專利名稱：利用單個(gè)發(fā)光粒子檢測(cè)的光分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種光分析方法，其能夠使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等可檢測(cè)來(lái)自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)，檢測(cè)來(lái)自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它們的聚合體(以下將它們稱為“粒子”)、例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細(xì)胞等粒子狀的對(duì)象物、或非生物學(xué)粒子的光，來(lái)獲取在分析或解析它們的狀態(tài)(相互作用、結(jié)合/離解狀態(tài)等)時(shí)有用的信息，更詳細(xì)地說(shuō)，涉及一種能夠使用如上所述的光學(xué)系統(tǒng)個(gè)別檢測(cè)來(lái)自單個(gè)的發(fā)光的粒子的光并進(jìn)行各種光分析的方法。此外，在本說(shuō)明書中，發(fā)光的粒子(以下稱為“發(fā)光粒子”)可以是其自身發(fā)光的粒子、或附加了任意的發(fā)光標(biāo)識(shí)或發(fā)光探針的粒子中的任意一個(gè)，從發(fā)光粒子發(fā)出的光可以是螢光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、散射光等。
背景技術(shù)：
由于近年來(lái)的光計(jì)量技術(shù)的發(fā)展，使用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和還能夠進(jìn)行光子計(jì)數(shù)(單光子檢測(cè))的超高靈敏度的光檢測(cè)技術(shù)，能夠檢測(cè)/測(cè)量單光子或螢光單分子水平的微弱光。因此，提出了各種使用這樣的微弱光的計(jì)量技術(shù)對(duì)生物體分子等的特性、分子間相互作用、或結(jié)合/離解反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的裝置或方法。例如，在螢光相關(guān)分光分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如參照專利文獻(xiàn) 1-3、非專利文獻(xiàn) 1-3)中，利用激光共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)，測(cè)量來(lái)自出入樣本溶液中的微小區(qū)域(被稱為顯微鏡的激光會(huì)聚的焦點(diǎn)區(qū)域-共焦區(qū)組織)內(nèi)的熒光分子或被熒光標(biāo)識(shí)的分子(熒光分子等)的螢光強(qiáng)度，根據(jù)由該測(cè)量得到的螢光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)的值所確定的在微小區(qū)域內(nèi)螢光分子等的平均滯留時(shí)間(平移擴(kuò)散時(shí)間)和滯留的分子的個(gè)數(shù)的平均值，獲取螢光分子等的運(yùn)動(dòng)的速度或大小、濃度之類的信息，或檢測(cè)分子的構(gòu)造或大小的變化、分子的結(jié)合/離解反應(yīng)或分散/聚合之類的各種現(xiàn)象。另外，在螢光強(qiáng)度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如專利文獻(xiàn) 4、非專利文獻(xiàn)4)、光子計(jì)數(shù)直方圖(Photon Counting Histogram:PCH。例如專利文獻(xiàn)5)中，生成與FCS同樣地計(jì)量出的出入共焦區(qū)組織內(nèi)的螢光分子等的螢光強(qiáng)度的直方圖，使統(tǒng)計(jì)性的模型公式擬合該直方圖的分布，由此估算螢光分子等的固有的亮度的平均值和滯留在共焦區(qū)組織內(nèi)的分子的個(gè)數(shù)的平均值，根據(jù)這些信息估計(jì)分子的構(gòu)造或大小的變化、結(jié)合/離解狀態(tài)、分散/聚合狀態(tài)等。另外，除此以外，在專利文獻(xiàn)6、7中，提出了根據(jù)利用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)計(jì)量出的樣本溶液的螢光信號(hào)的時(shí)間經(jīng)過(guò)來(lái)檢測(cè)螢光性物質(zhì)的方法。專利文獻(xiàn)8提出了一種信號(hào)運(yùn)算處理技術(shù)，其用于使用光子計(jì)數(shù)技術(shù)計(jì)量來(lái)自流通于流式細(xì)胞儀的螢光微粒子或固定在基板上的螢光微粒子的微弱光，來(lái)檢測(cè)流體中或基板上的螢光微粒子的存在。特別是，根據(jù)FCS、FIDA等使用了利用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)進(jìn)行微小區(qū)域的螢光測(cè)量的技術(shù)的方法，需要測(cè)量的樣本與以前相比可以是極低濃度且極微量(在一次測(cè)量中使用的量至多為幾十UL左右)，測(cè)量時(shí)間也大幅縮短(在一次測(cè)量中多次反復(fù)進(jìn)行秒級(jí)時(shí)間的計(jì)量)。因而，這些技術(shù)特別是在對(duì)醫(yī)學(xué)、生物學(xué)的研究開發(fā)領(lǐng)域中經(jīng)常使用的稀少或昂貴的樣本進(jìn)行分析的情況下，或在疾病的臨床診斷、生理活性物質(zhì)的篩選等檢測(cè)體數(shù)多的情況下，期待成為與以前的生物化學(xué)方法相比能夠廉價(jià)或迅速地執(zhí)行實(shí)驗(yàn)或檢查的強(qiáng)力工具。專利文獻(xiàn)1:日本特開2005-098876專利文獻(xiàn)2:日本特開2008-292371專利文獻(xiàn)3:日本特開2009-281831專利文獻(xiàn)4:專利第4023523號(hào)專利文獻(xiàn)5:國(guó)際公開2008-080417專利文獻(xiàn)6:日本特開2007-20565專利文獻(xiàn)7:日本特開2008-116440專利文獻(xiàn)8:日本特開平4-337446號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1:金城政孝、蛋白質(zhì)核酸酶Vol.44、N0.9、1431-1438頁(yè)1999年非專利文獻(xiàn)2:F.J.Meyer-Alms> 突光相關(guān)譜(Fluorescence CorrelationSpectroscopy)、R.Rigler 編、Springer、柏林、2000 年、204-224 頁(yè)非專利文獻(xiàn)3:加藤則子及其它4名、遺傳醫(yī)學(xué)、Vol.6、N0.2,271-277頁(yè)非專利文獻(xiàn)4:卡斯柯(Kask)及其它3名、美國(guó)科學(xué)學(xué)院紀(jì)要、1999年、96卷、13756-13761 頁(yè)(P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761(1999))

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題在上述的FCS、FIDA等使用了共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)的光學(xué)分析技術(shù)中，所計(jì)量的光是從螢光單分子或多分子發(fā)出的光，但在該光的分析中，執(zhí)行時(shí)序地測(cè)量出的螢光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的自相關(guān)函數(shù)的運(yùn)算或?qū)χ狈綀D擬合之類的螢光強(qiáng)度的波動(dòng)的計(jì)算等統(tǒng)計(jì)性的處理，并非個(gè)別地參照或分析來(lái)自各個(gè)螢光分子等的光的信號(hào)。即，在這些光分析技術(shù)中，對(duì)來(lái)自多個(gè)螢光分子等的光的信號(hào)統(tǒng)計(jì)性地進(jìn)行處理，針對(duì)螢光分子等檢測(cè)統(tǒng)計(jì)平均性的特性。因而，為了在這些光分析技術(shù)中得到統(tǒng)計(jì)上有意義的結(jié)果，樣本溶液中的作為觀測(cè)對(duì)象的螢光分子等的濃度或個(gè)數(shù)密度需要在平衡狀態(tài)下是在一次的秒級(jí)長(zhǎng)度的計(jì)量時(shí)間內(nèi)能夠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)性的處理的個(gè)數(shù)的螢光分子等出入微小區(qū)域內(nèi)的水平，優(yōu)選的是在微小區(qū)域內(nèi)始終存在一個(gè)左右的螢光分子等的水平。實(shí)際上，共焦區(qū)組織的體積為IfL左右，因此，在上述的光分析技術(shù)中使用的樣本溶液中的螢光分子等的濃度典型的是InM左右或其以上，在大幅低于InM時(shí)，在共焦區(qū)組織內(nèi)不存在螢光分子等的時(shí)間產(chǎn)生而無(wú)法得到統(tǒng)計(jì)上有意義的分析結(jié)果。另一方面，在專利文獻(xiàn)6 8所記載的螢光分子等的檢測(cè)方法中，不包括螢光強(qiáng)度的波動(dòng)的統(tǒng)計(jì)性的運(yùn)算處理，即使樣本溶液中的螢光分子等小于InM也能夠檢測(cè)螢光分子等，但無(wú)法達(dá)成定量地計(jì)算出在溶液中隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的螢光分子等的濃度或個(gè)數(shù)密度之類的情況。因此，本申請(qǐng)的申請(qǐng)人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于以下的新原理的光分析技術(shù)，即能夠定量地觀測(cè)比利用FCS、FIDA等包含統(tǒng)計(jì)性處理的光分析技術(shù)對(duì)作為觀測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子的濃度或個(gè)數(shù)密度進(jìn)行處理的水平低的樣本溶液中的發(fā)光粒子的狀態(tài)或特性。