專利名稱：抗生腱蛋白-c a2抗體及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)生腱蛋白-C A2結(jié)構(gòu)域(A2domain of tenascin-C, TNC A2)特異性的抗體。另外，本發(fā)明涉及編碼此類抗體的多核苷酸，及包含此類多核苷酸的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于生成該抗體的方法和在疾病的治療中使用它們的方法。
背景技術(shù)：
生腱蛋白C和抗生腱蛋白C抗體生腱蛋白是在脊椎動(dòng)物中找到的，較大多聚體細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)糖蛋白的一個(gè)高度保守的家族。已經(jīng)在哺乳動(dòng)物中鑒定出四種生腱蛋白旁系同源物(paralogue)，稱作生腱蛋白-C、生腱蛋白-R、生腱蛋白-X和生腱蛋白-W。生腱蛋白家族蛋白質(zhì)共同的一級(jí)結(jié)構(gòu)，其包含N端七段重復(fù)、表皮生長因子(EGF)樣重復(fù)、纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域重復(fù)和C端纖連蛋白樣球狀結(jié)構(gòu)域。經(jīng)由N段寡聚化結(jié)構(gòu)域，亞基個(gè)體裝配成三聚體，或在生腱蛋白-C的情況中，裝配成六聚體。

哺乳動(dòng)物生腱蛋白-C單體通常具有由所有生腱蛋白-C同等型共享的14.5個(gè)EGF樣重復(fù)和8個(gè)纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域重復(fù)。然而，通過可變剪接，能獨(dú)立包括或排除多至9個(gè)另外的纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域重復(fù)(結(jié)構(gòu)域Al至D)，產(chǎn)生多種生腱蛋白-C同等型(參見例如 Hsia and Schwarzbauer, J Biol Chem280, 26641-26644 (2005))。生腱蛋白-C在發(fā)育的胚胎中瞬時(shí)表達(dá)，但是在成年組織中實(shí)際上缺失。然而，它在經(jīng)歷重塑過程的組織中再現(xiàn)，包括某些病理狀況，諸如傷口愈合、炎癥和癌癥(綜述Chiquet-Ehrismann&Chiquet, J Pathol200, 488-499(2003))。重要的是，生腱蛋白-C在大多數(shù)惡性實(shí)體瘤中高度表達(dá)，包括腦、乳房/乳腺、結(jié)腸、肺、皮膚和其它器官的腫瘤(綜述Orend and Chiquet-Ehrismann, CancerLetters244, 143-163 (2006))，在那里它可以由轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞以及腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)(Yoshida et al., J Pathol 182，421-428 (1997)，Hanamura et al., Int JCancer73, 10-15(1997))。特別地，含有可變剪接結(jié)構(gòu)域Al至D的生腱蛋白-C “較大同等型”在侵入性癌瘤中表達(dá)，而在健康成年組織中幾乎檢測不到(Borsi et al.，Int J Cancer52, 688-692(1992), Carnemolla et al., Eur J Biochem205, 561-567(1992))。它的表達(dá)樣式使得生腱蛋白-C (特別是它的可變剪接結(jié)構(gòu)域)成為腫瘤靶向應(yīng)用的一種有希望抗原，而且因此開發(fā)了針對(duì)該蛋白質(zhì)中數(shù)種結(jié)構(gòu)域的一些抗體(參見例如Brack et al., Clin Cancer Resl2, 3200-3208 (2006)或 EP1817345，描述針對(duì)生腱蛋白-CAl 結(jié)構(gòu)域的抗體；Silacci et al., Prot Eng DesSell9, 471-478 (2006)或 EP1173766，描述針對(duì)生腱蛋白-C C結(jié)構(gòu)域的抗體；Wang et al.，Hybridoma29, 13-16 (2010),描述針對(duì)生腱蛋白C D結(jié)構(gòu)域的抗體；或Balza et al.，F(xiàn)EBS332，39_43 (1993)，描述針對(duì)人生腱蛋白不同結(jié)構(gòu)域的數(shù)種抗體)。最近，還描述了一種識(shí)別人生腱蛋白-C A2結(jié)構(gòu)域中特定表位的抗體(W02009/089998)?？贵w糖基化
寡糖組分可以顯著影響與治療性糖蛋白的功效有關(guān)的特性，包括物理穩(wěn)定性、對(duì)蛋白酶攻擊的抗性、與免疫系統(tǒng)的相互作用、藥動(dòng)學(xué)、和特定生物學(xué)活性。此類特性可以不僅取決于寡糖的存在或缺乏，而且還取決于寡糖的特定結(jié)構(gòu)?？梢宰龀龉烟墙Y(jié)構(gòu)與糖蛋白功能間的一些概括。例如，某些寡糖結(jié)構(gòu)經(jīng)由與特定碳水化合物結(jié)合蛋白的相互作用來介導(dǎo)糖蛋白自血流的快速清除，而其它寡糖結(jié)構(gòu)可以被抗體結(jié)合，并且觸發(fā)不想要的免疫反應(yīng)。(Jenkins et al., Nature Biotechnoll4, 975-81 (1996))。IgGl型抗體(即癌癥免疫療法中最常使用的抗體)是在每個(gè)CH2域中的Asn297處具有保守的N連接的糖基化位點(diǎn)的糖蛋白。