專利名稱：心血管疾病的檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)在例如人或者非人類動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物的宿主中心血管疾病(CVD)的可能性或傾向性的檢測(cè)方法，并具體涉及一種用于在該宿主出現(xiàn)明顯的 CVD癥狀發(fā)作之前，檢測(cè)CVD的可能性或傾向性的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
心血管疾病是人類健康不良的一個(gè)主要來源。在1998年，全歐洲的死亡人數(shù)中大約有40 %的死于CVD (即，每2. 5例死亡中就有I例)。據(jù)估計(jì)，2002年，在美國，將有超過一百萬人遭受新發(fā)現(xiàn)的和復(fù)發(fā)的心臟冠狀動(dòng)脈發(fā)作的病痛，并且在患有這些疾病的人數(shù)中將有超過40%的人會(huì)死亡。這些人中的許多都是在未經(jīng)就醫(yī)或治療的情況下突然死亡的。 許多人都將不能認(rèn)識(shí)到他們易患心血管疾病。然而，早期或搶先治療，例如改變飲食、減少或停止吸煙、增加運(yùn)動(dòng)量、降低體重等在預(yù)防CVD或降低CVD的傾向性方面具有很高的成功率。因此，如果能夠檢測(cè)CVD或CVD 的可能性或傾向性，就能夠有效地進(jìn)行治療。因此，需要一種在CVD疾病發(fā)展到超過通常可成功治療(例如改變生活方式和/ 或習(xí)慣)的階段之前，用于診斷CVD，特別是診斷CVD的可能性或傾向性的方法。特別地， 需要一種在當(dāng)癥狀對(duì)宿主和第三方例如內(nèi)科醫(yī)師并不明顯的早期階段，用于檢測(cè)CVD的方法，即需要用于測(cè)試“無癥狀宿主”的方法。這種方法可被用于篩選一般人群(即普查)或者易感人群，例如年齡超過40歲的男性、從事高壓力工作的工人、具有不良飲食習(xí)慣的個(gè)人、患有臨床肥胖癥的個(gè)人、吸煙者等。在診斷出具有CVD可能性或CVD傾向的病例中，可以進(jìn)行預(yù)先治療和/或鼓勵(lì)病人調(diào)節(jié)生活方式和習(xí)慣。同樣地，當(dāng)檢測(cè)出具有CVD可能性或CVD傾向時(shí)，可對(duì)病人進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)試，例如使用更昂貴的或更費(fèi)時(shí)的技術(shù)，例如有和沒有身體活動(dòng)的ECG(心電圖)、心肌灌注的放射性同位素成像、X射線(例如CT)心肌血管造影、MR心肌血管造影或灌注成像等。從而通過使用本發(fā)明的廉價(jià)、易行的檢測(cè)方法在初始篩選中(例如在“無癥狀健康”宿主的普查中)確認(rèn)CVD的存在、可能性、或傾向性，在健康損害變得無法挽回之前，提高檢測(cè)或識(shí)別未被發(fā)現(xiàn)的CVD、或CVD傾向性，同時(shí)，限制使用了昂貴和耗時(shí)的不必要測(cè)試。所謂“CVD”表示任何中斷向軀體的生命維持區(qū)域例如大腦、心臟等的供氧的心臟、動(dòng)脈、或靜脈的病況。CVD的實(shí)例為動(dòng)脈硬化(arteriosclerosis)、急性心肌梗塞 (acute myocardial infarction)、心絞痛(angina pectoris)、缺血性心臟病(ischemic heart disease)、腦血管疾病(cerebrovascular disease)、中風(fēng)(stroke)、蛛網(wǎng)膜下出血(subarachnoid haemorrhage)、大腦內(nèi)出血(intra-cerebral haemorrhage)、腦梗死(cerebral infarction)、充血性心力衰竭(congestive heart failure)、心絞痛(angina)、心力衰竭(heart attack)、心臟停搏(cardiac arrest)與心律不齊 (arrhythmia)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于如下令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，S卩，發(fā)現(xiàn)蛋白鈣衛(wèi)蛋白是一種在CVD癥狀發(fā)作之前(即無癥狀宿主)對(duì)于CVD可能性或CVD傾向有用的“標(biāo)記子”或者“指示子”。特別地，已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)在各種體液中異常高的鈣衛(wèi)蛋白水平，在對(duì)該宿主或第三方(例如內(nèi)科醫(yī)師)明顯CVD癥狀的發(fā)作之前，指示著CVD的易感性。因?yàn)樵摫苊庖鹨蓡?，術(shù)語鈣衛(wèi)蛋白是“LI蛋白”、“MRP 8/14”、“囊性纖維化(關(guān)聯(lián))抗原(CFA) ”和“鈣粒蛋白”的同義表達(dá)。鈣衛(wèi)蛋白同時(shí)存在二聚或三聚形式。作為二聚物，鈣衛(wèi)蛋白包含多肽鏈S100A8與 S100A9。作為三聚物，鈣衛(wèi)蛋白是具有兩個(gè)重鏈(14kD)與一個(gè)輕鏈(8kD)的非共價(jià)連接的 36kDa雜三聚蛋白。