專利名稱：使用質(zhì)譜分析法確定植物配型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及識別針對感興趣的等位基因純合的種子的方法，以及識別可能生產(chǎn)具有所希望性狀的植物的種子的方法。背景在植物育種或植物進(jìn)化實驗中的常規(guī)做法是由已知來源的種子來種植植物。這些種子被種植在實驗田、生長室、溫室或其他的生長條件下，其中它們與其他已知來源的植物進(jìn)行異花授粉或自花授粉。所生成的種子是來自兩個親本植物或自花授粉植物的后代，并且將其收獲、處理并種植以便于繼續(xù)植物育種循環(huán)。為了輔助育種或推進(jìn)選擇過程，可以在植物、植物組織、種子和/或種子組織上進(jìn)行特定實驗室或基于大田的測試。基于已知的異花或自花授粉的植物世代被種植并且然后進(jìn)行測試以便于弄清它們是否具有市場中所希望的特征。所希望的性狀的實例包括但不限于，增加的產(chǎn)量、增加的純合性、改進(jìn)的或新近賦予的對于特定除草劑和/或有害生物和/或病原體的抗性和/或耐受性、增加的含油量、改變的淀粉含量、營養(yǎng)食品組合物、耐寒性以及具體的基于形態(tài)學(xué)的性狀的增強(qiáng)。如可以理解的以及現(xiàn)有技術(shù)中已知的，這些實驗在規(guī)模上可以是巨大的。需要龐大的勞動力來設(shè)計實驗、種植種子、維持植物以及以另外的方式進(jìn)行這些實驗，這些實驗可以包括成千上萬的單個植物。此類實驗還需要實質(zhì)上的土地資源-當(dāng)植物萌發(fā)、生長并產(chǎn)生種子時，一個實驗可以占用數(shù)千英畝的土地數(shù)個月。然后，必須對大量種子單個地進(jìn)行標(biāo)記、收獲并且處理。另一個復(fù)雜之處是這些實驗的許多毫無結(jié)果。在文獻(xiàn)中已有報道，一些種子公司在該實驗的早期丟棄任何一個世代中的80%-90%的植物。因此，大部分花費在用于種子的生長、收獲以及收獲后處理的大量土地、人力和物力最終被浪費了。時間壓力也是一個因素。為了更快速地推進(jìn)植物的品系或品種以實現(xiàn)更多且更好的性狀和特征，植物育種中的顯著推進(jìn)向種子公司施加了更多壓力。因此，植物育種者以及有關(guān)的工作人員處于不斷增加的壓力之下，以便于更有效和更有力地處理這些世代，并且對應(yīng)當(dāng)繼續(xù)進(jìn)入下一世代育種的植物進(jìn)行更多和更初期的選擇。因此，出現(xiàn)了通過基于實驗室的種子測試以實現(xiàn)在早期識別所感興趣的性狀的動作。此類測試總體上包括從該種子中去除組織樣品，以使得這些種子在去除該組織樣品之后仍有活力。對這些種子進(jìn)行測試本身避免了這些種子在檢驗之前生長為不成熟的植株的需要，節(jié)省了時間、空間以及工作量。此外，在種植之前對這些種子進(jìn)行測試允許消除缺乏這個或這些所希望性狀的品系。換言之，可以選擇并只種植那些包含這個或這些所希望性狀的種子，以消除在識別并丟棄之前，缺乏這個或這些所希望性狀的種子生長為不成熟的植物時發(fā)生的浪費?？傊?，在一個給定的種子亞群中，一個所希望的性狀的早期識別可以減少用于實驗測試所需要的土地量、必須檢驗的種子/植物量以及識別具有所希望的性狀的種子/植物所需要的時間量。常規(guī)的種子測試技術(shù)目的在于使用傳統(tǒng)的遺傳檢驗確定種子的遺傳組成。雖然已經(jīng)證明此類技術(shù)對識別包含給定基因的種子而言是有用的，它們局限于它們可以提供的信息的量以及類型。因為每一個測試都必然地聚焦在一個感興趣的單個基因上，如果希望調(diào)查多基因的話必須進(jìn)行多個檢驗。此外，此類測試只能闡明一個給定的種子是否包含該感興趣的基因-這些檢驗不能確定這些種子實際上是否會表達(dá)所希望的基因產(chǎn)物。常規(guī)的遺傳測試也不能用于確定這些種子是否表達(dá)任意特定的蛋白形式。使用質(zhì)譜分析法來定量衍生自胚乳(已經(jīng)從這些種子中去除)的一部分的樣品中的感興趣的蛋白量，通過提供識別針對一個等位基因純合的種子的方法，本發(fā)明克服了本領(lǐng)域的許多缺點。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)針對一個感興趣的等位基因純合的植物的方法。還提供了用于實施本發(fā)明的這些方法的系統(tǒng)。將在下文更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。本說明書并非旨在成為實施本發(fā)明的所有的不同方法、或所有的加至本發(fā)明的特征的詳細(xì)目錄。例如，對于一個實施例所展示的特征可以結(jié)合在其他實施例中，并且對于一個特定的實施例所展示的特征也可以從那個實施例中刪除。此外，鑒于本披露的內(nèi)容，在此建議的不偏離本發(fā)明的多種變體以及對不同實施例的增添對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將是清楚的。因此，以下說明書旨在說明本發(fā)明的一些具體的實施例，并且不是窮盡性地限定所有的排列、組合以及其變體。發(fā)明概述提供了用于識別針對感興趣的等位基因純合的種子的方法。還提供了用于生產(chǎn)針對感興趣的等位基因純合的植物的方法。還提供了用于識別可能生產(chǎn)具有所希望性狀的植物的種子的方法。還提供了用于生產(chǎn)具有所希望性狀的植物的方法。可以將此類方法用于增強(qiáng)植物發(fā)育的效率并且改進(jìn)的技術(shù)包括但不限于，傳統(tǒng)的育種、標(biāo)記輔助的選擇以及轉(zhuǎn)化。在某些實施例中，提供了用于識別針對感興趣的等位基因純合的種子的方法。此類方法可以包括、主要由以下步驟組成或由以下步驟組成:I)從種子中去除胚乳的一部分；2)使用質(zhì)譜分析法來定量衍生自胚乳部分的樣品中的一種感興趣的蛋白；并且3)確定該種子針對感興趣的等位基因純合。在某些實施例中，提供了生產(chǎn)針對感興趣的等位基因純合的植物的方法。此類方法可以包括、主要由以下步驟組成或由以下步驟組成:I)從種子中去除胚乳的一部分；2)使用質(zhì)譜分析法來定量衍生自胚乳部分的樣品中的一種感興趣的蛋白；3)確定該種子針對感興趣的等位基因純合；并且4)從該種子生長一種植物。在某些實施例中，該種子從一個包含該感興趣的等位基因的第一植物或種質(zhì)與一個包含該感興趣的等位基因的第二植物或種質(zhì)進(jìn)行雜交而得來。在某些此類的實施例中，該第一植物或種質(zhì)針對該感興趣的等位基因是純合的并且第二植物或種質(zhì)針對該感興趣的等位基因是雜合的，而在其他此類實施例中，該第一植物或種質(zhì)針對該感興趣的等位基因是雜合的并且第二植物或種質(zhì)針對該感興趣的等位基因是純合的。在又此外的此類實施例中，該第一植物或種質(zhì)以及第二植物或種質(zhì)針對該感興趣的等位基因都是雜合的。在某些實施例中，該種子從已經(jīng)用該感興趣的等位基因轉(zhuǎn)化的植物中得來。
在某些實施例中，使用質(zhì)譜分析法來定量衍生自胚乳部分的樣品中的感興趣的蛋白包括將與感興趣的肽相關(guān)聯(lián)的峰和與標(biāo)準(zhǔn)品的已知量相關(guān)聯(lián)的峰的相對強(qiáng)度進(jìn)行比較。在某些實施例中，該標(biāo)準(zhǔn)品可以是一種同位素標(biāo)記的、與感興趣的肽化學(xué)上相同的肽。在某些實施例中，該標(biāo)準(zhǔn)品可以是一種無關(guān)的分子(例如，皮質(zhì)醇)。在某些實施例中，使用質(zhì)譜分析法來定量衍生自胚乳部分的樣品中的感興趣的蛋白包括與感興趣的肽相關(guān)聯(lián)的峰的相對定量。在某些此類實施例中，將衍生自第一種子樣品中的與感興趣的肽相關(guān)聯(lián)的峰的強(qiáng)度與衍生自另一個種子樣品中的等效峰的強(qiáng)度不使用任何標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。在某些實施例中，使用質(zhì)譜分析法來定量衍生自胚乳部分的樣品中的感興趣的蛋白包括與感興趣的肽相關(guān)聯(lián)的峰的相對定量。在某些此類實施例中，將衍生自第一種子樣品中的與感興趣的肽相關(guān)聯(lián)的峰的強(qiáng)度與衍生自多個其他種子樣品中的等效峰的強(qiáng)度不使用任何標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。在某些實施例中，確定一個種子針對感興趣的等位基因純合可以包括、主要由以下步驟組成或由以下步驟組成:確定衍生自從第一種子中去除的胚乳的一部分的樣品中的感興趣的蛋白量至少是衍生自從第二種子中去除的胚乳的一部分的一種樣品中的感興趣的蛋白量的大約兩倍。某些此類實施例進(jìn)一步包括確定該第二種子針對感興趣的等位基因是雜合的。在某些實施例中，確定一個種子針對感興趣的等位基因純合可以包括、主要由以下步驟組成或由以下步驟組成:確定衍生自從第一種子中去除的胚乳的一部分的樣品中的感興趣的蛋白量至少是衍生自從第二種子中去除的胚乳的一部分的樣品中的感興趣的蛋白量的大約兩倍并且確定衍生自從第三種子中去除的胚乳的一部分的樣品中不包含可檢出量的該感興趣的蛋白。某些此類實施例進(jìn)一步包括確定該第二種子針對感興趣的等位基因是雜合的，確定該第三種子不包含該感興趣的等位基因和/或確定該第三種子不包含感興趣的功能等位基因(即，如果存在的話，該感興趣的等位基因就功能而言，不導(dǎo)致可檢出的量的感興趣蛋白)。在某些實施例中，確定一個種子針對感興趣的等位基因純合可以包括、主要由以下步驟組成或由以下步驟組成:確定該種子不包含可檢出量的感興趣的蛋白。在某些此類實施例中，與該感興趣的等位基因相關(guān)聯(lián)的所希望性狀的至少一個是該感興趣的蛋白的下降或消除。在某些實施例中，確定一個種子針對感興趣的等位基因純合可以包括、主要由以下步驟組成或由以下步驟組成:將衍生自已經(jīng)從第一種子中去除的胚乳的一部分的樣品中的感興趣的蛋白量與一個或多個參比值進(jìn)行比較。在某些此類實施例中，這個或這些參比值可以與其相關(guān)聯(lián)或獲得自:衍生自從種子(針對感興趣的等位基因純合)中去除的胚乳的一部分的樣品，衍生自從種子(針對感興趣的等位基因雜合)中去除的胚乳的一部分的樣品，衍生自從種子(不包含感興趣的等位基因)中去除的胚乳的一部分的樣品和/或衍生自從種子(針對感興趣的功能等位基因)中去除的胚乳的一部分的樣品。在某些實施例中，提供了用于識別針對一個感興趣的等位基因純合的種子的系統(tǒng)。此類系統(tǒng)可以包括、主要由以下項組成或由以下項組成:I)用于從種子中去除胚乳的一部分的裝置；以及
