專利名稱：一種具有抗細胞畸變植物提取物的快速篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種具有抗細胞畸變植物提取物的快速篩選方法，具體涉及ー種SOS/Umu測試體系和秀麗線蟲在抗細胞畸變藥物篩選中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
化療和放療是治療和輔助手術(shù)治療癌癥的最常規(guī)、有效的方法，但放化療的毒副作用給癌癥患者帶來了極大的痛苦。無論是放療還是化療都會損傷正常組織和細胞。輻射暴露導(dǎo)致水的分解，產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxygen species, R0S)。ROS啟動化學(xué)過氧化過程從而破壞DNA和其他生物大分子，化療作為治療癌癥的ー種重要方法，在臨床上廣泛應(yīng)用。但大多數(shù)有效的抗癌藥物都有ー些毒性，而且很多抗癌藥物在一些實驗體系中表現(xiàn)出致突變、致畸型和致癌的效應(yīng)。所以，尋找高效、低毒的抗化療藥物便成了防止細胞損傷，預(yù)防細胞突變的一條重要途徑。目前研究證實ー些中草藥能夠?qū)兗毎鸬奖Ｗo作用，且具有藥源廣、毒性低的特點，但傳統(tǒng)的抗細胞畸變藥物的篩選方法多是建立在動物試驗上，存在人力、物力消耗大，周期長的缺點。因此建立快速篩選體系成為了人們尋求抗細胞畸變中草藥的關(guān)鍵技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種具有抗細胞畸變植物提取物的快速篩選方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了 ー種具有抗細胞畸變植物提取物的快速篩選方法，是以SOS/Umu測試體系快速初篩和秀麗線蟲復(fù)篩的方法進行篩選。具體包括以下步驟用待篩選的植物提取物對鼠傷寒沙門氏菌TA1535/pSK1002 進行保護，使用致突變劑對該菌進行處理，檢測β -半乳苷酶活性，計算誘導(dǎo)率R值和抑制率，初步篩選出大蒜、刺五加、緑茶、大豆、葡萄籽、苦參和蘆薈七種提取物；再以初篩獲得的七種抗細胞畸變中草藥提取物喂養(yǎng)模式生物秀麗隱形線蟲，并利用化療藥物MMC對其進行處理，通過壽命長短、世代周期、產(chǎn)卵情況指標(biāo)的檢測，進ー步篩選刺五加、大蒜、緑茶、大豆、葡萄籽和蘆薈六種具有較強抗畸變活性的植物提取物。所述的致突變劑為甲氨喋呤或/和絲裂霉素C。所述的SOS/Umu測試體系的初篩方法如下(I)取 8Oul 冷凍 Salmonella typhimuriumTA1535/PSK1002 菌液于 2Oml 的 LB 培養(yǎng)基中，37°C振蕩隔夜培養(yǎng)12h ;次日將培養(yǎng)菌液用TGA培養(yǎng)液稀釋10 50倍，37°C條件下振蕩培養(yǎng)I. 5 2h后，再用LB培養(yǎng)基將培養(yǎng)液吸光值^OOnm)調(diào)至0. 2-0. 4 ；(2)取培養(yǎng)菌液990uL加入I. 5mLEppendorf管中，再添加IOul配制好的各種中草藥溶液振蕩搖勻，以DMSO為溶劑對照，37°C振蕩培養(yǎng)2h ;將培養(yǎng)板于600nm波長下測定菌液的吸光度值；(3)另取200ul反應(yīng)菌液加入800uL緩沖液、50ul 0. I % SDS,混合5min后再カロ入IOul三氯甲烷，振蕩搖勻IOmin ;然后加入含ONPG的磷酸鹽緩沖溶液0. IM的NaH2PO4和KH2PO4IOOuI于上述溶液中，于37°C下反應(yīng)25min，加入IOOOulIM的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，吸取上清液200ul于96孔酶標(biāo)板中，分別于420nm和550nm波長下測定吸光度值。所述的LB培養(yǎng)基組成為10g胰蛋白胨+5g氯化鈉+5g酵母膏溶解于IOOOml超純水。所述的TGA培養(yǎng)液組成為10g胰蛋白胨+5g氯化鈉溶解于980ml超純水中，滅菌后加入20ml濃度為10%葡萄糖溶液于4°C冰箱保存?zhèn)溆?。步驟⑶的振蕩頻率為lMrmirT1。所述的緩沖液組成為=Z-Buffer溶液，21. 48g Na2HPO4. 