附著于Asn297的兩個(gè)復(fù)合雙觸角寡糖掩埋于CH2域間，與多肽主鏈形成廣泛的接觸，并且其存在對(duì)于抗體介導(dǎo)效應(yīng)器功能諸如抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)是至關(guān)重要的(Lifely et al.，Glycobiology5，813-822 (1995);Jefferis et al., Tmmunol Revl63,59-76(1998);Wright and Morrison, TrendsBiotechnoll5，26-32(1997))。蛋白質(zhì)工程研究顯示了 Fe γ R與IgG CH2結(jié)構(gòu)域的下部鉸鏈區(qū)相互作用。Lund et al.，J.1mmunol.157:4963-69 (1996)。然而，F(xiàn)e Y R 結(jié)合還需要 CH2 區(qū)中的寡糖存在。Lund et al., J.1mmunol.157:4963-69 (1996) ; Wright andMorrison, Trends Biotech.15:26-31 (1997)提示,或是寡糖和多肽二者直接促成相互作用位點(diǎn)，或是維持活性CH2多肽構(gòu)象需要寡糖。因此可以探索寡糖結(jié)構(gòu)的修飾，作為提高IgGl和Fe Y R之間相互作用親和力和提高IgGl的ADCC活性的一種手段。一種獲得單克隆抗體效力大幅升高的方式是通過工程化改造它們的寡糖組分來增強(qiáng)其天然的、細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)器功能，如記載于Umafsa et al.，NatBiotechnol 17，176-180 (1999)和美國專利 N0.6，602，684 (W099/54342)，在此通過提及而完整收錄其內(nèi)容。1Umafia等顯示了 β (1，4)-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII)(—種催化兩分型寡 糖形成的糖基轉(zhuǎn)移酶)在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中的過表達(dá)顯著提高在那些細(xì)胞中生成的抗體的體外ADCC活性。生產(chǎn)細(xì)胞系中的GnTIII過表達(dá)產(chǎn)生富含兩分型寡糖(通常也是非巖藻糖基化的且是雜合物類型的)的抗體。如果在GnTIII之夕卜，生產(chǎn)細(xì)胞系中還過表達(dá)甘露糖苷酶II (ManII)，那么獲得富含復(fù)合物類型的兩分型非巖藻糖基化寡糖的抗體(Ferrara et al., Biotechn Bioeng93, 851-861 (2006))。與具有未修飾聚糖的抗體相比，這兩種類型的抗體顯示強(qiáng)烈增強(qiáng)的ADCC，但是只有其中大部分N-聚糖屬于復(fù)合物類型的抗體能夠誘導(dǎo)顯著的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(Ferraraet al.,Biotechn Bioeng93, 851-861 (2006))。Asn297 碳水化合物的組成改變或其消除也影響抗體Fe域?qū)e Y受體(FcyR)和補(bǔ)體Clq蛋白的結(jié)合，這分別對(duì)于ADCC和 CDC 是重要的(Umana et al., Nat Biotechnoll7, 176-180(1999) ;Davies etal.,Biotechnol Bioeng74,288-294(2001);Mimura et al., J Biol Chem276, 45539-45547(2001) ;Radaev et al., J Biol Chem276, 16478-16483(2001);Shields et al., J BiolChem276, 6591-6604(2001);Shields et al., J Biol Chem277, 26733-26740(2002);Simmons et al., J Tmmunol Methods263, 133-147 (2002))。發(fā)明概述本發(fā)明提供了特異性結(jié)合生腱蛋白-C A2結(jié)構(gòu)域、具有高親和力和/或增強(qiáng)的效應(yīng)器功能的抗體。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合TNC A2的抗體，其包含SEQ ID N03，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45 和 47 所列至少一個(gè)(即一
個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè))互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含選自 SEQ ID N03，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45 和 47的三個(gè)重鏈CDR (即HCDR1、HCDR2、和HCDR3)和/或三個(gè)輕鏈CDR (即LCDR1、LCDR2、和LCDR3)。在一個(gè)更特別的實(shí)施方案中，該抗體包含選自SEQ ID N055，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89和91所列重和輕鏈可變區(qū)序列的抗體重鏈可變區(qū)和/或抗體輕鏈可變區(qū)，特別是重和輕鏈可變區(qū)二者。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含F(xiàn)e區(qū)，特別是IgG Fe區(qū)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體是全長抗體，特別是IgG類抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含人抗體恒定區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體是人的。