專(zhuān)利名稱(chēng)：硝酸纖維素膜富集體液蛋白質(zhì)組蛋白的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane,簡(jiǎn)稱(chēng)NC膜)的新用途，特別是硝酸纖維素膜富集體液，尤其是血清、血漿、尿液、腦脊液、組織液中的蛋白質(zhì)組蛋白的新用途。
背景技術(shù)：
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane,簡(jiǎn)稱(chēng)NC膜)在膠體金試紙中用做C/T線(xiàn)的承載體，同時(shí)也是免疫反應(yīng)的發(fā)生處。NC膜是生物學(xué)試驗(yàn)中最重要的耗材之一。其中它主要用于分子雜交。雜交技術(shù)有固相雜交和液相雜交之分。固相雜交技術(shù)目前較為常用，其中先將待測(cè)核酸結(jié)合到一定的固相支持物上，再與液相中的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。固相支持物常用硝酸纖維素膜。NC膜是人類(lèi)研究最早的微濾膜之一，至今己有百年的歷史。NC屬于纖維素衍生物的一種，有一定親水性但不溶于水，可溶于有機(jī)溶劑，如丙酮，微溶于醇類(lèi)，對(duì)核酸等大分子物質(zhì)具有非特異性吸附作用。在生物學(xué)上的應(yīng)用主要有酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，分離DNA、RNA、內(nèi)毒素、蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)，Southern斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn),Western斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)等。NC膜對(duì)蛋白質(zhì)的吸附力分為兩部分，即離子作用力和非離子作用力，主要來(lái)源于三種作用:(I)載體上所帶的硝基所引起的永久偶極距與蛋白質(zhì)分子上所帶的極性基團(tuán)所引起的多種靜電吸附力，(2)氫鍵，(3)疏水作用力[I]。近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)取得了很大進(jìn)展，體液蛋白質(zhì)組學(xué)由于包含了大量關(guān)于機(jī)體健康的信息，在臨床上具有重要的影響，其中尿液蛋白質(zhì)組學(xué)是體液蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)重要組成部分。尿液采集簡(jiǎn)便易行，其中富含多種蛋白及小分子多肽，可以反映腎臟、膀胱、前列腺及其他系統(tǒng)的生理功能和疾病狀態(tài)[2-4]。在疾病狀態(tài)時(shí)，可能存在著尿蛋白量和尿蛋白成分的異常。因此，完全有可能將尿中出現(xiàn)的一些特殊蛋白成分作為特異性的“生物標(biāo)志物”(biomarker),用于診斷疾病或監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)程。現(xiàn)有技術(shù)中富集尿蛋白的方法包括有機(jī)溶劑沉淀法、超速離心法、凍干法和超濾法等[5]。但是，現(xiàn)有的蛋白提取方法較為繁瑣，大量的樣品長(zhǎng)期儲(chǔ)存需占用較大空間。為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明探索用硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜收集蛋白使之應(yīng)用于臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種硝酸纖維素膜在制備富集體液蛋白質(zhì)組蛋白膜制品中的應(yīng)用，優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中至少一半種類(lèi)的蛋白均被富集在硝酸纖維素膜上，更優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中全部種類(lèi)的蛋白的60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%均被富集在硝酸纖維素膜上，更優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中全部種類(lèi)的蛋白的95-100%均被富集在硝酸纖維素膜上，最優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中全部種類(lèi)的蛋白的100%均被富集在硝酸纖維素膜上；優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中的蛋白均以其天然含量成比例富集在硝酸纖維素膜上；優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組蛋白中的白蛋白以相當(dāng)于其天然存在比例更少的比例被富集。