12H20+6. 24gNaH2P04. 2H20+0. 745g KC1+0. 12gMgS04+3. 9g β -巰基こ醇溶解于1000ml超純水中，滅菌后于4°C冰箱·保存?zhèn)溆谩Ｋ龅男沱愲[形線蟲復(fù)篩實驗方法包括以下步驟(I)線蟲同步化培養(yǎng)將正在產(chǎn)卵期的秀麗線蟲雌雄同體成蟲用M9 buffer從90mm NGM培養(yǎng)板中洗下，1500rpm離心Imin,棄去上清。如上法再用M9 buffer清洗一次后將含秀麗線蟲的M9buffer溶液定容至500μ I于1.5ml EP管內(nèi)。加入裂解液500 μ 1，上下顛倒混勻3 5min后1500rpm離心3min,棄去上清，收集底部沉淀；沉淀改用無菌的S-Medium反復(fù)清洗2 3次至pH至7. O左右，此時秀麗線蟲蟲體已被裂解而蟲卵仍然保存完好；將含有蟲卵的無菌的S-Medium溶液放于20°C培養(yǎng)8 12h ;由于沒有食物，卵孵化以后會全部停止在LI期，1500rpm離心3min收集幼蟲，轉(zhuǎn)到有E. coli 0P50的NGM培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)；(2)線蟲壽命的測定秀麗線蟲采用液體培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)，取96孔板，每孔加入培養(yǎng)液S-Medium70 μ 1，Ε· coli 0P50 到 0D600 = O. 2 左右，DhHP-6 至 50 μ Μ、200 μ Μ、500 μ M 不同濃度；同期培養(yǎng)秀麗線蟲至L4期，挑取單個雌雄同體的線蟲到96孔板的U型孔底部，20°C培養(yǎng)；在產(chǎn)卵期內(nèi)，需每日將線蟲挑取到新的培養(yǎng)液中以防止幼蟲過多影響成蟲的生長；產(chǎn)卵期過后可改為每2 3天換液一次；以線蟲卵孵化開始記為線蟲生命起始的O天，以用取蟲器末端輕探蟲體無反應(yīng)記為線蟲生命終止。線蟲壽命期記為線蟲從生命起始到生命終止的時間；丟失的線蟲、因爬到培養(yǎng)皿壁而死亡的線蟲以及“蟲袋”(worm bag)應(yīng)從統(tǒng)計數(shù)據(jù)中排除；(3)產(chǎn)卵量的測定將單個同期培養(yǎng)至L4期雌雄同體的秀麗線蟲挑取到含50 μ I培養(yǎng)液的96孔板的U型孔底部，每隔24h換孔一次，直至產(chǎn)卵期結(jié)束。將產(chǎn)有卵的培養(yǎng)液于20°C繼續(xù)培養(yǎng)2 3天至幼蟲長至L3 L4期，記錄所有孔內(nèi)的子代幼蟲數(shù)目即為產(chǎn)卵量；產(chǎn)卵期為L4期結(jié)束到產(chǎn)卵結(jié)束時的時間間隔；所有數(shù)據(jù)均連續(xù)測定10只以上秀麗線蟲，取平均值；(4)世代周期長度的測定先準(zhǔn)備若干NGM平板，每個平板上面移入5只懷孕的成蟲，20°C培養(yǎng)2h后，收集蟲卵；在96微孔板中加入刺五加提取物+0P50菌液+MMC+k培養(yǎng)基混合液，在U型孔底部移入20只新鮮蟲卵，20°C恒溫培養(yǎng)；此時記時為0h，48h之后每隔3h取出觀察，直至有卵出現(xiàn)。記錄有第二代卵出現(xiàn)的時間。本發(fā)明建立了一種基于SOS/Umu測試體系快速初篩和秀麗線蟲復(fù)篩的方法，SOS/Umu試驗是檢測環(huán)境誘變物的短期篩選試驗，它是基于DNA損傷物誘導(dǎo)SOS反應(yīng)而表達umuC基因的基礎(chǔ)上建立起來的。與基于化療敏感細胞而建立的抗畸變藥物篩選模型相比，本方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點。本發(fā)明用待篩選的中草藥提取物對鼠傷寒沙門氏菌TA1535/pSK1002進行保護，使用甲氨喋呤和絲裂霉素COnitomycin C，MMC)作為致突變劑對該菌進行處理，并檢測其β-半乳苷酶活性情況從而篩選出具有抗細胞畸變功能的中草藥提取物。采用本方法從近二十種植物提取物中快速篩選到了大豆、緑茶等七種提取物。但畢竟鼠傷寒沙門氏菌是ー種原核生物，它的遺傳背景和人類相差很大，而秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)在毒理學(xué)和人類生理機制研究上，是ー種非常有效的模式生物。