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體糖工程化改造成具有Fe區(qū)中經(jīng)過修飾的寡糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，與非糖工程化抗體相比，該抗體具有Fe區(qū)中比例升高的非巖藻糖基化和/或兩分型寡糖(bisectedoligosaccharide)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體具有升高的效應(yīng)器功能和/或升高的Fe受體結(jié)合親和力。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，升高的效應(yīng)器功能是升高的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體以低于約I μ M、優(yōu)選低于約ΙΟΟηΜ、最優(yōu)選低于約InM的Kd值結(jié)合人TNC A2。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體是親和力成熟的。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體結(jié)合人組織中的TNC A2。在其它方面，本發(fā)明還涉及與該抗體有關(guān)的多肽、多核苷酸、宿主細(xì)胞、和表達(dá)載體。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及制備該抗體的方法。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及使用該抗體的方法，特別是用于治療以TNC A2表達(dá)為特征的疾病(諸如癌癥)。附圖簡述

圖1顯示親和力成熟抗TNC A2Fab片段結(jié)合人(hu)TNC A2的基于表面等離振子共振(SPR)的動(dòng)力學(xué)分析。為克隆2B10_C3B6(A)、克隆2B10_6A12(B)、克隆2B10_C3A6(C)、克隆2B10_07D8(D)、克隆2B10_01F7(E)和克隆2B10_6H10(F)呈現(xiàn)了經(jīng)過加工的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)集。平滑線呈現(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)1:1相互作用模型的整體擬合。圖2 (A)顯示2B10抗TNC A2Fab片段結(jié)合人、鼠和獼猴TNC A2的基于SPR的動(dòng)力學(xué)分析。小圖(B)顯示2B10抗TNC A2人IgG結(jié)合人、鼠和獼猴TNCA2的基于SPR的動(dòng)力學(xué)分析，如實(shí)施例7所述。圖3(A)顯示正常(上部小圖)和腫瘤(下部小圖)人子宮組織的免疫組織化學(xué)圖像，100倍(左邊小圖)和400倍(中間小圖)放大倍數(shù)，用與FLAG片段融合的Fab片段中2B10可變區(qū)(SHD2B10-FLAG)染色。右邊小圖:對(duì)照，100倍放大倍數(shù)。⑶顯示各種人組織樣品中TNC A2的表達(dá)水平，依據(jù)免疫熒光表面積％，用與FLAG片段融合的Fab片段中2B10可變區(qū)(SHD2B10-FLAG)染色。來自健康個(gè)體和癌癥患者的各種人組織樣品用SHD2B10-FLAGFab片段染色，如實(shí)施例8所述。圖4㈧至(N)，顯示人組織的免疫組織化學(xué)圖像100倍(左邊小圖)和400倍(中間小圖)放大倍數(shù)，用SHD2B10-小鼠IgG染色，如實(shí)施例8所述。以100倍放大倍數(shù)顯示用同種型對(duì)照抗體染色(右邊小圖)。上部小圖:正常組織，下部小圖:腫瘤組織。(A)腦，(B)乳房/乳腺，(C)結(jié)腸，(D)腎，(E )肝，(F)肺，(G)卵巢，(H) mm, (I)前列腺，(J)骨骼肌，(K)皮膚，(L)小腸，(M)胃，(N)子宮。圖5顯示2B10衍生人IgG對(duì)U87MG成膠質(zhì)細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的TNCA2的結(jié)合，通過流式細(xì)胞術(shù)測定(見實(shí)施例9)。顯示了用不同濃度的2B10IgG處理的細(xì)胞的均值熒光強(qiáng)度，與未處理細(xì)胞和僅僅用二抗染色的細(xì)胞(陰性對(duì)照)比較。圖6顯示野生型2B10人IgG的純化和分析。A)蛋白A親和層析純化步驟。B)大小排阻層析純化步驟。C)分析性SDS-PAGE。實(shí)驗(yàn)規(guī)程如實(shí)施例1所述。圖7顯示糖工程化2B10人IgG的純化和分析。A)蛋白A親和層析純化步驟。B)大小排阻層析純化步驟。C)分析性SDS-PAGE。D)分析性大小排阻層析。實(shí)驗(yàn)規(guī)程如實(shí)施例I所述。圖8顯示野生型(wt)和糖工程化(ge)形式的抗TNC A2抗體2B10對(duì)U87MG細(xì)胞上的TNC A2的結(jié)合。發(fā)明詳述1.定義 出于本文中的目的，“受體人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定義的人共有框架衍生的輕鏈可變域(VL)框架或重鏈可變域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受體人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列變化。