優(yōu)選地，所述的體液蛋白質(zhì)組蛋白包括尿液蛋白質(zhì)組蛋白、血漿蛋白質(zhì)組蛋白、血清蛋白質(zhì)組蛋白、腦脊液蛋白質(zhì)組蛋白和組織液蛋白質(zhì)組蛋白。優(yōu)選地，所述的體液蛋白質(zhì)組蛋白包括將體液一次性通過(guò)硝酸纖維素膜所得的蛋白，或者將體液循環(huán)通過(guò)硝酸纖維素膜所得的蛋白，優(yōu)選地，體液一次性通過(guò)硝酸纖維素膜的流速無(wú)限制，更優(yōu)選地，該流速為0.lml/min 1000ml/min,優(yōu)選地,體液循環(huán)通過(guò)硝酸纖維素膜的循環(huán)時(shí)間在15小時(shí)以下，優(yōu)選地，體液在O 10°C下通過(guò)硝酸纖維素膜，更優(yōu)選地，體液在冰浴條件下通過(guò)硝酸纖維素膜；優(yōu)選地，所述體液在通過(guò)硝酸纖維素膜前通過(guò)低速離心預(yù)先去除不溶物。優(yōu)選地，所述的硝酸纖維素膜的孔徑和孔徑均一度無(wú)特殊要求，優(yōu)選孔徑為0.22 μ m或0.4 μ m ;優(yōu)選地，所述硝酸纖維素膜單層使用或多層疊加或多層分隔使用；優(yōu)選地，硝酸纖維素膜的邊緣形狀無(wú)特殊要求，以能與配套容器配合使用、讓體液僅通過(guò)硝酸纖維素膜膜孔通過(guò)為限。本發(fā)明的第二方面涉及一種富集體液蛋白質(zhì)組蛋白的方法，包括將體液通過(guò)硝酸纖維素膜以得到體液蛋白質(zhì)組蛋白，優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中的至少一半種類(lèi)的蛋白均被富集在硝酸纖維素膜上，更優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中全部種類(lèi)的蛋白的60 %、70 %、80 %、90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%均被富集在硝酸纖維素膜上，更優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中全部種類(lèi)的蛋白的95-100 %均被富集在硝酸纖維素膜上，最更優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中全部種類(lèi)的蛋白的100%均被富集在硝酸纖維素膜上；優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中的蛋白均以其天然含量成比例富集在硝酸纖維素膜上；優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組蛋白中的白蛋白以相當(dāng)于其天然存在比例更少的比例被富集。優(yōu)選地，所述的體液蛋白質(zhì)組蛋白包括尿液蛋白質(zhì)組蛋白、血漿蛋白質(zhì)組蛋白、血清蛋白質(zhì)組蛋白、腦脊液蛋白 質(zhì)組蛋白和組織液蛋白質(zhì)組蛋白。優(yōu)選地，所述的體液蛋白質(zhì)組蛋白包括將體液一次性通過(guò)硝酸纖維素膜所得的蛋白，或者將體液循環(huán)通過(guò)硝酸纖維素膜所得的蛋白，優(yōu)選地，體液一次性通過(guò)硝酸纖維素膜的流速無(wú)限制，更優(yōu)選地，該流速為0.lml/min 1000ml/min,優(yōu)選地,體液循環(huán)通過(guò)硝酸纖維素膜的循環(huán)時(shí)間在15小時(shí)以下，優(yōu)選地，體液在O 10°C下通過(guò)硝酸纖維素膜，更優(yōu)選地，體液在冰浴條件下通過(guò)硝酸纖維素膜；優(yōu)選地，所述體液在通過(guò)硝酸纖維素膜前通過(guò)低速離心預(yù)先去除不溶物。優(yōu)選地，所述的硝酸纖維素膜的孔徑和孔徑均一度無(wú)特殊要求，優(yōu)選孔徑為0.22 μ m或0.4 μ m ;優(yōu)選地，所述硝酸纖維素膜單層使用或多層疊加或多層分隔使用；優(yōu)選地，硝酸纖維素膜的邊緣形狀無(wú)特殊要求，以能與配套容器配合使用、讓體液僅通過(guò)硝酸纖維素膜膜孔通過(guò)為限。本發(fā)明的第三方面涉及一種用于執(zhí)行上述第二方面的富集體液蛋白質(zhì)組蛋白的方法的試劑盒，其包括硝酸纖維素膜、配套容器及使用該硝酸纖維素膜的說(shuō)明書(shū)，其中使用時(shí)硝酸纖維素膜被置于配套容器中或者硝酸纖維素膜被預(yù)先置于配套容器中，以將配套容器分隔為上下兩個(gè)或多個(gè)空間，從而使體液僅能通過(guò)膜從配套容器的一個(gè)空間進(jìn)入另一個(gè)空間，以及可選地，將配套容器加壓或減壓的設(shè)備。
