專利名稱：一種a-型原花青素代謝產(chǎn)物的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種A-型原花青素代謝產(chǎn)物的分析方法。
背景技術(shù)：
原花青素(procyanidins，PC)是植物界中廣泛存在的一大類多酚類化合物的總稱，自然界中的原花青素是由不同數(shù)量的兒茶素和表兒茶素結(jié)合而成的，因其單體連接方式不同，可以分為A-型(C2-0-C7或C2-0-C5連接)和B-型(C4-C8或C4-C6連接)兩種。 A-型原花青素具有較強(qiáng)的清除自由基、抑菌、降血脂、抑制動(dòng)脈粥樣硬化等的抗氧化活性， 具有極大的開發(fā)和利用價(jià)值。A-型原花青素在生物體內(nèi)經(jīng)過動(dòng)物小腸吸收進(jìn)入血液，以單體及其甲基化形式存在，到達(dá)結(jié)腸后被腸道微生物降解，形成了多種酚酸及其衍生物并通過尿液排出。目前，在藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究中，常通過動(dòng)物體內(nèi)和體外的研究方法，揭示藥物在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，獲得藥物的基本代謝參數(shù)。體內(nèi)藥物分析所采用的生物樣品包括血液、尿液、唾液、頭發(fā)、臟器組織、乳汁、精液、膽汁、胃液、淋巴液、糞便等，其中最常見的是血清和尿液，能很好的體現(xiàn)藥物濃度和治療作用之間的關(guān)系。生物樣品中的目標(biāo)物質(zhì)必須進(jìn)行分離純化才能進(jìn)行檢測(cè)分析，對(duì)于藥物或其代謝物與體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合生成的綴合物，在分離純化之前還需要進(jìn)行水解使之釋放。檢測(cè)分析方法包括高效液相色譜法(HPLC)、 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MQ、氣相色譜法(GC)、紫外分光光度法、熒光偏振免疫法等。到目前為止，國內(nèi)外還尚未見關(guān)于A-型原花青素的代謝產(chǎn)物及其代謝產(chǎn)物分析方法的報(bào)道。單一黃烷醇類物質(zhì)的代謝產(chǎn)物可直接利用有機(jī)溶劑對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行萃取分離，繼而對(duì)有機(jī)相進(jìn)行檢測(cè)，這是目前最常用的樣品處理方法。但如果代謝產(chǎn)物組分較為復(fù)雜，目標(biāo)物含量較少時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致萃取回收率低，目標(biāo)物受到干擾。A-型原花青素組分復(fù)雜，與單一受試物相比，僅利用有機(jī)溶劑提取并不能完全地將代謝產(chǎn)物分離純化，且不易檢出定量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種A-型原花青素代謝產(chǎn)物的分析方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的—種A-型原花青素代謝產(chǎn)物的分析方法，所述分析方法包括生物樣品的采集、 A-型原花青素代謝產(chǎn)物溶液的制備以及A-型原花青素代謝產(chǎn)物的檢測(cè)，所述A-型原花青素代謝產(chǎn)物溶液的制備包括以下步驟(1)制備水解產(chǎn)物用0. 2-1. Ommol/L的醋酸溶液調(diào)節(jié)生物樣品的pH值至5. 5，加入β -葡萄糖醛酸酶，37°C水解1-3小時(shí)后，用2-6mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2后終止反應(yīng)，于4°C下離心10分鐘，取上清液，得到水解產(chǎn)物；(2)制備代謝產(chǎn)物粗提物將水解產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取，合并酯相，真空濃縮除去乙酸乙酯后復(fù)溶于甲醇水溶液中，得到代謝產(chǎn)物粗提物；
(3)代謝產(chǎn)物粗提物的純化將代謝產(chǎn)物粗提物經(jīng)過C18固相萃取柱吸附純化，用清水洗凈，再用甲醇洗脫定容，得到A-型原花青素代謝產(chǎn)物溶液。所述生物樣品為動(dòng)物血清和/或尿液。步驟(1)中所述的離心為10000-15000轉(zhuǎn)/分的高速離心。步驟(3)中所述的甲醇洗脫的流速為Hml/分。本發(fā)明的有益效果1、由于A-型原花青素代謝產(chǎn)物組分較為復(fù)雜，本發(fā)明采用固相萃取的方法對(duì)粗提物進(jìn)行分離純化，將C18填料作為固定相裝入微型小柱，當(dāng)含有藥物的生物樣品上柱時(shí)， 由于受到“吸附”、“分配”或其他作用，藥物被保留在固定相上，用純水清洗，以甲醇為洗脫劑洗脫，從而達(dá)到分離純化的目的。該方法有效避免了液液萃取中水相和有機(jī)相的乳化現(xiàn)象，減少了雜質(zhì)引入和環(huán)境污染。2、本發(fā)明能夠用于分析多種生物樣品中的A-型原花青素代謝產(chǎn)物，對(duì)處理后的代謝產(chǎn)物進(jìn)行HPLC和HPLC-MS分析，結(jié)果準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好。3、本發(fā)明的分析方法高效快速，不僅有助于了解A-型原花青素的代謝機(jī)理和代謝產(chǎn)物，也為進(jìn)一步利用A-型原花青素起到了重要的作用。