因此，在單細胞生物篩選體系的基礎(chǔ)上，以初篩獲得的抗細胞畸變中草藥提取物喂養(yǎng)模式生物秀麗隱形線蟲，并利用化療藥物MMC對其進行處理，通過壽命長短、世代周期、產(chǎn)卵情況等指標(biāo)的檢測，進ー步篩選出刺五加、大蒜、緑茶、大豆、葡萄籽和蘆薈六種抗畸變作用顯著的中草藥提取物。最后，對篩選到得六種植物提取物進行急性毒性試驗，研究表明用六種提取物對小白鼠灌胃處理，對大白鼠血、尿、生化及臟器組織結(jié)構(gòu)均無影響，未發(fā)現(xiàn)任何毒性作用。通過小鼠存活率、微核率和胸腺指數(shù)等參數(shù)的變化驗證了刺五加、緑茶、大豆、葡萄籽等六種篩選的提取物在小鼠使用后具有顯著抗細胞畸變作用。本發(fā)明涉及的植物提取物溶液的配制主要采用無菌水溶解，部分提取物溶解效果 不好的，可加入O. 1%的DMSO及加熱助溶。本發(fā)明涉及的SOS/Umu測試體系快速初篩的方法是I.取 80ul 冷凍 Salmonella typhimuriumTA1535/PSK1002 菌液于 20ml 的 LB 培養(yǎng)基(IOg胰蛋白胨+5g氯化鈉+5g酵母膏溶解干IOOOml超純水中，高壓滅菌后于4°C冰箱保存?zhèn)溆?中，37°C振蕩隔夜培養(yǎng)12h。次日將培養(yǎng)菌液用TGA培養(yǎng)液(IOg胰蛋白胨+5g氯化鈉溶解于980ml超純水中，高壓滅菌后加入20ml 10%葡萄糖溶液于4°C冰箱保存?zhèn)溆?稀釋10 50倍，37°C條件下振蕩(175rmin-l)培養(yǎng)I. 5 2h后，再用LB培養(yǎng)基將培養(yǎng)液吸光值(600nm)調(diào)至O. 3左右。2.取培養(yǎng)菌液990uL加入I. 5mLEppendorf管中，再添加IOul由實例I配制好的各種中草藥溶液振蕩搖勻，以DMSO為溶劑對照，37°C振蕩培養(yǎng)2h。將培養(yǎng)板于600nm波長下測定菌液的吸光度值。3.另取 200ul 反應(yīng)菌液加入 800uL 緩沖液(Z-Buffer 溶液，21. 48g Na2HPO4. 12H20+6. 24gNaH2P04. 2H20+0. 745g KC1+0. 12gMgS04+3. 9g β -巰基こ醇溶解于 1000ml超純水中，高壓滅菌后于4°C冰箱保存?zhèn)溆?、50ul O. 1% SDS，混合5min后再加入IOul三氯甲烷，振蕩搖勻lOmin。加入含ONPG的磷酸鹽緩沖溶液O. IM的NaH2PO4和KH2PO4) IOOul于上述溶液中，于37°C下反應(yīng)25min，加入IOOOul IM的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，吸取上清液200ul于96孔酶標(biāo)板中，分別于420nm和550nm波長下測定吸光度值。按照下式計算B2半乳糖苷酶誘導(dǎo)活性β-Galactosidase Activity (IU) = 1000*(A420-1· 75*A550)/(t*v*A600)其中，t為加入ONPG后的反應(yīng)時間，V為反應(yīng)菌液的體積，本研究中為O. 2。A600為最終培養(yǎng)液細菌含量；A420為酶與底物反應(yīng)后生成物的含量；A550代表反應(yīng)系統(tǒng)中有無顆粒性干擾物，通常接近O"根據(jù)IU值計算得到經(jīng)過稀釋后樣品的誘導(dǎo)比率
(R)值誘導(dǎo)比率(R)=試驗管IU值/對照管IU值(2)數(shù)值以均值土標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation, SD)表不。用 SPSS 13. O forWindows軟件進行t_檢驗分析顯著性，p值小于O. 05達到顯著水平。
具體實施例方式實施例一按照國標(biāo)規(guī)定的用量，將待篩先的植物提取物配制成如下的使用濃度。表I中草藥提取物和有效成分含量
權(quán)利要求