在該新的光分析技術(shù)中，如果清楚地進(jìn)行描述，則與FCS、FIDA等同樣地，在使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測(cè)來(lái)自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)的情況下，一邊使作為光的檢測(cè)區(qū)域的微小區(qū)域(以下稱為“光檢測(cè)區(qū)域”)的位置在樣本溶液中移動(dòng)，即一邊通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域?qū)颖救芤簝?nèi)進(jìn)行掃描，一邊在光檢測(cè)區(qū)域包含在樣本溶液中分散且隨機(jī)地運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子時(shí)檢測(cè)從該發(fā)光粒子發(fā)出的光，由此，能夠?qū)颖救芤褐械陌l(fā)光粒子逐個(gè)地進(jìn)行個(gè)別檢測(cè)，來(lái)獲取與發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)、樣本溶液中的發(fā)光粒子的濃度或個(gè)數(shù)密度有關(guān)的信息。根據(jù)該新的光分析技術(shù)(以下稱為“掃描分子計(jì)數(shù)法”)，與FCS、FIDA等光分析技術(shù)同樣地，需要測(cè)量的樣本可以是微量的(例如幾十UL左右)，另外，測(cè)量時(shí)間短，并且與FCS、FIDA等光分析技術(shù)的情況相比，能夠檢測(cè)更低的濃度或個(gè)數(shù)密度的發(fā)光粒子的存在，定量地檢測(cè)其濃度、個(gè)數(shù)密度或其它特性。但是，在上述的掃描分子計(jì)數(shù)法中，一邊使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊進(jìn)行計(jì)量而得到的光強(qiáng)度值(或光子計(jì)數(shù)值)的時(shí)序的數(shù)據(jù)中，在觀測(cè)到相當(dāng)于來(lái)自發(fā)光粒子的光的光強(qiáng)度增大、即某個(gè)閾值以上的光的強(qiáng)度(典型的是吊鐘狀的曲線地)增大時(shí)，判定為在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)包含一個(gè)發(fā)光粒子，由此進(jìn)行一個(gè)發(fā)光粒子的存在的檢測(cè)。但是，在該結(jié)構(gòu)中，在由于樣本溶液中的發(fā)光粒子的濃度比較高而在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)暫時(shí)包含兩個(gè)以上的發(fā)光粒子從而產(chǎn)生同時(shí)觀測(cè)這些發(fā)光粒子的光的時(shí)間的情況下，即在光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上表不來(lái)自多個(gè)發(fā)光粒子的光的信號(hào)一部分在時(shí)間上重疊的情況下，難以分別對(duì)各個(gè)發(fā)光粒子區(qū)別地進(jìn)行檢測(cè)，有可能無(wú)法準(zhǔn)確地獲取發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)、或濃度、或個(gè)數(shù)密度等信息。實(shí)際上，如后面所記載的實(shí)施例所示那樣，發(fā)現(xiàn)了在樣本溶液中的發(fā)光粒子的濃度高時(shí)(約InM以上)，發(fā)光粒子的檢測(cè)個(gè)數(shù)低于根據(jù)樣本溶液中的發(fā)光粒子的濃度所預(yù)期的個(gè)數(shù)，發(fā)光粒子的檢測(cè)個(gè)數(shù)的精度惡化。通過(guò)在顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中變更激勵(lì)光的聚光狀態(tài)或針孔的直徑而縮小光檢測(cè)區(qū)域，使得暫時(shí)包含在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)實(shí)質(zhì)上始終為一個(gè)以下，由此能夠解決由該光檢測(cè)區(qū)域中暫時(shí)包含兩個(gè)以上發(fā)光粒子的狀態(tài)發(fā)生所引起的問(wèn)題，但實(shí)際上，難以進(jìn)行用于縮小光檢測(cè)區(qū)域的光學(xué)系統(tǒng)的變更和調(diào)整，另外裝置的結(jié)構(gòu)有可能變得復(fù)雜。但是，關(guān)于該點(diǎn)，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn):在光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中提高用于判別與發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)度增大的閾值時(shí)，能夠減小“表觀的光檢測(cè)區(qū)域”，能夠得到與實(shí)際減小光檢測(cè)區(qū)域的大小大致同等的作用效果。一般，在實(shí)施掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置中，從單個(gè)發(fā)光粒子釋放并到達(dá)光檢測(cè)器的光的強(qiáng)度因發(fā)光粒子在光檢測(cè)區(qū)域中的位置而不同，典型的是在發(fā)光粒子的位置位于光檢測(cè)區(qū)域的大致中心區(qū)域時(shí)，光強(qiáng)度最大(以下將光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子的光強(qiáng)度最大的位置稱為“最大強(qiáng)度點(diǎn)”)，隨著發(fā)光粒子的位置趨于接近光檢測(cè)區(qū)域的周緣，光強(qiáng)度逐漸降低。即，從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放而被檢測(cè)出的光的強(qiáng)度分布具有強(qiáng)度從最大強(qiáng)度點(diǎn)向周緣降低的大致吊鐘狀的曲線，光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)過(guò)程中的發(fā)光粒子的通過(guò)路徑越是接近光檢測(cè)區(qū)域的最大強(qiáng)度點(diǎn)，則對(duì)應(yīng)的光的信號(hào)的強(qiáng)度越高。因而，與某個(gè)閾值以上的強(qiáng)度的光的信號(hào)對(duì)應(yīng)的發(fā)光粒子的通過(guò)路徑位于包含光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的最大強(qiáng)度點(diǎn)的比光檢測(cè)區(qū)域狹小的區(qū)域內(nèi)，通過(guò)該比光檢測(cè)區(qū)域狹小的區(qū)域以外的發(fā)光粒子的光的強(qiáng)度低于上述閾值。而且，越是增大在光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上用于判別表示與發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的光的信號(hào)的閾值，則與所選擇的信號(hào)對(duì)應(yīng)的發(fā)光粒子的通過(guò)位置越是限定在更狹小的區(qū)域內(nèi)。換言之，通過(guò)增大或變更用于判別發(fā)光粒子的信號(hào)的閾值，能夠進(jìn)行“表觀的光檢測(cè)區(qū)域(即檢測(cè)發(fā)光粒子的區(qū)域、或產(chǎn)生被檢測(cè)為發(fā)光粒子的信號(hào)的信號(hào)的發(fā)光粒子通過(guò)的區(qū)域)”的縮小或調(diào)節(jié)(參照下述(注))。根據(jù)本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的見(jiàn)解，只要對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)的分析處理的校正，即使在樣本溶液中的發(fā)光粒子的濃度高時(shí)，也能夠劃定使暫時(shí)包含的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)實(shí)質(zhì)上始終為一個(gè)以下的區(qū)域，能夠個(gè)別檢測(cè)通過(guò)該區(qū)域內(nèi)的單個(gè)發(fā)光粒子，能夠高精度地獲取發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)、濃度、個(gè)數(shù)密度等信息。(注)能夠認(rèn)為發(fā)光粒子在樣本溶液中三維地均等分散，因此在移動(dòng)中的光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)包含兩個(gè)以上的發(fā)光粒子時(shí)，發(fā)光粒子的信號(hào)的峰值點(diǎn)(信號(hào)強(qiáng)度的極大點(diǎn))重疊的情況非常稀少，在大多數(shù)情況下，各個(gè)信號(hào)的峰值點(diǎn)相互錯(cuò)開，因此，重疊的信號(hào)的最大值并不比一個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)的峰值強(qiáng)度大。另外，通過(guò)表觀的光檢測(cè)區(qū)域以外的發(fā)光粒子越是遠(yuǎn)離表觀的光檢測(cè)區(qū)域，則其個(gè)數(shù)越多，但光的強(qiáng)度比通過(guò)表觀的光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子低。因而，能夠認(rèn)為即使通過(guò)與某個(gè)閾值對(duì)應(yīng)的表觀的光檢測(cè)區(qū)域外的兩個(gè)以上的發(fā)光粒子的光重疊，該光的信號(hào)的強(qiáng)度的最大值在大多數(shù)情況下低于閾值，不被檢測(cè)為發(fā)光粒子的信號(hào)，檢測(cè)為發(fā)光粒子的信號(hào)的信號(hào)在大多數(shù)情況下是通過(guò)了表觀的光檢測(cè)區(qū)域中的發(fā)光粒子的信號(hào)。這樣，本發(fā)明的一個(gè)課題是提供一種新的方法，其用于利用上述的見(jiàn)解避免在掃描分子計(jì)數(shù)法中由于在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)暫時(shí)包含多個(gè)發(fā)光粒子導(dǎo)致發(fā)光粒子的檢測(cè)個(gè)數(shù)的精度惡化。