專利名稱：磁性細胞檢測的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及磁性細胞檢測，為此借助磁性標記物來標記待檢測的細胞。
背景技術：
—方面,在細胞檢測領域已知流式測量(Durchflussmessungen)。其能夠基于磁性探測，然而卻常常基于光學測試方法，例如散射光譜或熒光光譜。另一方面，已知作為驗證方法的測試，其中為了驗證特異性物質而進行反應。已知不同的標記法用于流式細胞儀以及用于化學驗證方法。熒光標記物或待驗證的抗原將通過抗體與待檢測的細胞相連。例如由 Mujika 等人在 Phys.Stat.Sol 第(a) 205 卷，第 6 期，1478 頁-1483 頁(2008年)“Microsystem for the immunomagnetic detection of Escherichia coli 0157:H7”中公開的那樣，其中通過固定在功能化表面上選擇待檢測的物質，而與該免疫磁性檢測相反，磁性流式測量對測量信號有更高的要求。除了磁性標記的細胞，同樣還一起流過未連接的標記物以及未連接標記物的聚集體，并且通過傳感器發(fā)出信號。此外，并不總是給出標記細胞類型的唯一性。特別諸如腫瘤細胞的細胞類型在細胞表面上具有較大差異的表位濃度。從而得到用于一個細胞種類的MR信號的全譜。因此，至今僅對如下細胞實施流式細胞儀，即其在細胞表面上具有較高的表位密度。在所有其他情況中必須歸溯到光學流量測量，然而其在關于測量器材結構方面相對磁性細胞檢測而言是存在缺點的。為了在使用磁阻傳感器的檢測中從層流中得到足夠大的信噪比，就必須使得待檢測的細胞通過標記具有較高的磁矩。各個細胞的磁矩對于原位濃縮和通過外磁場的細胞引導也是很重要的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于，給出一種用于磁性檢測和標記細胞的方法，其造成細胞足夠大的磁矩。此外，應該給出一個適用于此的測量設備。該目的通過根據(jù)權利要求1所述的方法以及根據(jù)權利要求12所述的設備得以完成。依據(jù)本發(fā)明的方法包括磁性細胞檢測以及用于細胞特異性標記的標記步驟。待標記的細胞分配為一種細胞類型中，其在細胞表面上具有細胞特異性的表位。磁性標記物將通過抗體與細胞表面上的表位相連接。為了特異性標記而將磁性標記物通過第一抗體類型的抗體連接，其連接在第一細胞特異性表位類型的表位上。此外，其他磁性標記物將通過第二抗體類型的抗體在細胞上與第二細胞特異性的表位類型的表位相連?；蛘叽判詷擞浳锿ㄟ^第四抗體類型的抗體與第一抗體類型的抗體相連，并且其再次在細胞上與第一細胞特異性的表位類型的表位相連。該方法允許細胞的特異性標記。通過標記來提高相對于其他細胞的磁矩。在通過第二抗體類型相連的附加磁性標記物的情況下，圍繞細胞的磁性標記物密度將升高，這僅發(fā)生在如下細胞上，即其具有第一和第二表位類型的組合。此類標記相應地排除了因其他細胞導致的錯誤正信號，這些細胞例如僅具有第一或僅具有第二表位類型。其磁矩相應地非常小，因為僅具有第一抗體類型或者僅具有第二抗體類型的標記物能夠與這些細胞相連?；蛘呷缦绿岣邩擞浀倪x擇性，即通過第四抗體類型與第一抗體類型的組合來進行其他的配合。第一抗體類型在此尤其是高度特異性的抗體類型，其與細胞的表位相連。該高度特異性的抗體類型例如保證了很低數(shù)量的錯誤連接。磁性標記例如能夠通過較少的特異性第四抗體類型來實現(xiàn)。第一抗體類型的認知比表面上細胞特異性表位的認知有更少的缺陷。通過本發(fā)明的標記能夠實現(xiàn)無需校準的磁性流式細胞儀。在本發(fā)明有益的實施方式中，通過額外的將磁性標記物經(jīng)過第三抗體類型的抗體與第三細胞特異性表位類型的表位在細胞上相連，依該方法提高細胞的磁矩。