專利名稱：用于信號放大的方法和試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于檢測測定的試劑，例如，含有與葡聚糖部分綴合的結(jié)合部分的試劑。
背景技術(shù)：
在從血液或其它生物樣品中分離稀少細(xì)胞的過程中，必須與可能存在于樣品中的其它有核細(xì)胞區(qū)分開靶細(xì)胞。當(dāng)分離稀少細(xì)胞時(shí)，也可能存在多種其它細(xì)胞，例如白血細(xì)胞(WBC)。就分離循環(huán)的腫瘤細(xì)胞(CTC)而言，標(biāo)準(zhǔn)方法包括:使用細(xì)胞角蛋白抗體將上皮細(xì)胞染色，并還通過抗-CD45抗體染色排除假陽性的細(xì)胞角蛋白染色的細(xì)胞，以便僅檢測出CTC。 在未決的美國專利申請?zhí)?0100255479 (其特此通過引用整體并入)中，描述了使用多種抗體進(jìn)行CTC捕獲的方法。盡管可以利用這些方法，諸如CTC等細(xì)胞的檢測需要其它檢測試劑和方法。這樣的試劑和方法將能夠進(jìn)行診斷測定以及其它臨床上有關(guān)的測定。本發(fā)明描述了可用于檢測生物樣品中的細(xì)胞的試劑和方法。例如，本發(fā)明提供了可以用于檢測生物樣品中的稀少細(xì)胞(諸如CTC)的試劑和方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明至少部分地基于下述發(fā)現(xiàn):多個(gè)葡聚糖和它們的構(gòu)型可以用作可檢測試劑的一部分。因此，本發(fā)明提供了可檢測試劑，其含有可用于不同檢測測定(例如，細(xì)胞檢測測定)的多個(gè)葡聚糖。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可檢測試劑，其含有與葡聚糖組分綴合的結(jié)合部分。所述葡聚糖組分可以另外與可檢測實(shí)體連接。在有些實(shí)施方案中，所述可檢測試劑的葡聚糖組分含有約2個(gè)至約10個(gè)葡聚糖、約4個(gè)至約8個(gè)葡聚糖或約6個(gè)葡聚糖。每個(gè)葡聚糖可以具有約IOkDa至約200kDa的分子量、約30kDa至約IOOkDa的分子量、或約50kDa至約70kDa的分子量。在有些實(shí)施方案中，所述葡聚糖具有約70kDa的分子量。在有些實(shí)施方案中，所述葡聚糖組分包含超過一個(gè)葡聚糖，其中每個(gè)葡聚糖具有基本上相同的分子量。在有些實(shí)施方案中，所述葡聚糖組分包含超過一個(gè)葡聚糖，其中至少一個(gè)葡聚糖具有不同于其它葡聚糖的分子量。 在有些實(shí)施方案中，所述可檢測實(shí)體是熒光團(tuán)，其可以選自具有綠色熒光、橙色熒光、紅色突光和遠(yuǎn)紅外突光的突光團(tuán)。在有些實(shí)施方案中，所述突光團(tuán)選自具有在約350nm至約775nm范圍內(nèi)的激發(fā)和發(fā)射波譜的熒光團(tuán)。在有些實(shí)施方案中，所述熒光團(tuán)選自具有約 346nm/446nm、約 494nm/519nm、約 554nm/570nm、約 555nm/572nm、約 590nm/617nm、約651nm/672nm、約679nm/702nm或約749nm/775nm的激發(fā)和發(fā)射波譜的熒光團(tuán)。在有些實(shí)施方案中，所述可檢測試劑的結(jié)合部分選自抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、生物素、地高辛配基、免疫試劑、寡核苷酸、肽核酸、蛋白A和蛋白G。本發(fā)明提供了制備可檢測試劑的方法，所述方法包括:提供葡聚糖組分，使所述葡聚糖組分與結(jié)合部分綴合，其中所述反應(yīng)形成葡聚糖-結(jié)合部分復(fù)合物；然后將可檢測實(shí)體連接至所述葡聚糖-結(jié)合部分復(fù)合物。本發(fā)明提供了用于制備可檢測試劑的方法，所述方法包括:使結(jié)合部分與葡聚糖綴合，以形成核心葡聚糖-結(jié)合部分，使所述核心葡聚糖-結(jié)合部分與葡聚糖反應(yīng)，以形成葡聚糖-結(jié)合部分復(fù)合物，然后將可檢測實(shí)體連接至所述核心葡聚糖-結(jié)合部分復(fù)合物。在有些實(shí)施方案中，所述結(jié)合部分是抗生物素蛋白。本發(fā)明提供了一種用于檢測或定量靶分子的方法，所述方法包括:使根據(jù)權(quán)利要求I所述的可檢測試劑與疑似含有靶分子的樣品接觸，其中所述結(jié)合部分能夠結(jié)合所述靶分子，和檢測與所述葡聚糖組分連接的可檢測實(shí)體的信號，由此檢測或定量所述靶分子。本發(fā)明提供了一種包含多個(gè)互聯(lián)的葡聚糖的試劑，其中所述試劑包含至少2個(gè)葡聚糖。在有些實(shí)施方案中，總分子量是至少500kDa。在有些實(shí)施方案中，所述多個(gè)互聯(lián)的葡聚糖構(gòu)造成分層構(gòu)型或分支構(gòu)型。在有些實(shí)施方案中，所述多個(gè)互聯(lián)的葡聚糖與可檢測實(shí)體連接。


圖1:增強(qiáng)染色一祀向捕獲的細(xì)胞的細(xì)胞表面抗體。顯示了 3種不同類型的染色方法，所述方法可以用于檢測已經(jīng)用抗體混合液捕獲在微通道上的細(xì)胞。在反應(yīng)A中，捕獲的細(xì)胞被在CTC領(lǐng)域中常用的抗-CK染色。細(xì)胞`角蛋白是一種胞質(zhì)蛋白，通過與用綠色熒光染料(命名為488)標(biāo)記的抗-細(xì)胞角蛋白抗體一起溫育，將細(xì)胞染色。在反應(yīng)B中，通過加入用488染料標(biāo)記的抗生物素蛋白(抗生物素蛋白-488)，將所述細(xì)胞進(jìn)一步染色。在該情況下，所述抗體將細(xì)胞質(zhì)CK染色，并且抗生物素蛋白通過結(jié)合已經(jīng)用生物素標(biāo)記的捕獲抗體而進(jìn)一步將細(xì)胞表面染色。兩種染色是累加性的，從而導(dǎo)致更高的細(xì)胞標(biāo)記。這方面的一個(gè)實(shí)驗(yàn)實(shí)施例顯示在圖2中。在反應(yīng)C中，細(xì)胞未被細(xì)胞角蛋白染色，而僅被抗生物素蛋白-488染色。在該情況下，僅僅基于與細(xì)胞表面上的生物素化的捕獲抗體相結(jié)合的抗生物素蛋白的數(shù)目而觀察細(xì)胞。這方面的一個(gè)實(shí)驗(yàn)實(shí)施例顯示在圖3中。圖2:當(dāng)使用捕獲抗體來增加染色時(shí)，會增強(qiáng)臨床CK+CTC的檢測。顯示了抗體混合液對乳腺癌腫瘤細(xì)胞的捕獲、以及CK染色劑對它的檢測(圖A)。在該情況下，染色非常弱，盡管在背景以上足夠高以致于被鑒別為腫瘤細(xì)胞。象通常一樣，這些CTC細(xì)胞同時(shí)地被紅色熒光標(biāo)記的CD45染色，且該細(xì)胞是CD45陰性的。