圖1 :A-型原花青素的HPLC色譜圖。圖2 尿液代謝產(chǎn)物固相萃取前的HPLC色譜圖。圖3 尿液代謝產(chǎn)物固相萃取后的HPLC色譜圖。圖4 血清代謝產(chǎn)物固相萃取后的HPLC色譜圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明實(shí)施例1一種A-型原花青素代謝產(chǎn)物的分析方法，包括以下步驟1、生物樣品的采集(1)分組取SD大鼠15只，雄性，體重200 士 20g，購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)分3組，正常組，低劑量(150mg/kg)和高劑量(300mg/kg)A-型原花青素組，每組5只大鼠。(2)給藥將SD大鼠在SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)一個(gè)星期后，開始實(shí)驗(yàn)。將冷凍干燥的 A-型原花青素粉末150mg、300mg溶于IOml生理鹽水中配成混懸液，給予低劑量和高劑量組大鼠灌胃，正常組直接以生理鹽水替代。灌胃前大鼠禁食給水12-18h，于下午4點(diǎn)開始灌胃，灌胃后將大鼠置于代謝籠中，收集其18h內(nèi)排出的尿液，分析前-80°C冷凍保存。(3)采血將冷凍干燥的A-型原花青素粉末300mg溶于IOml生理鹽水中配成混懸液，正常組以生理鹽水代替。灌胃前大鼠禁食給水12-1他，于下午4點(diǎn)灌胃，灌胃Ih后， 對(duì)大鼠腹腔注射水合氯醛局部麻醉，頸部脫白處死，從大鼠肝門靜脈抽取血液，于4°C下高速離心IOmin取上清，分析前-80°C冷凍保存。2、代謝產(chǎn)物的制備
(1)制備水解產(chǎn)物用0. 2-1. Ommol/L的醋酸溶液調(diào)節(jié)生物樣品的pH值至5. 5，加入β -葡萄糖醛酸酶，37°C水解1-3小時(shí)后，用2-6mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2后終止反應(yīng)，于4°C下離心10分鐘，取上清液，得到水解產(chǎn)物；(2)制備代謝產(chǎn)物粗提物將水解產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取，合并酯相，真空濃縮除去乙酸乙酯后復(fù)溶于甲醇水溶液中，得到代謝產(chǎn)物粗提物；(3)代謝產(chǎn)物粗提物的純化將代謝產(chǎn)物粗提物經(jīng)過C18固相萃取柱吸附純化，用少量清水洗凈，再用甲醇洗脫定容，得到A-型原花青素代謝產(chǎn)物溶液。所述β -葡萄糖醛酸酶為Type H_5型，每100微升血清中加入200-500U，每毫升尿液中加入0. 5-1. 5KU進(jìn)行水解。3、代謝產(chǎn)物的檢測(cè)(1)代謝產(chǎn)物的HPLC檢測(cè)色譜柱ZORBAXEclipse XDB-Cw (150mmX 4. 6mm，5 μ m)；柱溫28°C ；檢測(cè)波長 280nm ；流速:lmL/min ；流動(dòng)相=A為0. 4%的醋酸水溶液，B為乙腈。洗脫梯度:0-40min, 5-35 % B ；40-45min, 35-50 % B ；45_50min，50-80 % B ；50_55min，80-5 % B,柱平衡 IOmin,進(jìn)樣量20μ 1。(2)代謝產(chǎn)物的HPLC-MS檢測(cè)液相色譜條件同上，質(zhì)譜選用負(fù)離子模式，電噴霧氣壓為20psi，干燥氣流速為 7.0L/min，干燥溫度為325°C。離子掃描范圍50-1200m/z，重點(diǎn)關(guān)注分子量300左右的小分子物質(zhì)，同時(shí)進(jìn)行二級(jí)破碎。(3) A-型原花青素藥物的HPLC檢測(cè)對(duì)大鼠灌胃藥物A-型原花青素進(jìn)行HPLC分析，色譜條件同代謝物的檢測(cè)，進(jìn)樣量 10 μ 1。A-型原花青素代謝產(chǎn)物的分析結(jié)果尿液和血液中A-型原花青素的代謝產(chǎn)物，經(jīng)過HPLC和HPLC-MS檢測(cè)分析Α_型原花青素代謝后主要以3-羥基苯乙酸，3-羥基苯丙酸，4-羥基苯丙酸，ρ-香豆酸，m-香豆酸， 咖啡酸，香草酸，莽草酸及其衍生物等小分子酚酸的形式通過尿液排出；而在血清中僅發(fā)現(xiàn)有少量原花青素單體及其甲基化形式的物質(zhì)存在。