在一些實(shí)施方案中，氨基酸變化的數(shù)目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些實(shí)施方案中，VL受體人框架與VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同?！坝H和力”指分子(例如抗體)的單一結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體(例如抗原)之間全部非共價(jià)相互作用總和的強(qiáng)度。除非另有指示，如本文中使用的，“結(jié)合親和力”指反映結(jié)合對(duì)的成員(例如抗體和抗原)之間1:1相互作用的內(nèi)在結(jié)合親和力。分子X對(duì)其配偶體Y的親和力通?？梢杂媒怆x常數(shù)(Kd)來表述，它是解離和結(jié)合速率常數(shù)(分別為UP km)之t匕。如此，等同的親和力可包含不同的速率常數(shù)，只要速率常數(shù)之比保持相同。親和力可以通過本領(lǐng)域知道的常用方法來測量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于測量結(jié)合親和力的具體的說明性和例示性的實(shí)施方案?！坝H和力成熟的”抗體指在一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)(HVR)(例如⑶R)中具有一處或多處改變(例如氨基酸突變)的抗體，與不擁有此類改變的親本抗體相比，此類改變導(dǎo)致該抗體對(duì)抗原的親和力改善。典型地，親和力成熟的抗體與親本抗體結(jié)合相同表位。術(shù)語“抗生腱蛋白-C A2抗體”和“結(jié)合生腱蛋白-C A2結(jié)構(gòu)域的抗體”指能夠以足夠親和力結(jié)合TNC A2，使得該抗體可作為診斷劑和/或治療劑用于靶向TNC A2的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)例如通過放射免疫測定法(RIA)的測量，抗TNC A2抗體結(jié)合無關(guān)的、非TNC A2的蛋白質(zhì)的程度小于該抗體對(duì)TNC A2的結(jié)合的約10%。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合 TNC A2 的抗體具有彡 ΙμΜ、彡 ΙΟΟηΜ、彡 ΙΟηΜ、彡 InM、彡 0.1nM、彡 0.0lnM、或彡 0.0OlnM(例如10_8M或更少，例如10_8M到10_13M，例如10_9M到I(T13M)的解離常數(shù)(Kd)。在某些實(shí)施方案中，抗TNC A2抗體結(jié)合在來自不同物種的TNC A2中保守的TNC A2表位。本文中的術(shù)語“抗體”以最廣義使用，并且涵蓋各種抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的抗原結(jié)合活性。還包括具有Fe區(qū)的抗體片段，和包含與免疫球蛋白Fe區(qū)等同的區(qū)域的融合蛋白?！翱贵w片段”指與完整抗體不同的分子，其包含完整抗體中結(jié)合完整抗體結(jié)合的抗原的部分?？贵w片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’)2、單鏈抗體分子(例如scFv )、雙抗體、和由抗體片段形成的多特異性抗體。與參照抗體“結(jié)合相同表位的抗體”指在競爭測定法中將參照抗體對(duì)其抗原的結(jié)合阻斷50%或更多的抗體，且相反，參照抗體在競爭測定法中將該抗體對(duì)其抗原的結(jié)合阻斷50%或更多。本文中提供了例示性的競爭測定法。術(shù)語“抗原結(jié)合域”指抗原結(jié)合分子中包含特異性結(jié)合部分或整個(gè)抗原并與部分或整個(gè)抗原互補(bǔ)的區(qū)域的部分。在抗原較大的情況中，抗原結(jié)合分子可以僅結(jié)合抗原的特定部分，該部分稱作表位?？乖Y(jié)合域可以由例如一個(gè)或多個(gè)抗體可變域(也稱作抗體可變區(qū))提供。優(yōu)選地，抗原結(jié)合域包含抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)。術(shù)語“嵌合”抗體指其中的重和/或輕鏈的一部分自特定的來源或物種衍生，而重和/或輕鏈的剩余部分自不同來源或物種衍生的抗體。對(duì)于例如嵌合抗體，非抗原結(jié)合構(gòu)件可以自極其多種物種，包括靈長類諸如黑猩猩和人衍生。人源化抗體是嵌合抗體的一種特別優(yōu)選的形式?？贵w的“類”指其重鏈擁有的恒定域或恒定區(qū)的類型?？贵w有5大類:IgA、IgD、IgE、IgGjP IgM，并且這些中的幾種可以進(jìn)一步分成亞類(同種型)，例如，IgG1, IgG2, IgG3、IgG4 JgA1、和IgA2。與不同類免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作α、δ、ε、Y、和μ。在用于本文時(shí)，術(shù)語“細(xì)胞毒劑”指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞死亡或破壞的物質(zhì)。細(xì)胞毒劑包括但不限于:放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y9°、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素);化學(xué)治療劑或藥物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、長春花生物堿類(vinca alkaloids)(長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅霉素(daunorubicin)或其它 嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或者細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體 '及下文公開的各種抗腫瘤或抗癌劑?！