纖絲病毒融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了包含纖絲病毒糖蛋白片段和免疫球蛋白多肽片段的融合蛋白。所述融合蛋白用于免疫原性組合物以在人和非人動物中保護抵御纖絲病毒例如埃博拉病毒的感染。所述融合蛋白也用于診斷試驗以檢測纖絲病毒感染。
【專利說明】纖絲病毒融合蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及纖絲病毒(Filovirus)糖蛋白融合蛋白在預(yù)防和診斷纖絲病毒感染中的應(yīng)用。
技術(shù)背景[0002]埃博拉病毒(EBOV)和馬爾堡病毒(MARV)是纖絲病毒科(Filoviridae)的成員，纖絲病毒科是分類為“A類”生物戰(zhàn)劑的病毒家族，造成人和非人靈長動物中嚴(yán)重的出血熱，發(fā)病率和死亡率高達 90%(Sanchez 等，F(xiàn)iloviridae:Marburg and Ebola viruses (纖絲病毒科:馬爾堡和埃博拉病毒)，第1409-1448頁，收錄于D.M.Knipe, P.M.Howley, D.E.Griffin, M.A.Martin, R.A.Lamb, B.Roizman 和 S.E.Straus (編),Fields Virology(《費氏病毒學(xué)》)，第5版，賓夕法尼亞州費城的利平科特威廉斯和威爾金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins) 2007)。4 - 10天的短培養(yǎng)期后，纖絲病毒感染個體突然發(fā)生與很多其他病毒感染相同的癥狀，包含發(fā)熱、發(fā)冷、不適和肌痛。MARV在抗原性上穩(wěn)定并僅存在一個種類，而EBOV更加可變并有五個種類。最近在2007年末在烏干達爆發(fā)了本迪布焦(Bundibugyo)EBOV(Towner 等，PLoS Pathog2008 年 11 月；4 (11): el000212),相較扎伊爾(Zaire)、蘇丹(Sudan)或萊斯頓(Reston)的EBOV種，其與象牙海岸(Ivory Coast)種更加接近。扎伊爾EBOV (ZEBOV)通常與最高致死率相關(guān)聯(lián)。非洲爆發(fā)和近期豬中EBOV爆發(fā)數(shù)目的增加(Normile Science2009年I月23日;323 (5913):451)，引起了牲畜可以把致死疾病傳遞給人的關(guān)注，這突出了開發(fā)疫苗和包含爆發(fā)在內(nèi)的快速診斷測試的緊迫性。基于纖絲病毒糖蛋白(GP)的疫苗處于臨床前和臨床評價中，并且當(dāng)前沒有治療劑來治療纖絲病毒感染。由于對安全和有效的纖絲病毒疫苗的許可能需要數(shù)年，診斷和隔離感染的個體是當(dāng)前限制爆發(fā)的主要方法。
[0003]當(dāng)前開發(fā)了數(shù)個纖絲病毒疫苗候選，包含表達EBOV GP的重組腺病毒(Sullivan 等，PLoS Med2006 年 6 月；3 (6): el77;Sullivan 等，Nature2OO3 年 8 月 7H ; 424 (6949):681-4;和 Sullivan 等，Nature2000 年 11 月 30 日；408 (6812): 605-9)、重組副流感病毒(Bukreyev等，J Virol2007年6月；81 (12):6379-88)、重組委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Pushko 等，Vaccine2000 年 8 月 15 日；19 (I): 142-53)、重組復(fù)制型(Feldmann等，PLoS Pathog2007 年 I 月;3 ⑴:e2 和 Jones 等，Nat Med2005 年 7 月;11 (7): 786-90)和重組復(fù)制缺陷型(Halfmann等，J Virol2009年4月;83(8):3810-5)水泡性口炎病毒、和載有纖絲病毒GP的病毒樣顆粒(Warfield等，Proc Natl Acad Sci U S A2003年12月 23 日；100 (26):15889-94 和 Warfield 等，J Infect Dis2007 年 11 月 15 日；196 增刊2:S430-7)。使用桿狀病毒表達纖絲病毒GP的起始研究顯示部分保護，可以對昆蟲細胞中糖基化特性和GP的加工起作用(Mellquist-Riemenschneider等，Virus Res2003年4月；92 (2):187-93)。
