抗-分枝桿菌疫苗接種的功效的確定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及測定疫苗，特別是結(jié)核疫苗的功效的方法和試劑。
【專利說明】抗-分枝桿菌疫苗接種的功效的確定
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明涉及測定疫苗，特別是結(jié)核疫苗的功效的方法和試劑。
【【背景技術(shù)】】
[0002]每年，達2百萬人死于結(jié)核(TB) (I)。針對TB唯一可利用的疫苗是牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)卡介苗(BCG),其在1921年首次用于人(2)。至今，已施用四十億劑量的BCG，致使其成為世界上最廣泛使用的人疫苗(3)。但是，我們?nèi)赃h未達到達到TB的根除。BCG疫苗接種在嬰兒中預(yù)防結(jié)核性腦膜炎和粟粒性TB (4)。但是，針對其他形式的TB，尤其是青少年和成年中的肺部TB的保護是非結(jié)論性的，如由元分析強調(diào)，其揭示成年中O~80%的保護性功效(5)。因此，迫切地需要針對TB的新疫苗。目前，臨床試驗中針對TB的新疫苗接種策略包括重組BCG以取代規(guī)范BCG以及亞單位疫苗和基于非復制病毒載體的疫苗以追加BCG引發(fā)(6) (7)。
[0003]成為保護的基礎(chǔ)的免疫學機理的鑒定可輔助用于TB防止的新疫苗接種策略的合理的設(shè)計。而且，此策略可揭示指示保護性免疫的生物標記，其可揭示臨床TB疫苗功效試驗中臨床結(jié)果的標志物，由此減少它們的持續(xù)時間以及輔助在平行試驗中測試更大量的疫苗候選體。聚焦于新感染的，TB患者的健康接觸及聚焦于BCG-免疫接種的嬰兒的觀察研究已起始定議該生物標記(8)。盡管對于針對TB的免疫應(yīng)答，保護性記憶的根本性的元件的進一步研究仍待闡明。在BCG疫苗接種之后，由于缺乏免疫顯性抗原而抗原-特異性記憶⑶4T細胞難以檢測。目前，最廣泛使用的生物標記基于產(chǎn)生IFNy的⑶4T細胞的升高的頻度。增加的證據(jù)拷問IFNy作為TB中保護的關(guān)聯(lián)的價值(9，10)。毋庸置疑地IFNy在針對MTB的防御中起到關(guān)鍵的作用(11)，但單獨IFNy的測定可不再被認為是保護性免疫的可靠的標志物。
[0004]表達吞噬溶酶體逃 逸結(jié)構(gòu)域的重組BCG株描述于W099/101496，其內(nèi)容通過引用在本文合并。吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域致使所述株自感染的宿主細胞的吞噬體通過穿孔吞噬體的膜逃逸。為了提供對于最佳吞噬溶酶體逃逸活性的酸性吞噬體pH，開發(fā)了脲酶-缺陷型重組株。此株公開于W02004/094469，其內(nèi)容通過引用在本文合并。
[0005]在臨床前模型中，相比親本BCG (pBCG)，表達單核細胞增多性利斯特菌(Listeriamonocytogenes)的膜-穿孔利斯特菌溶血素(Hly)和缺乏脲酶C的重組AureC Hly+rBCG(rBCG)株誘導抵御用MTB產(chǎn)氣攻擊的更優(yōu)保護(12)。此疫苗構(gòu)建體在I期臨床試驗中成功地證明了安全性和免疫原性(US61/384，375)，其內(nèi)客通過引用在本文合并。
[0006]在本研究中，顯示rBCG和pBCG誘導顯著的Thl免疫應(yīng)答，而更顯示僅rBCG引發(fā)是深刻的Thl7應(yīng)答。也觀察到在rBCG-免疫接種的小鼠的MTB感染后抗原-特異性T淋巴細胞向肺的更早募集。這些T細胞在再刺激之后產(chǎn)生豐富的Thl細胞因子。rBCG的更優(yōu)保護性功效明顯依賴于IL17。也在I期臨床試驗期間在健康自愿者中檢測到在rBCG疫苗接種之后，但不是PBCG疫苗接種之后提升的IL17產(chǎn)生。我們的發(fā)現(xiàn)將通用的免疫學通路鑒定為用于針對TB的改善的疫苗接種策略的標志物，其也可由亞單位疫苗候選體探索?！?br/>【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0007]本發(fā)明的主題是測定疫苗功效的方法，包括測定免疫接種的受試者中的Thl7免疫應(yīng)答，其中Thl7免疫應(yīng)答的存在指不所述受試者中的保護性免疫。
[0008]本發(fā)明的再一方面是測定疫苗功效的試劑盒，其包含至少ー種檢測Thl7免疫應(yīng)答的試劑。
[0009]在優(yōu)選的實施方式中，疫苗是活疫苗,特別是分枝桿菌屬(Mycobacterium)細胞。在甚至更優(yōu)選的實施方式中，疫苗是重組分枝桿菌屬(Mycobacterium),其包含編碼融合多肽的重組核酸分子，所述融合多肽包含(a)能引發(fā)免疫應(yīng)答的結(jié)構(gòu)域及(b)吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域。能引發(fā)免疫應(yīng)答的結(jié)構(gòu)域優(yōu)選是來自病原體的免疫原性肽或多肽或其免疫原性片段。在進ー步實施方式中，疫苗是亞單位疫苗，即疫苗包含自病原體純化的抗原或其免疫原性片段，特別是重組抗原或其免疫原性片段。在仍進ー步實施方式中，疫苗是基于滅活的全病原體細胞或細胞級分的疫苗。