2)用于使用質(zhì)譜分析法來定量衍生自從胚乳部分的樣品中的感興趣的蛋白的裝置。在某些實施例中，提供了識別可能生產(chǎn)具有所希望性狀的植物的種子的方法。此類方法可以包括、主要由以下步驟組成或由以下步驟組成:I)從種子中去除胚乳的一部分；2)使用質(zhì)譜分析法來定量衍生自從該胚乳部分的樣品中的一種感興趣的蛋白；并且3)確定該種子可能生產(chǎn)一種具有所希望性狀的植物。在某些實施例中，提供了生產(chǎn)具有所希望性狀的植物的方法。此類方法可以包括、主要由以下步驟組成或由以下步驟組成:I)從種子中去除胚乳的一部分；2)使用質(zhì)譜分析法來定量衍生自該胚乳部分的樣品中的一種感興趣的蛋白；3)確定該種子可能生產(chǎn)一種具有所希望性狀的植物；并且4)從該種子生長一種植物。在某些實施例中，該種子從一個具有該感興趣的性狀的第一植物或種質(zhì)與一個缺乏該感興趣的性狀的第二植物或種質(zhì)進(jìn)行雜交而得來。在某些實施例中，該種子從已經(jīng)用與該感興趣的性狀相關(guān)聯(lián)的等位基因轉(zhuǎn)化的植物中得來。在某些實施例中，使用質(zhì)譜分析法來定量衍生自胚乳部分的樣品中的感興趣的蛋白包括將與感興趣的肽相關(guān)聯(lián)的峰和與一個已知量的標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)聯(lián)的峰的相對強(qiáng)度進(jìn)行比較。在某些實施例中，該標(biāo)準(zhǔn)品可以是一種同位素標(biāo)記的、與感興趣的肽化學(xué)上相同的肽。在某些實施例中，該標(biāo)準(zhǔn)品可以是一種無關(guān)的分子(例如，皮質(zhì)醇)。在某些實施例中，使用質(zhì)譜分析法來定量衍生自胚乳部分的樣品中的感興趣的蛋白包括與感興趣的肽相關(guān)聯(lián)的峰的相對定量。在某些此類實施例中，將衍生自第一種子樣品中的與感興趣的肽相關(guān)聯(lián)的峰的強(qiáng)度與衍生自另一個種子樣品中的等效峰的強(qiáng)度不使用任何標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。在某些實施例中，使用質(zhì)譜分析法來定量衍生自胚乳部分的樣品中的感興趣的蛋白包括與感興趣的肽相關(guān)聯(lián)的峰的相對定量。在某些此類實施例中，將衍生自第一種子樣品中的與感興趣的肽相關(guān)聯(lián)的峰的強(qiáng)度與衍生自多個其他種子樣品中的等效峰的強(qiáng)度不使用任何標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。在某些實施例中，確定一個種子可能生產(chǎn)具有所希望性狀的植物可以包括、主要由以下步驟組成或由以下步驟組成:確定衍生自從第一種子中去除的胚乳的一部分的樣品中的感興趣的蛋白量高于衍生自從第二種子中去除的胚乳的一部分的樣品中的感興趣的蛋白量。在某些此類實施例中，衍生自從該第一種子中去除的該胚乳的部分的樣品中的感興趣的蛋白量至少是衍生自從該第二種子中去除的該胚乳的部分的樣品中的感興趣的蛋白量的大約兩倍。某些此類實施例進(jìn)一步包括確定該第二種子可能生產(chǎn)缺乏所希望性狀的植物。在某些實施例中，確定一個種子可能生產(chǎn)具有所希望性狀的植物可以包括、主要由以下步驟組成或由以下步驟組成:確定衍生自從第一種子中去除的胚乳的一部分的樣品中的感興趣的蛋白量低于衍生自從第二種子中去除的胚乳的一部分的樣品中的感興趣的蛋白量。在某些此類實施例中，衍生自從該第一種子中去除的該胚乳的部分的樣品中的感興趣的蛋白量是衍生自從該第二種子中去除的該胚乳的部分的樣品中的感興趣的蛋白量的至少大約一半。某些此類實施例進(jìn)一步包括確定該第二種子可能生產(chǎn)一種具有所希望性狀的植物。在某些實施例中，確定一個種子可能生產(chǎn)具有所希望性狀的植物可以包括、主要由以下步驟組成或由以下步驟組成:確定衍生自從該種子中去除的胚乳的一部分的樣品中不包含可檢出量的感興趣的蛋白。在某些此類實施例中，所希望性狀的至少一個與該感興趣的蛋白的下降或消除相關(guān)聯(lián)。在某些實施例中，確定一個種子可能生產(chǎn)具有所希望性狀的植物可以包括、主要由以下步驟組成或由以下步驟組成:將衍生自從第一種子中去除的胚乳的一部分的樣品中的感興趣的蛋白的量與一個或多個參比值進(jìn)行比較。在某些此類實施例中，這個或這些參比值可以與其相關(guān)聯(lián)或獲得自:衍生自從種子(生產(chǎn)具有所希望性狀的植物)中去除的胚乳的一部分的樣品，衍生自從種子(生產(chǎn)缺乏所希望性狀的植物)中去除的胚乳的一部分的樣品，在這些衍生自從種子(生產(chǎn)具有所希望性狀的植物)中去除的胚乳的一部分的樣品中的感興趣的蛋白的平均量和/或在這些衍生自從種子(生產(chǎn)缺乏所希望性狀的植物)中去除的胚乳的一部分的樣品中的感興趣的蛋白的平均量。在某些實施例中，提供了用于識別可能生產(chǎn)具有所希望性狀的植物的種子的系統(tǒng)。此類系統(tǒng)可以包括、主要由以下項組成或由以下項組成:I)用于從種子中去除胚乳的一部分的裝置；以及2)用于使用質(zhì)譜分析法來定量衍生自該胚乳部分的樣品中的一種感興趣的蛋白的裝置。在下文給出的附圖
和說明書中詳細(xì)解釋了本發(fā)明的上述以及其他目的和方面。詳細(xì)描述本發(fā)明提供了識別并生產(chǎn)植物的方法，該植物來自針對一個感興趣的等位基因純合的種子。還提供了用于識別針對一個感興趣的等位基因純合的種子的系統(tǒng)。還提供了識別可能生產(chǎn)具有所希望性狀的植物的種子的方法。和依賴遺傳測試以建立種子是否包含一個感興趣的等位基因和/或種子針對一個感興趣的等位基因純合還是雜合的常規(guī)種子切片技術(shù)不同，本發(fā)明的方法/系統(tǒng)允許本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員使用質(zhì)譜分析法在單個樣品中同時確定一對或多對感興趣的等位基因的基因型狀態(tài)。此外，本發(fā)明的方法/系統(tǒng)允許本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員使用質(zhì)譜分析法從單個樣品中確定一對或多對感興趣的等位基因事實上在該種子中是否表達(dá)和/或一種或多種感興趣的蛋白是否作為特定的構(gòu)象異構(gòu)體存在。本發(fā)明的方法可以使用自動化、高通量的系統(tǒng)實施，該系統(tǒng)允許本領(lǐng)域普通技術(shù)人員以比以前的技術(shù)更有效且有成本效益的方式處理大容量的種子。參見例如美國專利號
7,591, 101 (描述一種自動化的種子米樣器)。本發(fā)明的方法/系統(tǒng)可以與傳統(tǒng)的育種計劃、標(biāo)記輔助選擇計劃和/或植物轉(zhuǎn)化計劃結(jié)合使用。值得注意地是，本發(fā)明的方法/系統(tǒng)可以用于同時監(jiān)控并識別多個重組事件和/或轉(zhuǎn)化事件。
定義雖然認(rèn)為以下術(shù)語可以很好地為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解，給出以下定義是為了使本披露的主題容易理解。除非另有定義，在此所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語旨在具有與本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。在此采用的技術(shù)的參考文獻(xiàn)旨在參照本領(lǐng)域中通常理解的技術(shù)，包括對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言很明顯的那些技術(shù)的變化或等效技術(shù)的替換。在此提及的所有專利、專利公開以及非專利公開以其全文通過引用而結(jié)合。如在此使用的，術(shù)語“一種/ 一個(a或an)”或“該”(the)可以表示一個或多于一個。例如，“一個”標(biāo)記可以意味著一個標(biāo)記或多個標(biāo)記。同樣地，“一個”感興趣的等位基因可以意味著多個感興趣的等位基因的Iv感興趣的等位基因。如在此使用的，術(shù)語“和/或”是指并包括一個或多個相關(guān)地列出的項的任何的與所有的可能組合，并且當(dāng)用可替代地(“或”)解釋時組合的缺少。如在此使用的，當(dāng)提及可測量的值如質(zhì)量、劑量、時間、溫度以及類似物的量時，術(shù)語“約”旨在包含特定量的20%、10%、5%、1%、0.5%或者甚至0.1%的變化。如在此使用的，術(shù)語“等位基因”是指在一個特定的基因座處發(fā)生的兩個或更多個不同的核苷酸或核苷酸序列之一。如在此使用的，術(shù)語“回交”以及“進(jìn)行回交”是指由此子代植物反復(fù)地向后和它的親本之一雜交的方法。在回交方案中，“供體”親本是指具有所希望的、要被滲入的基因或基因座或等位基因的親本植物。“受體”親本(使用一次或多次)或“輪回”親本(使用兩次或更多次)是指該基因或基因座或等位基因向其中滲入的親本植物。例如，參見瑞格特等人，標(biāo)記輔助的回交:一個實際的例子，《技術(shù)和分子標(biāo)記利用專題討論會》(Ragot, M.et al.Marker-assisted Backcrossing:A Practical Example, in Techniques etUtilisations des Marqueurs Moleculaiees Les COLLOquesj Vol.72，pp.45-56 (1995));以及奧於肖等人，回交育種中的標(biāo)記輔助的選擇，《“分子標(biāo)記數(shù)據(jù)的分析”專題討論會紀(jì)要》(Openshawet al., Marker-assisted Selection in Backcross Breeding, in Proceedings of theSymposium Analysis ofMoleculae Marker Dataj ”pp.41-43(1994))。初次雜交產(chǎn)生了 Fl世代。術(shù)語“BC1”是指輪回親本的第二次使用，“BC2”是指輪回親本的第三次使用，以此類推。如在此使用的，術(shù)語“雜交”或“雜交的”是指配子通過授粉從而產(chǎn)生子代(例如細(xì)胞、種子或植物)的融合。術(shù)語包括有性雜交(一個植物由另一個授粉)和自交(自花授粉，例如當(dāng)花粉和胚珠是來自相同的植物時)兩者。術(shù)語“進(jìn)行雜交”是指通過授粉從而產(chǎn)生子代的配子融合行為。如在此使用的，術(shù)語“栽培品種”以及“品種”是指一組相似的植物，這些植物在結(jié)構(gòu)和/或遺傳特征和/或表型性狀和/或性能上可以與在同一種類中的其他品種區(qū)分出來。