[0004]盡管在這方面有進步，還需要開發(fā)針對纖絲病毒感染的新疫苗。本發(fā)明解決了這些和其它需求。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了包含纖絲病毒糖蛋白片段和免疫球蛋白多肽片段的融合蛋白。在典型的實施方式中，所述纖絲病毒糖蛋白片段是例如來自埃博拉病毒(特別是扎伊爾埃博拉病毒Mayinga株)的胞外結(jié)構(gòu)域。所述免疫球蛋白多肽片段能是IgGl的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)多肽(即Fe片段)。在一些實施方式中，所述融合蛋白還包含纖絲病毒糖蛋白片段和免疫球蛋白多肽片段之間的接頭。本發(fā)明的示例性融合蛋白是由沒有接頭的SEQ ID NO:1和有FLAG標(biāo)簽接頭的SEQ ID NO: 3所示的核酸序列編碼。
[0006]本發(fā)明還提供包含本發(fā)明融合蛋白的免疫原性組合物。所述免疫原性組合物還可以包含佐劑。
[0007]也提供了包含本發(fā)明融合蛋白編碼核酸序列的核酸載體。示例性核酸序列示于SEQ ID NO:1。
[0008]本發(fā)明還提供了在患者中誘導(dǎo)對纖絲病毒感染的保護免疫反應(yīng)的方法。所述方法包含給予患者免疫有效量的本發(fā)明免疫原性組合物。所述免疫原性組合物能包含本發(fā)明融合蛋白或其編碼核酸分子。所述組合物能以任意多種途徑給予。在一些實施方式中，所述組合物肌肉內(nèi)給予。
[0009]本發(fā)明也提供了檢測患者中纖絲病毒免疫反應(yīng)的方法。所述方法包含使患者生物樣品接觸本發(fā)明融合蛋白，并且檢測體液或細胞免疫反應(yīng)。能使用ELISA、化學(xué)發(fā)光試驗或熒光試驗檢測抗體。細胞免疫反應(yīng)能通過檢測IFN-Y、TNF-a、或其他細胞因子和細胞活化及增殖試驗來檢測。
[0010]本發(fā)明的另一方面是檢測患者生物樣品中抗纖絲病毒抗體(即中和抗體)的方法，所述患者用纖絲病毒糖蛋白Fe融合蛋白或其他免疫原免疫。這種方法包含使生物樣品接觸表達纖絲病毒GP的重組水皰性ロ炎病毒(VSV)(如扎伊爾埃博拉病毒Mayinga株)，并且評價易受纖絲病毒感染的細胞中殘留的感染性。所述用于此試驗的細胞能是Vero E6細胞?；蛘咚鲋亟MVSV顆粒能固定在固體支持物上，并且抗纖絲病毒抗體能使用標(biāo)準(zhǔn)方法例如ELISA、化學(xué)發(fā)光試驗或熒光試驗來檢測。
[0011]定義
[0012]術(shù)語“佐劑”和〃免疫刺激劑〃在本文中互換使用，并且定義為ー種或多種引起免疫系統(tǒng)刺激的物質(zhì)。本文中，佐劑用于增強對本發(fā)明融合蛋白的免疫反應(yīng)。
[0013]本文使用的術(shù)語“氨基末端”(或“ N-末端”)和“羧基末端”(或“ C-末端”)表示多肽特別是本發(fā)明融合蛋白內(nèi)的位置。本文允許時，涉及多肽或蛋白的特定序列或片段使用這些術(shù)語以表示附近或相對位點。例如，多肽中相對參照序列位于羧基末端的某些序列位于參照序列的羧基末端附近，但并不必需在完整多肽的羧基末端。
[0014]當(dāng)用于序列的氨基酸殘基位點吋，術(shù)語“對應(yīng)”指當(dāng)序列最優(yōu)比對時，多個序列的對應(yīng)位點。
[0015]術(shù)語“表達載體”指包含感興趣多肽編碼片段(如本發(fā)明融合蛋白)的線形或環(huán)形DNA分子，所述感興趣多肽編碼片段可選連接到提供轉(zhuǎn)錄的其他片段。這種其他片段包含啟動子和終止子序列，并且也可以包含一個或多個復(fù)制起點、ー個或多個選擇標(biāo)記、增強子、聚腺苷酸化信號等。表達載體通常來自細菌或病毒DNA，并且可以包含兩者的元件。[0016]兩個或更多個核酸或多肽序列(如本發(fā)明融合蛋白和其編碼多核苷酸)背景下術(shù)語"相同的"或"相同性"指就最大對應(yīng)性進行比較和比對時，相同或有特定百分?jǐn)?shù)的相同氨基酸殘基或核苷酸的兩個或更多個序列或亞序列，如使用下列序列比較算法之一或通過視覺檢查測量。
[0017]本發(fā)明的兩個核酸或多肽背景下的短語"基本相同"指就最大對應(yīng)性進行比較和比對時，兩個或更多個序列有至少60%，更優(yōu)選65%，甚至更優(yōu)選70%，仍然更優(yōu)選75%，甚至更優(yōu)選80%和最優(yōu)選90-95%核苷酸或氨基酸殘基相同性，如使用下列序列比較算法之一或通過視覺檢查測量。優(yōu)選地，基本相同存在于至少約50個殘基長度的序列區(qū)域上，更優(yōu)選至少約100個殘基的區(qū)域上，并且最優(yōu)選所述序列在至少150個殘基上基本一致。在最優(yōu)選的實施方式中，所述序列在編碼區(qū)域的整個長度上基本一致。