靶?yīng)器功能”指那些可歸于抗體Fe區(qū)且隨抗體同種型而變化的生物學(xué)活性。抗體效應(yīng)器功能的例子包括:Clq結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC) ；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞因子分泌；免疫復(fù)合物介導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞的抗原攝取；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體)下調(diào)；和B細(xì)胞活化。藥劑(例如藥物配制劑)的“有效量”指在必需的劑量和時(shí)段上有效實(shí)現(xiàn)期望的治療或預(yù)防結(jié)果的量。本文中的術(shù)語“Fe區(qū)”用于定義免疫球蛋白重鏈中至少含有恒定區(qū)一部分的C端區(qū)。該術(shù)語包括天然序列Fe區(qū)和變體Fe區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人IgG重鏈Fe區(qū)自Cys226，或自Pro230延伸至重鏈的羧基端。然而，F(xiàn)e區(qū)的C端賴氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有規(guī)定，F(xiàn)e區(qū)或恒定區(qū)中的氨基酸殘基的編號(hào)方式依照EU編號(hào)系統(tǒng)，又稱作EU 索弓 I,如記載于 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991。術(shù)語“與免疫球蛋白的Fe區(qū)等同的區(qū)域”意圖包括免疫球蛋白的Fe區(qū)的天然存在等位變體及具有產(chǎn)生替代、添加、或刪除的變化，但是沒有實(shí)質(zhì)性降低免疫球蛋白介導(dǎo)效應(yīng)器功能(諸如抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性)的能力的變體。例如，可以在沒有實(shí)質(zhì)性生物學(xué)功能損失的情況中自免疫球蛋白Fe區(qū)的N端或C端刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域中已知的一般規(guī)則來選擇此類變體，使得對(duì)活性具有最小的影響。(見例如Bowie，J.U.等，Science247:1306-10 (1990))。
“框架”或“FR”指除高變區(qū)(HVR)(或⑶R)殘基外的可變域殘基。一般地，可變域的FR由4個(gè)FR域組成:FR1、FR2、FR3、和FR4。因而，HVR和FR序列在VH (或VL)中一般以如下的順序出現(xiàn):FR1-H1 (LI) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4。術(shù)語“全長抗體”、“完整抗體”、和“全抗體”在本文中可互換使用，指與天然抗體結(jié)構(gòu)具有基本上類似的結(jié)構(gòu)或者具有含有如本文中所限定的Fe區(qū)的重鏈的抗體。術(shù)語“宿主細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞系”、和“宿主細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，并且指已經(jīng)導(dǎo)入外源核酸的細(xì)胞，包括此類細(xì)胞的后代。宿主細(xì)胞包括“轉(zhuǎn)化體”和“經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”，其包括原代的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞及自其衍生的后代而不考慮傳代的次數(shù)。后代在核酸內(nèi)容物上可以與親本細(xì)胞不完全相同，而是可以含有突變。本文中包括具有與在初始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選或選擇的相同功能或生物學(xué)活性的突變體后代。在一個(gè)實(shí)施方案中，將宿主細(xì)胞工程化改造成容許生成具有經(jīng)修飾寡糖的抗體。在某些實(shí)施方案中，已經(jīng)對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)一步操作以表達(dá)升高水平的一種或多種具有β (I, 4)-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III (GnTIII)活性的多肽。宿主細(xì)胞包括培養(yǎng)的細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞，諸如CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、NSO細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、YO骨髓瘤細(xì)胞、Ρ3Χ63小鼠骨髓瘤細(xì)胞、PER細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、和植物細(xì)胞等等，而且還有轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物或培養(yǎng)的植物或動(dòng)物組織內(nèi)包含的細(xì)胞?！