞因子，因此可知CpG-M (S)與作為TLR9的激動劑的CpG-B (S)不同，其不具有免疫原性。更詳細(xì)地說，通過ΙμΜ CpG-M (S)對Tlr9基因缺損小鼠(ΤΙΜ+)及對照小鼠(Tlr9+/_)來源的cDC進(jìn)行前處理或者作為對照不進(jìn)行前處理，在I小時(shí)后將5μ g/mLB-DNA,5 μ g/mL poly (1:C)導(dǎo)入至細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行刺激。在刺激后的3、6小時(shí)后將總RNA回收，通過定量 RT-PCR 對(A) Ifna4、(B) IfnbU (C) 116、(D) Tnfa 的 mRNA 的誘導(dǎo)進(jìn)行定量。使用各自獨(dú)立的2個(gè)樣品，示出平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖54中，N.D.表示無法檢測。表示P < 0.05，“#”表示P < 0.01，表示在CpG-M (S) ( + )與CpG-M (S) (_)的值間具有顯著性差異。(由CpG-M(S)導(dǎo)致的TLR通路抑制的探討)(實(shí)施例55)由實(shí)施例54的結(jié)果認(rèn)為，CpG-M (S)以TLR9的更上游為靶，抑制由核酸刺激所導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)活性。因此，探討了作為識別相同核酸的膜受體的TLR7的下游信號通路是否也會同樣被CpG-M (S)所抑制。CpG-M (S)作為TLR9的激動劑不具有免疫原性。因此，使用大量表達(dá)TLR7及TLR9、且當(dāng)識別到具有作為各自配體的ssRNA、CpG基序的DNA時(shí)則產(chǎn)生大量I型IFN的細(xì)胞pDC，探討TLR7、TLR9在核酸識別時(shí)的I型IFN誘導(dǎo)是否被CpG-M (S)所抑制。如圖58所示，當(dāng)利用作為TLR9配體的CpG-A或作為TLR7配體的poly (U)刺激PDC時(shí)，誘導(dǎo)了 IFN-α的產(chǎn)生，但該產(chǎn)生可被利用CpG-M (S)的前處理所抑制。更詳細(xì)地說，利用(A)作為TLR9配體的I μ M CpG-A, (B)作為TLR7配體的5 μ g/mL poly (U)刺激用3μΜ CpG-M (S)進(jìn)行了前處理或未進(jìn)行前處理的C57BL/6J小鼠來源的PDC，使用ELISA對24小時(shí)后培養(yǎng)上清中的IFN- α進(jìn)行定量?！?*，，表示在CpG-M (S)(_)與(+ )的數(shù)值間以P < 0.01具有顯著性差異。(實(shí)施例56)接著，使用定量RT-PCR解析I型IFN基因的表達(dá)誘導(dǎo)時(shí)，如圖59所示，在使用CpG-A, poly (U)任一者進(jìn)行刺激時(shí)，均在mRNA的水平上抑制了 I型IFN基因的表達(dá)。由此教導(dǎo)了，CpG-M (S)以利用TLR7、TLR9進(jìn)行核酸識別所共有的機(jī)制為靶，抑制了 I型IFN的誘導(dǎo)。更詳細(xì)地說，使用 定量RT-PCR對將用10 μ M CpG-M (S)進(jìn)行了前處理或未進(jìn)行前處理的C57BL/6J小鼠來源的pDC利用I μ M CpG-A進(jìn)行刺激時(shí)的(A) Ifna4、(B) Ifnbl的mRNA誘導(dǎo)進(jìn)行定量，并使用定量RT-PCR對將用10 μ M CpG-M (S)進(jìn)行了前處理或未進(jìn)行前處理的C57BL/6J小鼠來源的pDC利用5 μ g/mL poly (U)進(jìn)行刺激時(shí)的(C) Ifna4、(D)Ifnbl的mRNA誘導(dǎo)進(jìn)行定量。均使用各自獨(dú)立的2個(gè)樣品，示出平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。N.D.表示無法檢測。為 P < 0.05，“**”為 P <0.01，表示在 CpG-M (S) ( + MPCpG-M (S)(-)的值間有顯著性差異。(CpG-M (S)的核酸刺激所導(dǎo)致的獲得性免疫激活的抑制及病態(tài)模型的評價(jià))由上述結(jié)果可知，在體外CpG-M (S)顯示了固有免疫應(yīng)答抑制功能。迅速識別病原體相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns ;PAMPs)或自身組織來源的損傷相關(guān)分子模式(Damage-associated molecular patterns ;DAMPs)并進(jìn)行應(yīng)答的固有免疫在迅速排除生物體內(nèi)的非己的方面很重要。但是同時(shí)，激活獲得性免疫以引起特異性更高的免疫應(yīng)答也是固有免疫的重要作用。因此，首先以CD8+T細(xì)胞的激活為指標(biāo)探討體內(nèi)的固有免疫應(yīng)答及由此激活的獲得性免疫應(yīng)答是否可被CpG-M (S)所抑制。進(jìn)而，在利用CpG-M (S)的獲得性免疫抑制的基礎(chǔ)上，著眼于由上述結(jié)果所示的CpG-M (S)不具有免疫原性，在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis ;EAE)或敗血癥等病態(tài)模型中探討 CpG-M(S)所造成的影響。(由CpG-M(S)產(chǎn)生的抗原特異性⑶8+T細(xì)胞的激活抑制)(實(shí)施例57)