1.ー種具有抗細胞畸變植物提取物的快速篩選方法，其特征在于是以SOS/Umu測試體系快速初篩和秀麗線蟲復(fù)篩的方法進行篩選。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的具有抗細胞畸變植物提取物的快速篩選方法，其特征在于具體包括以下步驟用待篩選的植物提取物對鼠傷寒沙門氏菌TA1535/pSK1002進行保護，使用致突變劑對該菌進行處理，檢測β -半乳苷酶活性，計算誘導(dǎo)率R值和抑制率，初步篩選出大蒜、刺五加、緑茶、大豆、葡萄籽、苦參和蘆薈七種提取物；再以初篩獲得的七種抗細胞畸變中草藥提取物喂養(yǎng)模式生物秀麗隱形線蟲，并利用化療藥物MMC對其進行處理，通過壽命長短、世代周期、產(chǎn)卵情況指標(biāo)的檢測，進ー步篩選刺五加、大蒜、緑茶、大豆、葡萄籽和蘆薈六種具有較強抗畸變活性的植物提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抗細胞畸變植物提取物的快速篩選方法，其特征在于所述的致突變劑為甲氨喋呤或/和絲裂霉素C。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的具有抗細胞畸變植物提取物的快速篩選方法，其特征在于所述的SOS/Umu測試體系的初篩方法如下(1)取80ul 冷凍 Salmonella typhimuriumTA1535/PSK1002 菌液于 20ml 的 LB 培養(yǎng)基中，37°C振蕩隔夜培養(yǎng)12h ;次日將培養(yǎng)菌液用TGA培養(yǎng)液稀釋10 50倍，37°C條件下振蕩培養(yǎng)I. 5 2h后，再用LB培養(yǎng)基將培養(yǎng)液吸光值^OOnm)調(diào)至O. 2-0. 4 ； (2)取培養(yǎng)菌液990uL加入I.5mLEppend0rf管中，再添加IOul配制好的各種中草藥溶液振蕩搖勻，以DMSO為溶劑對照，37°C振蕩培養(yǎng)2h ;將培養(yǎng)板于600nm波長下測定菌液的吸光度值； (3)另取200ul反應(yīng)菌液加入800uL緩沖液、50ulO. I % SDS，混合5min后再加入IOul三氯甲烷，振蕩搖勻IOmin ;然后加入含ONPG的磷酸鹽緩沖溶液O. IM的NaH2PO4和KH2PO4IOOuI于上述溶液中，于37°C下反應(yīng)25min，加入IOOOul IM的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，吸取上清液200ul于96孔酶標(biāo)板中，分別于420nm和550nm波長下測定吸光度值。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有抗細胞畸變植物提取物的快速篩選方法，其特征在于所述的LB培養(yǎng)基組成為10g胰蛋白胨+5g氯化鈉+5g酵母膏溶解于IOOOml超純水。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有抗細胞畸變植物提取物的快速篩選方法，其特征在于所述的TGA培養(yǎng)液組成為10g胰蛋白胨+5g氯化鈉溶解于980ml超純水中，滅菌后加入20ml濃度為10%葡萄糖溶液于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有抗細胞畸變植物提取物的快速篩選方法，其特征在于步驟(3)的振蕩頻率為Πδηι ιΓ1。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有抗細胞畸變植物提取物的快速篩選方法，其特征在于所述步驟(3)的緩沖液組成為2-81^デ61"溶液，21. 48g Na2HPO4. 12H20+6. 24gNaH2P04. 2H20+O.745g KC1+0. 12gMgS04+3. 9g β -巰基こ醇溶解于1000ml超純水中，滅菌后于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的具有抗細胞畸變植物提取物的快速篩選方法，其特征在于所述的秀麗隱形線蟲復(fù)篩實驗方法包括以下步驟 (I)線蟲同步化培養(yǎng) 將正在產(chǎn)卵期的秀麗線蟲雌雄同體成蟲用M9 buffer從90mm NGM培養(yǎng)板中洗下，1500rpm離心Imin,棄去上清。如上法再用M9 buffer清洗一次后將含秀麗線蟲的M9buffer溶液定容至500μ I于1.5ml EP管內(nèi)。