換言之，由于尿液等體液中某些蛋白的變化與疾病特別是腎臟的疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系，通過(guò)體液蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)有可能發(fā)現(xiàn)疾病如腎臟疾病的早期診斷標(biāo)志物。其中，尿液蛋白質(zhì)組研究中尿液的收集及蛋白富集方法的選擇直接影響后期鑒定的蛋白種類(lèi)及疾病差異蛋白標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。目前富集體液蛋白質(zhì)組蛋白如尿液蛋白質(zhì)組蛋白的方法包括有機(jī)溶劑沉淀法、超速離心法、凍干法和超濾法等[5]，但已有的方法都有一定的局限性。本領(lǐng)域技術(shù)人員曾對(duì)以上幾種方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)凍干法富集尿液蛋白的總量最多，但種類(lèi)最少；超濾法富集蛋白的總量和種類(lèi)都不是最好；有機(jī)溶劑沉淀法雖然富集尿蛋白總量稍遜于凍干法，但富集蛋白種類(lèi)最多，且重復(fù)性較好[6]。還有人比較了幾種不同的有機(jī)溶劑，綜合富集蛋白總量、蛋白種類(lèi)、重復(fù)性和分離效果，丙酮沉淀富集尿蛋白效果最佳[6，7]。因此，本發(fā)明嘗試用硝酸纖維素膜(NC膜)來(lái)富集體液蛋白質(zhì)組蛋白，尤其是尿液蛋白質(zhì)組蛋白，并將其富集的蛋白與現(xiàn)有技術(shù)中丙酮沉淀法富集的蛋白進(jìn)行比較，以評(píng)價(jià)本發(fā)明的尿蛋白富集效果。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)NC膜能夠快速富集蛋白，從0min_2h富集的蛋白量沒(méi)有明顯差異，15h富集的蛋白量最多且與丙酮沉淀所得蛋白量無(wú)明顯差異。NC膜是第一種用來(lái)作為蛋白質(zhì)吸附印跡的膜，蛋白質(zhì)吸附到膜上的原因較多，目前的研究大多認(rèn)為其作用力要是靜電力、疏水力和化學(xué)鍵力。雖然在其理論方面已有一些研究工作，但具體的吸附機(jī)理依然是個(gè)未知數(shù)。有研究發(fā)現(xiàn)，溫度較低時(shí)蛋白吸附量較大，隨著溫度的升高，蛋白吸附量下降。這是由于吸附過(guò)程多數(shù)是放熱過(guò)程，故吸附量常隨溫度升高而下降。因此，考慮到蛋白富集量和蛋白降解等情況，本發(fā)明的研究均在冰浴下進(jìn)行?，F(xiàn)有技術(shù)中使用的硝酸纖維素膜都可以用于本發(fā)明。現(xiàn)有銷(xiāo)售的NC膜品牌型號(hào)包括，但不限于:PALL(美國(guó))，MILLIP0RE(美國(guó))，M135 (有背襯/無(wú)背襯兩種)M180 (有背襯/無(wú)背襯兩種,WHATMAN and SS, Purabandimpuraband, SARTOR IUS (德國(guó))，CN140,伊能(國(guó)產(chǎn))，8um, 6um,MDI (印度)，8um, 6um 等等，國(guó)產(chǎn)的市售硝酸纖維素膜也可以使用，例如，上海今邁生物科技有限公司，北京普利萊基因技術(shù)有限公司，硝酸纖維素膜WB501(上海西唐生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品)。以尿液蛋白質(zhì)組蛋白的富集為例，通過(guò)比較丙酮沉淀法、NC膜富集Omin、NC膜富集15h富集蛋白的SDS-PAGE結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)，NC膜可以明顯減少白蛋白的富集?，F(xiàn)有技術(shù)對(duì)蛋白溶劑PH對(duì)NC膜吸附蛋白的影響進(jìn)行了研究，得出結(jié)論蛋白質(zhì)吸附量在其等電點(diǎn)處吸附量最大。在等電點(diǎn)處，蛋白質(zhì)分子凈電荷為零，分子內(nèi)的靜電排斥力及分子間的相互作用出于最小狀態(tài)，蛋白質(zhì)就會(huì)失去穩(wěn)定性，導(dǎo)致溶解度最小，吸附量最大。