[0018]對于序列比較，一般將ー種序列用作與測試序列比較的參照序列。使用序列比較算法吋，將測試序列和參比序列輸入計算機，如果必要則指定子序列坐標(biāo)，并指定序列算法程序參數(shù)。然后，序列比較算法根據(jù)指定的程序參數(shù)計算測試序列相對參比序列的序列相同性百分?jǐn)?shù)。
[0019]可通過，例如Smith和Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2:482 (1981),通過 Needleman 和 Wunsch 的同源性比對算法，J.Mol.Biol.48:443 (1970)，通過 Pearson 和 Lipman 的相似性搜索法，Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USA85:2444 (1988),通過計算機執(zhí)行這些算法(遺傳學(xué)計算組(Genetics Computer Group)的威斯康星遺傳學(xué)軟件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的 GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，威斯康星州麥迪遜(Madison, WI))科學(xué)大道575號，或視覺檢查(通常參見，Current Protocols in Molecular Biology (《新編分子生物學(xué)實驗指南》)(F.M.Ausubel等編，Current Protocols (《新編實驗指南》)，格林出版聯(lián)合公司(GreenePublishing Associates, Inc)和約翰,利森出版公司(John Wiley&Sons, Inc.)合資公司，(1995增刊)(Ausubel))進行最優(yōu)序列比對以便比較。
[0020]適合測定序列相同性百分?jǐn)?shù)和序列相似性百分?jǐn)?shù)的示例性算法是BLAST和BLAST2.0 算法，分別描述于 Altschul 等(1990) J.Mol.Biol.215:403-410 和 Altschul 等(1977)Nucleic Acids Res.25:3389-3402。進行BLAST分析的軟件可從國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)公開！犬得(http://ncb1.nlm.nih.gov/)。此算法包括:首先通過鑒定查詢序列中長度為W的短字來鑒定高評分序列對(HSP)，與數(shù)據(jù)庫序列中長度相同的字比對時它們能匹配或滿足ー些正值的閾值評分T。T稱為相鄰字評分閾值(Altschul等，同上)。這些初始相鄰字命中用作啟動搜索的種子，以便找到含有它們的較長HSP。然后，沿各個序列在兩個方向上延伸該字命中，直到提高累積的比對評分。就核苷酸序列而言，采用參數(shù)M(—對匹配殘基的獎勵評分；總是>0)和N(錯配殘基的罰分；總是〈O)計算累積評分。就氨基酸序列而言，用評分矩陣計算累積評分。出現(xiàn)以下情況時中止字命中在各個方向上的延伸:累積比對評分比其最大獲得值降低X ;由于ー個或多個負評分殘基比對的累積，累積評分變?yōu)榱慊蛄阋韵?；或者達到任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對的靈敏度和速率。BLASTN程序(對核苷酸序列而言)采用的默認(rèn)值如下:字長(W)ll，期望值(E)10，M=5，N=-4，以及比較兩條鏈。就氨基酸序列而言，BLASTP程序使用默認(rèn)參數(shù)，字長(W) 3、期望值(E) 10、使用BL0SUM62評分矩陣(參見Henikoff和 Henikoff(1989)Proc Natl Acad Sci USA89:10915 (1989))。
[0021]除計算序列相同性百分?jǐn)?shù)外，BLAST算法也進行兩個序列之間相似性的統(tǒng)計學(xué)分析(參見例如，Karlin 和 Altschul，Proc.Nat’ 1.Acad.Sc1.USA90:5873-5787 (1993))。BLAST算法提供的一種相似性測量是最小概率和(P (N))，它表明兩個核苷酸或氨基酸序列之間偶爾發(fā)生匹配的概率。例如，如果測試核酸與參照核酸比較時的最小概率和小于約0.1，更優(yōu)選小于約0.01，最優(yōu)選小于約0.001，那么認(rèn)為該核酸與參照序列相似。