優(yōu)點如下，即針對細胞進行另外的選擇，其也具有第一和第二表位類型的表位的組合，并且與待檢測的細胞僅通過第三表位類型的表位相區(qū)別。此外，通過細胞表面上更高的標記物密度來提高細胞的磁矩。由此能夠為正信號設置更高的閾值。在本發(fā)明其他有益實施方式中，在本方法中如下選擇第二和/或第三抗體類型，即其并不在第二細胞類型上與表位相連?；蛘呷缦逻x擇第二和/或第三抗體類型，即其僅與表位相連，該表位與待檢測的細胞類型上的濃度并不相同。相應地，能夠通過挑選抗體來進行選擇，其保證了幾乎僅僅檢測待檢測細胞類型的細胞。為了禁止對其他具有較低表位密度的細胞的橫向選擇性，特別地能夠在細胞上實現(xiàn)具有多個針對不同表位的抗體的免疫標記。在本發(fā)明有益的實施方式中，通過在第二標記步驟中額外地將磁性標記物通過第四抗體類型的抗體與第一標記步驟的磁性標記物相連，依本方法提高細胞的磁矩。還能夠如下提高標記物密度，即實現(xiàn)已經(jīng)連接在細胞上的磁珠的第二標記。第四抗體類型的抗體對此必須特別地連接第一標記的磁珠。附加磁性標記物尤其與第一標記步驟的磁性標記物不同。這樣顯著提高了圍繞細胞的標記物密度，并由此提高了細胞的磁矩。這樣，提高通過各個細胞所引起的磁阻信號，并保證了較高的信噪比。在用于磁性細胞檢測的方法中，有利地通過磁阻變化來測量特異性磁性標記的細胞。細胞的高磁矩尤其保證了能夠如下來設定用于磁阻變化的下限值的最高值，即使得信噪比至少為2。信噪比尤其至少為3。在本發(fā)明另一有益的實施方式中，依該方法將用于磁阻變化的上限值設定為其最小值實現(xiàn)單一細胞檢測。其優(yōu)點如下，即較高的磁阻變化值并不會分配給各個細胞而是分配給了聚集體，并且作為錯誤正信號被排除掉。在本發(fā)明另一有益的實施方式中，借助流式細胞儀實現(xiàn)磁性檢測。在此，尤其在流動的同時通過傳感器測量特異性標記的細胞。例如在層流中引導細胞。流式細胞儀例如具有較高樣品通量的優(yōu)點。在本發(fā)明另一有益的實施方式中，在該方法中使用磁性標記物，其具有小于200nm的直徑。還被稱為磁珠的磁性標記物較小的尺寸具有如下優(yōu)點，即其并不會由于大量抗體在各個大小的磁性標記物上的連接而導致產(chǎn)生聚集體。具有小于200nm直徑的較小磁性標記物能夠各自圍繞細胞布置。在本發(fā)明另一有益的實施方式中，將在該方法中使用超順磁性的磁性標記物。這將根據(jù)通過磁阻構成的可獲取性例如相對于鐵磁性珠是有益的。在本發(fā)明另一有益的實施方式中，依該方法在梯度磁場中引導細胞，并由此聚集在傳感器上。磁性標記的細胞借助梯度磁場能夠有目的的通過傳感器轉向。用于磁性細胞檢測的依據(jù)本發(fā)明的設備具有傳感器和分析單元。如下安排分析單元和傳感器，即能夠接受磁阻變化的譜圖。在這里，將用于磁阻變化的下限值存儲在該分析單元中，該下限值的最高達使得信噪比至少為3。額外的或者可選的，存儲用于磁矩變化的上限值，該上限值最低使得可實施單獨的細胞檢測。兩個閾值的組合對于測量的高特異性是格外有利的。單個細胞的正MR信號必須能夠例如被未連接的標記物、聚集的標記物或其他磁性干擾場這樣的背景效果襯托出來。為了減弱此類背景效果，單個細胞必須相應地達到閾值之上的磁阻變化。此外為了排除將例如已標記的細胞聚集體或磁性標記物更大的聚集體一起計算在內，還可以使用上限值。在本發(fā)明有益的實施方式中，所述設備包括引流系統(tǒng)，該設備以此適合于磁性流式細胞儀。此外，所述設備包括用于在引流系統(tǒng)中產(chǎn)生梯度磁場的物質。磁性標記細胞由此可在梯度磁場中積聚在傳感器上。相應地，設置用于產(chǎn)生梯度磁場的物質。產(chǎn)生梯度磁場的物質可以是鐵磁性條(Streifen)。