[0010]分枝桿菌屬(Mycobacterium)細胞優(yōu)選是牛分枝桿菌(M.bovis)細胞，結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)細胞，特別是減毒的結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)細胞或其他分枝桿菌屬(Mycobacterium),例如田鼠分枝桿菌(M.microti),恥垢分枝桿菌(M.smegmatis),卡耐提分枝桿菌(M.canettii ),海分枝桿菌(M.marinum)或偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum)。更優(yōu)選地,細胞是重組牛分枝桿菌(M.bovis) (BCG)細胞,特別是來自丹麥亞型布拉格株的重組牛分枝桿菌(M.bovis)細胞(43)。在尤其優(yōu)選的實施方式中，疫苗是重組脲酶-缺陷型分枝桿菌屬(Mycobacterium)細胞。在尤其優(yōu)選的實施方式中，將分枝桿菌屬(Mycobacterium)細胞的ureC序列滅活(A Urec),例如通過構(gòu)建含有被選擇標記物基因破壞的ureC基因的自殺載體，用所述載體轉(zhuǎn)化靶細胞及篩選具有脲酶陰性表型的選擇標記物-陽性細胞。最優(yōu)選，細胞是表征為rBCGAUrec::Hly+::Hyg+的重組BCG株丹麥亞型布拉格。
[0011]能引發(fā)免`疫應(yīng)答的結(jié)構(gòu)域優(yōu)選選自來自牛分枝桿菌(M.bovis)或結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)的免疫原性肽或多肽或選自具有至少6個,優(yōu)選至少8個氨基酸，更優(yōu)選至少9個氨基酸和例如達20個氨基酸長度的其免疫原性片段。適合的抗原的特定例是自結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)的Ag85B (p30),自牛分枝桿菌(M.bovis) BCG的Ag85B (a-抗原)，自結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)的Ag85A及自結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)的 ESAT-6 及其片段。
[0012]疫苗優(yōu)選是針對分枝桿菌感染，特別是肺部分枝桿菌感染，更特別是結(jié)核的疫苗。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的方法，測定免疫接種的受試者中的Thl7免疫應(yīng)答。受試者優(yōu)選是哺乳動物，例如人。測定優(yōu)選在源于所述受試者的生物學樣品中實施，其中所述樣品包含免疫細胞，特別是T細胞和/或NK細胞，更特別是抗原-特異性T細胞諸如CD4T細胞。樣品可為體液或組織樣品，例如血，血清或血漿樣品或自肺或脾臟的樣品。收集樣品的方法為本領(lǐng)域所熟知。
[0014]本發(fā)明的方法需要確定Thl7免疫應(yīng)答。為此目的，優(yōu)選用免疫原再刺激待分析的受試者的樣品中存在的免疫細胞及測定從所述細胞的細胞因子表達。待分析的細胞優(yōu)選是抗原-特異性T細胞，更優(yōu)選CD4T細胞。用于再刺激的免疫原對應(yīng)于疫苗中存在的免疫原(待測定其功效)。免疫原可以與疫苗中存在的形式相同的形式或以不同形式存在。例如，當疫苗包含免疫原性多肽時，在再刺激步驟中免疫原可包含其免疫原性片段或反之亦然。優(yōu)選地，用于再刺激步驟的免疫原是純化的多肽或肽。為了測試結(jié)核疫苗的功效，特別是上述活結(jié)核疫苗，免疫原可有利地為分枝桿菌抗原，例如自PPD"純化的蛋白衍生物"選擇的，其是分枝桿菌的甘油提取物或Ag85A和Ag85B，以及其他分枝桿菌抗原和其免疫原性片段(諸如以上描述的)。
[0015] 柜據(jù)本發(fā)明測定Thl7應(yīng)答可包括利用所述細胞中存在的和/或由所述細胞分泌的表面標志物和/或細胞因子測定與Thl7應(yīng)答關(guān)聯(lián)的細胞，例如IL-17產(chǎn)生細胞。表面標志物的例是⑶4，⑶8，IL-23R，CCR4和/或CCR6。該細胞中存在的和/或由該細胞分泌的細胞因子的例是IL-17，IL-21，IL-22，IL-23，IFN-Y和其組合。優(yōu)選地，細胞因子是IL-17。該細胞可通過細胞學方法，例如由細胞分選技術(shù)使用可攜帶標記，例如熒光基團的免疫學檢測試劑諸如特異于細胞-表面標志物和/或細胞因子的抗體來測定。
[0016]更優(yōu)選地，與Thl7免疫應(yīng)答關(guān)聯(lián)的細胞是例如產(chǎn)生及任選地分泌IL-17的⑶4T細胞。
[0017]在進一步實施方式中，測定Thl7免疫應(yīng)答包括測定從Thl7免疫應(yīng)答關(guān)聯(lián)的細胞分泌的細胞因子，例如IL-17。細胞因子可通過免疫學方法使用適當?shù)目贵w，例如針對IL-17的抗體測定。