記錄該細(xì)胞的位置，然后用抗生物素蛋白-488將微通道染色。圖B顯示了在抗生物素蛋白-488處理以后該細(xì)胞的重新定位，并表明，它被遠(yuǎn)遠(yuǎn)更亮地染色。在兩幅圖中，觀察到白血細(xì)胞(細(xì)胞核被DAPI染色)，但是這些細(xì)胞不具有可檢測的染色。圖3:僅僅基于細(xì)胞捕獲抗體的標(biāo)記而檢測從血液捕獲的摻入細(xì)胞。顯示了僅僅基于捕獲抗體的染色的細(xì)胞檢測的一個(gè)實(shí)例。在該實(shí)驗(yàn)中，將SKOV細(xì)胞摻入血液中，并象平常一樣為CTC的捕獲而處理樣品。盡管并非絕對量度，SKOV細(xì)胞的核大小通常是典型WBC的細(xì)胞核的2-3倍。在僅用抗生物素蛋白-488染色以后，SKOV細(xì)胞被亮染色，而WBC不具有可檢測的染色。這證實(shí)，通過細(xì)胞表面捕獲抗體的標(biāo)記，可以檢測出未被CK染色的細(xì)胞或不含有CK的細(xì)胞。如在美國專利申請?zhí)?0100255479中所述，通過使用多種抗體，可以顯著增強(qiáng)染色。圖4:用標(biāo)記的抗-細(xì)胞角蛋白和標(biāo)記的中和親和素(Neutravidin)檢測的捕獲的乳腺癌細(xì)胞的計(jì)數(shù)。顯示了在微通道上的乳腺癌樣品的計(jì)數(shù)。在該實(shí)驗(yàn)中，首先在標(biāo)準(zhǔn)條件下用熒光標(biāo)記的488抗-CK抗體將細(xì)胞染色。檢測綠色標(biāo)記的細(xì)胞，記錄它們在微通道上的X-Y坐標(biāo)。接著，用綠色熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白處理通道，以標(biāo)記在細(xì)胞表面上的抗體。記錄通道的綠色熒光細(xì)胞，除了關(guān)于CK染色劑記錄的位置以外。也確定如此鑒別出的所有細(xì)胞是CD45陰性的。條形圖表明，在大多數(shù)情況下，抗生物素蛋白檢測出比CK染色劑明顯更多的細(xì)胞。在使用健康供體血液的對照實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)在相同條件下進(jìn)行時(shí)，不存在可檢測的細(xì)胞，并同時(shí)被與抗生物素蛋白-488相組合的抗-CK-488染色(數(shù)據(jù)未顯示)。圖5:Beyond NA:使用葡聚糖的放大染色。該圖表示了用突光染料標(biāo)記的抗生物素蛋白-葡聚糖綴合物(含有可檢測實(shí)體的示例性可檢測試劑)。每個(gè)抗生物素蛋白的理論染料數(shù)目高于僅用抗生物素蛋白標(biāo)記。圖6:在SKOV細(xì)胞上的FACS熒光強(qiáng)度。顯示了用單一生物素化的EpCAM抗體溫育、隨后用抗生物素蛋白-488 (用綠色熒光標(biāo)記)和抗生物素蛋白-葡聚糖-488溫育的SKOV細(xì)胞的FACS分析。第一個(gè)和第二個(gè)條是對照細(xì)胞的染色強(qiáng)度，其中加入了抗生物素蛋白或綴合物，但是沒有加入生物素化的EpCAM抗體。第三個(gè)條顯示了當(dāng)將抗生物素蛋白-488加給EpCAM處理過的細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的染色強(qiáng)度。第四個(gè)條顯示了用抗生物素蛋白-葡聚糖-488溫育的相同細(xì)胞的染色強(qiáng)度。這些數(shù)據(jù)指示，抗生物素蛋白-葡聚糖綴合物的熒光強(qiáng)度是單獨(dú)的抗生物素蛋白-488的3-4倍。圖7 =ADS優(yōu)點(diǎn)II—更低的WBC染色顯示SKOV和白血細(xì)胞(WBC)的相對染色。在該實(shí)驗(yàn)中，將SKOV細(xì)胞摻 入血液中，并象平常一樣處理，并使用捕獲抗體的抗體混合液捕獲在微通道上。然后僅用抗生物素蛋白-546(546指示橙色熒光染料)和抗生物素蛋白-葡聚糖-546將不同通道中的細(xì)胞染色。在圖A和C中，大的強(qiáng)染色的細(xì)胞被橙色熒光地標(biāo)記。得自顯微鏡的匹配圖像B和D是DAPI染色的細(xì)胞，其揭示有核細(xì)胞，無論它們是SKOV還是WBC。在圖B的情況下，檢測到10個(gè)DAPI陽性的WBC(用箭頭指示)。在圖像匹配的圖A (其中使用適當(dāng)?shù)臑V光片揭示橙色熒光標(biāo)記的細(xì)胞)中，10個(gè)WBC中的9個(gè)可以視作在暴露2秒以后含有不同水平的橙色染色劑。當(dāng)將相同標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于抗生物素蛋白-葡聚糖處理過的通道時(shí)，在圖D中檢測到9個(gè)DAPI陽性的WBC，而在使用橙色濾光片的匹配的圖C中，在暴露2秒以后僅I個(gè)WBC是微弱可檢測的。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抗生物素蛋白-葡聚糖染色劑不僅比單獨(dú)的抗生物素蛋白更強(qiáng)地將細(xì)胞染色(圖6)，而且對周圍的WBC具有更少的背景染色。圖8:在70kDa x6葡聚糖*488和500kDa葡聚糖之間的相對熒光。對比了通過使用下述綴合物標(biāo)記SKOV細(xì)胞所得到的相對熒光強(qiáng)度:本發(fā)明的抗生物素蛋白-葡聚糖綴合物(A),除了使用單一 500kDa的葡聚糖-胺分子(與抗生物素蛋白綴合，并用AlexaFluor_488熒光標(biāo)記)以外，以相同方式制備的抗生物素蛋白-葡聚糖綴合物(B)。盡管每個(gè)核心抗生物素蛋白-葡聚糖綴合物含有可比較的葡聚糖重量/抗生物素蛋白分子，并且各自用相同摩爾過量的NHS-AlexaFluor-488衍生化，順序地制備的(互聯(lián)的葡聚糖)綴合物導(dǎo)致細(xì)胞的熒光標(biāo)記水平提高了幾乎3倍。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明至少部分地基于下述發(fā)現(xiàn):多個(gè)葡聚糖和它們的構(gòu)型可以用作可檢測試劑的一部分。因此，本發(fā)明提供了可檢測試劑，其含有可用于不同檢測測定(例如，細(xì)胞檢測測定)的多個(gè)葡聚糖。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可檢測試劑，其含有與葡聚糖組分綴合的結(jié)合部分。所述葡聚糖組分可以另外與可檢測實(shí)體連接。根據(jù)本發(fā)明，所述可檢測試劑的葡聚糖組分可以是多個(gè)葡聚糖的任意組合，例如，至少2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)互聯(lián)的葡聚糖的組合。在有些實(shí)施方案中，以使它的用于連接可檢測實(shí)體的部位的可用性最大化的方式，構(gòu)造或互聯(lián)多個(gè)葡聚糖。