固有免疫的激活與獲得性免疫的激活密切相關(guān)。眾所周知，通過投予抗原和佐劑可激活抗原特異性的獲得性免疫，認(rèn)為佐劑激活固有免疫，在樹突細(xì)胞等中表達(dá)共刺激分子而促進(jìn)成熟化，從而促進(jìn)對T細(xì)胞的抗原提呈。很多報(bào)告指出，通過核酸和抗原的投予可引起抗原特異性的獲得性免疫，這里以使用B-DNA作為核酸、投予卵清蛋白(ovalbumin ；OVA)作為抗原時(shí)所誘導(dǎo)的OVA特異性CD8+T細(xì)胞為指標(biāo)來探討CpG-M (S)是否能夠抑制獲得性免疫的激活。在利用OVA和B-DNA對小鼠進(jìn)行免疫時(shí)，準(zhǔn)備了投予CpG-M (S)組和未投予組。在免疫后第8天制備脾細(xì)胞，使用OVA特異性MHC I類分子四聚體，利用流式細(xì)胞儀檢測與OVA特異性反應(yīng)的CD8+T細(xì)胞。如圖60所示，與僅通過OVA致敏小鼠的情況(0.97%)相比，與B-DNA —起用OVA進(jìn)行免疫時(shí)，OVA特異性⑶8+T細(xì)胞的比例(12.6%)顯著增加。此時(shí)，投予了 CpG-M (S)的小鼠中，該比例(2.41%)顯著減弱。即說明，CpG-M (S)可以抑制由核酸導(dǎo)致的獲得性免疫的激活。更詳細(xì)地說，對C57BL/6J小鼠腹腔內(nèi)投予(A)僅OVA (B-DNA (_))、(B)0VA和B-DNA (B-DNA ( + ))、或(C) OVA 和 B-DNA、進(jìn)而加有 CpG-M (S) (B-DNA ( + ).CpG-M (S)(+ ))。使用MHC I類分子四聚體，利用流式細(xì)胞儀分析8天后的脾臟中的OVA特異性CD8+T細(xì)胞的比例。圖60表示對⑶8+T細(xì)胞設(shè)門的細(xì)胞。另外，用紅框?qū)ⅱ?4陽性且MHC四聚體陽性的部分圍起來。標(biāo)記的數(shù)字表示對CD8+T細(xì)胞設(shè)門的細(xì)胞集團(tuán)中CD44陽性且MHC四聚體陽性部分的比例。(EAE 病情中的 CpG-M (S )評價(jià))(實(shí)施例58)EAE是人類多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis ;MS)的動物模型之一。MS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中自身免疫性的脫髓鞘炎癥疾病，在小鼠的EAE中，可以將髓鞘來源的肽(M0G肽35-55、Operon、以下稱作 “M0G 妝”)隨弗氏完全佐劑(complete Freund’ s adjuvant ；CFA)一起投予至正常小鼠中，通過進(jìn)行免疫使其發(fā)病。還有報(bào)告指出，MS和EAE所共有的病理觀察為B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞向中樞神`經(jīng)系統(tǒng)的浸潤及由此導(dǎo)致的神經(jīng)障礙，核酸與其病情的惡化有關(guān)。因此，考慮到通過投予CpG-M (S)是否能夠減輕EAE的病情而進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。在EAE中，通過對尾巴或四肢的麻痹等神經(jīng)障礙的嚴(yán)重程度進(jìn)行評分，可以評價(jià)自身免疫性炎癥的發(fā)展。EAE的病情得分基于表I的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。將MOG肽和CFA皮下注射至小鼠后背部進(jìn)行免疫。注射I周后開始，每隔2天投予3次CpG-M (S) (η = 4)或作為對照的PBS(η = 4)，對之后的病情進(jìn)行評價(jià)。將結(jié)果示于圖61。在CpG-M (S)投予組中，與對照組相t匕，EAE的病情顯著減輕。即表明，CpG-M (S)可以減輕EAE的病情。更詳細(xì)地說，在C57BL/6J小鼠后背部投予MOG肽及CFA的I周后開始每隔2天通過尾靜脈注射投予3次CpG-M (S) (CpG-M (S) ( + )、n = 4)或作為對照的PBS (CpG-M (S)(-)、η = 4)。圖61中以從MOG肽投予開始起算的天數(shù)為橫軸、用平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差示出各組的病情得分的經(jīng)過?！?”為卩< 0.05，“#”為卩< 0.01，“*#”SP < 0.001，表示在CpG-M (S) ( + )和CpG-M (S) (_)的值間有顯著性差異。表I
權(quán)利要求
1.一種由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑，其由選自硫代磷酸寡核苷酸及其衍生物中的I種以上的化合物構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制劑，其中，所述化合物是不含非甲基化CG序列且長度為5 100個(gè)堿基的硫代磷酸寡核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抑制劑，其中，所述化合物由序列號40所記載的堿基序列構(gòu)成，或者由下述堿基序列構(gòu)成:其是在序列號40所記載的堿基序列中缺失、取代或添加有I個(gè)或多個(gè)堿基的堿基序列，且是具有針對HMGB蛋白的結(jié)合能力的堿基序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制劑，其中，所述化合物是硫代磷酸寡核苷酸的衍生物，該衍生物為無堿基硫代磷酸酯脫氧核糖均聚體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的抑制劑，其在細(xì)胞內(nèi)阻礙激活免疫應(yīng)答的核酸與HMGB蛋白的結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的抑制劑，其中，由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活選自:抗原特異性的獲得性免疫體系、多發(fā)性硬化癥、由死細(xì)胞導(dǎo)致的過剩的免疫應(yīng)答、器官移植排斥反應(yīng)、自身免疫疾病、炎癥性腸病、過敏、敗血癥、由炎癥導(dǎo)致的腫瘤增殖以及由含核酸的病原體所引起的炎癥性疾病。
7.一種由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活的抑制用組合物，其含有權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的抑制劑及藥學(xué)上可容許的載體。