[0018]在本發(fā)明的方法中，在疫苗接種之后適合的時間測定Thl7免疫應(yīng)答。例如，免疫應(yīng)答可在疫苗接種之后20~50天，特別是25~35天測定。
[0019]本發(fā)明也涉及測定疫苗功效的試劑盒，特別是在上述方法中使用的試劑盒。試劑盒包含適合于再刺激來自已免疫接種的受試者的樣品中存在的免疫細胞的免疫原。進一步試劑盒包含至少一種如上所述的適合于檢測Thl7免疫應(yīng)答標志物的試劑。試劑可例如選自細胞學和/或免疫學檢測試劑，例如針對對于Thl7免疫應(yīng)答關(guān)聯(lián)的細胞特征性的細胞標志物的抗體和/或特異于與Thl7免疫應(yīng)答關(guān)聯(lián)的細胞因子，特別是IL-17和/或IL-22的免疫學試劑。檢測區(qū)可攜帶可檢測基團，例如熒光標記基團。
[0020]而且，本發(fā)明由以下圖和實施例更詳細描述。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0021]圖1:WT小鼠中的MTB負荷。腹膜內(nèi)免疫保護免于p.1.90天用MTB感染(A)。細菌負荷是在P.1.第7天在免疫接種的及非-免疫接種的組之間可比較的(B)。在用400CFUMTB氣霧劑感染之后肺和脾臟中的CFU測定。將心臟肺葉(全器官的大致71/10)或半個脾臟均質(zhì)化；余下物質(zhì)用于體外再刺激測定。統(tǒng)計學意義由具有2-尾的P值的Mann-Whitney測試測定。*，P〈0.05 ;**，P〈0.01。數(shù)據(jù)是具有近似結(jié)果的3次實驗的代表。
[0022]圖2:相比pBCG疫苗接種，在rBCG疫苗接種之后的更優(yōu)細胞因子誘導。用rBCG或pBCG皮下疫苗接種后83天在肺(A)和脾臟(B)中的應(yīng)答。將總2.5X IO5 (肺)或2X IO6細胞(脾臟)用PB)再刺激20小時并將上清液由多重測定分析。細胞因子濃度以4次每次實驗3個重復的獨立實驗的平均值土SEM描述。減去自培養(yǎng)基對照產(chǎn)生的背景細胞因子。ANOVA和Bonferroni多比較測試應(yīng)用于統(tǒng)計學分析。*，P〈0.05 ;#，P〈0.01。
[0023]圖3:用rBCG疫苗接種加速在用MTB氣霧劑感染之后抗原-特異性T細胞向肺的募集。在用200?400CFU MTB氣霧劑感染之后7天由肺細胞的細胞因子分泌。將總2 X IO5細胞用PH)刺激20小吋，并將上清液由多重測定分析(A)。細胞因子濃度以2次每次實驗3個重復的獨立實驗的平均值土SEM表示。減去自培養(yǎng)基對照產(chǎn)生的背景細胞因子。將在布雷菲德菌素A的存在下用PH)再刺激6小時的細胞由多色流式細胞術(shù)分析(B)。應(yīng)答CD4T細胞的頻度以3次每次實驗3個重復的獨立實驗的平均值土SEM表示。ANOVA和Bonferroni多比較測試應(yīng)用于統(tǒng)計學分析。*，P〈0.05 ;**，P〈0.01 ;***，P〈0.001。
[0024]圖4:用rBCG疫苗接種增加在用MTB氣霧劑感染之后脾臟中的PPD-特異性應(yīng)答。在用200?400CFU MTB氣霧劑感染之后7天由脾臟細胞的細胞因子分泌。將總2X IO6細胞用PH)再刺激20小吋，并將上清液由多重測定分析(A)。細胞因子濃度以4次毎次實驗3個重復的獨立實驗的平均值土SEM表示。減去自培養(yǎng)基對照產(chǎn)生的背景細胞因子。將在布雷菲德菌素A的存在下用PH)再刺激6小時的細胞由多色流式細胞術(shù)分析(B)。應(yīng)答CD4T細胞的頻度以3次每次實驗3個重復的獨立實驗的平均值土SEM表示。ANOVA和Bonferroni多比較測試應(yīng)用于統(tǒng)計學分析。*，P〈0.05 ;**，P〈0.01 ;***，P〈0.001。
[0025]圖5:用pBCG或rBCG疫苗接種不導致Treg細胞群中的顯著變化。用rBCG或pBCG皮下免疫之后脾臟中的Treg細胞。黑條表示⑶25+FoxP3+和白條表示⑶25_FoxP3+細胞。在免疫(A和B)之后83天以及在用200?400CFU MTB氣霧劑感染之后7天(C和D)或90天(E和F)⑶4T細胞和⑶8Treg細胞的頻度。3小鼠/組，以平均值土SEM表示。數(shù)據(jù)是具有近似結(jié)果的3次獨立實驗的代表。
[0026]圖6:在疫苗接種和隨后用MTB氣霧劑感染之后肺中產(chǎn)生細胞因子的CD8T細胞的頻度。在用200?400CFU MTB氣霧劑感染之后7天的細胞因子分泌。將在布雷菲德菌素A的存在下用PH)再刺激6小時的細胞由多色流式細胞術(shù)分析。應(yīng)答CD8T細胞的頻度以2次每次實驗3個重復的獨立實驗的平均值土SEM表示。ANOVA和Bonferroni多比較測試應(yīng)用于統(tǒng)計學分析。
[0027]圖1:在疫苗接種和隨后用MTB氣霧劑感染之后脾臟中產(chǎn)生細胞因子的CD8T細胞的頻度。在用200?400CFU MTB氣霧劑感染之后7天的細胞因子分泌。將在布雷菲德菌素A的存在下用PH)再刺激6小時的細胞由多色流式細胞術(shù)分析。應(yīng)答CD8T細胞的頻度以4次每次實驗3個重復的獨立實驗的平均值土SEM表示。ANOVA和Bonferroni多比較測試應(yīng)用于統(tǒng)計學分析。*，P〈0.05 ;**，P〈0.01 ;林*，P〈0.001。