在其它實(shí)施方案中，以支鏈構(gòu)型構(gòu)造或互聯(lián)多個(gè)葡聚糖。在一些其它的實(shí)施方案中，以分層構(gòu)型構(gòu)造或互聯(lián)多個(gè)葡聚糖。例如，多個(gè)葡聚糖可以以有序或無序方式彼此疊加在上面。在一些其它的實(shí)施方案中，構(gòu)造或互聯(lián)多個(gè)葡聚糖，使得每個(gè)葡聚糖與至少另一個(gè)葡聚糖連接。在另外一些其它的實(shí)施方案中，構(gòu)造或互聯(lián)多個(gè)葡聚糖，使得每個(gè)葡聚糖與至少2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)其它葡聚糖連接。在另外一些其它的實(shí)施方 案中，直接地或間接地互聯(lián)多個(gè)葡聚糖。例如，通過已知方法諸如衍生化，可以直接地互聯(lián)葡聚糖。在有些實(shí)施方案中，間接地互聯(lián)多個(gè)葡聚糖，例如，經(jīng)由能夠引入官能團(tuán)或反應(yīng)部位的實(shí)體或分子。在一些其它的實(shí)施方案中，經(jīng)由一種或多種能夠提供用于連接其它實(shí)體(包括葡聚糖或可檢測實(shí)體)的官能團(tuán)(例如，硫醇或馬來酰亞胺基團(tuán))的分子，間接地互聯(lián)多個(gè)葡聚糖。在有些實(shí)施方案中，經(jīng)由一種或多種實(shí)體間接地互聯(lián)多個(gè)葡聚糖，所述實(shí)體例如交聯(lián)劑、蛋白或核酸，其還可以提供可檢測實(shí)體的連接位點(diǎn)。在另一些實(shí)施方案中，所述葡聚糖組分含有約2至約40個(gè)葡聚糖。在有些實(shí)施方案中，所述葡聚糖組分含有約2至約30個(gè)葡聚糖。在有些實(shí)施方案中，所述葡聚糖組分含有約2至約20個(gè)葡聚糖。在有些實(shí)施方案中，所述葡聚糖組分含有約2個(gè)至約10個(gè)葡聚糖。在有些實(shí)施方案中，所述葡聚糖組分含有約4個(gè)至約8個(gè)葡聚糖。在有些實(shí)施方案中，所述葡聚糖組分含有約4個(gè)、約6個(gè)或約8個(gè)葡聚糖。本發(fā)明的葡聚糖組分的葡聚糖可以具有不同的分子量。在有些實(shí)施方案中，每個(gè)葡聚糖具有約IOkDa至約200kDa的分子量。在有些實(shí)施方案中，每個(gè)葡聚糖具有約30kDa至約IOOkDa的分子量。在有些實(shí)施方案中，每個(gè)葡聚糖具有約50kDa至約70kDa的分子量。在有些實(shí)施方案中，每個(gè)葡聚糖具有約70kDa的分子量。本發(fā)明的葡聚糖組分可以包括類似分子量的葡聚糖或不同分子量的葡聚糖的混合物。在有些實(shí)施方案中，每個(gè)葡聚糖具有基本上相同的或相同的分子量。例如，所述葡聚糖組分可以是所有IOkDa葡聚糖、所有30kDa葡聚糖、所有70kDa葡聚糖、所有IOOkDa葡聚糖或所有200kDa葡聚糖的組合。在其它實(shí)施方案中，所述葡聚糖組分含有葡聚糖的混合物，其中至少一個(gè)葡聚糖的分子量實(shí)質(zhì)上不同于其它葡聚糖。例如，所述葡聚糖組分可以是IOkDa葡聚糖、30kDa葡聚糖、70kDa葡聚糖、IOOkDa葡聚糖和200kDa葡聚糖的任意組合。在其它實(shí)施方案中，所述葡聚糖組分含有低分子量葡聚糖和高分子量葡聚糖的混合物。在另外一些其它的實(shí)施方案中，所述葡聚糖組分含有葡聚糖的混合物，其中這些葡聚糖的總分子量累加至預(yù)定的分子量，例如，約500kDa至約1000kDa、1500kDa、2000kDa或更高。通過本領(lǐng)域已知的或可利用的任意合適的方法，可以制備本發(fā)明的葡聚糖組分。例如，使用標(biāo)準(zhǔn)的衍生化操作，通過順序地衍生化所需的葡聚糖，可以制備所述葡聚糖組分。所述可檢測實(shí)體可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意可檢測實(shí)體，包括:熒光團(tuán)、酶(例如但不限于過氧化物酶或堿性磷酸酶)、重金屬(例如但不限于金或鐵蛋白)、放射性標(biāo)記或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于檢測靶實(shí)體的任意其它分子?？蓹z測實(shí)體可以包括在熒光檢測測定、酶檢測測定、金檢測測定中使用的那些，放射性標(biāo)記諸如放射性磷(諸如31P、32P或33p)、硫(諸如32S或35S)和地高辛配基。在有些實(shí)施方案中，所述可檢測實(shí)體是熒光團(tuán)。熒光團(tuán)是商購可得的，并且任何已知的和/或商購可得的熒光團(tuán)可以用作本發(fā)明的可檢測實(shí)體。在有些實(shí)施方案中，所述熒光團(tuán)表現(xiàn)出綠色熒光(例如494nm/519nm)、橙色熒光(例如554nm/570nm)、紅色熒光(例如590nm/617nm)或遠(yuǎn)紅外熒光(例如651nm/672nm)激發(fā)/發(fā)射波譜。在有些實(shí)施方案中，所述熒光團(tuán)是具有在約350nm至約775nm范圍內(nèi)的激發(fā)和發(fā)射波譜的熒光團(tuán)。在有些實(shí)施方案中，所述激發(fā) 和發(fā)射波譜是約346nm/446nm、約494nm/519nm、約554nm/570nm、約555nm/572nm、約 590nm/617nm、約 651nm/672nm、約 679nm/702nm 或約 749nm/775nm。在有些實(shí)施方案中，所述突光團(tuán)可以包括AlexaFluor3、AlexaFluor5>AlexaFluor350、AlexaFluor405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor500、AlexaFluor514、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor610、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680>AlexaFluor700 和 AlexaFluor750 (Molecular Probes AlexaFlour 染料，可得自Life Technologies, Inc.(USA))。在有些實(shí)施方案中，所述突光團(tuán)可以包括但不限于〇7染料，包括072，073，0738，Cy3.5，Cy5，Cy5.5 和 Cy7(可得自 Lumiprobes )。在有些實(shí)施方案中，所述突光團(tuán)可以包括但不限于DyLight350、DyLight405、DyLight488、DyLight550、DyLight594> DyLight633> DyLight650> DyLight680> DyLight750 和 DyLight800 (可得自ThermoScientific (USA))。