[0022]說明本發(fā)明兩種核酸序列或多肽基本相同的進一步指標(biāo)是第一種核酸編碼的多肽與第二種核酸編碼的多肽能發(fā)生免疫交叉反應(yīng)，如下所述。因此，例如某多肽與第二種多肽的區(qū)別僅為保守取代時，該兩種肽通?；鞠嗤?。兩種核酸序列基本相同的另一指標(biāo)是兩種分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下互相雜交，如下所述。
[0023]“免疫球蛋白”是脊椎動物生物體中作為抗體功能的血清蛋白。各免疫球蛋白包含輕鏈和重鏈。各鏈包括恒定區(qū)和可變區(qū)。有5種類型的重鏈,表示為α、δ、ε、y和μ，其分別定義抗體類型IgA、IgD, IgE, IgG和IgM0人中，IgG由四個稱為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的亞型組成。編碼人和非人免疫球蛋白鏈的DNA序列為本領(lǐng)域熟知。
[0024]術(shù)語“免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)多肽”表示野生型免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)或其變體。IgG恒定區(qū)包含CH1、CH2、和Ch3結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)。
[0025]“Fe片段”是與Fe受體相互作用的免疫球蛋白區(qū)對應(yīng)的重鏈恒定區(qū)的片段。在IgG, IgA和IgD中，所述Fe區(qū)對應(yīng)CH2，和CH3結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)。在IgM和IgE，所述Fe區(qū)包含三個重鏈恒定區(qū)(Ch2，Ch3和Ch4)。
[0026]“可操作連接”指兩個或多個DNA片段結(jié)合一起，從而就其預(yù)定用途協(xié)同作用。例如，編碼序列在正確的讀框中可操作連接到啟動子，從而轉(zhuǎn)錄在啟動子開始，并且通過編碼片段進行到終止子。
[0027]“多核苷酸”是通常從5’讀向3’末端的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單或雙鏈聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，且可分離自天然來源、體外合成、或由天然和合成的分子組合制備。當(dāng)所述術(shù)語用于雙鏈分子時，其用于表示整體長度，并且會理解為與術(shù)語"喊基對〃等同。
[0028]“多肽”是氨基酸殘基通過肽鍵連接而成的聚合物，可為天然或合成產(chǎn)生。少于約50個氨基酸殘基的多肽通常稱為“寡肽”。
[0029]術(shù)語“啟動子”在本文中就其本領(lǐng)域公知的意義使用以表示提供結(jié)合RNA聚合酶和啟動可操作連接編碼序列轉(zhuǎn)錄的包含DNA序列的基因部分。啟動子序列通常在基因的5’非編碼區(qū)。
[0030]“蛋白質(zhì)”是包含一條或多條多肽鏈的大分子。蛋白質(zhì)也可包含非肽組分，如糖基團。糖和其它非肽取代基可由產(chǎn)生蛋白質(zhì)的細胞加入到蛋白質(zhì)中，其會隨細胞類型而變化。本文在其氨基酸主鏈結(jié)構(gòu)方面定義蛋白；取代基例如糖基通常沒有指定，但是可以存在。
[0031]本發(fā)明融合蛋白背景下術(shù)語"基本相似"指示多肽包含的序列與參照序列(如本文示例的GP-Fc融合)在超過10-20個氨基酸的比較窗口上有至少90%，優(yōu)選至少95%序列相同性。序列相同性百分比通過在比較窗口中對比兩種最佳比對序列而測定，其中比較窗口中多核苷酸序列的部分與參考序列(不含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即缺口)以最佳比對所述兩種序列。該百分比如下計算:通過測定兩種序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)產(chǎn)生匹配位置數(shù)，將該匹配位置數(shù)除以比較窗口中位置的總數(shù)，得到的結(jié)果乘以100產(chǎn)生序列相同性百分比。
[0032]附圖簡要說明