[0028]圖8:在持續(xù)MTB感染期間在rBCG-免疫接種的小鼠中肺中的免疫應(yīng)答。在用200?400CFU MTB氣霧劑感染之后90天由肺細胞的細胞因子分泌。細胞用PI3D再刺激20小時，并將上清液由多重測定分析(A)。細胞因子濃度以2次毎次實驗3個重復的獨立實驗的平均值土SEM表示。減去自培養(yǎng)基對照產(chǎn)生的背景細胞因子。將在布雷菲德菌素A的存在下用PH)再刺激6小時的細胞由多色流式細胞術(shù)分析(B)。應(yīng)答CD4T細胞的頻度以2次每次實驗3個重復的獨立實驗的平均值土SEM表示。ANOVA和Bonferroni多比較測試應(yīng)用于統(tǒng)計學分析。*，P〈0.05 ;**，P〈0.01。
[0029]圖9:在疫苗接種和隨后用MTB氣霧劑感染之后產(chǎn)生細胞因子的⑶8T細胞的頻度。由在用200?400CFU MTB氣霧劑感染之后90天自肺分離的細胞的細胞因子分泌。將在布雷菲德菌素A的存在下用PH)再刺激6小時的細胞由多色流式細胞術(shù)分析。應(yīng)答CD8T細胞的頻度以2次每次實驗3個重復的獨立實驗的平均值土SEM表示。ANOVA和Bonferroni多比較測試應(yīng)用于統(tǒng)計學分析。*，P〈0.05。
[0030]圖10:疫苗接種誘導IL22產(chǎn)生但不誘導IL21產(chǎn)生。由自在疫苗接種和隨后用200~400CFU MTB氣霧劑感染之后83天小鼠的脾臟的細胞(2X IO6細胞)或肺的細胞(2X IO5細胞)的IL21 (A)和IL22 (B)分泌。自3樣品/組測量IL21濃度，以平均值土SEM表示。對于IL22，合并來自一組的樣品。數(shù)據(jù)是2個(疫苗接種后第83天)和5個(p.1.第7天)近似實驗的代表。細胞用PH)再刺激20小時，并上清液由ELISA分析。
[0031]圖11:rBCG不顯著地改變APC群地導至Y δ T細胞和NK細胞的增加的募集。腹膜內(nèi)施用IO6CFU的rBCG或pBCG后細胞募集到腹膜腔。由流式細胞術(shù)的腹膜灌洗液中細胞群的分析。腹膜內(nèi)施用rBCG或pBCG后5小時(上圖)和6天(下圖)募集到腹膜的APC(A)0注射后5小時的T細胞群的ICS (B)0將細胞在布雷菲德菌素A的存在下用α⑶3/α⑶28抗體刺激18小時。施用后6天T細胞群的ICS (C)。將細胞在布雷菲德菌素A的存在下用PH)再刺激18小時。數(shù)據(jù)顯示為用5只小鼠/組的3次獨立實驗的總結(jié)。水平線指示中位。ANOVA和Bonferroni多比較測試應(yīng)用于統(tǒng)計學分析。*，P〈0.05 ;#，P〈0.01。將在腹膜灌洗液中檢測的細胞因子和趨化因子由多重測定(D)分析，以平均濃度土SEM表示。
[0032]圖12:rBCG在自I期臨床試驗的健康自愿者的人PBMC中誘導IL17。由自I期臨床研究的健康人自愿者分離的人PBMC的IL17產(chǎn)生。用rBCG或pBCG疫苗接種后29天分離總5X IO5細胞，用PH)再刺激20小時，并將上清液由多重測定分析。統(tǒng)計學意義由用單尾P值和Welch氏修正的Mann-Whitney測試測定。*，P〈0.05 ;對于pBCG是n=3和對于rBCG是 n=7。
[0033]【實施例】
[0034]【材料和方法】
[0035]【小鼠】
[0036]在柏林的Bundesinstitut fiir Risikobewertung(BfR)中飼養(yǎng)雌性 BALB/c 小鼠。小鼠在實驗開始時是6~8周齡及保持在無特定病原體的(SPF)條件下。在Landesamt furGesundheit und Soziales (LAGeSo,柏林，德國)的批準下進行動物實驗。
[0037]【細菌】
[0038]之前描述了使用的MTB H37Rv和pBCG和rBCG株(12)。使細菌在補充甘油，0.05%吐溫80和ADC的Middlebrook7H9肉湯中生長。收獲中-對數(shù)培養(yǎng)物及存儲于_80°C直到使用。全部濃儲物在使用之前滴定。單細胞細菌懸浮液由通過具有27G針的注射器重復的轉(zhuǎn)移獲得。
[0039]【疫苗接種和MTB感染】
[0040]將pBCG或rBCG (IO6CFU)在尾根緊鄰處皮下施用。用MTB的小鼠氣原感染通過使用Glas-Col吸入暴露系統(tǒng)實施。細菌負荷由在PBS0.5%v/v吐溫80中機械破壞無菌地移出的器官及在補充OADC的Middlebrook7Hll瓊脂板上平鋪系列稀釋來評定。在3周之后，對MTB集落計數(shù)。結(jié)果的統(tǒng)計學意義通過用于非-參數(shù)數(shù)據(jù)的2-尾的P-值的Mann-Whitney測試使用GraphPad Prism5.0測定。
[0041]【細胞分離，刺激和流式細胞術(shù)】