在有些實(shí)施方案中，所述突光團(tuán)可以包括但不限于FluoProbes390> FluoProbes488> FluoProbes532> FluoProbes547H> FluoProbes594>FluoProbes647H>FluoProbes682> FluoProbes752 和 FluoProbes782。所述結(jié)合部分可以包括能夠結(jié)合其它分子或分子集合的任意分子或分子集合，包括、但不限于基于蛋白和核酸的結(jié)合部分。多種結(jié)合部分是本領(lǐng)域已知的，并且可以預(yù)見到任何已知的結(jié)合部分與本發(fā)明的方法一起使用。在有些實(shí)施方案中，所述結(jié)合部分包括但不限于:抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、生物素、地高辛配基、免疫試劑、寡核苷酸或其衍生物、肽或其衍生物、核酸或其衍生物、肽核酸或其衍生物、以及蛋白A和蛋白G其配體結(jié)合部分。免疫試劑可以包括但不限于抗體或其抗原結(jié)合部分，且可以包括例如Fab片段。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了制備可檢測試劑的方法。在有些實(shí)施方案中，這些方法包括:提供多個(gè)互聯(lián)的葡聚糖，和使所述互聯(lián)的葡聚糖與結(jié)合部分綴合。在一些其它的實(shí)施方案中，這些方法任選地包括:將可檢測實(shí)體與互聯(lián)的葡聚糖連接。
用于制備多個(gè)互聯(lián)的葡聚糖的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的NHS (N-羥基琥珀酰亞胺基酯)和亞氨基四氫噻吩(iminothiolane)胺衍生化試劑。根據(jù)本領(lǐng)域已知的或可利用的任何合適的綴合方法，可以使多個(gè)互聯(lián)的葡聚糖與結(jié)合部分綴合。在有些實(shí)施方案中，綴合包括在2種實(shí)體(例如，多個(gè)互聯(lián)的葡聚糖和結(jié)合部分)之間的一個(gè)或多個(gè)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵或它們的組合。在有些實(shí)施方案中，可以用亞氨基四氫噻吩衍生化結(jié)合部分，例如抗生物素蛋白。在本領(lǐng)域中已經(jīng)充分描述了亞氨基四氫噻吩反應(yīng)(參見，例如，ThermoScientific instructions availablewith commercially purchased iminothiolane ;以及Traut, R.R.，等人.Biocheml2 (17): 3266-3273(1973))。在有些實(shí)施方案中，可以進(jìn)行衍生化反應(yīng)，以達(dá)到每個(gè)抗生物素蛋白3_5個(gè)硫醇的取代率。在有些實(shí)施方案中，還可以用常用的異雙功能試劑SMCC(琥珀酰亞胺基-4_[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己燒-1-甲酸酯；Pierce Chemical公司，Rockford, IL)衍生化葡聚糖，以形成葡聚糖-胺。SMCC反應(yīng)在本領(lǐng)域中得到充分描述，且是眾所周知的(參見,例如，ThermoScientific instructions available with commerciallypurchase SMCC ；以及 Ishikawa，E.，等人，J Immunoassay4:209-327(1983);Brinkley, M.A.，Bioconjugate Chem3:2-13(1992)；和 Mattson, G.，等 A , Molecular BiologyR印ortsl7:167-83 (1993))。在有些實(shí)施方案中，可以進(jìn)行衍生化反應(yīng)，以得到每個(gè)葡聚糖1-2個(gè)馬來酰亞胺基團(tuán)。 在有些實(shí)施方案中，通過順序地衍生化所需量的葡聚糖，可以制備多個(gè)互聯(lián)的葡聚糖。通過多種方法，可以使可檢測實(shí)體添加或連接至可檢測試劑上，所述方法都是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，可以采用NHS反應(yīng)來將熒光團(tuán)(通常也稱作熒光染料)添加或連接至葡聚糖分子上。在有些實(shí)施方案中，所述熒光團(tuán)可以是NHS酯、琥珀酰亞胺基酯(SE)或四氟苯基(TFP)酯。商購可得的熒光團(tuán)含有關(guān)于將熒光團(tuán)添加至其它分子上的詳細(xì)說明，這些熒光團(tuán)標(biāo)記方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如，可與購買的熒光團(tuán)或其它可檢測實(shí)體一起得到的產(chǎn)品資料；以及Proudnikov D.,等人，Nucleic Acids Research, 24(22):4535-4542(1996) , Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 2003;Current Protocols inMolecular Biology (2002);和 Current Protocols in Immunology (2002))。在有些實(shí)施方案中，用于制備可檢測試劑的方法包括:使結(jié)合部分與葡聚糖綴合，以形成核心葡聚糖-結(jié)合部分，并使所述核心葡聚糖-結(jié)合部分與一個(gè)或多個(gè)葡聚糖綴合，例如，將一個(gè)或多個(gè)葡聚糖層或分支順序地添加至所述核心葡聚糖-結(jié)合部分上。然后可以將得到的葡聚糖-結(jié)合部分復(fù)合物任選地連接至可檢測實(shí)體上。在有些實(shí)施方案中，可以使用葡聚糖來提供主要反應(yīng)部位，例如，當(dāng)使用NHS酯的胺反應(yīng)性衍生物時(shí)。在一些其它的實(shí)施方案中，可以使用葡聚糖來引入次要官能度(functionalities)、官能團(tuán)或反應(yīng)部位，例如，可用于與其它分子(諸如葡聚糖或可檢測實(shí)體)反應(yīng)或連接的硫醇或馬來酰亞胺基團(tuán)。在一些其它的實(shí)施方案中，可以使用葡聚糖來與其它實(shí)體反應(yīng)，以提供其它官能團(tuán)、反應(yīng)部位或結(jié)合部位，例如，用于與葡聚糖或可檢測實(shí)體連接。例如，可以將蛋白質(zhì)諸如藻紅蛋白(phycoethrythrin)與葡聚糖連接，以提供熒光標(biāo)記的內(nèi)源水平，替代使用熒光分子的NHS酯。