NC膜明顯減少了白蛋白的富集，可能是因?yàn)榘椎鞍椎牡入婞c(diǎn)為4.5，而尿液的pH值范圍一般為6.5-7.5，此時(shí)白蛋白帶負(fù)電，而由于NC殘留的羧基具有微弱的電荷交換能力，當(dāng)pH > 6.5時(shí)，NC膜也帶負(fù)電荷，因此在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子表面荷負(fù)電，膜表面也帶微量負(fù)電，二者之間存在靜電排斥力，致使只有少量白蛋白吸附在膜上。通過(guò)比較丙酮沉淀法、NC膜富集OmiruNC膜富集15h富集蛋白的SDS-PAGE結(jié)果(圖3)，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，與NC膜富集Omin相比，NC膜富集15h，25KD以下的蛋白分子明顯增多，且質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示NC膜富集Omin和丙酮沉淀均能鑒定到500個(gè)左右蛋白，NC膜富集15h只鑒定到200個(gè)左右蛋白，因此推測(cè)15h時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能導(dǎo)致蛋白發(fā)生了降解。因此，雖然現(xiàn)有技術(shù)中有關(guān)于硝酸纖維素膜可以吸附蛋白質(zhì)的相關(guān)報(bào)道，但本申請(qǐng)首次發(fā)現(xiàn)，NC膜可以快速、有效地富集體液特別是尿液蛋白質(zhì)組的蛋白，所獲得的蛋白質(zhì)數(shù)目與傳統(tǒng)的丙酮沉淀法獲得的蛋白質(zhì)數(shù)目和比例均相仿，同時(shí)，所獲得的蛋白質(zhì)組蛋白中白蛋白的比例相對(duì)降低，所獲得的數(shù)量足以進(jìn)行相關(guān)的后續(xù)檢測(cè)之用，但NC膜顯然比丙酮沉淀等常規(guī)方法方便、快捷，所花費(fèi)的費(fèi)用也要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的方法。本發(fā)明進(jìn)一步比較了用NC膜富集并儲(chǔ)存蛋白的效果，發(fā)現(xiàn)用NC膜儲(chǔ)存蛋白與丙酮沉淀富集的蛋白個(gè)數(shù)相似，且NC膜富集尿液蛋白只需幾分鐘，而丙酮沉淀法則需要幾個(gè)小時(shí)甚至過(guò)夜，因此可以通過(guò)NC膜快速富集尿液蛋白。通過(guò)比較NC膜儲(chǔ)存蛋白與儲(chǔ)蓄尿液所得到的蛋白數(shù)目，發(fā)現(xiàn)NC膜儲(chǔ)存的蛋白，經(jīng)質(zhì)譜鑒定，所得蛋白數(shù)目多于直接儲(chǔ)存尿液。因此，不僅可以應(yīng)用NC膜來(lái)快速富集尿液蛋白，還可以應(yīng)用NC膜來(lái)大量?jī)?chǔ)存尿液蛋白，這樣不但可以節(jié)省富集尿液蛋白的時(shí)間，還可以節(jié)省大量的儲(chǔ)存空間，適用于大量標(biāo)本的儲(chǔ)存，有利于流行病學(xué)調(diào)查和臨床標(biāo)本的收集和保存。


圖1為測(cè)定裝置的示意圖，其中圓圈代表蠕動(dòng)泵，綠色箭頭代表蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)動(dòng)方向，紅色部分代表NC膜所在位置。圖2表示不同蛋白富集方法所得尿蛋白濃度變化，其中ACTONE:丙酮沉淀法富集的尿蛋白濃度；NC0-NC15H分別為NC膜法富集0min、10min、30min、60min、2h和15h所富集的尿蛋白濃度。圖3表示不同富集方法所得尿蛋白SDS-PAGE電泳圖，其中Al_3為丙酮沉淀法富集重復(fù)三次所得的尿液蛋白，N01-N03為NC膜法富集Omin重復(fù)三次所得的尿液蛋白，N15H1-N15H3為NC膜法富集15h重復(fù)三次所得的尿液蛋白。
具體實(shí)施例方式下面將通過(guò)下述非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不背離本發(fā)明精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。下述實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法，所使用的實(shí)驗(yàn)材料如無(wú)特別說(shuō)明，均可容易地從商業(yè)公司獲取。實(shí)施例實(shí)施例1對(duì)象與方法1、樣品收集(I)收集健康男性和女性志愿者(年齡23-30歲)各2人空腹晨尿作為樣品，每人250ML。(2)離心5000g*30min去除細(xì)胞和碎屑等殘?jiān)?，_80°C凍存。2、實(shí)驗(yàn)分組組1:丙酮沉淀尿蛋白組；組2:NC膜富集尿蛋白組,根據(jù)富集時(shí)間又分為:0min, IOmin, 30min, lh, 2h, 15h。