[0042]如之前描述純化細胞(42)。實驗組包含5只小鼠。將2個脾臟或肺合并及將一個樣品個別處理，導致3樣品/5只小鼠的組用于隨后刺激。將細胞用50 y g/ml PPD( SSI,哥本哈根，丹麥)刺激20小時而用于由多重測定的細胞因子分析或在25 u g/ml布雷菲德菌素A的存在下刺激6小時而用于細胞內(nèi)細胞因子染色(ICS)。使用以下抗體:⑶4(RM4-5)，IFNy (XMG-1.2)，IL2 (JES6-5H4),Ly6G/C (RB6-8C5)，CDllb (Ml/70), y 8 -TCR (GL-3)，F(xiàn)oxP3 染色組和 CD49b (cloneDX5)全部 eBioscience。將 CD8 a (YTS169), TNF-a (XT22),CD16/CD32 (2.4G2)，F(xiàn)4/80 (Cl:A3_1)和CDllc (N418)自雜交瘤上清液純化和內(nèi)部熒光標記。IL-17 (TC11-18H10)從 BD Biosciences 得到。將細胞通過使用 FACSCanto II 或LSRII流式細胞儀和FACSDiva軟件(BD Biosciences)分析。通過使用來自Bio-Rad的基于Bio-Plex小鼠Thl/Th2，IL17和IL6珠的免疫測定根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明測量細胞因子。IL21 和 IL22 由自 R&D systems 的 ELISA測量。人 IL17 用自 Millipore 的Milliplex42_plex測定檢測。
[0043]【腹膜灌洗】
[0044]自中-對數(shù)培養(yǎng)新鮮制備pBCG或rBCG。將細菌用PBS洗滌3次和通過在580nm處測量光密度來測定濃度。腹膜內(nèi)實施施用106CFU。通過注射5ml PBS在5小時或6天后從腹膜腔得到募集的細胞及由流式細胞術(shù)分析。通過使用來自Bio-Rad的Bio-Plex小鼠細胞因子23-plex試劑盒測定灌洗液中的細胞因子和趨化因子。
[0045]【結(jié)果】
[0046]【在rBCG和pBCG疫苗接種之后的Thl/Thl7應(yīng)答】
[0047]在嘗試闡明與TB疫苗功效關(guān)聯(lián)的免疫機理中，我們比較了小鼠中針對rBCG和PBCG的免疫應(yīng)答。在靜脈內(nèi)免疫后已原本測定rBCG的更優(yōu)保護性功效(12)。在這里我們顯示rBCG的皮下施用誘導可比較的水平的保護及`保留其強于pBCG的更優(yōu)功效(圖1A)。接下來，我們分析了在用rBCG或pBCG皮下疫苗接種后83天小鼠的肺和脾臟中的長期記憶應(yīng)答。將細胞用PH)再刺激和由多重測定分析上清液中的細胞因子。相比pBCG，用rBCG免疫誘導了由自肺分離的細胞的顯著地更高細胞因子產(chǎn)生(圖2A)。這些包括IFNy，IL2，IL6和GM-CSF。相反，2型細胞因子IL4，IL5和ILlO未增加到背景水平以上(不顯示數(shù)據(jù))。有趣地，由自rBCG-免疫接種的小鼠的肺細胞產(chǎn)生大致3倍更高IL17濃度。注意到可從未感染的小鼠的肺分離僅少量細胞。因而，總體細胞因子濃度少于脾臟中的濃度，其中每孔10倍更高細胞密度可用于刺激(圖2B)。在脾臟中，兩種疫苗引發(fā)了與由IL2，IL6，IFNy和GM-CSF的可比較的濃度反映的等同強的Thl應(yīng)答。然而，相比pBCG-免疫接種的動物，自rBCG-免疫接種的小鼠的脾臟細胞在用PH)再刺激后產(chǎn)生了顯著地更多IL17。由此，用rBCG免疫，而非PBCG，在肺和脾臟中誘導了相伴的和強的Thl和Thl7應(yīng)答，其持續(xù)延長的時間。
[0048]【在rBCG-免疫接種的小鼠中用強毒MTB感染之后MTB-特異性T細胞的加速的募集】
[0049]Thl7細胞已關(guān)聯(lián)到改善的免疫監(jiān)瞀(13)。我們比較了用強毒MTB氣霧劑感染之后在免疫接種的動物中，在感染后7天肺和脾臟中抗原-特異性T細胞應(yīng)答。在用PPD(圖3A)或Ag85A肽(數(shù)據(jù)未顯示)再刺激之后20小時檢測到由來自rBCG-免疫接種的小鼠的肺細胞的顯著的IFNy，IL17，IL2和GM-CSF產(chǎn)生。相反，這些細胞因子極罕由來自pBCG-免疫接種的小鼠的細胞分泌。在用MTB感染的非-免疫接種的動物中，細胞因子產(chǎn)生在檢測限以下，與MTB-特異性T細胞在MTB感染后3周之前不呈現(xiàn)的之前報道一致(13)。在此MTB攻擊后早期時間點未檢測到2型細胞因子IL4，IL5和IL10，且TNFa，IL12p70和IL6僅極罕在背景水平以上(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0050]我們在MTB感染后7天由流式細胞術(shù)測定由肺T細胞的細胞因子產(chǎn)生(圖3B)。將細胞用pro刺激6小時，之后是對IL2，IL17，IFNy和TNF a的細胞內(nèi)細胞因子染色。在非-免疫接種的對照中，小比例的⑶4T細胞產(chǎn)生IL2，TNFa或IFN Y。在免疫接種的小鼠中，CD4T細胞分泌了 IL2，IFNy，TNFa和也IL17。在rBCG組中單細胞因子產(chǎn)生細胞的頻度最高，盡管不顯著。在免疫接種的動物中，我們檢測了牽涉保護性免疫的多功能T細胞
(14)。多細胞因子-產(chǎn)生T細胞主要是IL2+TNF a +雙生產(chǎn)者和在rBCG疫苗接種后顯著地增加。三-生產(chǎn)細胞幾乎唯獨是IL2+IFN Y +TNF a +和相比pBCG-免疫接種的小鼠，在rBCG-免疫接種的小鼠中稍微增加。而且，IL2+TNF a +IFN y +IL17+四重-陽性細胞在rBCG組中唯獨呈現(xiàn)，盡管以非常低頻度呈現(xiàn)。