在另一個(gè)實(shí)例中，可以將核酸引入葡聚糖中，以充當(dāng)反應(yīng)中的其它分子的次要結(jié)合部位，或它們可以充當(dāng)其它官能團(tuán)(functionality)的探針。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備基于抗生物素蛋白的可檢測試劑的方法。在有些實(shí)施方案中，所述方法可以包括:衍生化葡聚糖-胺以產(chǎn)生馬來酰亞胺基團(tuán)，和衍生化抗生物素蛋白以產(chǎn)生硫醇基團(tuán)。然后使所述衍生化的抗生物素蛋白與一定摩爾比的一種或多種衍生化的葡聚糖-胺分子反應(yīng)，其中衍生化的抗生物素蛋白與衍生化的葡聚糖-胺的反應(yīng)會產(chǎn)生葡聚糖-抗生物素蛋白。然后，衍生化所述葡聚糖-抗生物素蛋白以產(chǎn)生每個(gè)葡聚糖的一個(gè)或多個(gè)硫醇基團(tuán)，并進(jìn)一步使所述衍生化的葡聚糖-抗生物素蛋白與一定摩爾比的一種或多種馬來酰亞胺-衍生化的葡聚糖胺分子反應(yīng)，其中所述衍生化的葡聚糖-抗生物素蛋白和所述馬來酰亞胺-衍生化的葡聚糖胺之間的反應(yīng)會產(chǎn)生分層的或分支的葡聚糖-抗生物素蛋白復(fù)合物。然后，任選地使所述葡聚糖-抗生物素蛋白復(fù)合物與一定摩爾比的一種或多種可檢測實(shí)體反應(yīng)，其中所述葡聚糖-抗生物素蛋白復(fù)合物與所述可檢測實(shí)體的反應(yīng)會產(chǎn)生本發(fā)明的可檢測試劑。
在有些實(shí)施方案中，用亞氨基四氫噻吩衍生化抗生物素蛋白，以得到每個(gè)抗生物素蛋白的3-5個(gè)硫醇。然后加入3倍摩爾過量的70kDa葡聚糖-胺，其已經(jīng)使用常用的異雙功能試劑SMCC (琥珀酰亞胺基-4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-甲酸酯，PierceChemical公司，Rockford, IL)用1_2馬來酰亞胺基團(tuán)衍生化。進(jìn)一步用亞氨基四氫噻吩衍生化所述抗生物素蛋白-葡聚糖，以實(shí)現(xiàn)每個(gè)葡聚糖2-3個(gè)硫醇的取代率，然后進(jìn)一步與相對于原始抗生物素蛋白6倍摩爾過量的葡聚糖一起溫育。然后可以用相對于葡聚糖10倍過量的NHS-熒光團(tuán)標(biāo)記所述葡聚糖-抗生物素蛋白復(fù)合物。在有些實(shí)施方案中，所述熒光團(tuán)是 AlexaFluor488 或 AlexaFluor546?？梢哉{(diào)節(jié)試劑的摩爾比，以得到期望數(shù)目的馬來酰亞胺基團(tuán)、硫醇基團(tuán)或期望的可檢測實(shí)體標(biāo)記程度，病者這樣的修改是本領(lǐng)域眾所周知的。技術(shù)人員可以容易地調(diào)節(jié)反應(yīng)物，以實(shí)現(xiàn)所需的反應(yīng)。例如，可以修改反應(yīng)物，以得到特定應(yīng)用所需的特定數(shù)目的馬來酰亞胺和硫醇基團(tuán)。本發(fā)明也提供了用于檢測或定量靶分子的方法。這樣的方法包括:使本發(fā)明的可檢測試劑與疑似含有靶實(shí)體的樣品接觸，其中所述可檢測試劑的結(jié)合部分能夠結(jié)合所述靶實(shí)體，然后檢測可檢測實(shí)體信號，以便檢測或定量靶分子。靶實(shí)體可以包括但不限于蛋白、蛋白集合、肽、核酸或細(xì)胞。樣品可以包括任意的生物樣品或非生物樣品。在有些實(shí)施方案中，樣品包括任何未經(jīng)處理的或經(jīng)處理的細(xì)胞、組織和/或人分泌樣品。在一些其它的實(shí)施方案中，樣品包括從粗制生物樣品中部分地或完全地分離或純化的任何核酸、蛋白或亞細(xì)胞組分。在另一些其它的實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的樣品包括但不限于:血清、血液、血漿、全血及其衍生物、皮膚、毛發(fā)、毛囊、唾液、口腔粘液、陰道粘液、汗液、淚液、上皮組織、尿、精液(semen)、精液(seminal fluid)、精衆(zhòng)、前列腺液、射精前的流體(Cowper氏流體)、排泄物、活組織檢查樣品、腹水、腦脊液、淋巴、和組織提取物樣品、或活組織檢查樣品樣品、或它們的組合(參見，例如，Clinical Proteomics:Methods and Protocols,第 428 卷，Methodsin Molecular Biology, Antonia Vlahou 編(2008);和 Holland, N.，Mutation Research/Reviews in Mutation Research, 543 (3): 217-234 (2003);它們?nèi)客ㄟ^引用整體并入本文)。
就與檢測和定量有關(guān)的方法而言，這樣的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，且可以采用任意標(biāo)準(zhǔn)方法?；谝c本發(fā)明的可檢測試劑一起使用的可檢測實(shí)體，技術(shù)人員將容易地理解采用哪種方法。這樣的檢測和定量方案是眾所周知的，且可以采用任意標(biāo)準(zhǔn)方法(參見，例如，Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, Frederick M.編(2010);Current Protocols in Protein Science Last, Coligan, John E.，等人 編(2010);Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Egli，Martin 編(2010)；和Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第 3 版，Sambrook, Joseph (2001),它們都通過引用整體并入本文)。本發(fā)明的可檢測試劑可以與下述測定一起使用:免疫測定(諸如ELISA)、細(xì)胞分選測定(例如但不限于FACS)、流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)測定、核酸測定、蛋白測定、藥物相互作用測定、微流體測定、稀少細(xì)胞檢測或定量、或本領(lǐng)域目前使用和描述的多種分選、檢測或定量測定中的任意其它測定。這樣的測定可以是手工的或自動化的。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑與例如微通道或其它微流體裝置一起使用。本發(fā)明的可檢測試劑可以用于檢測和定量靶實(shí)體(諸如分子、蛋白和/或核酸)。這樣的靶實(shí)體還可以包括稀少細(xì)胞。在有些實(shí)施方案中，稀少細(xì)胞可以包括:在生物樣品中通常不存在的、且可以作為疾病或異常狀況的指示劑而呈現(xiàn)的任意細(xì)胞。