3、尿蛋白的富集:(I)丙酮沉淀尿蛋白組:取尿液20ML，按尿液與丙酮體積比1: 3加入_20°C預(yù)冷的丙酮，4°C沉淀過(guò)夜，14000 X g離心30min，保留沉淀，用細(xì)胞裂解液(7M尿素，2M硫脲，I %DTE, 5% Tris) IML復(fù)溶蛋白，14000 Xg離心10_15min，保留上清，_80°C凍存，重復(fù)3-4次。(2)NC膜富集法組:參見(jiàn)附圖1，標(biāo)本取尿液各20ML，冰浴中將尿液按10ml/min通過(guò)NC膜,分別循環(huán)Omin ( —次性通過(guò))，IOmin, 30min, lh, 2h, 15h,裂解液溶解在市售的NC膜(北京普利萊基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的硝酸纖維素膜(NC)孔徑為0.22 μ m，貨號(hào)為P2110)。結(jié)合的尿蛋白，14000g離心10-13min，保留上清，-80°C凍存，每個(gè)時(shí)間段均重復(fù)3次。(3)冰凍尿液6個(gè)月后應(yīng)用NC膜富集Omin:上述去細(xì)胞后尿液，在_80°C冰凍6個(gè)月后，取尿液20ML，按10ml/min通過(guò)NC膜Omin，用裂解液溶解NC膜結(jié)合的尿蛋白，14000g離心10-13min，保留上 清，重復(fù)3_4次。(4)NC膜富集尿蛋白后冰凍6個(gè)月:取尿液20ML，按10ml/min通過(guò)NC膜Omin，將富集有蛋白的NC膜冰凍6個(gè)月，后用裂解液溶解NC膜結(jié)合的尿蛋白，14 O O O g離心10-15min,保留上清，重復(fù)3-4次。4、尿蛋白濃度測(cè)定:應(yīng)用Bradford法[8]測(cè)定蛋白濃度。5、ID-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法比較丙酮沉淀組與NC膜富集尿蛋白組內(nèi)的Omin和15h所富集的尿蛋白的差異。(I)凝膠配制
權(quán)利要求
1.一種硝酸纖維素膜在制備富集體液蛋白質(zhì)組蛋白膜制品中的應(yīng)用，優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中至少一半種類(lèi)的蛋白均被富集在硝酸纖維素膜上，更優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中全部種類(lèi)的蛋白的 60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99 %或100 %均被富集在硝酸纖維素膜上，更優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中全部種類(lèi)的蛋白的95-100%均被富集在硝酸纖維素膜上，最優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中全部種類(lèi)的蛋白的100%均被富集在硝酸纖維素膜上；優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中的蛋白均以其天然含量成比例富集在硝酸纖維素膜上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硝酸纖維素膜在制備富集體液蛋白質(zhì)組蛋白膜制品中的應(yīng)用，其特征在于所述的體液蛋白質(zhì)組蛋白包括尿液蛋白質(zhì)組蛋白、血漿蛋白質(zhì)組蛋白、血清蛋白質(zhì)組蛋白、腦脊液蛋白質(zhì)組蛋白和組織液蛋白質(zhì)組蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的硝酸纖維素膜在制備富集體液蛋白質(zhì)組蛋白膜制品中的應(yīng)用，其特征在于所述的體液蛋白質(zhì)組蛋白包括將體液一次性通過(guò)硝酸纖維素膜所得的蛋白，或者將體液循環(huán)通過(guò)硝酸纖維素膜所得的蛋白，優(yōu)選地，體液一次性通過(guò)硝酸纖維素膜的流速無(wú)限制，更優(yōu)選地，該流速為0.lml/min 1000ml/min,優(yōu)選地,體液循環(huán)通過(guò)硝酸纖維素膜的循環(huán)時(shí)間在15小時(shí)以下，優(yōu)選地，體液在O 10°C下通過(guò)硝酸纖維素膜，更優(yōu)選地，體液在冰浴條件下通過(guò)硝酸纖維素膜；優(yōu)選地，所述體液在通過(guò)硝酸纖維素膜前通過(guò)低速離心預(yù)先去除不溶物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的硝酸纖維素膜在制備富集體液蛋白質(zhì)組蛋白膜制品中的應(yīng)用，其特征在于所述的硝酸纖維素膜的孔徑和孔徑均一度無(wú)特殊要求，優(yōu)選孔徑為0.22 μ m或0.4 μ m ;優(yōu)選地，所述硝酸纖維素膜單層使用或多層疊加或多層分隔使用；優(yōu)選地，硝酸纖維素膜的邊緣形狀無(wú)特殊要求，以能與配套容器配合使用、讓體液僅通過(guò)硝酸纖維素膜膜孔通過(guò)為限。