加入裂解液500 μ 1，上下顛倒混勻3 5min后1500rpm離心3min,棄去上清，收集底部沉淀；沉淀改用無菌的S-Medium反復(fù)清洗2 3次至pH至7. O左右，此時秀麗線蟲蟲體已被裂解而蟲卵仍然保存完好；將含有蟲卵的無菌的S-Medium溶液放于20°C培養(yǎng)8 12h ;由于沒有食物，卵孵化以后會全部停止在LI期，1500rpm離心3min收集幼蟲，轉(zhuǎn)到有E. coli 0P50的NGM培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)； (2)線蟲壽命的測定 秀麗線蟲采用液體培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)，取96孔板，每孔加入培養(yǎng)液S-Medium 70μ I,E. coli 0P50 到 0D600 = 02 左右，DhHP-6 至 50 μ Μ、200 μ Μ、500 μ M 不同濃度;同期培養(yǎng)秀麗線蟲至L4期，挑取單個雌雄同體的線蟲到96孔板的U型孔底部，20°C培養(yǎng)；在產(chǎn)卵期內(nèi)，需每日將線蟲挑取到新的培養(yǎng)液中以防止幼蟲過多影響成蟲的生長；產(chǎn)卵期過后可改為每2 3天換液一次；以線蟲卵孵化開始記為線蟲生命起始的O天，以用取蟲器末端輕探蟲體無反應(yīng)記為線蟲生命終止；線蟲壽命期記為線蟲從生命起始到生命終止的時間；丟失的線蟲、因爬到培養(yǎng)皿壁而死亡的線蟲以及“蟲袋”(worm bag)應(yīng)從統(tǒng)計數(shù)據(jù)中排除； (3)產(chǎn)卵量的測定 將單個同期培養(yǎng)至L4期雌雄同體的秀麗線蟲挑取到含50 μ I培養(yǎng)液的96孔板的U型孔底部，每隔24h換孔一次，直至產(chǎn)卵期結(jié)束。將產(chǎn)有卵的培養(yǎng)液于20°C繼續(xù)培養(yǎng)2 3天至幼蟲長至L3 L4期，記錄所有孔內(nèi)的子代幼蟲數(shù)目即為產(chǎn)卵量；產(chǎn)卵期為L4期結(jié)束到產(chǎn)卵結(jié)束時的時間間隔；所有數(shù)據(jù)均連續(xù)測定10只以上秀麗線蟲，取平均值； (4)世代周期長度的測定 先準(zhǔn)備若干NGM平板，每個平板上面移入5只懷孕的成蟲，20°C培養(yǎng)2h后，收集蟲卵；在96微孔板中加入刺五加提取物+0P50菌液+MMC+k培養(yǎng)基混合液，在U型孔底部移入20只新鮮蟲卵，20°C恒溫培養(yǎng)；此時記時為0h，48h之后每隔3h取出觀察，直至有卵出現(xiàn)；記錄有第二代卵出現(xiàn)的時間。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有抗細胞畸變植物提取物的快速篩選方法，是以SOS/Umu測試體系快速初篩和秀麗線蟲復(fù)篩的方法進行篩選，具體為用待篩選的植物提取物對鼠傷寒沙門氏菌TA1535/pSK1002進行保護，使用絲裂霉素C作為致突變劑對該菌進行處理，檢測其β-半乳苷酶活性情況，初步篩選出刺五加、大蒜、綠茶、大豆、蘆薈、苦參和葡萄籽等七種具有抗細胞畸變作用的提取物；然后以初篩獲得的七種提取物喂養(yǎng)模式生物秀麗隱桿線蟲，同時用MMC對其進行處理，通過半數(shù)致死天數(shù)、壽命長短、世代周期、產(chǎn)卵情況等指標(biāo)的檢測，進一步篩選出刺五加、大蒜、綠茶、大豆、葡萄籽和蘆薈六種提取物抗畸變作用顯著。研究表明用六種提取物對小白鼠灌胃處理，對大白鼠血、尿、生化及臟器組織結(jié)構(gòu)均無影響，未發(fā)現(xiàn)任何毒性作用。通過小鼠存活率、微核率和胸腺指數(shù)等參數(shù)的變化驗證了刺五加、大蒜、綠茶、大豆、葡萄籽和蘆薈六種篩選的提取物在小鼠使用后具有顯著抗細胞畸變作用。
文檔編號G01N21/31GK102692493SQ201210010958
公開日2012年9月26日 申請日期2012年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月15日
發(fā)明者任國艷, 古紹彬, 吳影, 李市場, 李 浩, 李莉, 楊劍波, 賀嘉怡, 郭金英 申請人:安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所, 河南科技大學(xué)