在有些實(shí)施方案中，這些細(xì)胞比樣品中的其它細(xì)胞小約I個(gè)或多個(gè)數(shù)量級存在。這樣疾病或狀況可以包括慢性疾病(諸如癌癥)、損傷或妊娠。在有些實(shí)施方案中，稀少細(xì)胞可以包括這樣的細(xì)胞:其通常存在于生物樣本中，但是存在的頻率比樣品中存在的其它細(xì)胞小約I個(gè)或多個(gè)數(shù)量級。稀少細(xì)胞可以包括但不限于:循環(huán)的腫瘤細(xì)胞(CTC)、胎兒細(xì)胞和干細(xì)胞。用于對比得自各種可檢測實(shí)體的信號的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，技術(shù)人員可以容易地獲知如何進(jìn)行這樣的對比分析?？梢詫⒃鰪?qiáng)的、增加的和/或放大的檢測與下述結(jié)合部分進(jìn)行對比:直接綴合到一 種或多種可檢測實(shí)體上的結(jié)合部分，或綴合到含有一種或多種可檢測實(shí)體的單一葡聚糖上的結(jié)合部分。增強(qiáng)的、增加的和/或放大的檢測可以包括:例如，減少的與非靶實(shí)體的結(jié)合(例如，減少的與白血細(xì)胞(WBC)的結(jié)合)，減少的非特異性結(jié)合，增加的可檢測實(shí)體信號(例如，增加的來自熒光團(tuán)的光信號，增加的來自放射性標(biāo)記的放射性信號，或增加的來自酶反應(yīng)的光)，以及增加的測定靈敏度(例如，可以增加樣品中的稀少細(xì)胞的檢測水平，從而檢測更多的稀少細(xì)胞)。使用本發(fā)明的可檢測試劑，還可以增加靶實(shí)體(諸如CTC、胎兒細(xì)胞、干細(xì)胞或其它稀少細(xì)胞)的檢測選擇性。本發(fā)明的可檢測試劑可以用于增強(qiáng)臨床樣品中的CK染色細(xì)胞的檢測，以及用于在多種測定中檢測不含有CK染色劑的細(xì)胞，以便增加在樣品中檢測出的CTC的數(shù)目。在有些實(shí)施方案中，與在沒有本發(fā)明的葡聚糖組分或綴合到含有一種或多種可檢測實(shí)體的單一葡聚糖上的結(jié)合部分存在下用綴合到可檢測實(shí)體上的結(jié)合部分實(shí)現(xiàn)的檢測相比，本發(fā)明的可檢測試劑會提供增強(qiáng)的、增加的和/或放大的檢測。在有些實(shí)施方案中，當(dāng)將本發(fā)明的可檢測試劑綴合到可檢測實(shí)體上時(shí)，所述可檢測試劑會產(chǎn)生強(qiáng)2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍的信號。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的可檢測試劑具有減少的或下降的與非靶實(shí)體的非特異性結(jié)合。在有些實(shí)施方案中，所述減少的非特異性結(jié)合會導(dǎo)致可檢測試劑的信噪比增加/優(yōu)化5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
實(shí)施例提供下述實(shí)施例來例證、而不是限制要求保護(hù)的發(fā)明。實(shí)施例1:使用熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白-葡聚糖生物綴合物在Biocept微通道中對細(xì)胞的增強(qiáng)染色本實(shí)施例描述了用于替代染色的試劑和方法，其可以用于增強(qiáng)臨床樣品中的CK染色細(xì)胞的檢測，且其可以用于檢測不含有CK染色劑的細(xì)胞。通過使結(jié)合部分(諸如抗生物素蛋白)與含有熒光標(biāo)記的氨基-葡聚糖(突光團(tuán)可檢測實(shí)體)綴合，可以實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)的或放大的染色。該增強(qiáng)形式的抗生物素蛋白的亮度是熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白的數(shù)倍，并且重要的是，其具有更低的與血液中的非靶細(xì)胞的非特異性結(jié)合。二者相加意味著，熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白-葡聚糖具有提高5-10倍的信噪比。通過具有更少的與非靶白血細(xì)胞(WBC)的非特異性結(jié)合，這會在捕獲的CTC的選擇性檢測中提供獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白-葡聚糖的制備在這些實(shí)驗(yàn)中使用標(biāo)準(zhǔn)的NHS和亞氨基四氫噻吩胺衍生化試劑。這些試劑的基本反應(yīng)條件是本領(lǐng)域眾所周知的。但是，這些綴合物各自的溫育次序和摩爾比對于抗生物素蛋白-葡聚糖綴合物的最終性能而言是重要的。下面是用于制備抗生物素蛋白-葡聚糖綴合物的優(yōu)選實(shí)施方案。用亞氨基四氫噻吩衍生化抗生物素蛋白，以實(shí)現(xiàn)每個(gè)抗生物素蛋白3-5個(gè)硫醇的取代率。向其中加入3倍摩爾過量的70kDa葡聚糖-胺，后者已經(jīng)使用常用的異雙功能試劑SMCC(琥珀酰亞胺基-4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-甲酸酯fierceChemical公司，Rockford, IL)用1_2馬來酰亞胺基團(tuán)衍生化。NHS是N-羥基琥珀酰亞胺基酯。結(jié)束后，進(jìn)一步用亞氨基四氫噻吩衍生化抗生物素蛋白-葡聚糖綴合物，以實(shí)現(xiàn)每個(gè)葡聚糖2-3個(gè)硫醇的取代率，然后進(jìn)一步與相對于原始抗生物素蛋白6倍摩爾過量的葡聚糖一起溫育。最后，用相對于葡聚糖10倍過量的NHS-熒光染料(在當(dāng)前的實(shí)施例中，488或546)標(biāo)記該綴合物?？梢哉{(diào) 節(jié)馬來酰亞胺、硫醇基團(tuán)的摩爾比或熒光標(biāo)記程度，以實(shí)現(xiàn)綴合物的改良性質(zhì)。據(jù)估計(jì)，該方法會產(chǎn)生連接了 4-8個(gè)70kDa的葡聚糖的抗生物素蛋白，在本實(shí)施例中將其稱作基于抗生物素蛋白的可檢測試劑70kDa葡聚糖。使用500kDa葡聚糖-胺，制備一種替代性的抗生物素蛋白-葡聚糖綴合物。在該情況下，采用相同的衍生化試劑。如上所述制備硫醇酯化的抗生物素蛋白。還如上所述用SMCC衍生化500kDa葡聚糖-胺，并與抗生物素蛋白綴合。在本實(shí)施例中，然后在與使用70kDa葡聚糖-胺的上述方法中相同的摩爾比過量(10倍)，用NHS-AleXaFluor488熒光標(biāo)記500kDa抗生物素蛋白-葡聚糖綴合物。在本實(shí)施例中將該試劑稱作基于抗生物素蛋白的試劑500kDa葡聚糖。