另外，本發(fā)明的另一個(gè)課題是利用上述的見(jiàn)解，在掃描分子計(jì)數(shù)法中，在樣本溶液中的發(fā)光粒子的濃度高的情況下，避免發(fā)光粒子的檢測(cè)個(gè)數(shù)的精度惡化，擴(kuò)大能夠良好地計(jì)量發(fā)光粒子的檢測(cè)個(gè)數(shù)的發(fā)光粒子的濃度范圍。用于解決問(wèn)題的方案根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)以下的方法達(dá)成上述的課題，該方法是一種光分析方法，其使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)來(lái)自在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子的光，其特征在于，包括如下步驟:通過(guò)變更顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)；一邊使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)，一邊測(cè)量來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光的強(qiáng)度，來(lái)生成光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；在光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上個(gè)別檢測(cè)表示發(fā)光粒子的光的信號(hào)，其中，在個(gè)別檢測(cè)表示發(fā)光粒子的光的信號(hào)的步驟中，選擇性地檢測(cè)具有超過(guò)閾值的強(qiáng)度的信號(hào)作為表示發(fā)光粒子的光的信號(hào)，設(shè)定上述閾值使得選擇性地檢測(cè)表示來(lái)自包含在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的比該光檢測(cè)區(qū)域狹小的區(qū)域中的發(fā)光粒子的光的信號(hào)。在該結(jié)構(gòu)中，“在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子”是指在樣本溶液中分散或溶解的原子、分子或它們的聚合體等發(fā)出光的粒子，只要是不固定在基板等上而自由地在溶液中進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)的粒子，就可以是任意的粒子。該發(fā)光粒子典型的是螢光性粒子，但也可以是通過(guò)磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等來(lái)發(fā)出光的粒子。共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測(cè)區(qū)域”是指在這些顯微鏡中檢測(cè)光的微小區(qū)域，在從物鏡提供照明光的情況下，相當(dāng)于該照明光會(huì)聚的區(qū)域(在共焦顯微鏡中，特別地根據(jù)物鏡和針孔之間的位置關(guān)系來(lái)確定。在發(fā)光粒子沒(méi)有照明光而發(fā)光的情況下，例如通過(guò)化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光來(lái)發(fā)光的粒子的情況下，在顯微鏡中不需要照明光)。另外，在本說(shuō)明書中，在“信號(hào)”這樣的情況下，只要沒(méi)有特別限定，是指表示來(lái)自發(fā)光粒子的光的信號(hào)。從上述可知，在作為本發(fā)明的基本結(jié)構(gòu)的掃描分子計(jì)數(shù)法中，首先一邊使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)，即一邊通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域掃描樣本溶液內(nèi)，一邊依次進(jìn)行光的檢測(cè)。這樣，在移動(dòng)的光檢測(cè)區(qū)域包含了隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子時(shí)，檢測(cè)來(lái)自發(fā)光粒子的光，由此，期待檢測(cè)出一個(gè)發(fā)光粒子的存在。因此，在依次檢測(cè)出的光中個(gè)別檢測(cè)來(lái)自發(fā)光粒子的光的信號(hào)，由此依次個(gè)別檢測(cè)每一個(gè)粒子的存在，獲取與粒子在溶液內(nèi)的狀態(tài)有關(guān)的各種信息。這時(shí)，在本發(fā)明中，基于以上所述的見(jiàn)解，即發(fā)光粒子的信號(hào)的強(qiáng)度因該發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的通過(guò)位置而不同這樣的見(jiàn)解，設(shè)定閾值使得選擇性地檢測(cè)表示來(lái)自包含在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的比該光檢測(cè)區(qū)域狹小的區(qū)域中的發(fā)光粒子的光的信號(hào)。根據(jù)該結(jié)構(gòu)，通過(guò)任意地變更閾值的設(shè)定，能夠調(diào)整“表觀的光檢測(cè)區(qū)域”的大小，能夠選擇性地檢測(cè)通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的任意特定區(qū)域的發(fā)光粒子的存在。另外，如已經(jīng)說(shuō)明的那樣，典型的是，從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放而被檢測(cè)出的光的強(qiáng)度分布是從發(fā)光粒子釋放而被檢測(cè)出的光的強(qiáng)度從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的最大強(qiáng)度點(diǎn)向光檢測(cè)區(qū)域的周緣降低的分布，即發(fā)光粒子的位置從最大強(qiáng)度點(diǎn)越是接近光檢測(cè)區(qū)域的周緣則光強(qiáng)度越是降低的分布(特別在發(fā)光粒子是被照射激勵(lì)光而釋放光的粒子、根據(jù)激勵(lì)光的會(huì)聚區(qū)域劃定光檢測(cè)區(qū)域的情況下，從光檢測(cè)區(qū)域中的發(fā)光粒子釋放而被檢測(cè)出的光的強(qiáng)度分布與光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的激勵(lì)光的強(qiáng)度分布一致)。因而，越是增大閾值，則能夠?qū)ⅰ氨碛^的光檢測(cè)區(qū)域”鎖定成(包含最大強(qiáng)度點(diǎn)的)越狹小的區(qū)域。另外，優(yōu)選的是在掃描分子計(jì)數(shù)法中，典型的是通過(guò)個(gè)別檢測(cè)單個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)來(lái)得到發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)、濃度等信息，因此，上述本發(fā)明的結(jié)構(gòu)中，優(yōu)選設(shè)定閾值使得暫時(shí)包含在比光檢測(cè)區(qū)域狹小的區(qū)域(表觀的光檢測(cè)區(qū)域)中的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)實(shí)質(zhì)上為一個(gè)以下。關(guān)于該點(diǎn)，例如可以基于理論上依設(shè)計(jì)估計(jì)出的光檢測(cè)區(qū)域的大小確定閾值，使得暫時(shí)包含在表觀的光檢測(cè)區(qū)域中的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)為一個(gè)以下，但通常難以高精度地確定光檢測(cè)區(qū)域的大小的理論值，因此可以通過(guò)多次反復(fù)進(jìn)行試行實(shí)驗(yàn)，來(lái)確定給出暫時(shí)包含的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)為一個(gè)以下的表觀的光檢測(cè)區(qū)域的閾值。此外，從后文所示的實(shí)施例可知，即使不將閾值設(shè)定成使暫時(shí)包含在表觀的光檢測(cè)區(qū)域中的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)為一個(gè)以下，也能夠獲取發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)、濃度等信息。在本發(fā)明中，重要的是應(yīng)該理解到能夠通過(guò)適當(dāng)?shù)卦O(shè)定閾值來(lái)適當(dāng)?shù)卦O(shè)定表觀的光檢測(cè)區(qū)域的大小這一點(diǎn)。在上述的本發(fā)明的實(shí)施方式之一中，可以對(duì)選擇性地檢測(cè)出的信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，來(lái)對(duì)包含在比光檢測(cè)區(qū)域狹小的區(qū)域(表觀的光檢測(cè)區(qū)域)中的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)(粒子的計(jì)數(shù))。在該情況下，能夠通過(guò)將檢測(cè)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)和光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)量相組合，得到與樣本溶液中的鑒定出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)密度或濃度有關(guān)的信息。具體地說(shuō)，例如可以計(jì)算多個(gè)樣本溶液的個(gè)數(shù)密度或濃度的比、或者相對(duì)于作為濃度或個(gè)數(shù)密度的基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液的相對(duì)的個(gè)數(shù)密度或濃度的比，或者使用相對(duì)于作為濃度或個(gè)數(shù)密度的基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液的相對(duì)的個(gè)數(shù)密度或濃度的比確定絕對(duì)的個(gè)數(shù)密度值或濃度值。或者，只要通過(guò)任意的方法、例如以規(guī)定的速度移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置等確定出光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡的全部體積和/或表觀的光檢測(cè)區(qū)域的全部體積，就能夠具體地估算出發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)密度或濃度。另外，作為本發(fā)明的另一個(gè)方式，也能夠基于從光檢測(cè)區(qū)域中的發(fā)光粒子釋放而被檢測(cè)出的光的強(qiáng)度分布，根據(jù)通過(guò)粒子的計(jì)數(shù)確定出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)，計(jì)算在設(shè)定了與進(jìn)行該粒子的計(jì)數(shù)時(shí)的閾值不同的其它閾值的情況下應(yīng)該檢測(cè)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)。如后文的具體實(shí)施方式