如在此使用的，可互換使用的術(shù)語“所希望的等位基因”以及“感興趣的等位基因”是指與所希望的性狀相關(guān)聯(lián)的等位基因。一個“感興趣的等位基因”和/或“所希望的等位基因”可以與給定性狀的增加或減少以及給定性狀的存在或不存在相關(guān)聯(lián)，取決于所希望的表型的性質(zhì)。如在此使用的，可互換使用的術(shù)語“所希望的性狀”以及“感興趣的性狀”是指給定性狀的增加或減少，以及給定性狀的存在或不存在，取決于所希望的表型的性質(zhì)。在某些實施例中，所希望的性狀可以與感興趣的蛋白的存在或不存在相關(guān)聯(lián)。在某些實施例中，所希望的性狀可以與感興趣的蛋白產(chǎn)物的提高或減少相關(guān)聯(lián)。如在此使用的，術(shù)語“良種”以及“良種品系”是指任何實質(zhì)上純合的、并且針對所希望的農(nóng)藝性狀的從育種和選擇所得到的品系。如在此使用的，術(shù)語“片段化的肽”是指當(dāng)使用一種技術(shù)如電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)、電子俘獲解離(E⑶)、碰撞誘導(dǎo)解離(CID)或紅外多光子解離(IRMPD)使感興趣的蛋白經(jīng)受碎裂時產(chǎn)生的肽。如在此使用的，術(shù)語“基因型”是指一個個體(或個體組)在一個或多個基因座處的遺傳組成，與可觀察到的和/或可檢出的和/或顯示的性狀(表型)相對。基因型由一個或多個個體已經(jīng)從它的親本遺傳的、已知基因座的這個或這些等位基因定義。可以使用術(shù)語基因型指一個個體在單個基因座處、在多個基因座處的遺傳組成，或者更通常地，可以使用術(shù)語基因型指一個個體針對它的基因組中所有基因座的遺傳組成?；蛐涂梢岳缡褂脴?biāo)記而被間接表征和/或通過核酸序列而被直接表征。如在此使用的，術(shù)語“種質(zhì)”是指一個個體(例如一個植物)的或來自一個個體、一組個體(例如，一個植物品系、種類、品種或家族)的遺傳物質(zhì)、或來自一個品系、品種、種類或培養(yǎng)物的克隆。種質(zhì)可以是一個生物體或細(xì)胞的一部分，或可以從該生物體或細(xì)胞中分離。通常，種質(zhì)提供了具有特定的分子結(jié)構(gòu)的遺傳物質(zhì)，該分子結(jié)構(gòu)提供了對于一個生物體或細(xì)胞培養(yǎng)物的一些或所有遺傳品質(zhì)的物理基礎(chǔ)。如在此使用的，種質(zhì)包括新植物可以從其生長的細(xì)胞、種子或組織以及可以被培養(yǎng)成整個植物的植物部位如葉、莖、花粉、或細(xì)胞?！皢伪缎汀笔且粋€個體在多個基因座處的基因型，S卩，等位基因的組合。典型地，用單倍型描述的基因座是物理上以及遺傳上相連的，即，在相同染色體片段上。術(shù)語“單倍型”可以指在特定基因座如一個單標(biāo)記基因座處的多態(tài)性，或在沿著一條染色體片段的多個基因座處的多態(tài)性?！半s優(yōu)類群”包括當(dāng)與來自不同雜優(yōu)類群的基因型雜交時表現(xiàn)良好的一組基因型?；魻枈W爾等人，玉米育種，《玉米和玉米改進(jìn)》(Hallauer et al., Corn breeding, in Cornand Corn Improvement p.463-564(1998))?；趲讉€標(biāo)準(zhǔn)如系譜、基于分子標(biāo)記的聯(lián)合以及雜種組合的性能，近交系被分為雜優(yōu)類群，并且被進(jìn)一步細(xì)分為雜優(yōu)類群內(nèi)的家族。斯密斯等人，《理論與應(yīng)用遺傳學(xué)》(Smith et al.，Theor.Appl.Gen.80:833 (1990))。如在此使用的，術(shù)語“雜合的”是指其中不同的等位基因位于同源染色體上相應(yīng)的基因座上的遺傳狀況。如在此使用的，術(shù)語“純合的”是指其中相同的等位基因位于同源染色體上相應(yīng)的基因座上的遺傳狀況。如在此使用的，術(shù)語“雜種”是指當(dāng)至少兩個遺傳上不同的親本雜交時產(chǎn)生的種子和/或植物。如在此使用的，術(shù)語“近交”是指實質(zhì)上純合的植物或品種。該術(shù)語可以是指遍及它們的整個基因組實質(zhì)上是純合的或者相對于該基因組的一部分實質(zhì)上是純合的植物或品種。如在此使用的，術(shù)語“離子化的肽”是指當(dāng)使用一種技術(shù)如電噴霧電離(ESI)、基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)、快原子轟擊(FAB)或大氣壓化學(xué)電離(APCI)使屬于感興趣的蛋白的肽經(jīng)受電離時產(chǎn)生的肽。如果種子有超過50%的可能將產(chǎn)生具有所希望的性狀的植物，那么該植物“可能產(chǎn)生具有所希望的性狀的植物”。在某些實施例中，該種子有大約99%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%或55%的可能將產(chǎn)生具有所希望的性狀的植物。一個“基因座”是一個染色體上的位置，其中一個基因或標(biāo)記或等位基因在這里定位。在某些實施例中，一個基因座可能包括一個或多個核苷酸。如在此使用的，術(shù)語“玉蜀黍(maize)”是指玉蜀黍?qū)?Zea mays L.ssp.)的一種植物，并且還被稱為“玉米”(corn)。如在此使用的，術(shù)語“玉蜀黍植物”包括整個玉蜀黍植物、玉蜀黍植物細(xì)胞、玉蜀黍植物原生體、玉蜀黍植物可以由之再生的玉蜀黍植物細(xì)胞或玉蜀黍組織培養(yǎng)物、玉蜀黍植物愈傷組織以及在玉蜀黍植物或玉蜀黍植物的部分中完整的玉蜀黍植物細(xì)胞，這些玉蜀黍植物的部分是如玉蜀黍種子、玉蜀黍穗、玉蜀黍花、玉蜀黍子葉、玉蜀黍葉、玉蜀黍莖、玉蜀黍芽、玉蜀黍根、玉蜀黍根尖以及類似物。如在此使用的，術(shù)語“感興趣的肽”是指屬于感興趣的蛋白的一種肽。在某些情況中，“感興趣的肽”包括或者是“蛋白水解的肽”、一種“離子化的肽”或“片段化的肽”。如在此使用的，術(shù)語“表型”、“表型性狀”或“性狀”是指一種生物體的一種或多種性狀。該表型可以是裸眼的或通過本領(lǐng)域中已知的任何其他評價方法(例如顯微術(shù)、生物化學(xué)分析法或一種電機(jī)的測定)可觀察到。在一些情況下，表型是由一個單個的基因或基因座來直接控制的，即一種“單基因性狀”。在其他情況下，表型是多個基因的結(jié)果。應(yīng)指出，如在此使用的，術(shù)語“水優(yōu)化表型”考慮到可能影響水優(yōu)化的環(huán)境條件，以使得水優(yōu)化效果是真實且可再現(xiàn)的。如在此使用的，術(shù)語“植物”可以指整個植物、其任何部分或衍生自植物的細(xì)胞或組織。因此，術(shù)語“植物”可以指以下的任何:整個植物、植物成分或器官(例如，葉、莖、根等)、植物組織、種子和/或植物細(xì)胞。植物細(xì)胞是植物的細(xì)胞，取自植物，或者通過從取自植物的細(xì)胞培養(yǎng)獲得。如在此使用的，術(shù)語“種群”是指共享一個共同的遺傳來源的植物的遺傳異質(zhì)性集
口 ο如在此使用的，術(shù)語“子代”以及“子代植物”是指由一株或多株親本植物的植物性或有性生殖產(chǎn)生的植物或種質(zhì)。子代植物可以通過一個單個親本植物的克隆或自花授粉，或者通過兩個親本植物的雜交獲得。如在此使用的，術(shù)語“感興趣的蛋白”是指由感興趣的等位基因或由包含該感興趣的等位基因的核苷酸序列編碼的一種蛋白。如在此使用的，術(shù)語“蛋白水解的肽”是指當(dāng)感興趣的蛋白酶消化時產(chǎn)生的一種肽。如在此使用的，術(shù)語“參比值”是指衍生自一個或多個樣品中的感興趣的蛋白的量的值，這個或這些樣品衍生自一個參比種子或多個參比種子。在某些實施例中，關(guān)于編碼該感興趣的蛋白的感興趣的等位基因的這個或這些參比種子的配型是已知的。在某些實施例中，已知是否這個或這些種子生產(chǎn)了或?qū)⒁a(chǎn)具有所希望的性狀的一個或多個植物。例如，一個參比值可以衍生自一個樣品中的感興趣的蛋白的量的值，這個樣品衍生自從一個參比種子中去除的胚乳的一部分，已知該參比種子針對一個感興趣的等位基因是純合的和/或已知該參比種子生產(chǎn)了或產(chǎn)生一個具有所希望的性狀的植物。類似地，一個參比值可以衍生自多個樣品中的感興趣的蛋白的平均量的值，這些樣品衍生自從多個參比種子中去除的胚乳部分，已知這些參比種子針對一個感興趣的等位基因是純合的和/或已知這些參比種子生產(chǎn)了或產(chǎn)生多個具有所希望的性狀的植物。如在此使用的，可互換使用的術(shù)語“樣品”以及“衍生自胚乳的[一個/該]部分的樣品”是指一個衍生自從一個種子中去除的胚乳的一部分的樣本。該樣本可以由從該種子中去除的胚乳部分的任何部分組成，或者可以包括從該種子中去除的胚乳部分的全部。該樣本可以處于其天然的形式，或它可能已經(jīng)在用于分析、測試或調(diào)查的制品中進(jìn)行了物理地/化學(xué)地處理?！坝矖U(Stiff Stalk)”雜優(yōu)類群代表了在美國北部以及加拿大玉米種植區(qū)的主要雜優(yōu)類群。還可以將其稱作“愛荷華州硬桿合成的(1wa Stiff Stalk Synthetic)”或“ BSSS ”雜優(yōu)類群。如在此使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”是指包含一條核苷酸序列(例如，編碼蛋白和/或其他功能基因產(chǎn)物的核苷酸序列)的核酸分子，該核酸分子作為異源的或外源的核苷酸序列被弓I入一個細(xì)胞中。在某些實施例中，該轉(zhuǎn)基因可以是包含來自一個生物體的一條核苷酸序列的核酸分子，該核酸分子被引入另一個和/或不同生物體的細(xì)胞中。該核酸分子可以在該生物體的細(xì)胞中瞬時表達(dá)和/或被穩(wěn)定地整合入該生物體細(xì)胞的基因組中。在某些實施例中，來自一個植物的一個基因或編碼序列可以作為一個轉(zhuǎn)基因被引入另一個植物的基因組中。如在此使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”、“進(jìn)行轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)化的”是指將一個或多個外源的或異源的核酸分子(例如，一個轉(zhuǎn)基因或編碼序列)引入一個細(xì)胞中。細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以是穩(wěn)定的或瞬時的?！