[0051]原理上，脾T細胞產(chǎn)生了與肺部T細胞類似的細胞因子模式(圖4)。相比pBCG組，在rBCG-免疫接種的動物中IL2和GM-CSF產(chǎn)生顯著地更高，及在非-免疫接種的對照中在檢測水平以下，即使在非-免疫接種的對照中，小百分率的CD4T細胞產(chǎn)生IFN Y?？傊?，相比pBCG組，在rBCG-免疫接種的小鼠中用pBCG或rBCG疫苗接種誘導具有單和多_生產(chǎn)者的更高頻度的分泌IFN Y和TNF a的⑶4T細胞。
[0052]在p.1.7天⑶4T細胞是主要細胞因子生產(chǎn)者；盡管具有類似模式，檢測到⑶8細胞因子生產(chǎn)者在肺(圖6)和脾臟(圖7)中具有更低頻度。需注意，在rBCG組中檢測到顯著地更高頻度的TNF a -單產(chǎn)生⑶8T細胞。
[0053]生產(chǎn)細胞的差異細胞因子產(chǎn)生和頻度不是由于在感染之后在此早期時間點的不同細菌負荷，如由肺和脾臟中可比較的集落形成單位(CFU)數(shù)確認(圖1B)。在2個免疫接種的組中在感染后Treg細胞總數(shù)增加到可比較的程度(圖5)。
[0054]【用rBCG疫苗接種在持續(xù)感染期間賦予有力的免疫應(yīng)答】
[0055]我們在當肺細菌負荷相比pBCG組而在rBCG-免疫的動物中大致10倍更低和相比非-免疫接種的對照組而在rBCG-免疫的動物中100倍更低時分析了 p.1.90天的MTB-特異性免疫應(yīng)。將來自免疫接種的小鼠的肺的細胞及未處理的對照用PB)再刺激20小時，并由多重測定測量細胞因子濃度(圖8A)。再刺激后檢測的細胞因子主要是I型。但是，我們在持續(xù)感染期間在IFNy或IL17免疫接種的組之間無法檢測到差異。相反，IL2，IL6，GM-CSF和TNF a的量在rBCG-免疫接種的小鼠中更高。在全部組中，IL4和IL5在檢測限以下并測量一些IL12p70和ILlO (數(shù)據(jù)未顯示)。此外，由多色流式細胞術(shù)的肺細胞分析主要揭示持續(xù)感染期間產(chǎn)生細胞因子的⑶4T細胞(圖8B)。在全部組中檢測到分泌僅IFNy的⑶4T細胞具有類似頻度。疫苗接種之后，也可檢測到以不同組合產(chǎn)生IL2，IFNy，TNFa或IL17的⑶4T細胞。有趣地，應(yīng)答⑶4T細胞的頻度在rBCG和pBCG疫苗接種之間未顯著地不同，盡管上清液中更高濃度的IL2和TNFa。我們推定在用成為更有力的細胞因子生產(chǎn)者的rBCG-誘導的T細胞持續(xù)MTB感染期間兩種疫苗增加了肺中抗原-特異性CD4T細胞的頻度。在全部組中⑶8T細胞以可比較的頻度幾乎唯獨分泌IFN Y，然而在rBCG組中檢測到顯著地更高的單TNFa -產(chǎn)生⑶8T細胞。多功能⑶8T細胞呈現(xiàn)極罕在背景以上(圖9)。
[0056]【疫苗接種導致IL22而非IL21產(chǎn)生】
[0057]Thl7細胞可產(chǎn)生另外的效應(yīng)子細胞因子諸如IL21 (15)和IL22 (16)。已在TB患者中鑒定IL22-產(chǎn)生細胞，但這些似乎不同于IL17-產(chǎn)生細胞(17)。我們在用來自免疫接種的及隨后MTB-感染的小鼠的脾臟或肺細胞的PH)刺激之后未檢測到IL21 (圖10A)。在rBCG-免疫的小鼠中由用PI3D刺激20小時的脾細胞以提升的濃度產(chǎn)生IL22(圖10B)，但在用MTB感染之后早期未進ー步増加。僅在rBCG-免疫接種的組中觀察到由肺細胞的IL22產(chǎn)生及在氣霧劑MTB感染之后降低。
[0058]【腹膜內(nèi)rBCG不顯著地改變APC群地導至Y8 T細胞和NK細胞的增加的募集】
[0059]我們想要定義成為在用rBCG免疫之后優(yōu)先Thl7細胞誘導的基礎(chǔ)的機理。為此，腹膜內(nèi)施用rBCG和pBCG，在施用之后5小時或6天自腹膜腔分離遷移細胞及由流式細胞術(shù)分析(圖11A)。嗜中性粒細胞(定義為GrlHI，⑶llbHI，MHCII_，⑶llc_)快速進入腹膜腔及在p.1.第6天在pBCG和rBCG組中保持升高到相同的程度。定居性腹膜巨噬細胞(定義為CDllbm, F4/80hi, GrF, MHCIIhi, CDl Icつ和樹突細胞(CDl lc+，CDllb' GrD 的頻度以低百分率保持不變?？傊瑀BCG和pBCG組之間未檢測到顯著差異。使在疫苗接種之后5小時收獲的腹膜細胞經(jīng)歷用a⑶3/a⑶28抗體的多克隆刺激(圖11B)。⑶4T細胞和NK細胞的頻度在全部組之間可比較，如IFNy和IL17產(chǎn)生。在施用之后6天，這些細胞數(shù)字上増加及在rBCG組中達到最高頻度(圖11C)。將PI3D用于在6天時間點細胞的再刺激。⑶4T細胞未產(chǎn)生可察覺的量的IFNy或IL17，而在rBCG施用之后實質(zhì)性比例的NK細胞產(chǎn)生IFNy。