部分所記載的那樣，能夠根據(jù)通過(guò)粒子的計(jì)數(shù)確定出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)近似地確定從光檢測(cè)區(qū)域中的發(fā)光粒子釋放而被檢測(cè)出的光的強(qiáng)度分布。而且，當(dāng)確定了從光檢測(cè)區(qū)域中的發(fā)光粒子釋放而被檢測(cè)出的光的強(qiáng)度分布時(shí)，能夠預(yù)測(cè)與任意的閾值對(duì)應(yīng)的表觀的光檢測(cè)區(qū)域的大小。能夠認(rèn)為通過(guò)表觀的光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)與該表觀的光檢測(cè)區(qū)域的大小成比例，因此根據(jù)與進(jìn)行粒子的計(jì)數(shù)時(shí)的閾值對(duì)應(yīng)的表觀的光檢測(cè)區(qū)域的大小和與其它閾值對(duì)應(yīng)的表觀的光檢測(cè)區(qū)域的大小之比，計(jì)算出在設(shè)定了其它閾值時(shí)應(yīng)該檢測(cè)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)。當(dāng)?shù)玫搅嗽谠O(shè)定了與進(jìn)行該粒子的計(jì)數(shù)時(shí)的閾值不同的其它閾值的情況下應(yīng)該檢測(cè)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)時(shí)，容易比較使用互不相同的閾值檢測(cè)出的粒子的個(gè)數(shù)，在得到與發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)密度或濃度等有關(guān)的信息時(shí)有利。此外，可以使用在設(shè)定了與進(jìn)行粒子的計(jì)數(shù)時(shí)的閾值不同的其它閾值的情況下應(yīng)該檢測(cè)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)，確定發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)密度或濃度。進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的再一個(gè)方式，也可以在設(shè)定閾值使得暫時(shí)包含在比光檢測(cè)區(qū)域狹小的區(qū)域中的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)實(shí)質(zhì)上為一個(gè)以下的情況下，檢測(cè)選擇性地檢測(cè)出的表示來(lái)自發(fā)光粒子的光的信號(hào)的個(gè)數(shù)為規(guī)定個(gè)數(shù)的閾值，根據(jù)檢測(cè)出的閾值的大小確定發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)密度或濃度。如后文的具體實(shí)施方式
部分所記載的那樣，根據(jù)選擇性地檢測(cè)出的信號(hào)個(gè)數(shù)和表觀的光檢測(cè)區(qū)域的大小而給出發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)密度或濃度，其中，信號(hào)個(gè)數(shù)和表觀的光檢測(cè)區(qū)域的大小都是閾值的函數(shù)(閾值越高，則信號(hào)個(gè)數(shù)和表觀的光檢測(cè)區(qū)域的大小均越降低)，能夠通過(guò)從光檢測(cè)區(qū)域中的發(fā)光粒子釋放而被檢測(cè)出的光的強(qiáng)度分布的參數(shù)來(lái)表示表觀的光檢測(cè)區(qū)域的大小。因而，能夠通過(guò)閾值、從光檢測(cè)區(qū)域中的發(fā)光粒子釋放而被檢測(cè)出的光的強(qiáng)度分布的參數(shù)以及選擇性地檢測(cè)出的信號(hào)個(gè)數(shù)，來(lái)表示發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)密度或濃度，只要檢測(cè)出給出某個(gè)選擇性地檢測(cè)出的信號(hào)個(gè)數(shù)的閾值，就能夠確定發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)密度或濃度。實(shí)際上，根據(jù)后文記載的實(shí)驗(yàn)例，可知能夠根據(jù)給出某個(gè)選擇性地檢測(cè)出的信號(hào)個(gè)數(shù)的閾值來(lái)確定發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)密度或濃度。該方式能夠在掃描分子計(jì)數(shù)法中有利于檢測(cè)任意的樣本溶液中的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)密度或濃度地進(jìn)行使用。關(guān)于上述的本發(fā)明的結(jié)構(gòu)中的使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的步驟，可以根據(jù)發(fā)光粒子的特性或樣本溶液中的個(gè)數(shù)密度或濃度，適當(dāng)?shù)刈兏鼧颖救芤簝?nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。從發(fā)光粒子檢測(cè)出的光的形態(tài)能夠根據(jù)其特性或樣本溶液中的個(gè)數(shù)密度或濃度而變化。特別當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度變快時(shí)，從一個(gè)發(fā)光粒子所能得到的光量降低，因此優(yōu)選的是適當(dāng)?shù)刈兏鈾z測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度，使得能夠高精度或高靈敏度地計(jì)量來(lái)自一個(gè)發(fā)光粒子的光。進(jìn)一步地，關(guān)于上述的使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的步驟，優(yōu)選的是將樣本溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定得比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度(由布朗運(yùn)動(dòng)造成的粒子的平均移動(dòng)速度)高。如上述說(shuō)明的那樣，在本發(fā)明的方法中，光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)從一個(gè)發(fā)光粒子發(fā)出的光，來(lái)個(gè)別檢測(cè)發(fā)光粒子。但是，發(fā)光粒子由于在溶液中進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)而隨機(jī)地移動(dòng)，在多次出入光檢測(cè)區(qū)域的情況下，有可能從一個(gè)發(fā)光粒子多次檢測(cè)(表示其存在的)信號(hào)，難以使檢測(cè)出的信號(hào)與一個(gè)發(fā)光粒子的存在對(duì)應(yīng)起來(lái)。因此，如上所述，將光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度設(shè)定得比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度高，由此能夠使一個(gè)發(fā)光粒子與一個(gè)信號(hào)相對(duì)應(yīng)。此外，擴(kuò)散移動(dòng)速度因發(fā)光粒子的不同而變化，因此如上所述，優(yōu)選的是根據(jù)發(fā)光粒子的特性(特別是擴(kuò)散系數(shù))適當(dāng)?shù)刈兏鈾z測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度。可以以任意的方式進(jìn)行光學(xué)系統(tǒng)的光路的變更以移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置。例如可以使用在激光掃描型光學(xué)顯微鏡中采用的檢電鏡變更光路，來(lái)變更光檢測(cè)區(qū)域的位置?？梢匀我獾卦O(shè)定光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡，例如可以從圓形、橢圓形、矩形、直線以及曲線中選擇。此外，在本發(fā)明中，構(gòu)成為變更光學(xué)系統(tǒng)的光路使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)，由此光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)迅速，并且在樣本溶液中實(shí)質(zhì)上不發(fā)生機(jī)械振動(dòng)、流體力學(xué)的作用，因此樣本溶液中的發(fā)光粒子不會(huì)受到力學(xué)作用的影響，能夠在(沒(méi)有偽像的狀態(tài)且)穩(wěn)定的狀態(tài)下進(jìn)行光的計(jì)量(例如在使樣本發(fā)生流動(dòng)的情況下，難以始終賦以一樣的流速，并且裝置結(jié)構(gòu)復(fù)雜，另外所需要的樣本量大幅增加，并且由于流動(dòng)所造成的流體力學(xué)的作用而溶液中的發(fā)光粒子或其它物質(zhì)有可能變質(zhì)或變性)。