八矔r轉(zhuǎn)化”在多核苷酸的背景下意為被引入細(xì)胞中并且不整合到該細(xì)胞的基因組中的多核苷酸。如在此使用的，“穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化”或“穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的”意為一種被引入細(xì)胞中并且整合到該細(xì)胞的基因組中的核酸。這樣，該整合的核酸能夠被其子代遺傳，更具體地，被多個連續(xù)世代的子代遺傳。如在此使用的，“基因組”還包括核基因組以及質(zhì)?；蚪M，并且因此包括該核酸分子整合進(jìn)入的，例如葉綠體基因組。如在此使用的，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化還可以指一種例如作為微型染色體在染色體外保持的轉(zhuǎn)基因。將一個外源的或異源的核酸序列引入一個植物中的方法是已熟知的并且包括用根瘤土壤桿菌直接感染或共培養(yǎng)植物細(xì)胞(豪斯徹等人，《科學(xué)》(Horsch etal.Science227:1229(1985)))以及使用涂覆有包含轉(zhuǎn)基因的核酸的金顆粒的微彈轟擊法。一種“所不希望的等位基因”是與所不希望的性狀相關(guān)聯(lián)的一個等位基因。包含所不希望的等位基因的種子和/或植物可以從育種計劃或種植中識別出并去除。種子切片本發(fā)明提供了一種用于從種子中去除胚乳的一部分的方法。該胚乳部分可以通過任何本領(lǐng)域中已知的、現(xiàn)有的或未來的方法去除，包括但不限于，用銳刀片去除胚乳的一部分、在種子中鉆一個小洞并收集所得的粉末并且用激光切割該種子。參見例如美國專利號7，591，101 ;戴等人，《植物科學(xué)動態(tài)》(Day et al.Trends Plant Sc1.10:397 (2005));納爾遜等人，《植物生物學(xué)年鑒》(Nelson et al.Ann.Rev.Plant.Biol.57:181 (2006) ) 在某些實施例中，以保護(hù)種子活力的方式從該種子中去除該胚乳部分。在某些此類實施例中，去除該胚乳部分之后，活力可以保持至少大約六個月。在某些此類實施例中，去除該胚乳部分之后，用保護(hù)物質(zhì)對該種子進(jìn)行處理。該保護(hù)物質(zhì)可以包括本領(lǐng)域中已知的、用于保護(hù)種子不受環(huán)境條件傷害的任何物質(zhì)，包括但不限于聚合物以及殺真菌劑。質(zhì)譜分析法本發(fā)明提供了使用質(zhì)譜分析法以識別和/或定量樣品中的感興趣的蛋白的方法，該樣品衍生自從種子中去除的胚乳的一部分。一般而言，基于在進(jìn)行質(zhì)譜分析法之前如何制備樣品，可以將此類方法分為兩個不同的類。使用蛋白水解的消化作用的方法通常包括:從該樣品中提取一種或多種蛋白，消化提取的這個或這些蛋白，電離所得的肽，根據(jù)它們的質(zhì)/荷比(m/z)分選離子化的肽，檢測這些離子化的肽并且基于與一種或多種屬于感興趣的蛋白的蛋白水解肽相關(guān)聯(lián)的一個或多個峰的相對強(qiáng)度對該蛋白進(jìn)行定量。任選地，在消化之前，可以將該感興趣的蛋白與該樣品中存在的其他蛋白的某些部分分開。相比之下，“由頂向下”的方法不要求在質(zhì)譜分析之前對該感興趣的蛋白進(jìn)行蛋白水解的消化作用。此類“由頂向下”的方法因此允許對完整的感興趣的蛋白進(jìn)行分析。本領(lǐng)域中已知的質(zhì)譜分析的任何現(xiàn)有的或未來的方法都可以在本發(fā)明的方法/系統(tǒng)中使用，包括但不限于，分析物分離技術(shù)如液相色譜法(LC)以及高效液相色譜法(HPLC);電離技術(shù)如電噴霧電離(ESI)、電噴霧解吸電離(DESI)、實時直接分析電離(DART)、基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)以及大氣壓化學(xué)電離(APCI);碎裂技術(shù)如電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)、電子俘獲解離(E⑶)、碰撞誘導(dǎo)解離(CID)以及紅外多光子解離(IRMPD);以及分析儀如 飛行時間分析儀(T0F)、四相質(zhì)譜儀、三相四極質(zhì)譜儀、死離子阱、傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(FT-1CR)以及軌道阱?？梢栽诶缫韵挛墨I(xiàn)中發(fā)現(xiàn)示例性的科學(xué)試驗計劃:波瑞曼等人，《質(zhì)譜快訊》(Bereman et al.Rapid Comm.MassSpectrom.20:3409 (2006));克瑞斯托尼等人，《質(zhì)譜快訊》(Cristoni et al.Rapid Comm.Mass Spectrom.16:1686 (2002));韓等人，《科學(xué)》(Han et al.Science314:109 (2006))；庫柏特等人，《農(nóng)業(yè)與食品化學(xué)雜志》(Kubec et al.J.Ag.Food Chem.58:1121 (2010))；萊曼等人，《植物學(xué)雜志》(Lehmann et al.Plant J.55:1039 (2008));里特等人，《化學(xué)年報》(Little et al.Anal.Chem.66:2809 (1994));洛佩斯等人，《色譜分析雜志》(Lopezet al.J.Chromatographyl216:7222 (2009));邁克士等人，《生物化學(xué)與生物物理學(xué)文獻(xiàn)》(Mikesh et al.Biochim.Biophys.Actal764:1811 (2006))；沙夫等人，《色譜分析雜志》(Schaff et al.J.Chromatography886:89 (2007));謝爾曼等人，《蛋白質(zhì)組學(xué)》(Sheoranet al.Proteomics5:3752 (2005))以及維庫柏等人，《實驗生物學(xué)雜志》(Wienkoop etal.J.Exp.Biol.59:3307(2008))。蛋白提取可以從一個樣品中通過本領(lǐng)域中已知的、任何現(xiàn)有的或未來的方法提取蛋白(或其片段)，這些方法包括但不限于由謝爾曼等人，《植物科學(xué)》(Sheoran et al.(PlantSciencel76:99 (2009))中描述的這些方法。以下是可以用來實行本發(fā)明的方法的提取流程的實例:1.TCA-丙酮提取將種子切片在液氮中研磨為細(xì)粉，并且用包含10% (w/v)三氯乙酸以及1% (w/v)DTT的丙酮進(jìn)行提取。將提取的樣品在-20° C儲存過夜并且然后在4° C以25，000xg離心20min。將所得的顆粒在-20° C用丙酮(包含1% (w/v) DTT)中的懸浮液洗滌I小時。I1.苯酚提取將種子切片在液氮中研磨為細(xì)粉，并且通過在Iml苯酚(Tris pH8.8緩沖的)以及Iml提取緩沖液(0.1M Tris-HCl pH8.8、5mM EDTA、20mMDTT、30%蔗糖)中進(jìn)一步研磨該粉末進(jìn)行提取。將提取的樣品在4° C以25，OOOx g離心IOmin之前，在4° C渦旋30min。在4° C以25，OOOx g離心20min之前，通過在-20° C添加5倍體積的、100%甲醇中的0.1M乙酸銨，在-20° C渦旋并孵化過夜，將來自苯酚層(上層)的蛋白沉淀出。將所得的顆粒用100%甲醇中的0.1M乙酸銨洗滌兩次，用80%丙酮洗滌兩次并且用80%丙酮(包含IOmM DTT)洗滌一次。II1.SDS 提取將種子切片研磨為細(xì)粉，并且在225mM Tris pH6.9,50%甘油、5%SDS以及250mMDTT中進(jìn)行提取。將提取的樣品在95° C孵化5min，然后在室溫以2，OOOx g離心15min。收集所得的上清液。IV.Tris-HCl 提取將種子切片在液氮中研磨為細(xì)粉，并且與包含50mM Tris-HCl pH8.8的Tris-HCl緩沖液、5mM EDTA、20mM DTTUOOmM KCl以及2mM甲苯磺酰氟(PMSF)混合。融化之后，將該混合物研磨額外的30min。V.Tris-HCl提取以及沉淀將種子切片在液氮中研磨為細(xì)粉，并且與包含50mM Tris-HCl pH8.8的Tris-HCl緩沖液、5mM EDTA、20mM DTTUOOmM KCl以及2mM甲苯磺酰氟(PMSF)混合。融化之后，在4° C以25，OOOx g離心20min之前,將該混合物在4° C研磨額外的30min。離心之前,通過添加5倍體積的100%丙酮，在-20° C渦旋并孵化2小時，將來自上清液的蛋白沉淀出。將所得的顆粒用80%丙酮洗滌兩次。V1.DESI “提取”將一種帶電荷的溶劑以一個角度電噴霧到樣品的表面上，致使離子化的蛋白或肽從該樣品表面釋放出。在某些實施例中，用帶電荷的溶劑噴霧之前，該樣品的表面被噴霧有蛋白酶溶液(例如，包含胰蛋白酶的溶液)。正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解的，該帶電荷的溶劑的組合物可以變化，取決于感興趣的一種或多種目標(biāo)蛋白。例如，該溶劑可能包含甲醇-水(1:1包含1%乙酸)或乙腈-水(1:1包含0.1%甲酸)。蛋白分離提取的蛋白可以通過本領(lǐng)域中已知的、任何現(xiàn)有的或未來的方法進(jìn)行分離，這些方法包括但不限于由謝爾曼等人，《蛋白質(zhì)組學(xué)》(Sheoran etal.Proteomics5:3752 (2005))中描述的這些方法。以下是可以用來實行本發(fā)明的方法的分離流程的實例:
1.一維(1-D)電泳將包含提取的蛋白的樣品與等體積的SDS還原緩沖液(2%SDS、25%甘油、0.5%β -巰基乙醇以及0.625mM Tris-HCl pH6.8)混合并且根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法通過SDS-PAGE進(jìn)行分離。參見，例如，雷米，《自然》(Laemmli, Nature227:680(1970))。將該凝膠進(jìn)行染色并分析?？梢允褂萌魏我阎姆椒▽υ撃z進(jìn)行染色，這些方法包括但不限于，考馬斯亮藍(lán)(CBB)染色、銀染色和/或SYPRO 紅寶石色染色(伯樂實驗室公司，加利福尼亞州，赫拉克勒斯(Bio-Rad Laboratories, Inc.，Hercules, CA))。例如，可以在4° C將該凝膠用在5:1:4甲醇:乙酸:水溶液里的0.25%CBB染色過夜并且在4° C用2:1:7甲醇:乙酸:水溶液脫色?？商娲?，可以將該凝膠在室溫用4:1:5甲醇:乙酸:水溶液里的0.1%CBB染色并且用4:1:5甲醇:乙酸:水溶液脫色I(xiàn)小時。可以根據(jù)任何已知的方法進(jìn)行銀染色，該方法包括但不限于，由莫茨等人，《蛋白質(zhì)組學(xué)》(Mortz etal.Proteomicsl:1359 (2001))中描述的方法。將該凝膠固定在1: 0.7:8.3甲醇:乙酸:水溶液中之后，可以進(jìn)行SYPRO 紅寶石色染色過夜?？梢允褂萌魏我阎姆椒?裝置來分析這些凝膠，該方法/裝置包括但不限于，視覺上檢查該凝膠以確定與感興趣的蛋白相對應(yīng)的點/帶是否存在于該凝膠中。I1.二維(2-D)電泳在22。C，使用再水合溶液(8M脲、2%CHAPS、20mM DTT、2%固定的pH梯度緩沖液(PH3-10)以及0.002%溴酚藍(lán))，將包含提取的蛋白的樣品載荷到具有4-7或3_10的線性pH梯度的ImmobiIine DryStrip (安瑪西亞生物科學(xué)公司，瑞典，烏普薩拉(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden))上持續(xù) 16 小時。使用 Multiphor II 水平電泳系統(tǒng)(GE醫(yī)療保健生命科學(xué)公司，新澤西州，皮斯卡塔韋(GE Healthcare LifeSciences, Piscataway, NJ))進(jìn)行第一維等電聚焦,應(yīng)用250V持續(xù)I小時,經(jīng)2小時漸升至3，500V,并且保持在3，500V直到總數(shù)達(dá)到75kVh。使用Protean II XI mult1-cell (伯樂實驗室公司，加利福尼亞州,赫拉克勒斯(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA))進(jìn)行第二維等電聚焦。將該條帶在平衡緩沖液(6M 脲、30% 甘油、2%SDS、50mM Tris-HCl pH8.8,0.01% 溴酚藍(lán)以及 IOmM DTT)中平衡15min,隨后在包含2%碘乙酰胺的平衡緩沖液平衡額外的15min。平衡之后，將該條帶應(yīng)用于垂直SDS聚丙烯酰胺凝膠(12%溶解并且5%堆積)上并且用在包含溴酚藍(lán)的SDS緩沖液中的0.5%低熔點的瓊脂糖密封。在10° C，將電泳在電泳緩沖液pH8.3 (25mM Tris堿、192mM甘氨酸以及0.1%SDS)中，在25mA持續(xù)30min并且在40mA持續(xù)3.5小時。將該凝膠進(jìn)行染色并分析。可以使用任何已知的方法對該凝膠進(jìn)行染色，該方法包括但不限于，考馬斯亮藍(lán)(CBB)染色、銀染色和/或SYPRO 紅寶石色染色(伯樂實驗室公司，加利福尼亞州，赫拉克勒斯(Bio-Rad Laboratories, Inc.，Hercules, CA))。例如，可以在4° C將該凝膠用在5:1:4甲醇:乙酸:水溶液里的0.25%CBB過夜染色并且4° C用2:1:7甲醇:乙酸:水溶液脫色?？商娲兀梢詫⒃撃z在室溫用4:1:5甲醇:乙酸:水溶液里的0.1%CBB染色并且用4:1:5甲醇:乙酸:水溶液脫色I(xiàn)小時?？梢愿鶕?jù)任何已知的方法進(jìn)行銀染色，該方法包括但不限于，由莫茨等人，《蛋白質(zhì)組學(xué)》(Mortz etal.Proteomicsl:1359 (2001))中描述的方法。將該凝膠固定在1: 0.7:8.3甲醇:乙酸:水溶液中之后，可以進(jìn)行SYPRO 紅寶石色染色過夜。可以使用任何已知的方法/裝置來分析這些凝膠，該方法/裝置包括但不限于，PhoretixTM2D(非線性動力學(xué)公司，英國，泰恩河畔紐卡斯?fàn)?Nonlinear Dynamics Ltd., Newcastle upon Tyne, UK)),Progenesis SameSpots(非線性動力學(xué)公司，英國，泰恩河畔紐卡斯?fàn)?Nonlinear Dynamics Ltd., Newcastleupon Tyne, UK))或者TOQuest (伯樂實驗室公司，加利福尼亞州，赫拉克勒斯(Bio-RadLaboratories, Inc., Hercules, CA))圖像分析軟件。蛋白消化提取的和/或分離的蛋白可以通過本領(lǐng)域中已知的、任何現(xiàn)有的或未來的方法進(jìn)行消化，該方法包括但不限于，由謝爾曼等人，《蛋白質(zhì)組學(xué)》(Sheoran etal.Proteomics5:3752 (2005))中描述的這些方法。以下是可以用來進(jìn)行本發(fā)明的方法的消化流程的實例:1.凝膠內(nèi)消化從染色的凝膠上切離對應(yīng)于感興趣的蛋白的點/帶，脫色、用DTT還原、烷基化并且用蛋白酶如胰蛋白酶進(jìn)行消化?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何裝置或系統(tǒng)切離該點/帶，這些裝置或系統(tǒng)包括但不限于，手持刀片，X-Acto 刀(埃爾默氏產(chǎn)品公司，俄亥俄州，哥倫布(Elmer，s Products, Inc., Columbus, OH))以及 Proteomefforks 2-D 點切割器(伯樂實驗室公司，加利福尼亞州，赫拉克勒斯(Bio-Rad Laboratories, Inc.，Hercules, CA))?？梢詫⒃擖c/帶(以及其中包含的這種或這些蛋白)脫色、還原、烷基化并且使用自動的MassPREP消化操作臺(微質(zhì)譜公司，英國，曼徹斯特(Micromass, Manchester, UK))進(jìn)行消化。I1.溶液內(nèi)消化在基于凝膠的分離科學(xué)試驗計劃不存在下，將提取的蛋白用一種酶進(jìn)行消化。可以使用胰蛋白酶溶液對提取的蛋白進(jìn)行消化。II1.DESI “消化”將一種帶電荷的溶劑以一個角度電噴霧到樣品的表面上，從而致使離子化的肽從該樣品表面釋放出。在某些實施例中，用帶電荷的溶劑噴霧之前，該樣品的表面被噴霧有蛋白酶溶液(例如，包含胰蛋白酶的溶液)。正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解的，該帶電荷的溶劑的組合物可以變化，取決于感興趣的一種或多種目標(biāo)蛋白。例如，該溶劑可能包含甲醇-水(1:1包含1%乙酸)或乙腈-水(1:1包含0.1%甲酸)。蛋白定量可以使用本領(lǐng)域中已知的、任何現(xiàn)有的或未來的方法進(jìn)行蛋白定量，該方法包括但不限于，由沙夫等人，《色譜分析雜志》(Schaff et al.J.Chromatography886:89 (2007));維庫柏等人，《實驗生物學(xué)雜志》(ffienkoop et al.J.Exp.Biol.59:3307 (2008))以及組斯克，《實驗生物學(xué)雜志》(Zieske J.Exp.Botany57:1501 (2006))中描述的方法。以下是可以用來實行本發(fā)明的方法的定量流程的實例:1.與同位素標(biāo)記的肽標(biāo)準(zhǔn)品比較通過將與感興趣的肽相關(guān)聯(lián)的峰和與同位素標(biāo)記的肽標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)聯(lián)的峰的相對強(qiáng)度進(jìn)行比較，以定量感興趣的蛋白。穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的肽標(biāo)準(zhǔn)品是合成的，所述標(biāo)準(zhǔn)品與感興趣的肽是化學(xué)上相同的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何方法識別感興趣的肽，該方法包括但不限于，由凱斯切等人，《分析化學(xué)和生物分析化學(xué)》(Kirsch et al.Anal.Bioanal.Chem.395 (11):57 (2009))以及麥克等人，《蛋白質(zhì)組學(xué)臨床應(yīng)用》(McKay etal.Proteomics Clin.Appl.1:1570 (2007))中描述的方法。該同位素標(biāo)記的肽標(biāo)準(zhǔn)品可以使用本領(lǐng)域中已知的任何方法合成，該方法包括但不限于，由戈伯等人，《美國科學(xué)院院刊》(Gerber et a 1.PNAS USAlOO: 6940 (2003))中描述的AQUA方法。其他適合的方法由賽倫與派克，《細(xì)胞》(Thelen and Peck Celll9:3339 (2007))所描述。在消化和/或離子化之前，將該同位素標(biāo)記的肽標(biāo)準(zhǔn)品引入已知量的樣品中。使用質(zhì)譜分析檢測感興趣的肽以及該同位素標(biāo)記的肽標(biāo)準(zhǔn)品。參見，例如，萊曼等人，《植物學(xué)雜志》(Lehmann et al.PlantJ.55:1039(2008))安德森與亨特，《分子和細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)》(Anderson and Hunter, Mo 1.Cell.Proteomics5:573 (2006))。I1.與非肽標(biāo)準(zhǔn)品比較通過將與感興趣的肽相關(guān)聯(lián)的峰和與已知標(biāo)準(zhǔn)品(例如，皮質(zhì)醇)相關(guān)聯(lián)的峰的相對強(qiáng)度進(jìn)行比較，以定量感興趣的蛋白?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何方法識別感興趣的肽，該方法包括但不限于，由凱斯切等人，《分析化學(xué)和生物分析化學(xué)》(Kirsch et al.Anal.Bioanal.Chem.395 (11):57 (2009))以及麥克等人，《蛋白質(zhì)組學(xué)臨床應(yīng)用》(McKay etal.Proteomics Clin.Appl.1:1570 (2007))中描述的方法。在消化/離子化/破碎之前或其過程中，將標(biāo)準(zhǔn)品如皮質(zhì)醇引入已知量的樣品中。II1.使用化學(xué)的肽標(biāo)記定量通過將與化學(xué)標(biāo)記的感興趣的肽(衍生自第一種子的樣品中)相關(guān)聯(lián)的一個峰和與化學(xué)標(biāo)記的感興趣的肽(衍生自一個或多個其他種子的一個或多個樣品中)相關(guān)聯(lián)的一個或多個峰的相對強(qiáng)度進(jìn)行比較，以定量感興趣的蛋白，其中，在衍生自該一個或多個其他種子的這個或這些樣品中的感興趣的肽與該第一種子樣品中的感興趣的肽是化學(xué)上相同的。