8.一種由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑或促進(jìn)劑的篩選方法，其包含: 混合步驟，其中，在待測物質(zhì)的存在下及非存在下將HMGB蛋白與標(biāo)記核酸進(jìn)行混合； 定量步驟，其中， 對與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白進(jìn)行定量；以及 判定步驟，其中，當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量少于在待測物質(zhì)的非存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)，判定該待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑，當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量多于在待測物質(zhì)的非存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)，判定該待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的促進(jìn)劑。
9.一種由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑或促進(jìn)劑的篩選方法，其包含: 放置步驟，其中，在待測物質(zhì)的存在下及非存在下將經(jīng)固相化的HMGB蛋白進(jìn)行放置； 標(biāo)記核酸接觸步驟，其中，使標(biāo)記核酸與放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白接觸； 定量步驟，其中，對與經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸進(jìn)行定量；以及 判定步驟，其中，當(dāng)與在待測物質(zhì)的存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸的量少于與在待測物質(zhì)的非存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸的量時(shí)，判定該待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制齊U，當(dāng)與在待測物質(zhì)的存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸的量多于與在待測物質(zhì)的非存在下進(jìn)行了放置步驟后的經(jīng)固相化的HMGB蛋白結(jié)合的標(biāo)記核酸的量時(shí)，判定該待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的促進(jìn)劑。
10.一種由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑或促進(jìn)劑的篩選方法，其包含: 接觸步驟，其中，在待測物質(zhì)的存在下及非存在下使經(jīng)固相化的核酸與HMGB蛋白接觸； 定量步驟，其中，對與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白進(jìn)行定量；以及判定步驟，其中，當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量少于在待測物質(zhì)的非存在下與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)，判定該待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免 疫應(yīng)答激活的抑制劑，當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量多于在待測物質(zhì) 的非存在下與經(jīng)固相化的核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)，判定該待測物質(zhì)為由HM GB蛋白介導(dǎo)的 免疫應(yīng)答激活的促進(jìn)劑。
全文摘要
本發(fā)明提供由選自硫代磷酸寡核苷酸及其衍生物的1種以上的化合物構(gòu)成的由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑以及由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑或促進(jìn)劑的篩選方法，該篩選方法包含在待測物質(zhì)的存在下及非存在下將HMGB蛋白與標(biāo)記核酸進(jìn)行混合的混合步驟；對與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白進(jìn)行定量的定量步驟；當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量少于在待測物質(zhì)的非存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)，判定該待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的抑制劑、當(dāng)在待測物質(zhì)的存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量多于在待測物質(zhì)的非存在下與標(biāo)記核酸結(jié)合的HMGB蛋白的量時(shí)、判定該待測物質(zhì)為由HMGB蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答激活的促進(jìn)劑的判定步驟。
文檔編號G01N33/50GK103096899SQ20118004444
公開日2013年5月8日 申請日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者谷口維紹, 柳井秀元 申請人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)