另外，不需要構(gòu)成為使樣本溶液流通，因此能夠與FCS、FIDA等的情況同樣地在微量(IuL 幾十y L左右)的樣本溶液中進(jìn)行計(jì)量和分析。應(yīng)該理解為:本發(fā)明的方法典型地用于分析或解析蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細(xì)胞等粒子狀的生物學(xué)對(duì)象物在溶液中的狀態(tài)，但也可以用于分析或解析非生物學(xué)的粒子(例如原子、分子、膠束(micelles)、金屬膠體等)在溶液中的狀態(tài)，這樣的情況也屬于本發(fā)明的范圍。發(fā)明效果總之，在本發(fā)明的方法中，在掃描分子計(jì)數(shù)法中，發(fā)光粒子的信號(hào)的強(qiáng)度因該發(fā)光粒子在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的通過(guò)位置而不同，因此著眼于能夠通過(guò)變更用于判別發(fā)光粒子的信號(hào)的閾值的設(shè)定來(lái)調(diào)整“表觀的光檢測(cè)區(qū)域”的大小這一點(diǎn)，嘗試通過(guò)適當(dāng)?shù)卦O(shè)定閾值，由此劃定“表觀的光檢測(cè)區(qū)域”(光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的比該光檢測(cè)區(qū)域狹小的區(qū)域)，選擇性地檢測(cè)表示來(lái)自包含在該“表觀的光檢測(cè)區(qū)域”中的發(fā)光粒子的光的信號(hào)。根據(jù)本發(fā)明的結(jié)構(gòu)，在發(fā)光粒子的信號(hào)檢測(cè)中所參照的區(qū)域(表觀的光檢測(cè)區(qū)域)與實(shí)際的光檢測(cè)區(qū)域相比相對(duì)狹小，因此包含在該區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)為兩個(gè)以上的可能性比實(shí)際的光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)為兩個(gè)以上的可能性低，因此能夠更準(zhǔn)確地計(jì)量單個(gè)發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)，獲取與發(fā)光粒子的濃度或個(gè)數(shù)密度等有關(guān)的信息。因而，即使在樣本溶液中的發(fā)光粒子的濃度比較高、從而實(shí)際的光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)為兩個(gè)以上的可能性變高的情況下，也能夠通過(guò)適當(dāng)?shù)卦O(shè)定閾值來(lái)實(shí)現(xiàn)在發(fā)光粒子的信號(hào)檢測(cè)中所參照的區(qū)域內(nèi)暫時(shí)包含的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)為一個(gè)以下的狀態(tài)，因此，能夠個(gè)別檢測(cè)單個(gè)發(fā)光粒子，對(duì)其個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，或者獲取與濃度或個(gè)數(shù)密度等有關(guān)的信息。換言之，根據(jù)本發(fā)明，能夠使可高精度地應(yīng)用掃描分子計(jì)數(shù)法的發(fā)光粒子的濃度范圍或個(gè)數(shù)密度范圍擴(kuò)大到高濃度或高密度側(cè)。這樣，根據(jù)本發(fā)明的方法，期待擴(kuò)大能夠利用掃描分子計(jì)數(shù)法的樣本溶液的范圍，擴(kuò)大分子間相互作用的觀測(cè)和分析等掃描分子計(jì)數(shù)法的應(yīng)用范圍。通過(guò)以下的本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的說(shuō)明，能夠了解本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)。


圖1的(A)是執(zhí)行本發(fā)明的方法的光分析裝置的內(nèi)部構(gòu)造的示意圖。圖1的(B)是共焦區(qū)組織(共焦顯微鏡的觀察區(qū)域)的示意圖。圖1的(C)是變更反射鏡7的朝向使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的機(jī)構(gòu)的示意圖。圖2的(A)、⑶分別是說(shuō)明應(yīng)用本發(fā)明的方法的掃描分子計(jì)數(shù)法中的光檢測(cè)的原理的示意圖和所計(jì)量的光強(qiáng)度的時(shí)間變化的示意圖。圖3是說(shuō)明依照本發(fā)明的方法通過(guò)適當(dāng)?shù)卦O(shè)定用于判別發(fā)光粒子的信號(hào)的閾值來(lái)設(shè)定表觀的光檢測(cè)區(qū)域的原理的圖。(A)是從顯微鏡的光的行進(jìn)方向觀察到的光檢測(cè)區(qū)域的截面的示意圖，示意性地示出在光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)暫時(shí)包含兩個(gè)以上的發(fā)光粒子的狀態(tài)。(B)是在(A)的情況下計(jì)量的時(shí)序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的例子的示意圖。(C)是說(shuō)明從光檢測(cè)區(qū)域中的發(fā)光粒子釋放而被檢測(cè)出的光的強(qiáng)度分布、閾值以及表觀的光檢測(cè)區(qū)域之間的關(guān)系的圖。左上是從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放而被檢測(cè)出的光的強(qiáng)度分布，右下是光檢測(cè)區(qū)域CV、表觀的光檢測(cè)區(qū)域qCVl、qCV2的示意立體圖，左下是從光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)方向觀察到的光檢測(cè)區(qū)域CV、表觀的光檢測(cè)區(qū)域qCVl、qCV2的示意截面圖。圖4是以流程圖的形式表示依照本發(fā)明的方法執(zhí)行的掃描分子計(jì)數(shù)法的處理步驟的圖。圖5的(A)、(B)分別是表示在發(fā)光粒子一邊進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)一邊橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)、和在由于以比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度使樣本溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)而發(fā)光粒子橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的粒子的運(yùn)動(dòng)的方式的模型圖。圖5的(C)是說(shuō)明用于依照掃描分子計(jì)數(shù)法根據(jù)所計(jì)量的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(光子計(jì)數(shù)的時(shí)間變化)檢測(cè)發(fā)光粒子的存在的處理步驟中的檢測(cè)信號(hào)的信號(hào)處理過(guò)程的例子的圖。圖6示出所計(jì)量的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的實(shí)測(cè)例子(直方圖表)、對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理而得到的曲線(虛線)以及在脈沖存在區(qū)域中擬合的高斯函數(shù)(實(shí)線)。在圖中，附加為“噪聲”的信號(hào)作為由噪聲或異物造成的信號(hào)而被忽略。圖7是通過(guò)依照本發(fā) 明的方法執(zhí)行的掃描分子計(jì)數(shù)法(實(shí)施例1)針對(duì)包含各種濃度的發(fā)光粒子的樣本溶液計(jì)量出的被檢測(cè)為發(fā)光粒子的信號(hào)的脈沖數(shù)的圖表。(A)、(B)分別是針對(duì)發(fā)光粒子的濃度繪制在檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)時(shí)設(shè)定為閾值=0.5(pC/10i!S)(在10 ys期間檢測(cè)出的光子個(gè)數(shù))以及閾值=2.0 (pc/10 ys)的情況下的脈沖數(shù)所得到的圖，(C)是針對(duì)發(fā)光粒子的濃度繪制各種閾值下的脈沖數(shù)所得到的圖(橫軸和縱軸是對(duì)數(shù))。圖8的(A)是根據(jù)閾值與發(fā)光粒子的信號(hào)數(shù)之間的關(guān)系得到的從光檢測(cè)區(qū)域中的發(fā)光粒子釋放而被檢測(cè)出的光的強(qiáng)度分布，圖8的(B)是針對(duì)發(fā)光粒子的濃度繪制根據(jù)圖8的(A)的光的強(qiáng)度分布將設(shè)定高的閾值所得到的發(fā)光粒子的脈沖數(shù)換算為設(shè)定低的閾值時(shí)應(yīng)該得到的脈沖數(shù)的情況下的脈沖數(shù)所得到的圖。圖9是針對(duì)發(fā)光粒子的濃度繪制脈沖數(shù)為20時(shí)的閾值所得到的圖。圖中，黑點(diǎn)是閾值，實(shí)線是針對(duì)閾值的擬合曲線。圖10是在現(xiàn)有的計(jì)算螢光強(qiáng)度的波動(dòng)的光分析技術(shù)中得到的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化的例子，(A)是樣本內(nèi)的粒子的濃度為能夠提供足夠的計(jì)量精度的程度的情況，(B)是樣本內(nèi)的粒子的濃度相比于(A)的情況大幅降低的情況。附圖標(biāo)記說(shuō)明1:光分析裝置(共焦顯微鏡)；2:光源；3:單模光纖；4:準(zhǔn)直透鏡；5、14a:分色鏡；6、7、11:反射鏡；8:物鏡；9:微板；10:皿(樣本溶液容器)；12:聚光鏡；13:針孔；14:屏蔽濾波器；15:多模光纖；16:光檢測(cè)器；17:反射鏡偏轉(zhuǎn)器；17a:臺(tái)位置變更裝置；18:計(jì)算機(jī)。