結(jié)果和討論可以使用3種不同類型的染色方法來檢測已經(jīng)用抗體混合液捕獲在微通道上的細(xì)胞(參見，圖1)。在反應(yīng)A中，捕獲的細(xì)胞被在CTC領(lǐng)域中常用的抗-CK染色。細(xì)胞角蛋白是一種胞質(zhì)蛋白，通過與用綠色熒光染料(命名為488 )標(biāo)記的抗-細(xì)胞角蛋白抗體一起溫育，將細(xì)胞染色。在反應(yīng)B中，通過加入抗生物素蛋白-488(用488染料標(biāo)記的抗生物素蛋白)，將所述細(xì)胞進(jìn)一步染色。在該情況下，所述抗體將細(xì)胞質(zhì)CK染色，并且抗生物素蛋白通過結(jié)合已經(jīng)用生物素標(biāo)記的捕獲抗體而進(jìn)一步將細(xì)胞表面染色。兩種染色是累加性的，從而導(dǎo)致更高的細(xì)胞標(biāo)記。這方面的一個(gè)實(shí)施例顯示在圖2中。在反應(yīng)C中，細(xì)胞未被細(xì)胞角蛋白染色，而僅被抗生物素蛋白-488染色。在該情況下，僅僅基于與細(xì)胞表面上的生物素化的捕獲抗體相結(jié)合的抗生物素蛋白的數(shù)目而觀察細(xì)胞。這方面的一個(gè)實(shí)驗(yàn)實(shí)施例顯示在圖3中。在圖2中顯示了抗體混合液對乳腺癌腫瘤細(xì)胞的捕獲、以及CK染色劑對它的檢測(圖A)。在該情況下，染色非常弱，盡管在背景以上足夠高以致于被鑒別為腫瘤細(xì)胞。象通常一樣，這些CTC細(xì)胞同時(shí)地被紅色熒光標(biāo)記的⑶45染色，且該細(xì)胞是⑶45陰性的。記錄該細(xì)胞的位置，然后用抗生物素蛋白-488將微通道染色。圖B顯示了在抗生物素蛋白-488處理以后該細(xì)胞的重新定位，并表明，它被遠(yuǎn)遠(yuǎn)更亮地染色。在兩幅圖中，觀察到白血細(xì)胞(細(xì)胞核被DAPI染色)，但是這些細(xì)胞不具有可檢測的染色。在圖3中顯示了僅僅基于捕獲抗體的染色的細(xì)胞檢測的一個(gè)實(shí)例。在該實(shí)驗(yàn)中，將SKOV細(xì)胞摻入血液中，并為CTC的捕獲而處理樣品(參見，例如，美國專利申請?zhí)?0100255479)。盡管并非絕對量度，SKOV細(xì)胞的核大小通常是典型WBC的細(xì)胞核的2_3倍。在僅用抗生物素蛋白-488染色以后，SKOV細(xì)胞被亮染色，而WBC不具有可檢測的染色。這證實(shí)，通過細(xì)胞表面捕獲抗體的標(biāo)記，可以檢測出未被CK染色的細(xì)胞或不含有CK的細(xì)胞。如在未決的美國專利申請?zhí)?0100255479中所述，通過使用多種抗體，可以顯著增強(qiáng)該染色。在圖4中顯示了在微通道上的乳腺癌樣品的計(jì)數(shù)。在該實(shí)驗(yàn)中，首先在標(biāo)準(zhǔn)條件下用熒光標(biāo)記的488抗-CK抗體將細(xì)胞染色。檢測綠色標(biāo)記的細(xì)胞，記錄它們在微通道上的X-Y坐標(biāo)。接著，用綠色熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白處理通道，以標(biāo)記在細(xì)胞表面上的抗體。記錄通道的綠色熒光細(xì)胞，除了關(guān)于CK染色劑記錄的位置以外。也確定如此鑒別出的所有細(xì)胞是CD45陰性的。條形圖表明，在大多數(shù)情況下，抗生物素蛋白檢測出比CK染色劑明顯更多的細(xì)胞。在使用健康供體血液的對照實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)在相同條件下進(jìn)行時(shí)，不存在可檢測的細(xì)胞，并同時(shí)被與抗生物素蛋白-488相組合的抗-CK-488染色(數(shù)據(jù)未顯示)。在圖5中顯示了用熒光染料標(biāo)記的抗生物素蛋白葡聚糖綴合物(基于抗生物素蛋白的可檢測試劑)的圖示。每個(gè)抗生物素蛋白的理論染料數(shù)目高于僅用抗生物素蛋白標(biāo)記。在圖6中顯示了用單一生物素化的EpCAM抗體溫育、隨后用抗生物素蛋白_488(綠色熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白)和抗生物素蛋白-葡聚糖-488 (基于抗生物素蛋白的可檢測試劑70kDa葡聚糖)溫育的SKOV細(xì)胞的FACS分析。第一個(gè)和第二個(gè)條是對照細(xì)胞的染色強(qiáng)度，其中加入了抗生物素蛋白或綴合物，但是沒有加入生物素化的EpCAM抗體。第三個(gè)條顯示了當(dāng)將抗生物素蛋白-488加給EpCAM處理過的細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的染色強(qiáng)度。第四個(gè)條顯示了用抗生物素蛋白-葡聚糖-488溫育的相同細(xì)胞的染色強(qiáng)度。這些數(shù)據(jù)指示，抗生物素蛋白-葡聚糖綴合物的熒光強(qiáng)度是單獨(dú)的抗生物素蛋白-488的3-4倍。用抗生物素蛋白-546 (橙色熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白)和抗生物素蛋白-葡聚糖-546 (基于抗生物素蛋白的可檢測試劑70kDa葡聚糖)對SKOV和白血細(xì)胞(WBC)的相對染色。在該實(shí)驗(yàn)中，將SKOV細(xì)胞摻入血液中，并象平常一樣處理，并使用捕獲抗體的抗體混合液捕獲在微通道上。然后僅用抗生物素蛋白-546 (546指示橙色熒光染料)和抗生物素蛋白-葡聚糖-546將不同通道中的細(xì)胞染色。在圖A和C中，大的強(qiáng)染色的細(xì)胞被橙色熒光地標(biāo)記。得自顯微鏡的匹 配圖像B和D是DAPI染色的細(xì)胞，其揭示有核細(xì)胞，無論它們是SKOV還是WBC。在圖B的情況下，檢測到10個(gè)DAPI陽性的WBC (用箭頭指示)。在圖像匹配的圖A (其中使用適當(dāng)?shù)臑V光片揭示橙色熒光標(biāo)記的細(xì)胞)中，10個(gè)WBC中的9個(gè)可以視作在暴露2秒以后含有不同水平的橙色染色劑。當(dāng)將相同標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于抗生物素蛋白-葡聚糖處理過的通道時(shí)，在圖D中檢測到9個(gè)DAPI陽性的WBC，而在使用橙色濾光片的匹配的圖C中，在暴露2秒以后僅I個(gè)WBC是微弱可檢測的。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抗生物素蛋白-葡聚糖染色劑不僅比單獨(dú)的抗生物素蛋白更強(qiáng)地將細(xì)胞染色(圖6)，而且對周圍的WBC具有更少的背景染色。