[0033]圖1是ZEBOVGP-Fc和FLAG-Fc蛋白的示意圖和純化。A)融合蛋白的示意圖。所述ZEBOVGP-Fc融合蛋白包含ZEBOV GP胞外域，所述胞外域在C末端有FLAG肽標(biāo)簽，并且融合到人IgGl的鉸鏈和Fe區(qū)。所述FLAG-Fc融合蛋白包含融合到人IgGl的鉸鏈和Fe區(qū)的FLAG標(biāo)簽。B)融合蛋白的SDS-PAGE分析。蛋白A純化的ZEBOVGP-Fc和FLAG-Fc制品通過變性SDS-PAGE在4-12%梯度膠中分析并用考馬斯藍染色。C) ZEBOVGP-Fc和FLAG-Fc的Western印跡分析。蛋白在變性條件下通過SDS-PAGE分解，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并且用ZEBOV特異性抗GPlmAbl3F6-l-2、抗Flag M2mAb或山羊抗人Fe Ab探測。ZEBOV GPl、GP2_FLAG_Fc和FLAG-Fc條帶用箭頭指示。蛋白和分子量標(biāo)記物用kDa指示。
[0034]圖2是ZEBOVGP-Fc融合蛋白的鑒定。A)蛋白A純化的ZEBOVGP-Fc的FPLC分析。未消化的(灰色)或腸激酶消化的(藍色)ZEBOVGP-Fc在非變性條件下通過Superdex200大小排阻柱，并且對38個收集的組分各記錄280nm吸光度。表示ZEBOVGP-Fc、ZEBOV GP以及Fe的峰用箭頭標(biāo)記。約150kDa的峰表示腸激酶制品中的運載體蛋白。箭頭顯示分子量標(biāo)準(zhǔn)的移動，并且其分子量用kDa表示。B)腸激酶消化的ZEBOVGP-Fc蛋白的Western印跡分析。凝膠過濾峰組分(20和32)在變性SDS-PAGE中分開，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用ZEBOV特異性抗GPlmAbl3F6-l-2或山羊抗人抗Fe抗體探測。凝膠中包含未消化的(U)或腸激酶消化的(D) ZEBOVGP-Fc 和 FLAG-Fc (Fe)作為標(biāo)記。箭頭指示 GPl、GP2_FLAG_Fc 和 FLAG-Fc 的移動。分子量標(biāo)記的移動和其大小用kDa指示。
[0035]圖3顯示了已接種C57BL/6小鼠中抗ZEBOV GP抗體的分析。A)通過病毒顆粒ELISA的抗ZEBOV GP特異性抗體分析。小鼠用ZEBOVGP-Fc或FLAG-Fc接種，并且最終接種后2周獲得血清樣品。在用蔗糖純化的經(jīng)輻射ZEBOV顆粒、rVSV-ZEBOVGP或?qū)φ找吧蚔SV涂層的96孔板上滴定血清。各小鼠血清的終點稀釋效價用點表示。B)小鼠血清與HEK293-ZEB0VGP細胞細胞表面所表達ZE`B0VGP結(jié)合的FACS分析。HEK293-ZEB0VGP或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染的HEK293細胞用小鼠血清(I μ I)和PE偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG Ab染色，和通過流式細胞儀分析。各小鼠血清的柱狀圖用不同顏色顯示，并且陽性對照抗GP mAbl3F6-l-2的柱狀圖用灰色虛線表示。為了使圖簡單，對兩只不同小鼠(一只用ZEBOVGP-Fc (左圖)接種，另一只用FLAG-Fc (右圖)接種)的血清用相同顏色。
[0036]圖4顯示用已接種C57BL/6小鼠血清的rVSV-ZEBOVGP中和。Vero E6細胞中，使用IOOpfu的rVSV-ZEBOVGP進行空斑減少試驗，所述rVSV-ZEBOVGP用ZEBOVGP-Fc或FLAG-Fc接種小鼠的5倍稀釋血清處理。計算各小鼠血清的中和百分比，作為相較未處理rVSV-ZEBOVGP的空斑數(shù)目下降。數(shù)據(jù)顯示了各小鼠血清稀釋的重復(fù)樣品中的平均中和百分比I，和條線表不標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0037]圖5顯示用ZEBOVGP-Fc接種的BALB/c小鼠中的體液免疫反應(yīng)。4只BALB/c小鼠用ZEBOVGP-Fc或FLAG-Fc免疫。最后接種后2周收集血清樣品。A)按照圖3A所述在用rVSV-ZEBOVGP涂層的平板上通過病毒顆粒ELISA完成抗ZEBOV GP特異性抗體分析。B)用ZEBOVGP-Fc或FLAG-Fc接種的BALB/c小鼠血清的rVSV-ZEBOVGP中和。1/10稀釋血清的平均中和通過使用如圖4所述重復(fù)樣品的空斑減少試驗來測定。數(shù)據(jù)顯示各樣品內(nèi)平均中和的平均百分比(n=4)，和條線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。ZEBOVGP-Fc-和FLAG-Fc-接種小鼠血清中和之間的差異是統(tǒng)計學(xué)顯著的(**，P ≤0.01)。