具體實(shí)施例方式以下，詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。光分析裝置的結(jié)構(gòu)本發(fā)明的方法能夠通過(guò)如下的光分析裝置來(lái)實(shí)現(xiàn):在基本結(jié)構(gòu)中，如圖1的(A)示意性地示例那樣，由能夠執(zhí)行FCS、FIDA等的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光檢測(cè)器組合而成。參照?qǐng)D1的(A)，光分析裝置I由光學(xué)系統(tǒng)2 17以及用于控制光學(xué)系統(tǒng)的各部的動(dòng)作并且獲取并解析數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)18構(gòu)成。光分析裝置I的光學(xué)系統(tǒng)可以與普通的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)相同，在此，使從光源2發(fā)射并在單模光纖3內(nèi)傳播的激光(Ex)在光纖的出射端成為以由固有的NA決定的角度發(fā)散的光而被發(fā)射，通過(guò)準(zhǔn)直器4成為平行光，被分色鏡5、反射鏡6、7反射，入射到物鏡8。典型的是在物鏡8的上方配置有微板9，該微板9排列有注入了 I U L 幾十U L的樣本溶液的樣本容器或皿10，從物鏡8射出的激光在該樣本容器或皿10內(nèi)的樣本溶液中形成焦點(diǎn)，形成光強(qiáng)度強(qiáng)的區(qū)域(激勵(lì)區(qū)域)。在樣本溶液中分散或溶解有作為觀測(cè)對(duì)象物的發(fā)光粒子，典型的是附加有螢光色素等發(fā)光標(biāo)識(shí)的分子，當(dāng)發(fā)光粒子進(jìn)入到激勵(lì)區(qū)域時(shí)，在其間激勵(lì)發(fā)光粒子而釋放出光。所釋放的光(Em)通過(guò)物鏡
8、分色鏡5，被反射鏡11反射而在聚光鏡12聚光，通過(guò)針孔13。此外，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的那樣，針孔13配置在與物鏡8的焦點(diǎn)位置共軛的位置，由此僅從如圖1的⑶示意性地表示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域、即激勵(lì)區(qū)域內(nèi)發(fā)出的光通過(guò)針孔13，遮斷來(lái)自焦點(diǎn)面以外的光。圖1的(B)所例示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域通常是具有IfL IOfL左右的有效體積的本光分析裝置中的光檢測(cè)區(qū)域，被稱為共焦區(qū)組織。在共焦區(qū)組織中，典型的是光強(qiáng)度以區(qū)域中心為頂點(diǎn)的高斯型分布或洛侖茲型分布，其有效體積是將光強(qiáng)度為1/e2的面作為邊界的大致橢圓球體的體積。這樣，通過(guò)了針孔13的光經(jīng)過(guò)分色鏡14a，透過(guò)屏蔽濾波器14(在此只選擇特定波長(zhǎng)頻帶的光成分)，被導(dǎo)入到多模光纖15，到達(dá)對(duì)應(yīng)的光檢測(cè)器16，在被轉(zhuǎn)換成時(shí)序的電信號(hào)后，輸入到計(jì)算機(jī)18，以后面說(shuō)明的方式進(jìn)行用于光分析的處理。作為光檢測(cè)器16，優(yōu)選的是使用能夠在光子計(jì)數(shù)中使用的超高靈敏度的光檢測(cè)器，由此，能夠檢測(cè)來(lái)自一個(gè)發(fā)光粒子的光、例如來(lái)自一個(gè)或多個(gè)螢光色素分子的微弱光。另外，在上述的光分析裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，還設(shè)置有用于變更光學(xué)系統(tǒng)的光路來(lái)通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域掃描樣本溶液內(nèi)、即使焦點(diǎn)區(qū)域(即光檢測(cè)區(qū)域)的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的機(jī)構(gòu)。作為該用于使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的機(jī)構(gòu)，例如如圖1的(C)示意性地例示的那樣，可以采用變更反射鏡7的朝向的反射鏡偏轉(zhuǎn)器17。該反射鏡偏轉(zhuǎn)器17可以與在通常的激光掃描型顯微鏡中裝備的檢電鏡裝置相同。另外，為了實(shí)現(xiàn)所希望的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)圖案，在計(jì)算機(jī)18的控制下與光檢測(cè)器16所進(jìn)行的光檢測(cè)協(xié)調(diào)地驅(qū)動(dòng)反射鏡偏轉(zhuǎn)器17?？梢詮膱A形、橢圓形、矩形、直線、曲線或它們的組合中任意地選擇光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡(可以使得在計(jì)算機(jī)18中的程序中能夠選擇各種移動(dòng)圖案)。此外，雖然沒(méi)有圖示，但也可以通過(guò)使物鏡8上下移動(dòng)來(lái)使光檢測(cè)區(qū)域的位置在上下方向上移動(dòng)。如上所述，根據(jù)不是移動(dòng)樣本溶液而是變更光學(xué)系統(tǒng)的光路使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的結(jié)構(gòu)，在樣本溶液內(nèi)不會(huì)實(shí)質(zhì)地產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)、流體力學(xué)作用，能夠排除力學(xué)作用對(duì)觀測(cè)對(duì)象物的影響，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的計(jì)量。此外，作為追加的結(jié)構(gòu)，也可以在顯微鏡的臺(tái)(未圖示)設(shè)置用于移動(dòng)微板9的水平方向位置的臺(tái)位置變更裝置17a，以變更所觀察的皿10?？梢杂捎?jì)算機(jī)18控制臺(tái)位置變更裝置17a的動(dòng)作。在發(fā)光粒子通過(guò)多光子吸收而發(fā)光的情況下，上述光學(xué)系統(tǒng)被用作多光子顯微鏡。在該情況下，只在激勵(lì)光的焦點(diǎn)區(qū)域(光檢測(cè)區(qū)域)釋放光，因此可以去除針孔13。在發(fā)光粒子通過(guò)磷光或散射而發(fā)光的情況下，能夠直接使用上述的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。另外，在發(fā)光粒子通過(guò)化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光現(xiàn)象而與激勵(lì)光無(wú)關(guān)地發(fā)光的情況下，可以省略用于生成激勵(lì)光的光學(xué)系統(tǒng)2 5。進(jìn)一步地，可以在光分析裝置I中如圖示那樣設(shè)置多個(gè)激勵(lì)光源2，可以使得能夠根據(jù)激勵(lì)發(fā)光粒子的光的波長(zhǎng)而適當(dāng)?shù)剡x擇激勵(lì)光的波長(zhǎng)。同樣地，也可以具備多個(gè)光檢測(cè)器16，在樣本中包含波長(zhǎng)不同的多種發(fā)光粒子的情況下，可以使得能夠根據(jù)波長(zhǎng)分別檢測(cè)來(lái)自這些發(fā)光粒子的光。本發(fā)明的方法的原理如發(fā)明內(nèi)容所記載的那樣，本發(fā)明的方法如果清楚地進(jìn)行描述，則如上所述，在共焦顯微鏡(或多光子顯微鏡)進(jìn)行光檢測(cè)時(shí)，發(fā)光粒子的信號(hào)的強(qiáng)度因該發(fā)光粒子在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置而不同，基于通過(guò)設(shè)定用于判別發(fā)光粒子的信號(hào)的閾值來(lái)使“表觀的光檢測(cè)區(qū)域”的大小變化這樣的原理，在掃描分子計(jì)數(shù)法中，通過(guò)適當(dāng)?shù)卦O(shè)定閾值來(lái)調(diào)整“表觀的光檢測(cè)區(qū)域”的大小。而且，優(yōu)選的是，設(shè)定用于判別發(fā)光粒子的信號(hào)的閾值，使得暫時(shí)包含在“表觀的光檢測(cè)區(qū)域”內(nèi)的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)為一個(gè)以下，即使得被檢測(cè)為發(fā)光粒子信號(hào)的信號(hào)各自與單個(gè)發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)，或者使得可靠地個(gè)別檢測(cè)單個(gè)發(fā)光粒子，在該狀態(tài)下對(duì)通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域掃描樣本溶液內(nèi)的期間的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，試著以更高精度獲取發(fā)光粒子的濃度或個(gè)數(shù)密度等信息。以下，說(shuō)明掃描分子計(jì)數(shù)法和本發(fā)明的方法的原理。1.掃描分子計(jì)數(shù)法的原理FCS、FIDA等分光分析技術(shù)與現(xiàn)有的生物化學(xué)的分析技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)在于所需要的樣本量極少且能夠迅速地執(zhí)行檢查。但是，在FCS、FIDA等分光分析技術(shù)中，在原理上，根據(jù)螢光強(qiáng)度的波動(dòng)來(lái)計(jì)算發(fā)光粒子的濃度、特性，因此為了得到高精度的測(cè)量結(jié)果，要求如圖10的(A)示意性地描繪的那樣樣本溶液中的發(fā)光粒子的濃度或個(gè)數(shù)密度在計(jì)量螢光強(qiáng)度的過(guò)程中始終是在光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)存在一個(gè)左右的發(fā)光粒子的水平，如該圖的右側(cè)所示那樣在計(jì)量時(shí)間中始終檢測(cè)到有意義的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))。在發(fā)光粒子的濃度或個(gè)數(shù)密度更低的情況下，例如如圖10的(B)所描繪的那樣，在發(fā)光粒子只是偶爾進(jìn)入到光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)的水平的情況下，如該圖的右側(cè)所示例的那樣，只在計(jì)量時(shí)間的一部分內(nèi)出現(xiàn)有意義的光強(qiáng)度的信號(hào)(光子計(jì)數(shù))，難以高精度地計(jì)算出光強(qiáng)度的波動(dòng)。另外，在與計(jì)量中始終是在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)存在一個(gè)左右的發(fā)光粒子的水平相比發(fā)光粒子的濃度大幅降低的情況下，在光強(qiáng)度的波動(dòng)的運(yùn)算中，容易受到背景的影響，為了得到足夠進(jìn)行運(yùn)算的量的有意義的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)而計(jì)量時(shí)間變長(zhǎng)。因此，本申請(qǐng)的申請(qǐng)人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于以下的新原理的“掃描分子計(jì)數(shù)法”:即使在發(fā)光粒子的濃度低于如上所述的在FCS、FIDA等分光分析技術(shù)中要求的水平的情況下，也能夠檢測(cè)發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)密度或濃度等特性。