叭丝贵w”指擁有與由人或人細(xì)胞生成的或利用人抗體全集或其它人抗體編碼序列自非人來源衍生的抗體的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的抗體。人抗體的此定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體?！叭斯灿锌蚣堋敝复砣嗣庖咔虻鞍譜L或VH框架序列選集中最常存在的氨基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列選集來自可變域序列亞組。通常，序列亞組是如 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，NIHPublication91-3242, Bethesda MD (1991),第1-3卷中的亞組。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于VL，亞組是如Kabat等，見上文中的亞組κ I。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于VH，亞組是如Kabat等，見上文中的亞組III?！叭嗽椿笨贵w指包含來自非人HVR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體會(huì)包含至少一個(gè)，通常兩個(gè)基本上整個(gè)可變域，其中所有或基本上所有HVR (例如，CDR)對(duì)應(yīng)于非人抗體的那些，且所有或基本上所有FR對(duì)應(yīng)于人抗體的那些。任選地，人源化抗體可以至少包含自人抗體衍生的抗體恒定區(qū)的一部分?？贵w，例如非人抗體的“人源化形式”指已經(jīng)經(jīng)歷人源化的抗體。在用于本文時(shí)，術(shù)語“高變區(qū)”或“HVR”指抗體可變域中在序列上高變的和/或形成結(jié)構(gòu)上限定的環(huán)(“高變環(huán)”)的每個(gè)區(qū)。一般地，天然的4鏈抗體包含6個(gè)HVR;三個(gè)在VH中(H1、Η2、Η3)，且三個(gè)在VL中(L1、L2、L3)。HVR —般包含來自高變環(huán)和/或來自“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR)的氨基酸殘基，后一種是最高序列變異性的和/或牽涉抗原識(shí)別。除了 VH中的⑶Rl外，⑶R—般包含形成高變環(huán)的氨基酸殘基?！案咦儏^(qū)”(HVR)又稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，而且這些術(shù)語在本文中提及形成抗原結(jié)合區(qū)的可變區(qū)部分時(shí)可互換使用。此特定區(qū)域已經(jīng)由Kabat等，美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部(U.S.Dept, of Health and HumanServices), “Sequences of Proteins of Immunological Interest，，(1983)及由 Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)描述，其中定義包括在彼此比較時(shí)氨基酸殘基的交疊或子集。然而，任一個(gè)定義指抗體或其變體的CDR的應(yīng)用意圖在該術(shù)語的范圍內(nèi)，如本文中定義并使用的。涵蓋如由上文所引用的每篇參考文獻(xiàn)定義的CDR的合適的氨基酸殘基在下文在表I中列出作為比較。涵蓋特定CDR的精確殘基編號(hào)會(huì)隨CDR的序列和大小而有所變化。給出抗體的可變區(qū)氨基酸序列時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)地確定哪些殘基構(gòu)成特定的 CDR。表1:Q)R 定義權(quán)利要求
1.一種特異性結(jié)合生腱蛋白c A2結(jié)構(gòu)域(TNC A2)的抗體，其中所述抗體糖工程化改造成具有升高的效應(yīng)器功能。
2.一種特異性結(jié)合生腱蛋白C A2結(jié)構(gòu)域(TNC A2)的抗體，其中所述抗體包含至少一種選自下組的重或輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR):SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQID NO:9, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 13，SEQ ID NO: 15，SEQ ID NO: 17，SEQ ID NO: 19，SEQID NO:21,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:31,SEQID NO:33,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:43,SEQID NO: 45 JPSEQ ID NO: 47，或其組合。
3.權(quán)利要求1或2的抗體，其中所述抗體包含重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含(a)選自SEQ ID NO: 3，SEQ ID NO: 5，和 SEQ ID NO: 7 的重鏈 CDRl ；(b)選自SEQ ID N0:9, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 13，SEQ ID NO: 15，SEQ ID NO: 17，SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:21, SEQ ID N0:23，和 SEQ ID N0:25 的重鏈 CDR2 ;和(c)重鏈CDR3SEQ ID NO: 27。