[0038]圖6顯示用ZEBOVGP-Fc接種的BALB/c小鼠中的細胞免疫反應(yīng)。圖5中經(jīng)接種BALB/c小鼠脾細胞在最終免疫后8天收集，用融合蛋白或肽刺激，并且用APC標(biāo)記的抗CD8mAb染色細胞表面，和用PE標(biāo)記的抗IFN- y mAb進行細胞內(nèi)染色。生成IFN- Y的CD8+T細胞百分比通過⑶8+脾細胞門控的流式細胞儀測定。A)點圖分析來自用ZEBOVGP-Fc或FLAG-Fc接種和用ZEBOVGP-Fc或FLAG-Fc刺激的代表性小鼠的CD8+脾細胞。表達CD8和IFN-Y的雙陽性脾細胞在矩形盒中顯示，并且數(shù)目表示盒中IFN-Y-陽性⑶8+細胞的百分比。B-E)柱狀圖表示來自用ZEBOVGP-Fc (B，D)或FLAG-Fc (C，E)接種和用Fe融合蛋白(B, C)或合成肽(D，E)刺激的小鼠脾細胞中IFN- Y -陽性CD8+細胞的百分比。脾細胞用Fe融合蛋白ZEBOVGP-Fc或FLAG-Fc、或ZEBOV GP特異性或?qū)φ蘸铣呻拇碳?。?shù)據(jù)顯示表達IFN- Y的總⑶8+細胞的平均百分比(n=4只小鼠)，和條線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。用ZEBOVGP-Fc和FLAG-Fc刺激的ZEBOVGP-Fc-接種小鼠中IFN- Y -陽性⑶8+脾細胞百分比差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(*，ρ=0.01)。
[0039]圖7顯示了針對ZEBOV致死攻擊的ZEBOVGP-Fc保護小鼠。小鼠用ZEBOVGP-Fc (實心三角)或FLAG-Fc (空心正方形)接種，并且最后接種后2周，用1，OOOpfu的小鼠適應(yīng)性ZEBOV攻擊。對各接種組的存活百分比結(jié)果作圖(每組n=8只小鼠)。
[0040]圖8顯示了用ZEBOVGP-Fc融合蛋白接種的豚鼠血清中病毒顆粒ELISA的實驗結(jié)果。7只豚鼠(GP-Fcl-GP-Fc7)用含ZEBOVGP-Fc的QS-21佐劑接種。2次加強后動物放血，并且通過病毒顆粒ELISA分析血清的抗ZEB0VGP抗體。所有動物發(fā)展出高效價的抗ZEB0VGP抗體。
[0041]圖9顯示了用對照Fe片段接種的豚鼠血清中病毒顆粒ELISA的實驗結(jié)果。7只豚鼠(Fcl-Fc7)用僅含F(xiàn)e片段的QS-21佐劑接種。2次加強后動物放血，并且通過病毒顆粒ELISA分析血清的抗ZEB0VGP抗體。沒有動物發(fā)展出抗ZEB0VGP抗體。
[0042]圖10顯示了用ZEBOVGP-Fc接種豚鼠血清的扎伊爾埃博拉假型病毒中和。扎伊爾埃博拉病毒假型用來自接種有ZEBOVGP-Fc或單獨Fe片段的豚鼠的血清中和。相較免疫前血清，測定中和百分比。所有ZEBOVGP-Fc接種動物發(fā)展出抗ZEBOV中和抗體，而沒有Fe接種動物發(fā)展出抗ZEBOV中和抗體。圖11顯示三只獼猴中抗埃博拉病毒抗體的分析。接種前，三只獼猴的血清通過病毒顆粒ELISA測試抗埃博拉病毒的GP抗體。猴子都沒有抗埃博拉病毒抗體。
[0043]圖12顯示了用ZEBOVGP-Fc接種的獼猴發(fā)展出抗埃博拉病毒抗體。用ZEBOVGP-Fc (GP-Fcl和GP_Fc2)接種的2只猴子的血清包含如病毒顆粒ELISA所評價的高效價抗埃博拉病毒抗體，而僅用Fe片段(Fe)接種的對照猴的血清沒有發(fā)展出抗埃博拉病毒抗體。
[0044]圖13顯示用ZEBOVGP-Fc接種獼猴血清的埃博拉假型病毒中和。用ZEBOVGP-Fc接種的獼猴GP-Fcl和-2和僅用Fe片段接種的對照猴Fe的血清在包含Vero E6細胞單層的96孔板中通過終點稀釋試驗測試抗埃博拉病毒中和抗體。初次免疫(疫苗)后3周收集血清，動物用對應(yīng)病毒加強，并且加強(第一次加強)后3周收集血清。相較免疫前血清，測定中和百分比。ZEBOVGP-Fc接種的猴發(fā)展出抗埃博拉病毒中和抗體，而用Fe對照接種的猴沒有發(fā)展出中和抗體。
[0045]發(fā)明詳述
[0046]本發(fā)明顯示了包含融合到免疫球蛋白多肽片段的纖絲病毒糖蛋白(GP)片段的融合蛋白經(jīng)歷了天然GP中觀察到的剪切和加工。本文顯示的結(jié)果清楚指出所述GP融合蛋白不需要病毒載體或組裝成病毒樣顆粒，本身就足以誘導(dǎo)對纖絲病毒感染的保護，并且用作針對纖絲病毒感染的安全和有效的亞基疫苗。
[0047]如下面詳細所示，哺乳動物細胞中表達的融合到免疫球蛋白片段(如人IgGl的Fe片段)的纖絲病毒GP (如ZEBOV GP)胞外結(jié)構(gòu)域經(jīng)歷復(fù)雜的翻譯后修飾，包含天然GP中觀察到的弗林蛋白酶切割和同源三聚體形成。用纖絲病毒GP-1gG融合體接種會保護小鼠抵御扎伊爾EBOV的致死劑量攻擊。本文所述結(jié)果顯示所述纖絲病毒GP-1gG融合體不需要病毒載體或組裝成病毒樣顆粒，就足以誘導(dǎo)對纖絲病毒感染的保護，并且顯示了纖絲病毒GP-1gG融合體用作針對纖絲病毒感染的安全和有效的亞基疫苗。