作為在掃描分子計(jì)數(shù)法中執(zhí)行的處理，如果清楚地描述，則驅(qū)動(dòng)用于使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的機(jī)構(gòu)(反射鏡偏轉(zhuǎn)器17)來(lái)變更光路，如在圖2中示意性地描繪的那樣，一邊使光檢測(cè)區(qū)域CV的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)，即一邊通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域CV掃描樣本溶液內(nèi)，一邊執(zhí)行光檢測(cè)。這樣，例如如圖2的(A)那樣，在光檢測(cè)區(qū)域CV移動(dòng)的期間(圖中為時(shí)間t0 t2)，在通過(guò)存在一個(gè)發(fā)光粒子的區(qū)域時(shí)(tl)，從發(fā)光粒子釋放出光，如在圖2的(B)中所描繪的那樣，在時(shí)序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)有意義的光強(qiáng)度(Em)的脈沖狀的信號(hào)。這樣，執(zhí)行上述的光檢測(cè)區(qū)域CV的位置的移動(dòng)和光檢測(cè)，檢測(cè)其間出現(xiàn)的每一個(gè)如圖2的⑶所示例的脈沖狀的信號(hào)(有意義的光強(qiáng)度)，由此個(gè)別檢測(cè)發(fā)光粒子，對(duì)其個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，由此能夠獲取與存在于所計(jì)量的區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)、濃度或個(gè)數(shù)密度有關(guān)的信息。在該掃描分子計(jì)數(shù)法的原理中，不進(jìn)行如螢光強(qiáng)度的波動(dòng)的計(jì)算那樣的統(tǒng)計(jì)性的運(yùn)算處理，而是檢測(cè)每一個(gè)發(fā)光粒子，因此即使在應(yīng)該觀測(cè)的粒子的濃度低至無(wú)法通過(guò)FCS、FIDA等以足夠的精度進(jìn)行分析的程度的樣本溶液中，也能夠獲取與粒子的濃度或個(gè)數(shù)密度有關(guān)的彳目息。2.本發(fā)明的“表觀的光檢測(cè)區(qū)域”的大小的調(diào)節(jié)的原理在上述的掃描分子計(jì)數(shù)法中，在樣本溶液中的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)密度高的情況下，在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)暫時(shí)包含兩個(gè)以上的發(fā)光粒子的可能性變高。例如，如圖3的(A)示意性地描繪的那樣，在光檢測(cè)區(qū)域CV的移動(dòng)過(guò)程中發(fā)光粒子a溜出光檢測(cè)區(qū)域之前，發(fā)光粒子^進(jìn)入光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)時(shí)，如圖3的(B)的右方所示那樣，在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上，發(fā)光粒子a的信號(hào)與發(fā)光粒子P的信號(hào)一部分相互重疊。在該情況下，發(fā)光粒子a、^的信號(hào)的曲線如在圖中用虛線所示的那樣，成為難以分別檢測(cè)這兩個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)的形狀，有時(shí)將該相互重疊的兩個(gè)以上的發(fā)光粒子的信號(hào)檢測(cè)為一個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)。實(shí)際上，可知在樣本溶液中的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)密度高的情況下，典型的是在高到約InM程度時(shí)，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)為發(fā)光粒子的光的信號(hào)個(gè)數(shù)大幅地少于根據(jù)實(shí)際的濃度所預(yù)期的個(gè)數(shù)，能夠認(rèn)為該信號(hào)個(gè)數(shù)的降低是由于將相互重疊的兩個(gè)以上的發(fā)光粒子的信號(hào)作為一個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)來(lái)進(jìn)行計(jì)數(shù)。作為排除如上所述的相互重疊的兩個(gè)以上的發(fā)光粒子的信號(hào)而個(gè)別檢測(cè)各單個(gè)發(fā)光粒子來(lái)生成時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的一個(gè)方法，能夠考慮如在圖3的(A)中用虛線所描繪的那樣，縮小光檢 測(cè)區(qū)域，實(shí)現(xiàn)在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)暫時(shí)包含的發(fā)光粒子個(gè)數(shù)實(shí)質(zhì)上始終為一個(gè)以下的狀態(tài)。但是，光檢測(cè)區(qū)域的縮小存在原理上的局限(無(wú)法將區(qū)域的大小縮小到光的波長(zhǎng)以下)，另外裝置的結(jié)構(gòu)變得復(fù)雜，因此實(shí)際上縮小光檢測(cè)區(qū)域是極其困難的。但是，根據(jù)本發(fā)明，只要對(duì)根據(jù)時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)檢測(cè)發(fā)光粒子的光的信號(hào)時(shí)的信號(hào)處理進(jìn)行校正，就能夠如在圖3的(A)中用虛線描繪的那樣，選擇性地檢測(cè)通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的比該光檢測(cè)區(qū)域狹小的區(qū)域的發(fā)光粒子的光的信號(hào)，將相互重疊的兩個(gè)以上的發(fā)光粒子的信號(hào)檢測(cè)為一個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)的可能性大幅降低。在光檢測(cè)區(qū)域中，從通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的發(fā)光粒子釋放并到達(dá)光檢測(cè)器的光的強(qiáng)度因發(fā)光粒子在光檢測(cè)區(qū)域中的位置而不同，例如，在發(fā)光粒子是被照射照明光而發(fā)光的粒子的情況下，照明光在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的光的強(qiáng)度典型的是在光檢測(cè)區(qū)域(聚光區(qū)域)的大致中心處最大，從該最大強(qiáng)度點(diǎn)向大致放射方向降低。因而，發(fā)光粒子的光強(qiáng)度在發(fā)光粒子橫穿光檢測(cè)區(qū)域的大致中心時(shí)為最大，隨著發(fā)光粒子的位置趨于接近光檢測(cè)區(qū)域的周緣，光強(qiáng)度逐漸降低。即，從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放而被檢測(cè)出的光的強(qiáng)度的分布如圖3的(C)的左上所示例的那樣，呈吊鐘狀的分布，例如如圖3的(A)所描繪的那樣，通過(guò)在圖中用虛線描繪的區(qū)域的發(fā)光粒子Y的光強(qiáng)度比通過(guò)用虛線描繪的區(qū)域以外的發(fā)光粒子
a、^的光強(qiáng)度高(參照?qǐng)D3的(B))。這樣，在清楚地描述時(shí)，如果參照發(fā)光粒子的信號(hào)的強(qiáng)度，則能夠大致確定發(fā)光粒子在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的通過(guò)范圍。而且，在根據(jù)時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)時(shí)，設(shè)定閾值，如果只將具有超過(guò)該閾值的強(qiáng)度的信號(hào)檢測(cè)為有意義的信號(hào)，則能夠只“挑出”與通過(guò)了給出該閾值以上的光強(qiáng)度的區(qū)域的發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的信號(hào)。另外，在如圖3的(C)的左上那樣按照IthO — Ithl — Ith2的順序提高閾值的情況下，挑出的發(fā)光粒子所通過(guò)的區(qū)域如圖3的(C)的左下和右下的截面圖和立體圖所描繪的那樣，按照CV — qCVl — qQV2的順序縮小。換言之，在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的信號(hào)的分析處理中，通過(guò)設(shè)定某個(gè)閾值(例如Ithl、Ith2)，來(lái)劃定檢測(cè)單個(gè)發(fā)光粒子的區(qū)域、即“表觀的光檢測(cè)區(qū)域”(例如qCVl、qCV2)，能夠選擇性地只檢測(cè)通過(guò)該表觀的光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子的信號(hào)。