將每一個樣品中的這些感興趣的肽用不同的化學(xué)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記(即，在衍生自該第一種子的樣品中的感興趣的肽具有一個與衍生自該一個或多個其他種子的該一個或多個樣品中的感興趣的肽不同的標(biāo)簽)并且將這些樣品混合并且使用質(zhì)譜分析一起進(jìn)行分析?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何方法化學(xué)標(biāo)記這些感興趣的肽，該方法包括但不限于，由組斯克，《實驗生物學(xué)雜志》(Zieske J.Exp.Botany57:1501 (2006))中描述的方法。例如，這些感興趣的肽可以使用針對相對和絕對定量的等壓標(biāo)簽(iTRAQ)、串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽(TMT)或同位素親和標(biāo)簽(iCAT)進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記。IV.無標(biāo)記定量通過將與衍生自第一種子的樣品中的感興趣的肽相關(guān)聯(lián)的一個峰和與衍生自一個或多個其他種子(例如，第二種子、第三種子、第四種子等等)的多個樣品中的感興趣的肽相關(guān)聯(lián)的多個峰的相對強(qiáng)度進(jìn)行比較，以定量感興趣的蛋白。將每一個樣品中的這些感興趣的肽在不存在任何標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行比較。在某些實施例中，使用選擇性離子監(jiān)控(SM)、選擇性反應(yīng)監(jiān)控(SRM)或多個反應(yīng)監(jiān)控(MRM)分析該感興趣的肽。SSM相對于感興趣的等位基因，種子的配型可以通過分析衍生自胚乳(已經(jīng)從該種子中去除)的一部分的樣品中的感興趣的蛋白的量進(jìn)行確定。在某些實施例中，將衍生自該胚乳的部分的樣品中的感興趣的蛋白量與一個或多個參比值進(jìn)行比較。這個或這些參比值可能與下列有關(guān)聯(lián):1.衍生自從一個參比種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量，該參比種子針對該感興趣的等位基因是純合的；2.衍生自從一個參比種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量，該參比種子針對該感興趣的等位基因是雜合的；3.衍生自從一個參比種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量，該參比種子不包含該感興趣的等位基因；4.衍生自從一個參比種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量，該參比種子不包含該感興趣的功能等位基因；5.衍生自從多個參比種子中去除的胚乳的多個部分的多個樣品中的感興趣的蛋白的平均量，這些參比種子針對該感興趣的等位基因是純合的；6.衍生自從多個參比種子中去除的胚乳的多個部分的多個樣品中的感興趣的蛋白的平均量，這些參比種子針對該感興趣的等位基因是雜合的；7.衍生自從多個參比種子中去除的胚乳的多個部分的多個樣品中的感興趣的蛋白的平均量，這些參比種子不包含該感興趣的等位基因；和/或8.衍生自從多個參比種子中去除的胚乳的多個部分的多個樣品中的感興趣的蛋白的平均量，這些參比種子不包含該感興趣的功能等位基因。在某些實施例中，將衍生自該種子(第一種子)胚乳部分的樣品中的感興趣的蛋白的量與衍生自已經(jīng)從一個第二種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量和/或衍生自已經(jīng)從一個第三種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量進(jìn)行比較。在某些此類實施例中，這三種種子是相同親本的子代。在某些實施例中，確定一個種子針對感興趣的等位基因是純合的，條件是衍生自已經(jīng)從該種子(一個第一種子)中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量是:1.實質(zhì)上與衍生自從一個參比種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量相關(guān)聯(lián)的參比值相等，該參比種子針對該感興趣的等位基因是純合的；2.實質(zhì)上與衍生自從多個參比種子中去除的胚乳的多個部分的多個樣品中的感興趣的蛋白的平均量相關(guān)聯(lián)的參比值相等，這些參比種子針對該感興趣的等位基因是純合的；3.至少是與衍生自從一個參比種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量相關(guān)聯(lián)的參比值的大約兩倍，該參比種子針對該感興趣的等位基因是雜合的；4.至少是與衍生自從多個參比種子中去除的胚乳的多個部分的多個樣品中的感興趣的蛋白的平均量相關(guān)聯(lián)的參比值的大約兩倍，這些參比種子針對該感興趣的等位基因是雜合的；或者5.至少是衍生自已經(jīng)從一個第二種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量的大約兩倍。在某些實施例中，確定一個種子針對感興趣的等位基因是雜合的，條件是衍生自已經(jīng)從該種子(一個第一種子)中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量是:1.與衍生自從一個參比種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量相關(guān)聯(lián)的參比值的大約一半，該參比種子針對該感興趣的等位基因是純合的；2.與衍生自從多個參比種子中去除的胚乳的多個部分的多個樣品中的感興趣的蛋白的平均量相關(guān)聯(lián)的參比值的大約一半，這些參比種子針對該感興趣的等位基因是純合的；3.實質(zhì)上與衍生自從一個參比種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量相關(guān)聯(lián)的參比值相等，該參比種子針對該感興趣的等位基因是雜合的；4.實質(zhì)上與衍生自從多個參比種子中去除的胚乳的多個部分的多個樣品中的感興趣的蛋白的平均量相關(guān)聯(lián)的參比值相等，這些參比種子針對該感興趣的等位基因是雜合的；或者5.衍生自已經(jīng)從一個第二種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量的大約一半。在某些實施例中，確定一個種子針對感興趣的等位基因是純合的，條件是衍生自已經(jīng)從該種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量是:1.實質(zhì)上與衍生自從一個參比種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量相關(guān)聯(lián)的參比值相等，該參比種子不包含該感興趣的等位基因；2.實質(zhì)上與衍生自從多個參比種子中去除的胚乳的多個部分的多個樣品中的感興趣的蛋白的平均量相關(guān)聯(lián)的參比值相等，這些參比種子不包含該感興趣的等位基因；3.實質(zhì)上與衍生自從一個參比種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量相關(guān)聯(lián)的參比值相等，該參比種子不包含該感興趣的等位基因的功能形；或者4.實質(zhì)上與衍生自從多個參比種子中去除的胚乳的多個部分的多個樣品中的感興趣的蛋白的平均量相關(guān)聯(lián)的參比值相等，這些參比種子不包含該感興趣的等位基因的功能形。在某些此類實施例中，與該感興趣的等位基因相關(guān)聯(lián)的所希望性狀的至少一個是該感興趣的蛋白或者感興趣的蛋白的可檢出量的下降或消除。在某些實施例中，可以確定一個種子針對感興趣的等位基因是純合的是因為衍生自已經(jīng)從該種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品包含可檢出量的感興趣的蛋白。在此類實施例中，與該感興趣的等位基因相關(guān)聯(lián)的所希望性狀的至少一個是該感興趣的蛋白或者可檢出量的感興趣的蛋白的存在。在某些此類實施例中，只有該種子針對該感興趣的等位基因純合，才產(chǎn)生該感興趣的蛋白。在某些實施例中，確定一個種子針對感興趣的等位基因是純合的是因為衍生自已經(jīng)從該種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中沒有可檢出量的感興趣的蛋白。在此類實施例中，與該感興趣的等位基因相關(guān)聯(lián)的所希望性狀的至少一個是該感興趣的蛋白或者可檢出量的感興趣的蛋白的不存在。在某些此類實施例中，除非該種子針對該感興趣的等位基因是純合的，該感興趣的蛋白以可檢出的量存在。預(yù)測具有所希望的性狀一個種子是否可能生產(chǎn)具有所希望的性狀的植物可以通過分析衍生自胚乳(已經(jīng)從該種子中去除)的一部分的樣品中的感興趣的蛋白的量進(jìn)行確定。在某些實施例中，將感興趣的蛋白量與一個或多個參比值進(jìn)行比較。這個或這些參比值可能與下列有關(guān)聯(lián):1.衍生自從一個參比種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量，該參比種子生產(chǎn)具有所希望的性狀的植物；2.衍生自從一個參比種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量，該參比種子生產(chǎn)缺乏所希望的性狀的植物；3.衍生自從多個參比種子中去除的胚乳的多個部分的多個樣品中的感興趣的蛋白的平均量，這些參比種子生產(chǎn)具有所希望的性狀的植物；和/或4.衍生自從多個參比種子中去除的胚乳的多個部分的多個樣品中的感興趣的蛋白的平均量，這些參比種子生產(chǎn)缺乏所希望的性狀的植物。在某些此類實施例中，將衍生自從該種子(一個第一種子)的胚乳部分的樣品中的感興趣的蛋白的量與衍生自已經(jīng)從一個第二種子中去除的胚乳部分的樣品中的感興趣的蛋白的量進(jìn)行比較。在某些此類實施例中，這兩種種子是相同親本的子代。在某些實施例中，可以確定一個種子可能生產(chǎn)具有所希望的性狀(與感興趣的蛋白的提高的產(chǎn)物相關(guān)聯(lián))的植物，條件是衍生自已經(jīng)從該種子(一個第一種子)中去除的胚乳的一部分的樣品中的感興趣的蛋白的量是:1.