[0048]纖絲病毒GP-免疫球蛋白融合蛋白
[0049]埃博拉病毒和馬爾堡(Marburg)病毒組成纖絲病毒科(Filoviridae)。有5種埃博拉病毒:扎伊爾(模式種)、蘇丹、萊斯頓、本迪布焦和象牙海岸。有一種馬爾堡病毒。所示糖蛋白(GP)是構(gòu)成病毒顆粒表面突起的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，所述突起調(diào)節(jié)病毒通過受體結(jié)合進入易感宿主細胞。GP是研究最多的纖絲病毒蛋白，不僅由于其在病毒進入和發(fā)病機制中的重要性，而且也因為是疫苗開發(fā)的首要靶標(biāo)。
[0050]纖絲病毒顆粒包含約19kb長的負鏈RNA基因組，編碼7個結(jié)構(gòu)蛋白和I個非結(jié)構(gòu)蛋白(Volchkov等，Adv Virus Res2005;64:359-81)。包膜糖蛋白(GP)存在于病毒顆粒表面突起上，并且對受體結(jié)合、病毒進入和免疫起作用(Feldmann等，J Gen Virol2001年 12 月;82 (Ptl2):2839-48 和 Takada 等，Proc Natl Acad Sci U S A1997 年 12 月 23日；94 (26): 14764-9)。 所述纖絲病毒GP是來自基因4的I型膜整合糖蛋白，經(jīng)歷涉及GP的N-末端和近膜部分之間弗林蛋白酶切割和二硫鍵形成的復(fù)雜加工。病毒包膜和感染細胞的膜上存在的成熟跨膜GP由兩個亞基形成:通過二硫鍵共價連接到GPlN末端的膜錨定GP2,其包含高ο-糖基化的粘蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Volchkov等，Proc Natl Acad Sci U S A1998年 5 月 12 日；95(10):5762-7)和 Jeffers 等，J Virol2002 年 12 月;76(24):12463-72)。大量的GPl在從GP2亞基釋放后于細胞中脫落。另外，與GPl共有氨基末端295氨基酸的非結(jié)構(gòu)可溶糖蛋白(sGP)缺少跨膜錨，并且形成二硫鍵連接的同源二聚體，其由EBOV而不是 MARV 感染的細胞生成(Feldmann 等，Curr Top Microbiol Immunol 1999; 235:1-21)。
[0051]編碼纖絲病毒GP的很多基因被克隆，并且描述于文獻(見例如W02006/037038)。技術(shù)人員能容易克隆所需基因或使用前述基因。表1提供了來自各種埃博拉和馬爾堡病毒亞型的示例性GP序列的GenBank 登錄號匯總。
[0052]表1
【權(quán)利要求】
1.ー種包含纖絲病毒糖蛋白片段和免疫球蛋白多肽片段的融合蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述纖絲病毒糖蛋白片段是胞外結(jié)構(gòu)域。
3.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述纖絲病毒糖蛋白片段來自埃博拉病4。
4.如權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述埃博拉病毒是扎伊爾埃博拉病毒Mayinga 株。
5.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白多肽片段是免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)多肽。
6.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白是IgGl。
7.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白還包含纖絲病毒糖蛋白片段和免疫球蛋白多肽片段之間的接頭。
8.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白有如SEQID N0:2所示的序列。
9.ー種包含如權(quán)利要求1所述的融合蛋白的免疫原性組合物。
10.如權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物還包含佐劑。
11.ー種核酸載體，所述載體包括含有纖絲病毒糖蛋白片段和免疫球蛋白多肽片段的融合蛋白的編碼核酸序列。
12.如權(quán)利要求11所述的核酸載體，其特征在于，所述纖絲病毒糖蛋白片段是胞外結(jié)構(gòu)域。