將以示例方式結合附圖1至8進一步說明本發(fā)明的實施方式。圖1示出單倍磁性標記細胞A。圖2示出雙倍磁性標記細胞A。圖3示出關于由其所引起的磁阻變化的細胞A分布的示意圖。圖4示出磁性標記的細胞B/C。圖5示出關于由其所引起的磁阻變化的細胞A、B和C分布的示意圖。圖6示出以不同磁性標記物雙倍磁性標記細胞A。圖7示出特異性標記的細胞A。圖8示出具有以不同磁性標記物雙倍標記的特異性標記的細胞A。
具體實施例方式圖1、2、4以及6至8分別示出了細胞A、B、C的示意圖，它們在表面上具有表位11、12、13。通過大圓圈來標明細胞表面。在以小圓圈所表示的表位11、12、13上連接有抗體21、22、23、24，其在示意圖中被示出為Y形。在此，端部之一分別連接細胞表面上的表位11、12、13，并且另一端部連接磁性標記物M1、M2。以比表位11、12、13更大的圈來表示磁性標記物Ml、M2。然而，磁性標記物Ml、M2具有比細胞A、B、C小很多的直徑。雖然附圖尺寸并不成比例，但是示出了磁性標記物M1、M2對細胞A、B、C的正確尺寸比例。對于較大磁性標記物M1、M2的情況，其將會導致聚集和橫向交聯(lián)。也就是說，多個抗體21、22、23、24將圍繞一個磁性標記物M1、M2排布并連接在其上，并且由此不再標記為單個的細胞A、B、C，而是產(chǎn)生抗體21、22、23、24的聚集體，細胞A、B、C和圍繞非常大的磁性標記物的磁性標記物Ml、M2。圖3和5分別示出了 一個示意圖，其中針對磁阻變化MR對細胞的數(shù)量N進行作圖，所述細胞產(chǎn)生MR信號。在圖3中示出了細胞A的分布，在圖5中示出了細胞A、B和C的分布。在后圖中，細胞A引起比細胞B高很多的MR信號，并且細胞B的信號也比細胞C高得多。但分別也有重疊范圍，在其中并不能夠區(qū)分哪些細胞類型A、B、C引起了 MR信號。因此根據(jù)過去的經(jīng)驗值或者已知的分布來設置用于MR信號的閾值T。之后根據(jù)閾值T分為正事件和負事件。在圖3的示意圖中使用了上限值T2和下限值1\。MR信號在下限值T1之上將被評價為正信號。在上限值T2之下，則認定為單個檢測。聚集體引起非常高的MR信號。圖1首先示出了磁性標記最簡單的形式。細胞A在細胞表面上具有大量的表位11、
12、13。表位類型的數(shù)量例如能夠在細胞上包括大約500個表位。在借助連接在特異性表位類型11、12、13上的抗體21、22、23、24標記時，大約覆蓋了 80%的表位。也就是說，存在游離的特征表位11、12、13，其也能夠通過特異性的抗體21、22、23、24捕獲磁性標記物Ml、M2。此類標記并不足夠用于有效信號。也就是說，僅通過一種抗體類型21-24連接在細胞
A、B、C上的標記物Ml、M2并未如此大的提高細胞A、B、C的磁矩，以至于產(chǎn)生足夠大的MR信號。也就是說，信噪比例如通過未連接的磁標記物Ml、M2對于明確的正信號來說是并不充足的。也就是說，標記的敏感度過低。此外，標記的選擇性也過低。細胞B區(qū)別于細胞A的地方在于表面上表位11、12、13的數(shù)量和種類。但是抗體21-24還有可能錯誤地與表位11-13相連。還會出現(xiàn)細胞A、B不同，但正好在待標記的表位11中具有較大的一致性。例如細胞A和細胞B僅具有共同的表位類型11，但它在細胞表面上有近似相同的濃度。這樣，細胞B同樣通過具有抗體21的標記物Ml來標注，并且在尺寸上并不與細胞A相區(qū)別。圖2再次示出細胞A，但其通過多個不同的抗體類型21、22、23來標記。提供具有不同抗體21、22、23的磁性標記物Ml以使用。其在細胞表面上與表位11、12、13相連。由此首先提高了細胞A的磁矩,其中，圍繞細胞A的標記物Ml的數(shù)量翻倍,或者變成三倍,也就是說，提高了靈敏度。