實質(zhì)上與衍生自從一個參比種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量相關(guān)聯(lián)的參比值相等，該參比種子生產(chǎn)具有所希望的性狀的植物；2.實質(zhì)上與衍生自從多個種子中去除的胚乳的多個部分的多個樣品中的感興趣的蛋白的平均量相關(guān)聯(lián)的參比值相等，這些種子生產(chǎn)具有所希望的性狀的植物；3.顯著大于與衍生自從一個參比種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量相關(guān)聯(lián)的參比值，該參比種子生產(chǎn)缺乏所希望的性狀的植物；4.顯著大于與衍生自從多個種子中去除的胚乳的多個部分的多個樣品中的感興趣的蛋白的平均量相關(guān)聯(lián)的參比值，這些種子生產(chǎn)缺乏所希望的性狀的植物；5.至少是與衍生自從一個參比種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量相關(guān)聯(lián)的參比值的大約兩倍，該參比種子生產(chǎn)缺乏所希望的性狀的植物；6.至少是與衍生自從多個種子中去除的胚乳的多個部分的多個樣品中的感興趣的蛋白的平均量相關(guān)聯(lián)的參比值的大約兩倍，這些種子生產(chǎn)缺乏所希望的性狀的植物；7.實質(zhì)上等于或大于衍生自已經(jīng)從一個第二種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量；8.至少是衍生自已經(jīng)從一個第二種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量的大約兩倍；和/或9.一個非零的量。在某些實施例中，可以確定一個種子可能生產(chǎn)具有所希望的性狀(與感興趣的蛋白的減少的產(chǎn)物相關(guān)聯(lián))的植物，條件是衍生自已經(jīng)從該種子(一個第一種子)中去除的胚乳的一部分的樣品中的感興趣的蛋白的量是:1.實質(zhì)上與衍生自從一個參比種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量相關(guān)聯(lián)的參比值相等，該參比種子生產(chǎn)具有所希望的性狀的植物；
2.實質(zhì)上與衍生自從多個種子中去除的胚乳的多個部分的多個樣品中的感興趣的蛋白的平均量相關(guān)聯(lián)的參比值相等，這些種子生產(chǎn)具有所希望的性狀的植物；3.顯著小于與衍生自從一個參比種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量相關(guān)聯(lián)的參比值，該參比種子生產(chǎn)缺乏所希望的性狀的植物；4.顯著小于與衍生自從多個種子中去除的胚乳的多個部分的多個樣品中的感興趣的蛋白的平均量相關(guān)聯(lián)的參比值，這些種子生產(chǎn)缺乏所希望的性狀的植物；5.至少是與衍生自從一個參比種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量相關(guān)聯(lián)的參比值的大約一半，該參比種子生產(chǎn)缺乏所希望的性狀的植物；6.至少是與衍生自從多個種子中去除的胚乳的多個部分的多個樣品中的感興趣的蛋白的平均量相關(guān)聯(lián)的參比值的大約一半，這些種子生產(chǎn)缺乏所希望的性狀的植物；7.實質(zhì)上等于或小于衍生自已經(jīng)從一個第二種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量；8.至少是衍生自已經(jīng)從一個第二種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中的感興趣的蛋白的量的大約一半；9.可忽略不計的；和/或10.不可檢出的。在某些實施例中，確定一個種子可能生產(chǎn)具有所希望的性狀的植物是因為衍生自已經(jīng)從該種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品包含可檢出量的感興趣的蛋白。在此類實施例中，所希望的性狀與感興趣的蛋白的存在相關(guān)聯(lián)。在某些此類實施例中，衍生自從多個種子(可能生產(chǎn)具有所希望的性狀的植物)中去除的胚乳的多個部分的多個樣品包含可檢出量的該感興趣的蛋白。在某些實施例中，可以確定一個種子可能生產(chǎn)具有所希望的性狀的植物是因為衍生自已經(jīng)從該種子中去除的胚乳的一部分的一個樣品中無可檢出量的感興趣的蛋白。在此類實施例中，所希望的性狀與感興趣的蛋白的不存在相關(guān)聯(lián)。在某些此類實施例中，衍生自從多個種子(可能生產(chǎn)具有所希望的性狀的植物)中去除的胚乳的多個部分的多個樣品中從未存在可檢出量的該感興趣的蛋白。提供了以下非限制性實例，從而進(jìn)一步說明本發(fā)明。實例以下實例并非旨在成為可以實施本發(fā)明的所有的不同方法、或所有的可以加至本發(fā)明的特征的詳細(xì)目錄。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解可以不脫離本發(fā)明而進(jìn)行多種變體以及對不同實施例進(jìn)行增添。因此，以下說明書旨在說明本發(fā)明的一些具體的實施例，并且不是窮盡性地限定所有的排列、組合以及其變體。實例I生產(chǎn)針對感興趣的等位基因純合的植物:使用同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定暈從多個玉蜀黍種子的每一個中去除胚乳的一部分-這些玉蜀黍種子的某些針對感興趣的等位基因是純合的，某些針對感興趣的等位基因是雜合的，某些不包含感興趣的等位基因，并且某些不包含處于功能形的感興趣的等位基因-以使得該胚乳的部分被去除之后，這些種子仍保持活力。在衍生自胚乳的每一個部分的樣品中進(jìn)行蛋白提取并且將提取的蛋白用胰蛋白酶進(jìn)行消化。將已知量的與蛋白水解的肽化學(xué)上相同的、同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品添加到這些樣品的每一個中，該蛋白水解的肽與感興趣的蛋白相關(guān)聯(lián)。使用三相四重液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對這些樣品(包括同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品)進(jìn)行分析。通過將與它的蛋白水解的肽相關(guān)聯(lián)的峰和與同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)聯(lián)的峰的相對強(qiáng)度進(jìn)行比較，以定量每一個樣品中的感興趣的蛋白(如果存在的話)?；诟信d趣的蛋白的可檢出量的存在或不存在以及感興趣的蛋白(如果可檢出的話)的量，將這些樣品分為三類。在第一類中的這些樣品不包含可檢出量的感興趣的蛋白。在第二類中的這些樣品包含感興趣的蛋白的可檢出量，該量大約X ng。在第三類中的這些樣品包含感興趣的蛋白的可檢出量，該量是至少大約2X ng。第一類中的這些樣品自其衍生的種子被鑒定為缺乏該感興趣的等位基因或者為缺乏處于功能形的該感興趣的等位基因。第二類中的這些樣品自其衍生的種子被鑒定為針對該感興趣的等位基因是雜合的。第三類中的這些樣品自其衍生的種子被鑒定為針對該感興趣的等位基因是純合的。使用第三類中的這些樣品自其衍生的種子生長植物。實例2生產(chǎn)針對感興趣的等位基因純合的植物:無標(biāo)記定暈從多個玉蜀黍種子的每一個中去除胚乳的一部分-這些玉蜀黍種子的某些針對感興趣的等位基因是純合的，某些針對感興趣的等位基因是雜合的，某些不包含感興趣的等位基因，并且某些不包含處于功能形的感興趣的等位基因-以使得該胚乳的部分被去除之后，這些種子仍保持活力。在衍生自胚乳的每一個部分的樣品中進(jìn)行蛋白提取并且將提取的蛋白用胰蛋白酶進(jìn)行消化。使用電噴霧離子化質(zhì)譜儀對每一個樣品進(jìn)行分析。針對每一個樣品，記錄與屬于該感興趣的蛋白的一種或多種蛋白水解的肽相關(guān)聯(lián)的這個或這些峰的強(qiáng)度。通過將一個樣品中的與屬于該感興趣的蛋白的一種或多種蛋白水解的肽相關(guān)聯(lián)的這個或這些峰的強(qiáng)度與一個或多個其他樣品中的與屬于該感興趣的蛋白的一種或多種蛋白水解的肽相關(guān)聯(lián)的這個或這些峰的強(qiáng)度進(jìn)行比較，定量每一個樣品中的感興趣的蛋白(如果存在的話)。基于感興趣的蛋白的可檢出量的存在或不存在以及感興趣的蛋白(如果存在的話)的量，將這些樣品分為三類。在第一類中的這些樣品不包含感興趣的蛋白的可檢出量。第二類中的這些樣品包含該感興趣的蛋白的可檢出的量，該量實質(zhì)上與針對該感興趣的等位基因雜合的種子相關(guān)聯(lián)的參比值相等和/或至少是與針對該感興趣的等位基因純合的種子相關(guān)聯(lián)的參比值的大約一半。第三類中的這些樣品包含可檢出的量的該感興趣的蛋白，該量實質(zhì)上與針對該感興趣的等位基因純合的種子相關(guān)聯(lián)的參比值相等和/或至少是與針對該感興趣的等位基因雜合的種子相關(guān)聯(lián)的參比值的大約兩倍。第一類中的這些樣品自其衍生的種子被鑒定為缺乏該感興趣的等位基因或者為缺乏處于功能形的該感興趣的等位基因。第二類中的這些樣品自其衍生的種子被鑒定為針對該感興趣的等位基因是雜合的。第三類中的這些樣品自其衍生的種子被鑒定為針對該感興趣的等位基因是純合的。使用第三類中的這些樣品自其衍生的種子生長植物。實例3生產(chǎn)針對感興趣的復(fù)等位基因純合的植物:多個轉(zhuǎn)基因事件從多個種子的每一個中去除胚乳的一部分，以使得該胚乳的部分被去除之后，這些種子仍保持活力；其中這些種子的每一個衍生自已經(jīng)根據(jù)熟知的方法(例如，經(jīng)由土壤桿菌素)被轉(zhuǎn)化的植物，以使得其包含多個轉(zhuǎn)基因，這些轉(zhuǎn)基因的每一個包括一個感興趣的等位基因。這些轉(zhuǎn)基因可能已經(jīng)被一起地(例如，經(jīng)由單次轉(zhuǎn)化，其中多個轉(zhuǎn)基因是單個構(gòu)建體的部分)或分別地(例如，經(jīng)由多次轉(zhuǎn)化，其中使用多個構(gòu)建體將這些轉(zhuǎn)基因引入該植物中)或以其任意組合地引入該植物中。使用質(zhì)譜分析法對衍生自胚乳的每一個部分的樣品、多個感興趣的蛋白的每一個的量-它們每一個都與感興趣的等位基因相關(guān)聯(lián)-進(jìn)行定量?；诿恳粋€樣品中的每一種感興趣的蛋白的量，將這些樣品分為不同類。