YS T細胞已被鑒定為在TB中早期IL17的主要來源(18)。用rBCG注射后5小時鑒定了盡管不顯著，増加的比例的Y S T細胞產(chǎn)生IFN Y。此細胞群進ー步増加及在注射之后6天在rBCG組中檢測到產(chǎn)生IL17的、S T細胞的顯著地更高頻度。在任何組腹膜中未檢測到CD8T細胞。我們由腹膜灌洗液的多重測定分析了存在于腹膜腔的細胞因子和趨化因子(圖11D)。注射后MCP-1，MIPl a，G-CSF和KC快速增加；嗜酸性粒細胞趨化因子水平保持未變化及在6天之后檢測到更高濃度的IL12p40。IL12p70, IFN y , ILla，IL2，IL3，IL4，IL5, IL10, IL17，GM-CSF 和 TNFa 濃度在檢測限以下，然而 ILl 3，IL6, IL9, IL13，MIPl 3和RANTES可測量但產(chǎn)生在r`BCG和pBCG之間可比較。由此，rBCG和pBCG以近似程度誘導APC的募集以及在施用位點趨化因子和細胞因子產(chǎn)生。有趣地，分泌IL17的Y S T細胞和產(chǎn)生IFNy的NK細胞的比例在rBCG施用之后最豐富。
[0060]【在人中用rBCG疫苗接種產(chǎn)生IL17-產(chǎn)生細胞】
[0061]最后，我們分析了來自I期臨床試驗的健康人自愿者的PBMC，以詢問是否IL17產(chǎn)生在rBCG-免疫接種的研究參與者中増加。在用rBCG或pBCG免疫之后29天從自愿者取血并將PBMC分離及冷凍。將PBMC解凍及靜止過夜，之后是用PI3D再刺激20小吋。由多重測定分析細胞因子產(chǎn)生。在來自用rBCG免疫的研究參與者的PBMC中唯獨檢測到IL17產(chǎn)生(圖12)。注意到有限數(shù)量的樣品是可利用的。
[0062]【討論】
[0063]免疫保護標志物的鑒定對于新TB疫苗的合理的設(shè)計是關(guān)鍵的。這些標志物也可建立替代品標志物的定義的基礎(chǔ)以預(yù)測TB疫苗功效試驗中臨床結(jié)果的端點，由此提供改善當前疫苗候選體的指南。良好建立活化巨噬細胞抗分支桿菌能力的關(guān)鍵細胞因子，包括IFNy (21)和TNFa (22)的重要性，及記憶細胞擴展中IL2 (23)的必要性，由此通常用于監(jiān)測TB疫苗試驗。
[0064]在鑒定疫苗功效的生物標志物的嘗試中，我們比較了由被證明相比其親本株，pBCG賦予更優(yōu)保護的rBCG引發(fā)的長期記憶免疫應(yīng)答。應(yīng)答在定量和定性術(shù)語中不同。我們檢測了肺中用rBCG疫苗接種后I型細胞因子以及IL17的增加的豐度(圖2A)。肺中疫苗-誘導的免疫應(yīng)答的分析在臨床試驗情景中是明顯不可行的。因此，我們也分析了系統(tǒng)性長期記憶應(yīng)答(圖2B)。有趣地，在pBCG和rBCG組中檢測到可比較的濃度的類型-1導向細胞因子。相反，由脾細胞的IL17產(chǎn)生在rBCG疫苗接種后顯著地提升。由此，我們總結(jié)，IL17，而非IFNy或IL2，作為由rBCG誘導的更優(yōu)保護的標志物合適。
[0065]Thl7細胞通過吸引及活化是在待響應(yīng)IL17而募集的第I細胞之中的嗜中性粒細胞(24)來貢獻于抗微生物防御。已顯示，IL17在主要MTB感染期間是可有可無的(25，26)，但在記憶應(yīng)答中獲得重要性(13)。此外，對人Thl7細胞上CCR6的表達的新近報道(27，28)意味著正反饋環(huán)，因為CCR6是由嗜中性粒細胞產(chǎn)生的CCL20的受體(29)和CCL20-CCR6已牽涉TB的免疫發(fā)病機制(30)。由此，Thl7細胞可輔助抗原-特異性記憶T細胞向細菌駐留位點的加速的募集。通過分析在用MTB氣霧劑感染之后7天疫苗-誘導的免疫應(yīng)答，我們顯示，用rBCG疫苗接種的確導致效應(yīng)細胞向細菌復制位點加速的募集。我們觀察到增加的頻度的抗原-特異性⑶4T細胞及由肺(圖3)和脾臟細胞(圖4)的IL2，IL17，IFNy和GM-CSF的提升的產(chǎn)生。
[0066]共產(chǎn)生IL2，IFNy和TNFa的多功能⑶4T細胞首先牽涉針對碩大利什曼原蟲(Leishmania major)的成功的疫苗接種策略(14)和隨后也牽涉針對MTB的成功的疫苗接種策略(31)。最近，這些多功能⑶4T細胞也在臨床TB疫苗試驗中檢測到(32，33)。我們在rBCG和pBCG疫苗接種和隨后感染后檢測了多功能CD4T細胞(圖3和4);但是雙生產(chǎn)者和三生產(chǎn)者中細胞因子的組成(IL2，IL17, IFNy和TNFa )在實驗以及個體動物之間顯著地改變。如果多功能細胞與保護真關(guān)聯(lián)，則它們的總體頻度，所述頻度在rBCG組中更高，而非它們的組成，似乎最關(guān)聯(lián)。
[0067]為何rBCG誘導Thl7應(yīng)答？用rBCG和pBCG免疫導致APC以及趨化因子和細胞因子生產(chǎn)者募集至類似程度。有趣地，分泌IL17的 δ T細胞和產(chǎn)生IFNy的NK細胞的比例在rBCG疫苗接種之后高度豐富。此與顯示IL17可由、δ T細胞(34，18)以及NKT細胞
(35)快速產(chǎn)生的報道一致。NK細胞，其在用rBCG疫苗接種后也增加，是早期IFNy的重要來源。我們已顯示了自rBCG釋放的不同分子組分在于感染的巨噬細胞的胞質(zhì)溶膠(12)。Nod-2是重要細胞溶質(zhì)PRR和其參與已關(guān)聯(lián)于Thl7記憶T細胞應(yīng)答的發(fā)展(19)。