這樣能夠如圖5所示，細胞A的MR信號相對于細胞B或C的MR信號明顯提高，并顯著高于細胞B和C的信號的閾值界限T來。此外，這樣還實現(xiàn)了較高的選擇性。雖然細胞B和C可能能夠具有相近數(shù)量的第一表位類型11。然而細胞B和C不具有或者比起細胞A以非常低的濃度具有第二和第三標記的表位12、13。圖6再次示出了在細胞表面上具有表位11、12、13的細胞A，所述表位將細胞A與細胞B、C區(qū)分開來。在第一步驟中將磁性標記物Ml通過抗體21與表位11相連來實現(xiàn)磁性標記。在該情況中并不通過第二表位類型來實現(xiàn)第二標記，而是通過具有抗體24的附加標記物M2，所述抗體再次與磁性標記物Ml相連。這樣提高細胞A的磁矩。選擇性發(fā)生在抗體-表位-對21-11上。磁性標記物M2額外的連接比使用較大的磁性標記物更好。在提高標記物直徑或體積時將增強聚集效應。在大于200nm直徑的較大磁性標記物上連接有多個抗體，其將細胞A、B、C和磁性標記物Ml、M2橫向交聯(lián)。理想地，使用超順磁性顆粒用于磁性標記，其具有小于200nm的直徑。圖7示出了提高標記選擇性的另一種可能性。在此，首先在具有適配抗體21的細胞A的表面上標記第一表位類型11的表位。在該抗體21上再次連接有抗體24。該抗體24與磁性標記物M2相連。雖然由此并未相對于圖1中的標記提高磁矩，然而通過兩個抗體21、24的組合的連接是非常特異性的，這提高了 MR測量的選擇性。為了提高敏感度，也就是說為了達到更好的信噪比，能夠重又實現(xiàn)如已在圖6中示出過的三明治標記類型。在圖8中示出了該組合。在此為了更高的選擇性，將第一磁性標記通過具有抗體24的標記物M2實施在特異性的抗體21上。磁矩在抗體24上將通過標記物Ml的第二標記得以提高，所述抗體24連接磁性標記物M2。優(yōu)選地，標記在兩個相隨的標記步驟中進行。隨后說明磁性流式細胞儀的示例過程。尤其在微流控中來實現(xiàn)。主要有三個運行步驟用于有效測量:1.磁性標記的細胞A原位聚集在傳感器上，2.細胞引導，尤其引導磁性標記的細胞A流經(jīng)傳感器中，和3.借助磁阻構成檢測磁性標記細胞A。尤其實現(xiàn)了在層流中的細胞運輸，也就是說，細胞流過微流控裝置。磁性標記的細胞A對此在外部磁性梯度場中受到一個力。該梯度場如下對齊，即細胞A在例如安裝在管壁上或管壁中的傳感器上流過。為了實現(xiàn)原位積累和細胞引導，磁性標記的細胞A必須具有足夠高的磁矩。只有如此，其才能夠在外部磁性梯度場中受到影響并轉向。外部磁性梯度場例如為IOOmT或為在該量級中的值。為了實現(xiàn)檢測具有磁阻構成的細胞A，磁性標記的細胞A具有較高的雜散磁場是必要的。僅當磁性標記的細胞A具有足夠高的雜散磁場時，其在組分中才起到足夠大的阻力變化MR。通過本發(fā)明方法，能夠并不依賴于單位細胞表面上的表位濃度來如下標記細胞A、
B、C，就能夠實施磁性流式細胞儀。單位細胞表面上的表位濃度典型的是在1000或者更多。在本方法中，特別可將超順磁性顆粒用于標記，并且在細胞表面上如此濃密的安裝，即磁矩并不依賴于細胞種類和其表位密度而適合于磁性流式細胞儀。通過較高標記物濃度和由此較高的磁阻信號MR能夠使用足夠高的閾值T用于正信號，以排除背景效應，否則該背景效應會作為錯誤正信號被獲取。尤其能夠實現(xiàn)組合的免疫磁性檢測。尤此，細胞聚集還可在例如全血的媒介中進行，并且細胞引導還可能在梯度場中進行。尤其能夠通過鐵磁性條來產(chǎn)生梯度場，所述條能夠安置在微流控裝置中。
權利要求