此外，如上所述，在根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)度的高低來(lái)選擇發(fā)光粒子的信號(hào)的情況下，在兩個(gè)以上的發(fā)光粒子同時(shí)進(jìn)入到光檢測(cè)區(qū)域且這些發(fā)光粒子的信號(hào)的峰值(最大值)的時(shí)間幾乎沒(méi)有錯(cuò)開時(shí)，無(wú)論這些發(fā)光粒子是否正在通過(guò)表觀的光檢測(cè)區(qū)域，這些發(fā)光粒子的信號(hào)都可能不相互區(qū)別地被檢測(cè)為一個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)。但是，發(fā)光粒子在樣本溶液中三維地分散，因此兩個(gè)發(fā)光粒子同時(shí)進(jìn)入光檢測(cè)區(qū)域的情況(限于發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)密度相當(dāng)?shù)?是稀少的，另外，光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子的所檢測(cè)出的光的強(qiáng)度分布是吊鐘狀的分布，發(fā)光粒子的位置越是接近光檢測(cè)區(qū)域的周緣，則發(fā)光粒子的強(qiáng)度越是降低，因此即使假設(shè)兩個(gè)發(fā)光粒子大致同時(shí)進(jìn)入光檢測(cè)區(qū)域而它們的信號(hào)所重疊的信號(hào)的強(qiáng)度的最大值增大，在大多數(shù)情況下，能夠認(rèn)為比位于光檢測(cè)區(qū)域的中心附近的單個(gè)發(fā)光粒子的光的強(qiáng)度低(越是高光強(qiáng)度， 則發(fā)光粒子個(gè)數(shù)越少，因此高光強(qiáng)度的發(fā)光粒子重疊的概率大幅地少于低光強(qiáng)度的發(fā)光粒子重疊的概率)。因而，如上所述，通過(guò)適當(dāng)?shù)卦O(shè)定閾值，來(lái)實(shí)質(zhì)上排除被檢測(cè)為一個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)的相互重疊的兩個(gè)以上的發(fā)光粒子的信號(hào)。

在上述的本發(fā)明的適當(dāng)?shù)卦O(shè)定閾值來(lái)調(diào)節(jié)表觀的光檢測(cè)區(qū)域的大小的結(jié)構(gòu)中，根據(jù)以下的關(guān)系式使閾值和表觀的光檢測(cè)區(qū)域的大小關(guān)聯(lián)起來(lái)。即，如圖3的(C)的左上所示例的那樣，在能夠用高斯函數(shù)來(lái)近似從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放而被檢測(cè)出的光的強(qiáng)度的分布的情況下，使用光強(qiáng)度分布的最大值Imax(Imax相當(dāng)于單個(gè)發(fā)光粒子的最大光強(qiáng)度)、分布的半峰半寬《、強(qiáng)度的背景Ibg以及表觀的光檢測(cè)區(qū)域的截面半徑(離最大強(qiáng)度點(diǎn)的距離)r，通過(guò)下式來(lái)表示閾值Ith。[式I]
權(quán)利要求
1.一種光分析方法，其使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)來(lái)自在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子的光，其特征在于，包括如下步驟: 通過(guò)變更上述光學(xué)系統(tǒng)的光路使上述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)； 一邊使上述光檢測(cè)區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊測(cè)量來(lái)自上述光檢測(cè)區(qū)域的光的強(qiáng)度，來(lái)生成光強(qiáng)度數(shù)據(jù)； 在上述光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上個(gè)別檢測(cè)表示發(fā)光粒子的光的信號(hào)， 其中，在上述個(gè)別檢測(cè)表示發(fā)光粒子的光的信號(hào)的步驟中，選擇性地檢測(cè)具有超過(guò)閾值的強(qiáng)度的信號(hào)作為上述表示發(fā)光粒子的光的信號(hào)，設(shè)定上述閾值使得選擇性地檢測(cè)表示來(lái)自包含在上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的比該光檢測(cè)區(qū)域狹小的區(qū)域中的發(fā)光粒子的光的信號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光分析方法，其特征在于， 從上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放而被檢測(cè)出的光的強(qiáng)度分布是從上述發(fā)光粒子釋放而被檢測(cè)出的光的強(qiáng)度從上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的最大強(qiáng)度點(diǎn)向上述光檢測(cè)區(qū)域的周緣降低的分布。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光分析方法，其特征在于， 設(shè)定上述閾值使得暫時(shí)包含在比上述光檢測(cè)區(qū)域狹小的上述區(qū)域中的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)實(shí)質(zhì)上為一個(gè)以下。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的光分析方法，其特征在于，還包括如下步驟: 對(duì)選擇性地檢測(cè)出的上述信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，來(lái)確定包含在比上述光檢測(cè)區(qū)域狹小的上述區(qū)域中的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的光分析方法，其特征在于，還包括如下步驟: 根據(jù)所確定的上述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)確定該發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)密度或濃度。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的光分析方法，其特征在于， 基于從上述光檢測(cè)區(qū)域中的發(fā)光粒子釋放而被檢測(cè)出的光的強(qiáng)度分布，根據(jù)所確定的上述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)計(jì)算在設(shè)定了與上述閾值不同的其它閾值的情況下應(yīng)該檢測(cè)出的上述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的光分析方法，其特征在于，還包括如下步驟: 根據(jù)計(jì)算出的上述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)確定該發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)密度或濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的光分析方法，其特征在于， 確定使選擇性地檢測(cè)出的表示來(lái)自發(fā)光粒子的光的上述信號(hào)的個(gè)數(shù)為規(guī)定個(gè)數(shù)的閾值，根據(jù)上述閾值的大小確定上述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)密度或濃度。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光分析方法，其特征在于， 上述發(fā)光粒子是通過(guò)被照射激勵(lì)光而釋放光的粒子，從上述光檢測(cè)區(qū)域中的發(fā)光粒子釋放而被檢測(cè)出的光的強(qiáng)度分布與上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的上述激勵(lì)光的強(qiáng)度分布一致。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 9中的任意一項(xiàng)所述的光分析方法,其特征在于， 上述光檢測(cè)區(qū)域的位置以比上述樣本溶液中的發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)。
全文摘要
提供如下一種方法在使用了共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光測(cè)量的掃描分子計(jì)數(shù)法中，避免由于多個(gè)發(fā)光粒子暫時(shí)包含在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)而發(fā)光粒子的檢測(cè)個(gè)數(shù)的精度惡化。在本發(fā)明的光分析技術(shù)中，在一邊通過(guò)變更共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊在測(cè)量光的強(qiáng)度而生成的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，在以選擇性地將具有超過(guò)閾值的強(qiáng)度的信號(hào)檢測(cè)為表示發(fā)光粒子的光的信號(hào)的方式個(gè)別檢測(cè)表示發(fā)光粒子的光的信號(hào)時(shí)，設(shè)定閾值使得選擇性地檢測(cè)表示來(lái)自包含在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的比該光檢測(cè)區(qū)域狹小的區(qū)域中的發(fā)光粒子的光的信號(hào)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK103119421SQ20118004554
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月21日
發(fā)明者田邊哲也 申請(qǐng)人:奧林巴斯株式會(huì)社