13.如權(quán)利要求11所述的核酸載體，其特征在于，所述纖絲病毒糖蛋白片段來自埃博拉病毒。
14.如權(quán)利要求13所述的核酸載體，其特征在于，所述埃博拉病毒是扎伊爾埃博拉病毒 Mayinga 株。
15.如權(quán)利要求11所述的核酸載體，其特征在于，所述免疫球蛋白多肽片段是免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)多肽。
16.如權(quán)利要求11所述的核酸載體，其特征在于，所述免疫球蛋白是IgGl。
17.如權(quán)利要求11所述的核酸載體，其特征在于，所述核酸載體還包含纖絲病毒糖蛋白片段和免疫球蛋白多肽片段之間接頭的編碼核酸序列。
18.如權(quán)利要求11所述的核酸載體，其特征在于，所述融合蛋白的編碼核酸序列有SEQID NO:1所示的序列。
19.一種誘導(dǎo)患者中對纖絲病毒感染的保護免疫反應(yīng)的方法，所述方法包含給予患者免疫有效量的如權(quán)利要求9所述免疫原性組合物。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述免疫原性組合物肌肉內(nèi)給予。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法還包含給予含有第二纖絲病毒抗原的免疫原性組合物的步驟。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述第二抗原通過重組病毒載體表達。
23.一種誘導(dǎo)患者中對纖絲病毒感染的保護免疫反應(yīng)的方法，所述方法包含給予患者免疫有效量的如權(quán)利要求11所述核酸載體。
24.一種檢測患者中對纖絲病毒免疫反應(yīng)的方法，所述方法包含使患者的生物樣品接觸如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，并且檢測免疫反應(yīng)。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述檢測免疫反應(yīng)的步驟包含檢測生物樣品中抗體和融合蛋白結(jié)合的步驟。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述檢測抗體結(jié)合的步驟通過ELISA、化學(xué)發(fā)光試驗或熒光試驗進行。
27.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述檢測免疫反應(yīng)的步驟包含檢測細胞免疫反應(yīng)的步驟。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述檢測細胞免疫反應(yīng)的步驟通過檢測IFN-Y 或 TNF-α 進行。
29.一種檢測患者生物樣品內(nèi)中和抗體的方法，所述方法包含使生物樣品接觸易受纖絲病毒感染的細胞和表達纖絲病毒GP的重組水皰性口炎病毒(VSV)。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述重組VSV還表達熒光蛋白。
31.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述重組VSV表達埃博拉表達GP。
32.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述埃博拉病毒是扎伊爾埃博拉病毒Mayinga 株。
33.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述易受纖絲病毒感染的細胞是VeroΕ6細胞。
34.一種檢測患者生物樣品中抗纖絲病毒抗體的方法，所述方法包含使生物樣品接觸結(jié)合在固體支持物上的重組VSV，并且檢測結(jié)合重組VSV的抗纖絲病毒抗體。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述抗纖絲病毒抗體使用ELISA、化學(xué)發(fā)光法或熒光法檢測。
【文檔編號】G01N33/50GK103596587SQ201180063188
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2011年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2010年10月28日
【發(fā)明者】G·卡普蘭, K·孔多魯, J·杰奎斯, S·巴瓦利, S·布拉德福特 申請人:健康和人類服務(wù)部秘書長代表的美利堅合眾國政府, 美國陸軍傳染病醫(yī)學(xué)研究所