對比了通過使用下述綴合物標(biāo)記SKOV細(xì)胞所得到的相對熒光強(qiáng)度:抗生物素蛋白-葡聚糖綴合物染色劑(A ;基于抗生物素蛋白的可檢測試劑70kDa葡聚糖)，除了使用單一 500kDa的葡聚糖-胺分子(與抗生物素蛋白綴合，并用AlexaFluor-488突光標(biāo)記)以夕卜，以相同方式制備的抗生物素蛋白-葡聚糖綴合物(B ;基于抗生物素蛋白的可檢測試劑500kDa葡聚糖)。盡管每個(gè)核心抗生物素蛋白-葡聚糖綴合物含有可比較的葡聚糖重量/抗生物素蛋白分子,并且各自用相同摩爾過量的NHS-AlexaFluor-488衍生化，順序地制備的含有分層的或分支的葡聚糖的綴合物導(dǎo)致細(xì)胞的熒光標(biāo)記水平提高了幾乎3倍。在本文中討論和引用的所有出版物通過引用整體并入本文。應(yīng)當(dāng)理解，公開的發(fā)明不限于描述的特定方法、方案和材料，因?yàn)檫@些可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解，在本文中使用的術(shù)語僅僅是用于描述特定實(shí)施方案的目的，無意限制本發(fā)明的范圍，所述范圍僅由所附權(quán)利要求限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到或者使用不超過例行實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼_定本文描述的發(fā)明的具體實(shí)施方案的許 多等同方案。這樣的等同方案意圖被所附權(quán)利要求包括在內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種可檢測試劑，其包含與葡聚糖組分綴合的結(jié)合部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可檢測試劑，其中所述葡聚糖組分與可檢測實(shí)體連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可檢測試劑，其中所述葡聚糖組分含有約2個(gè)至約10個(gè)葡聚糖、約4個(gè)至約8個(gè)葡聚糖或約6個(gè)葡聚糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可檢測試劑，其中每個(gè)葡聚糖具有約IOkDa至約200kDa的分子量、約30kDa至約IOOkDa的分子量、或約50kDa至約70kDa的分子量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可檢測試劑，其中所述葡聚糖具有約70kDa的分子量。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可檢測試劑，其中所述葡聚糖組分包含超過一個(gè)葡聚糖，且其中每個(gè)葡聚糖具有基本上相同的分子量。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可檢測試劑，其中所述葡聚糖組分包含超過一個(gè)葡聚糖，其中至少一個(gè)葡聚糖的分子量不同于其它葡聚糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可檢測試劑，其中所述可檢測實(shí)體是熒光團(tuán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的可檢測試劑，其中所述熒光團(tuán)選自具有綠色熒光、橙色熒光、紅色突光和遠(yuǎn)紅外突光的突光團(tuán)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的可檢測試劑，其中所述熒光團(tuán)選自具有在約350nm至775nm范圍內(nèi)的激發(fā)和發(fā)射波譜的熒光團(tuán)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述突光團(tuán)選自具有約346nm/446nm、約494nm/519nm、約 554nm/570nm、約 555nm/572nm、約 590nm/617nm、約 651nm/672nm、約679nm/702nm或約749nm/775nm的激發(fā)和發(fā)射波譜的熒光團(tuán)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可檢測試劑，其中所述結(jié)合部分選自:抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、生物素、地高辛配基、免疫試劑、寡核苷酸、肽核酸、蛋白A和蛋白G。
13.—種制備可檢測試劑的方法，所述方法包括: 提供葡聚糖組分， 使所述葡聚糖組分與結(jié)合部分綴合，以形成葡聚糖-結(jié)合部分復(fù)合物；和 將可檢測實(shí)體連接至所述葡聚糖-結(jié)合部分復(fù)合物。
14.一種制備可檢測試劑的方法，所述方法包括: 使結(jié)合部分與葡聚糖綴合，以形成核心葡聚糖-結(jié)合部分， 使所述核心葡聚糖-結(jié)合部分與葡聚糖反應(yīng)，以形成葡聚糖-結(jié)合部分復(fù)合物，和 將可檢測實(shí)體連接至所述葡聚糖-結(jié)合部分復(fù)合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述結(jié)合部分是抗生物素蛋白。
16.一種用于檢測或定量靶分子的方法，所述方法包括: 使根據(jù)權(quán)利要求2所述的可檢測試劑與疑似含有靶分子的樣品接觸，其中所述結(jié)合部分能夠結(jié)合所述靶分子；和 檢測與所述葡聚糖組分連接的可檢測實(shí)體的信號，由此檢測或定量所述靶分子。
17.一種包含多個(gè)互聯(lián)的葡聚糖的試劑，其中所述試劑包含至少2個(gè)葡聚糖。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑，其中葡聚糖的總分子量是至少500kDa。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑，其中所述多個(gè)互聯(lián)的葡聚糖構(gòu)造成分層構(gòu)型或分支構(gòu)型。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑， 其中所述多個(gè)互聯(lián)的葡聚糖與可檢測實(shí)體連接。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有與葡聚糖部分綴合的結(jié)合部分的試劑、制備這類試劑的方法、以及這類試劑在多種分子測定和細(xì)胞測定中的用途。
文檔編號G01N33/58GK103229057SQ201180056340
公開日2013年7月31日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月23日
發(fā)明者S·D·米克拉吉塞克, L·S·米勒 申請人:生物概念股份有限公司