4.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體包含輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含(a)選自SEQ ID NO: 29，SEQ ID NO: 31JPSEQ ID NO: 33 的輕鏈 CDRl ；(b)選自SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID N0:43,和SEQ ID NO:45的輕鏈CDR2 ;和(c)輕鏈CDR3SEQ ID NO:47。
5.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體不包含選自SEQID NO: 3, SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO:7 的重鏈 CDRl、選自 SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:15 和 SEQ ID N0:21 的重鏈CDR2、為 SEQ ID NO:27 的重鏈 CDR3、為 SEQ ID NO:29 的輕鏈 CDRl、為 SEQ ID N0:35 的輕鏈CDR2、和為SEQ ID NO:47的輕鏈CDR3的組合。
6.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體包含重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含選自 SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:67 JPSEQ ID NO:63 的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體包含輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含選自 SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:77，SEQ IDNO:81，SEQ ID NO:85 JPSEQ ID NO:89 的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體不包含這樣的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的組合，所述重鏈可變區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 59，所述輕鏈可變區(qū)包含氨基酸序列 SEQ ID NO:55 或 SEQ ID NO:57。
9.權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體包含F(xiàn)e區(qū)或與免疫球蛋白Fe區(qū)等同的區(qū)域。
10.權(quán)利要求9的抗體，其中所述Fe區(qū)是IgGFe區(qū)。
11.權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體是全長IgG類抗體。
12.權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體包含人恒定區(qū)。
13.權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體是人抗體。
14.權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體包含糖工程化Fe區(qū)。
15.權(quán)利要求14的抗體，其中與非糖工程化抗體相比，所述抗體具有所述Fe區(qū)中比例升高的非巖藻糖基化寡糖。
16.權(quán)利要求14或15的抗體，其中所述Fe區(qū)中至少約20%至約100%的N連接寡糖是非巖藻糖基化的。
17.權(quán)利要求14至16任一項(xiàng)的抗體，其中與非糖工程化抗體相比，所述抗體具有所述Fe區(qū)中比例升高的兩分型寡糖。
18.權(quán)利要求14至17任一項(xiàng)的抗體，其中所述Fe區(qū)中至少約20%至約100%的N連接寡糖是兩分型的。
19.權(quán)利要求14至18任一項(xiàng)的抗體，其中所述Fe區(qū)中至少約20%至約50%的N連接寡糖是兩分型、非巖藻糖基化的。
20.權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體具有升高的效應(yīng)器功能和/或升高的Fe受體結(jié)合親和力。
21.權(quán)利要求20的抗體，其中所述升高的效應(yīng)器功能是升高的ADCC。
22.權(quán)利要求1至21任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體是親和力成熟的。
23.權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體以低于約Iμ M的Kd值結(jié)合人TNCΑ2。
24.權(quán)利要求1至23任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體結(jié)合人組織中的TNCΑ2。
25.一種分離的多核苷酸，其編碼形成依照權(quán)利要求1至24任一項(xiàng)的抗體一部分的多肽。
26.—種分離的多肽,其由權(quán)利要求25的多核苷酸編碼。
27.一種組合物，其包含第一分離的多核苷酸和第二分離的多核苷酸，該第一分離的多核苷酸編碼包含選自SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO:67 JPSEQ ID ΝΟ:63的序列的多肽，該第二分離的多核苷酸編碼包含選自 SEQ ID NO: 55，SEQ ID NO: 57，SEQ ID NO: 69，SEQ ID NO: 73，SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:85 JPSEQ ID NO:89 的序列的多肽。