例如，一類中的樣品可能不包含任意感興趣的蛋白的可檢出量。另一類中的樣品可能包含可檢出量的每一種感興趣的蛋白。又另一類中的樣品中，以任意組合地，可能不包含可檢出量的一種感興趣的蛋白，但是可能包含可檢出量的另一種感興趣的蛋白。相對于每一個感興趣的等位基因，基于與該等位基因相關(guān)聯(lián)的感興趣的蛋白的量，確定每一個種子的配型(如上所述)。使用被鑒定為針對某些或全部感興趣的等位基因純合的種子生長植物。實例4生產(chǎn)具有所希望的性狀的植物:使用同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定暈從多個玉蜀黍種子的每一個中去除胚乳的一部分-這些玉蜀黍種子的某些可能生產(chǎn)具有所希望的性狀的植物并且某些可能生產(chǎn)缺乏所希望的性狀的植物-以使得該胚乳的部分被去除之后，這些種子仍保持活力。所希望的性狀與感興趣的蛋白產(chǎn)物的提高相關(guān)聯(lián)。在衍生自胚乳的每一個部分的樣品中進(jìn)行蛋白提取并且將提取的蛋白用胰蛋白酶進(jìn)行消化。將已知量的與蛋白水解的肽化學(xué)上相同的、同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品添加到這些樣品中，該蛋白水解的肽與感興趣的蛋白相關(guān)聯(lián)。使用三相四重液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對這些樣品(包括同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品)進(jìn)行分析。通過將與它的蛋白水解的肽相關(guān)聯(lián)的峰和與同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)聯(lián)的峰的相對強(qiáng)度進(jìn)行比較，以定量每一個樣品中的感興趣的蛋白(如果存在的話)?；诿恳粋€樣品中的感興趣的蛋白的量，將這些樣品分為兩類。第一類中的這些樣品包含以下量的該感興趣的蛋白，該量實質(zhì)上與生產(chǎn)缺乏所希望的性狀的植物的種子相關(guān)聯(lián)的參比值相等和/或顯著小于與生產(chǎn)具有所希望的性狀的植物的種子相關(guān)聯(lián)的參比值。第二類中的這些樣品包含以下量的該感興趣的蛋白，該量實質(zhì)上與生產(chǎn)具有所希望的性狀的植物的種子相關(guān)聯(lián)的參比值相等和/或顯著大于與生產(chǎn)缺乏所希望的性狀的植物的種子相關(guān)聯(lián)的參比值。第一類中的這些樣品自其衍生的種子被鑒定為可能生產(chǎn)缺乏所希望的性狀的植物。第二類中的這些樣品自其衍生的種子被鑒定為可能生產(chǎn)具有所希望的性狀的植物。
使用第二類中的這些樣品自其衍生的種子生長植物。
權(quán)利要求
1.一種用于識別針對感興趣的等位基因純合的種子的方法，包括: (a)從該種子中去除胚乳的一部分； (b)使用質(zhì)譜分析法來定量衍生自該胚乳的部分的樣品中的一種感興趣的蛋白；并且 (C)確定該種子針對該感興趣的等位基因是純合的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在該胚乳的部分去除之后，該種子仍保持活力。
3.一種用于生產(chǎn)針對感興趣的等位基因純合的植物的方法，包括: (a)從一種種子中去除胚乳的一部分，以使得該胚乳的部分去除之后，該種子仍保持活力； (b)使用質(zhì)譜分析法來定量衍生自該胚乳的部分的樣品中的一種感興趣的蛋白； (C)確定該種子針對該感興趣的等位基因純合；并且 (d)從該種子生長一種植物，由此生產(chǎn)針對該感興趣的等位基因純合的植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(b)包括將與該感興趣的肽相關(guān)聯(lián)的峰和與已知量的一種標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)聯(lián)的峰的相對強(qiáng)度進(jìn)行比較。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)品可以是一種同位素標(biāo)記的、與該感興趣的肽化學(xué)上相同的肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(b)包括將衍生自一個第一種子的該種子的胚乳部分的樣品中的感興趣的 蛋白的量與衍生自一個第二種子的胚乳部分的樣品中的感興趣的蛋白的量進(jìn)行比較。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(c)包括確定來自一個第一種子的該種子的胚乳部分的樣品中的感興趣的蛋白的量是至少來自一個第二種子樣品的量的大約兩倍。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中步驟(c)進(jìn)一步包括確定來自一個第三種子的樣品不包含可檢出量的該感興趣的蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中該第一種子、第二種子以及第三種子是相同親本的子代。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，進(jìn)一步包括確定該第二種子針對該感興趣的等位基因是雜合的，確定該第三種子不包含該感興趣的等位基因，和/或確定該第三種子不包含處于功能形的該感興趣的等位基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(C)包括確定衍生自該種子的胚乳部分的樣品包含一個可檢出量的該感興趣的蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(c)包括確定衍生自該種子的胚乳部分的樣品不包含可檢出量的該感興趣的蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(c)包括將衍生自該種子的胚乳部分的樣品中的該感興趣的蛋白的量與參比值進(jìn)行比較。
14.一種用于識別針對感興趣的等位基因純合的種子的系統(tǒng)，包括: (a)用于從該種子中去除胚乳的一部分的裝置；以及 (b)用于使用質(zhì)譜分析法來定量衍生自該胚乳部分的樣品中的感興趣的蛋白的裝置。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的系統(tǒng)，其中在該胚乳的部分去除之后，該種子仍保持活力。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的系統(tǒng)，進(jìn)一步包括用于從該種子生長一種植物，由此生長一種針對該感興趣的等位基因純合的植物的裝置。
17.一種用于識別可能生產(chǎn)具有所希望性狀的植物的種子的方法，包括: (a)從該種子中去除胚乳的一部分； (b)使用質(zhì)譜分析法來定量衍生自該胚乳的部分的樣品中的一種感興趣的蛋白；并且 (C)確定該種子可能生產(chǎn)具有一種所希望性狀的植物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中在該胚乳的部分去除之后，該種子仍保持活力。
19.一種用于生產(chǎn)具有所希望性狀的植物的方法，包括: (a)從種子中去除胚乳的一部分，以使得該胚乳的部分去除之后，該種子仍保持活力； (b)使用質(zhì)譜分析法來定量衍生自該胚乳的部分的樣品中的一種感興趣的蛋白； (C)確定該種子可能生產(chǎn)一種具有所希望性狀的植物；并且 (d)從該種子生長一種植物，由此生產(chǎn)一種具有所希望性狀的植物。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中步驟(b)包括將與該感興趣的肽相關(guān)聯(lián)的峰和與已知量的一種標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)聯(lián)的峰的相對強(qiáng)度進(jìn)行比較。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)品可以是一種同位素標(biāo)記的、與感興趣的肽化學(xué)上相同的肽。
22.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中步驟(b)包括將衍生自一個第一種子的該種子的胚乳部分的樣品中的感興趣的蛋白的量與衍生自一個第二種子的胚乳部分的樣品中的感興趣的蛋白的量進(jìn)行比較。
23.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中步驟(c)包括確定衍生自該種子的胚乳部分的樣品包含一個可檢出量的該感興趣的蛋白。
24.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中步驟(c)包括確定衍生自該種子的胚乳部分的樣品不包含可檢出量的該感興趣的蛋白。
25.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中步驟(c)包括將衍生自該種子的胚乳部分的樣品中的該感興趣的蛋白的量與一個參比值進(jìn)行比較。
26.一種用于識別可能生產(chǎn)具有所希望性狀的植物的種子的系統(tǒng)，包括: (a)用于從該種子中去除胚乳的一部分的裝置；以及 (b)用于使用質(zhì)譜分析法來定量衍生自該胚乳部分的樣品中的一種感興趣的蛋白的裝置。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的系統(tǒng)，其中在該胚乳的部分去除之后，該種子仍保持活力。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的系統(tǒng)，進(jìn)一步包括用于從該種子生長一種植物，由此生長一種可能具有所希望性狀的植物的裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及識別針對感興趣的等位基因純合的種子，和/或用于識別可能生產(chǎn)具有所希望性狀的植物的種子的方法與系統(tǒng)。還提供了生產(chǎn)針對感興趣的等位基因純合和/或具有所希望性狀的植物的方法。
文檔編號G01N30/72GK103154733SQ201180048549
公開日2013年6月12日 申請日期2011年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月4日
發(fā)明者S.S.巴蘇 申請人:先正達(dá)參股股份有限公司