1、尿液代謝產(chǎn)物的HPLC分析由于A-型原花青素的代謝產(chǎn)物比較復(fù)雜，如圖2所示，未經(jīng)過固相萃取柱純化的尿液代謝產(chǎn)物，不能通過C18色譜柱有效分離，拖尾現(xiàn)象非常嚴(yán)重，無法對(duì)其中的產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜解析。C18柱吸附純化后，從圖3中明顯可以看到，在10-35min之間出現(xiàn)了 10余種物質(zhì)，其中大部分都在277nm左右有最大吸收峰，可推斷其屬于黃烷醇類物質(zhì)。說明純化后極大地優(yōu)化了代謝產(chǎn)物的可檢測(cè)性，且準(zhǔn)確性更高。2、尿液中代謝產(chǎn)物的鑒定利用HPLC-MS對(duì)尿液中A-型原花青素的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，通過與灌胃原樣(如圖1所示)和與酚酸標(biāo)準(zhǔn)品的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)A-型原花青素經(jīng)過代謝產(chǎn)生了多種酚酸及其衍生物，一部分未被吸收利用的原花青素以其母體或甲基化的形式通過尿液排出體外。特別鑒定了其中存在的兒茶素、表兒茶素、A2和三聚體{表兒茶素—8，2β —0 — 7)-表兒茶素— 8)-表兒茶素}及其衍生物等，見表1。目前已經(jīng)鑒定的酚酸包括3-羥基苯乙酸，3-羥基苯丙酸，4-羥基苯丙酸，ρ-香豆酸，m-香豆酸，咖啡酸，香草酸和莽草酸。多次重復(fù)后，結(jié)果重現(xiàn)性高。繼續(xù)進(jìn)行定量分析，可以得到各代謝物的排出量。3、血液中原花青素的代謝產(chǎn)物從圖4中不難看出，大鼠血清中含有一定量的表兒茶素單體(表幻，可通過計(jì)算得到其濃度，并作為評(píng)價(jià)A-型原花青素在生物體內(nèi)吸收率的一種手段。表1大鼠尿液中A-型原花青素的代謝產(chǎn)物分析
權(quán)利要求
1.一種A-型原花青素代謝產(chǎn)物的分析方法，其特征在于所述分析方法包括生物樣品的采集、A-型原花青素代謝產(chǎn)物溶液的制備以及A-型原花青素代謝產(chǎn)物的檢測(cè)，所述A-型原花青素代謝產(chǎn)物溶液的制備包括以下步驟(1)制備水解產(chǎn)物用0.2-1. Ommol/L的醋酸溶液調(diào)節(jié)生物樣品的pH值至5. 5，加入 β-葡萄糖醛酸酶，37°C水解1-3小時(shí)后，用2-6mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2后終止反應(yīng)，于4°C下離心10分鐘，取上清液，得到水解產(chǎn)物；(2)制備代謝產(chǎn)物粗提物將水解產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取，合并酯相，真空濃縮除去乙酸乙酯后復(fù)溶于甲醇水溶液中，得到代謝產(chǎn)物粗提物；(3)代謝產(chǎn)物粗提物的純化將代謝產(chǎn)物粗提物經(jīng)過C18固相萃取柱吸附純化，用清水洗凈，再用甲醇洗脫定容，得到A-型原花青素代謝產(chǎn)物溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的A-型原花青素代謝產(chǎn)物的分析方法，其特征在于所述生物樣品為動(dòng)物血清和/或尿液。
3.如權(quán)利要求1所述的A-型原花青素代謝產(chǎn)物的分析方法，其特征在于步驟(1)中所述的離心為10000-15000轉(zhuǎn)/分的高速離心。
4.如權(quán)利要求1所述的A-型原花青素代謝產(chǎn)物的分析方法，其特征在于步驟(3)中所述的甲醇洗脫的流速為Hml/分。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種A-型原花青素代謝產(chǎn)物的分析方法，該方法包括生物樣品的采集、代謝產(chǎn)物溶液的制備以及代謝產(chǎn)物的檢測(cè)等步驟，其中代謝產(chǎn)物溶液的制備包括制備水解產(chǎn)物、制備代謝產(chǎn)物粗提物和代謝產(chǎn)物粗提物的純化三個(gè)步驟。本發(fā)明樣品分離純化的效果好，方法高效快速，結(jié)果準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好，不僅有助于了解A-型原花青素的代謝機(jī)理和代謝產(chǎn)物，也為進(jìn)一步利用A-型原花青素起到了至關(guān)重要的作用。
文檔編號(hào)G01N1/40GK102539220SQ20121001991
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月21日
發(fā)明者劉亮, 周瑋婧, 孫智達(dá), 李書藝, 肖娟, 謝筆鈞, 隋勇 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)