5.一種富集體液蛋白質(zhì)組蛋白的方法，包括將體液通過(guò)硝酸纖維素膜以得到體液蛋白質(zhì)組蛋白，優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中的至少一半種類(lèi)的蛋白均被富集在硝酸纖維素膜上，更優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中全部種類(lèi)的蛋白的60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%均被富集在硝酸纖維素膜上，更優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中全部種類(lèi)的蛋白的95-100%均被富集在硝酸纖維素膜上，最更優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中全部種類(lèi)的蛋白的100%均被富集在硝酸纖維素膜上；優(yōu)選地，體液蛋白質(zhì)組中的蛋白均以其天然含量成比例富集在硝酸纖維素膜上。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的富集體液蛋白質(zhì)組蛋白的方法，其特征在于所述的體液蛋白質(zhì)組蛋白包括尿液蛋白質(zhì)組蛋白、血漿蛋白質(zhì)組蛋白、血清蛋白質(zhì)組蛋白、腦脊液蛋白質(zhì)組蛋白和組織液蛋白質(zhì)組蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的富集體液蛋白質(zhì)組蛋白的方法，其特征在于所述的體液蛋白質(zhì)組蛋白包括將體液一次性通過(guò)硝酸纖維素膜所得的蛋白，或者將體液循環(huán)通過(guò)硝酸纖維素膜所得的蛋白，優(yōu)選地，體液一次性通過(guò)硝酸纖維素膜的流速無(wú)限制，更優(yōu)選地，該流速為0.lml/min 1000ml/min,優(yōu)選地,體液循環(huán)通過(guò)硝酸纖維素膜的循環(huán)時(shí)間在15小時(shí)以下，優(yōu)選地，體液在O 10°C下通過(guò)硝酸纖維素膜，更優(yōu)選地，體液在冰浴條件下通過(guò)硝酸纖維素膜；優(yōu)選地，所述體液在通過(guò)硝酸纖維素膜前通過(guò)低速離心預(yù)先去除不溶物。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)所述的富集體液蛋白質(zhì)組蛋白的方法，其特征在于所述的硝酸纖維素膜的孔徑和孔徑均一度無(wú)特殊要求，優(yōu)選孔徑為0.22 μ m或0.4 μ m ;優(yōu)選地，所述硝酸纖維素膜單層使用或多層疊加或多層分隔使用；優(yōu)選地，硝酸纖維素膜的邊緣形狀無(wú)特殊要求，以能與配套容器配合使用、讓體液僅通過(guò)硝酸纖維素膜膜孔通過(guò)為限。
9.一種用于執(zhí)行權(quán)利要求5至8任一項(xiàng)所述的富集體液蛋白質(zhì)組蛋白的方法的試劑盒，其包括硝酸纖維素膜、配套容器及使用該硝酸纖維素膜的說(shuō)明書(shū)，其中使用時(shí)硝酸纖維素膜被置于配套容器中或者硝酸纖維素膜被預(yù)先置于配套容器中，以將配套容器分隔為上下兩個(gè)或多個(gè)空間，從而使體液僅能通過(guò)膜從配套容器的一個(gè)空間進(jìn)入另一個(gè)空間，以及可選地，將配套容器加壓 或減壓的設(shè)備。
全文摘要
本發(fā)明涉及硝酸纖維素膜富集體液蛋白質(zhì)組蛋白的用途，特別是硝酸纖維素膜富集尿液蛋白質(zhì)組蛋白、血清蛋白質(zhì)組蛋白、血漿蛋白質(zhì)組蛋白、腦脊液蛋白質(zhì)組蛋白和組織液蛋白質(zhì)組蛋白的新用途。本發(fā)明還涉及使用硝酸纖維素膜富集體液蛋白質(zhì)組蛋白的方法，以及富集體液蛋白質(zhì)組蛋白的試劑盒。
文檔編號(hào)G01N1/40GK103207107SQ20121001227
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者劉雪姣, 賈露露, 高友鶴, 李明喜, 李雪梅, 李學(xué)旺 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院, 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所