28.—種載體,其包含權(quán)利要求25的多核苷酸。
29.—種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求25的多核苷酸、權(quán)利要求27的組合物、或權(quán)利要求28的載體。
30.權(quán)利要求29的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞經(jīng)過處理，表達(dá)升高水平的一種或多種具有GnTIII活性的多肽。
31.權(quán)利要求30的宿主細(xì)胞，其中所述具有GnTIII活性的多肽是融合多肽，該融合多肽包含GnTIII的催化結(jié)構(gòu)域和ManII的Golgi定位結(jié)構(gòu)域。
32.權(quán)利要求30或31的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞經(jīng)過進(jìn)一步處理，表達(dá)升高水平的一種或多種具有ManII活性的多肽。
33.一種生成特異性結(jié)合生腱蛋白C A2結(jié)構(gòu)域的抗體的方法，所述方法包括 a)在容許該抗體表達(dá)的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求29的宿主細(xì)胞， 和 b)回收該抗體。
34.一種生成特異性結(jié)合生腱蛋白C A2結(jié)構(gòu)域的抗體的方法，所述方法包括 a)在容許該抗體表達(dá)和所述具有GnTIII活性的多肽修飾所述抗體Fe區(qū)上存在的寡糖的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求30至32任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，和 b)回收該抗體。
35.一種特異性結(jié)合生腱蛋白C A2結(jié)構(gòu)域的抗體，其中所述抗體通過權(quán)利要求33或34的方法來生成。
36.一種抗體偶聯(lián)物，其包含權(quán)利要求1至24任一項(xiàng)的抗體和細(xì)胞毒劑。
37.一種藥物組合物，其權(quán)利要求1至24任一項(xiàng)的抗體和藥學(xué)可接受載體。
38.權(quán)利要求37的藥物組合物，其進(jìn)一步包含別的治療劑。
39.權(quán)利要求1至24任一項(xiàng)的抗體，其作為藥物使用。
40.權(quán)利要求1至24任一項(xiàng)的抗體，其用于治療以TNCA2表達(dá)為特征的疾病。
41.權(quán)利要求40的抗體，其中所述疾病是癌癥。
42.權(quán)利要求1至24任一項(xiàng)的抗體，其用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞或腫瘤基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞裂解。
43.權(quán)利要求1至24任一項(xiàng)的抗體在制造藥物中的用途。
44.權(quán)利要求1至24任一項(xiàng)的抗體在制造用于治療以TNCA2表達(dá)為特征的疾病的藥物中的用途。
45.權(quán)利要求44的用途,其中所述疾病是癌癥。
46.權(quán)利要求1至24任一項(xiàng)的抗體在制造用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞或腫瘤基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞裂解的藥物中的用途。
47.一種治療具有以TNC A2表達(dá)為特征的疾病的個(gè)體的方法，包括對(duì)該個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求1至24任一項(xiàng)的抗體或權(quán)利要求37或38的藥物配制劑。
48.權(quán)利要求47的方法，進(jìn)一步包括對(duì)該個(gè)體施用別的治療劑。
49.權(quán)利要求47或48的方法，其中所述疾病是癌癥。
50.一種誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞或腫瘤基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞裂解的方法,所述方法包括使所述腫瘤細(xì)胞或腫瘤基質(zhì)細(xì)胞與權(quán)利要求1至24任一項(xiàng)的抗體接觸。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述細(xì)胞裂解是通過該抗體的抗體依賴性細(xì)胞毒性誘導(dǎo)的。
52.一種診斷個(gè)體中的疾病的方法，所述方法包含對(duì)該個(gè)體施用有效量的診斷劑，其中所述診斷劑包含權(quán)利要求1至24任一項(xiàng)的抗體和標(biāo)記物，該標(biāo)記物容許檢測所述診斷劑和TNC A2的復(fù)合物。
53.如本文描述的發(fā)明。
全文摘要
本發(fā)明提供了針對(duì)生腱蛋白-C A2結(jié)構(gòu)域的抗體及其使用方法。
文檔編號(hào)G01N33/53GK103168049SQ201180049335
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月13日
發(fā)明者A.弗里莫瑟-格倫德舍伯, R.霍塞, C.克萊恩, E.莫斯納, V.G.尼科里尼, P.尤馬納 申請(qǐng)人:羅切格利卡特公司