1.用于磁性細胞檢測的方法，所述方法具有用于特異性標記待檢測細胞類型的細胞(A)的標記步驟，其中，磁性標記物(Ml、M2)通過第一抗體類型的抗體(21)連接在第一細胞特異性表位類型的表位(11)上，其特征在于，額外地 -第二 /其他磁性標記物(Ml、M2)通過第二抗體類型的抗體(22)連接在細胞(A)上的第二細胞特異性表位類型的表位(12)上，或者 -所述磁性標記物(Ml、M2)通過第四抗體類型的抗體(24)連接在第一抗體類型的抗體(21)上，并且再次連接在細胞(A)上的第一細胞特異性表位類型的表位(11)上。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法,其中，經(jīng)過額外地將磁性標記物(Ml、M2)通過第三抗體類型的抗體(23)連接在細胞(A)上的第三細胞特異性表位類型的表位(13)上來提高所述細胞㈧的磁矩。
3.根據(jù)前述權利要求中任意一項所述的方法，其中，如下選取第二和/或第三抗體類型(22、23)，即其在第二細胞類型(B/C)上并不連接表位，或者僅連接濃度不同于待檢測細胞類型(A)上表位的表位。
4.根據(jù)前述權利要求中任意一項所述的方法，其中，在第二標記步驟中經(jīng)過將額外的、尤其是與第一標記步驟的磁性標記物(M1、M2)不同的磁性標記物(M2、M1)通過第四抗體類型的抗體(24)連接在第一標記步驟的磁性標記物(M1、M2)上來提高細胞(A)的磁矩。
5.根據(jù)前述權利要求中任意一項所述的方法，其中，通過磁阻變化(MR)來測量所述特異性磁性標記的細胞(A)。
6.根據(jù)前述權利要求中任意一項所述的方法，其中，如下設置用于磁阻變化(MR)的下限值(Tl)，其最高為使得信噪比至少為3。
7.根據(jù)前述權利要求中任意一項所述的方法，其中，如下設置用于磁阻變化(MR)的上限值(T2)，其最低為實現(xiàn)單個細胞檢測。
8.根據(jù)前述權利要求中任意一項所述用于磁性流式細胞儀的方法，其中，在流動通過傳感器期間、尤其在層流流動中獲取所述特異性標記的細胞。
9.根據(jù)前述權利要求中任意一項所述的方法，其中，使用具有小于200nm直徑的所述磁性標記物(Ml、M2)。
10.根據(jù)前述權利要求中任意一項所述的方法，其中，使用超順磁性的所述磁性標記物(Ml、M2)。
11.根據(jù)前述權利要求中任意一項所述的方法，其中，所述細胞在梯度磁場中運行，并聚集在傳感器上。
12.具有傳感器和分析單元的用于磁性細胞檢測的設備，其設計如下，即用于接收磁阻變化(MR)的譜圖，其中，將用于磁阻變化(MR)的下限值(Tl)儲存在所述分析單元中，該下限值(Tl)最高為使得信噪比至少為3，和/或儲存用于磁阻變化(MR)的上限值(T2)，該上限值最低為使得可以進行單獨細胞檢測。
13.根據(jù)權利要求12所述的用于磁性流式細胞儀的設備具有流體引導系統(tǒng)和用于在流體引導系統(tǒng)中產(chǎn)生梯度磁場的介質，其中，如下設計所述介質，即磁性標記的細胞通過梯度磁場可聚集在傳感器上。
14.根據(jù)權利要求13所述的設備，其中，所述用于產(chǎn)生梯度磁場的介質是鐵磁性條。
全文摘要
本發(fā)明涉及磁性細胞檢測，特異性標記細胞。其中，將磁性標記物通過第一抗體類型的抗體與第一細胞特異性的表位類型的表位相連接來標記待檢測的細胞類型。此外，將第二/其他磁性標記物通過第二抗體類型的抗體與細胞上的第二細胞特異性的表位類型的表位相連，或者磁性標記物通過第四抗體類型的抗體與第一抗體類型的抗體相連，并且其進而與細胞上的第一細胞特異性的表位類型的表位相連。
文檔編號G01N33/50GK103201040SQ201180053147
公開日2013年7月10日 申請日期2011年10月28日 優(yōu)先權日2010年11月3日
發(fā)明者O.海登, M.J.赫爾勞, S.F.特德 申請人:西門子公司