[0068]在細菌感染期間誘導的凋亡誘導Thl7細胞(36)。我們獲得了相比pBCG，rBCG誘導增加的凋亡的證據(jù)(12)，其可還貢獻于Thl7細胞的增加的發(fā)展。發(fā)炎體的活化也可經(jīng)ILl β產(chǎn)生而貢獻于Thl7記憶應(yīng)答(37)。NLRP3例如已被發(fā)現(xiàn)通過ATP水平變化感知利斯特菌溶血素的存在(38)。由此，rBCG疫苗接種后Thl7細胞的誘導可需要細胞內(nèi)刺激及增加的凋亡的復雜相互作用。
[0069]Thl7細胞被認為是炎性和自身免疫疾病諸如膠原-誘導的關(guān)節(jié)炎(39)，EAE(40，39)和過敏性氣道超敏反應(yīng)(41，39)中的儀器而非有益于成功的疫苗接種。此病原性作用通常關(guān)聯(lián)于深刻的IL21-介導的 炎性應(yīng)答的發(fā)展。我們從未在任何實驗中檢測到在疫苗接種和隨后MTB感染之后IL21在背景水平以上(圖10A)。此外，我們從未觀察到用rBCG疫苗接種后在注射位點自身免疫或過量的發(fā)炎的跡象，也未觀察到在肺中MTB感染后達200天。[0070]在比較自小鼠中實驗TB的數(shù)據(jù)和人數(shù)據(jù)的第I嘗試中，我們用rBCG和pBCG分析了冷凍的自I期臨床試驗的PBMC的細胞因子特征。在有限數(shù)量的樣品中，我們在rBCG，而非pBCG，疫苗接種之后檢測到IL17產(chǎn)生。已在MTB-感染的人的外周血檢測到Thl7細胞
(17)。最近，IL17-產(chǎn)生⑶4T細胞已報道于由表達Ag85A的修飾的痘苗病毒Ankara組成的候選TB疫苗免疫接種的青少年(33)。應(yīng)答在疫苗接種后第7和28天之間達峰值及然后降低。此與我們的顯示在rBCG組中疫苗接種后第29天提升的IL17產(chǎn)生的數(shù)據(jù)一致(圖12)。由此，嘗試建議IL17為TB疫苗試驗中的保護關(guān)聯(lián)物。
[0071]總之，我們顯示，用rBCG疫苗接種導致Thl7細胞的優(yōu)先產(chǎn)生，可能依賴于細菌組分由Nod-2的細胞內(nèi)識別。這些Thl7細胞進而加速抗原-特異性T細胞向肺的募集。最終，此事件級聯(lián)導致MTB的早先防范和因此，至相比pBCG而由rBCG的更優(yōu)保護。我們在成功地完成的I期臨床試驗中檢測到唯獨由自rBCG-免疫接種的自愿者的PBMC的IL17產(chǎn)生。由于IL17似乎是抗原-特異性T細胞向MTB復制位點加速的募集的儀器，未來TB疫苗應(yīng)修飾為隨之誘導平衡的Thl和Thl7應(yīng)答。
[0072]【參考文獻】
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【權(quán)利要求】
1.測定疫苗功效的方法，包括測定免疫接種的受試者中的Thl7免疫應(yīng)答，其中可檢測的Thl7免疫應(yīng)答指示所述受試者中的保護性免疫。
2.權(quán)利要求1的方法，其中疫苗是活疫苗，特別是分枝桿菌活疫苗。
3.權(quán)利要求2的方法，其中疫苗是重組分枝桿菌屬(Mycobacterium)，其包含編碼融合多肽的重組核酸分子，所述融合多肽包含:(a)能引發(fā)免疫應(yīng)答的結(jié)構(gòu)域及(b)吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域。
4.權(quán)利要求3的方法,其中分枝桿菌屬(Mycobacterium)是脲酶-缺陷型。
5.權(quán)利要求4的方法,其中分枝桿菌屬(Mycobacterium)是rBCGA UreC::Hly+::Hyg+。
6.權(quán)利要求1的方法，其中疫苗是亞單位疫苗。
7.權(quán)利要求1~6之任ー項的方法，其中疫苗是針對分枝桿菌感染，特別是肺部分枝桿菌感染，更特別是結(jié)核的疫苗。
8.權(quán)利要求1~7之任ー項的方法，其中測定Thl7免疫應(yīng)答包括:使包含來自所述免疫接種的受試者的免疫細胞的樣品經(jīng)歷用對應(yīng)于所述疫苗中的免疫原的免疫原再刺激及測定所述樣品中Thl7免疫應(yīng)答關(guān)聯(lián)的細胞的存在和/或量。
9.權(quán)利要求1~7之任ー項的方法，其中測定Thl7免疫應(yīng)答包括測定IL17，例如由免疫學方法。
10.權(quán)利要求1~9之任ー項的方法，其中受試者是哺乳動物，例如人。
11.權(quán)利要求1~10之任ー項的方法，其中Thl7免疫應(yīng)答在疫苗接種之后20~50天測定。
12.測定疫苗功效的試劑盒，其包含: Ca)再刺激來自之前免疫接種的受試者的免疫細胞的試劑，以及 (b)檢測Th 17免疫應(yīng)答的試劑。
13.權(quán)利要求12的試劑盒在權(quán)利要求1~11之任ー項的方法中的用途。
【文檔編號】G01N33/50GK103492877SQ201180066448
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月21日
【發(fā)明者】C·德塞爾, S·H·E·考夫曼, S·班德曼, L·格羅德 申請人:馬普科技促進協(xié)會, 疫苗項目管理有限公司