鈣衛(wèi)蛋白是一個(gè)鈣結(jié)合性蛋白，并且在與鈣結(jié)合時(shí)，鈣衛(wèi)蛋白可以耐熱并耐蛋白水解。這使得能夠使用大量的試驗(yàn)方法和條件。鈣衛(wèi)蛋白的抗原表位圖譜顯示可以制造對(duì)配合和/或單一蛋白鏈具有專一性的抗體。已經(jīng)表明在鈣衛(wèi)蛋白配合物上存在至少四個(gè)單獨(dú)免疫原位點(diǎn)。一些抗體識(shí)別重鏈或者輕鏈，而另一些則同時(shí)識(shí)別兩者。可在人體各部分的細(xì)胞、組織和體液中發(fā)現(xiàn)鈣衛(wèi)蛋白，并且它主要是從嗜中性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞衍生而來的。很可能所有人體都攜帶有鈣衛(wèi)蛋白，這是因?yàn)樵诔^5000個(gè)個(gè)體測(cè)試中，還沒有發(fā)現(xiàn)不攜帶鈣衛(wèi)蛋白的個(gè)體。在大鼠、小鼠、兔、羊、牛與豬身上也發(fā)現(xiàn)有鈣衛(wèi)蛋白。因此，它是一種含量豐富、普遍存在的分子。在體內(nèi)，鈣衛(wèi)蛋白涉及許多生物機(jī)能，這包括胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、嗜中性粒細(xì)胞活化、 與細(xì)胞增殖、抗菌活性以及嗜中性粒細(xì)胞防御相關(guān)的胞內(nèi)酶的抑制。鈣衛(wèi)蛋白同時(shí)還是炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)蛋白，并且，在這一過程中還可以起到刺激產(chǎn)生免疫球蛋白、趨化因子活性以及嗜中性粒細(xì)胞固定因子的作用。雖然體液很可能總是包含鈣衛(wèi)蛋白，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在各種體液中的鈣衛(wèi)蛋白的濃度是會(huì)發(fā)生變化的，例如，在多種疾病狀況(例如炎癥性、傳染性與惡性疾病)中其濃度會(huì)增加。因此，可以使用如下方法作為診斷這種疾病的手段，測(cè)定正遭受這種疾病的病人(即對(duì)該宿主和/或第三方明顯的癥狀發(fā)作的個(gè)體)的體液中的鈣衛(wèi)蛋白的濃度，并與健康(即非患病)宿主的體液中的鈣衛(wèi)蛋白濃度進(jìn)行比較。例如，盡管細(xì)菌感染和病毒感染的癥狀非常相似，并且僅從它們的癥狀進(jìn)行診斷是非常困難的，病毒感染宿主的血漿/血清中鈣衛(wèi)蛋白的濃度上升I 2倍，而細(xì)菌感染宿主則上升I 18倍。因此，對(duì)于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)感染癥狀的宿主，可以測(cè)量其體液中的鈣衛(wèi)蛋白的濃度、診斷其感染情況，并進(jìn)相應(yīng)的治療?？墒褂肐丐衛(wèi)蛋白診斷測(cè)試的其它疾病包括風(fēng)濕性疾病(rheumatic diseases) (例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)、青年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(juvenile rheumatoid arthritis)、全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus))、斯耶格倫氏綜合癥(Sj0grens syndrome)、眼內(nèi)炎癥(intraocular inflammatory)、囊性纖維化(cystic fibrosis)、急性與慢性肺疾病(acute and chronic lung disease)、肺癌瘤(lung carcinoma)(鱗狀細(xì)胞)、肺癌(pulmonary cancers)、結(jié)腸直腸癌(colorectal cancer)、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease)、胃癌(gastric cancer)、結(jié)腸直腸腺瘤或癌(colorectal ademona or cancer)、克隆氏病(Chrohn ' s disease)、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis)、胃腸粘膜炎(gastrointestinal mucosal)、尿路結(jié)石(urinary stones)、酒精性肝臟病(alcoholic liver disease)、口腔粘膜炎性疾病 (oral inflammatory mucosal disease)、CNS 炎性疾病(CNS inflammatory disease) (例如多發(fā)性硬化(multiple sclerosis)與急性腦炎(acute encephalitis))、HIV 感染(HIV infection)、HIV 感染病人的繼發(fā) CNS 感染(secondary CNS infections in HIV infected patients)、尿路感染(urinary tract infections)、膀胱炎(cystitis)、腎盂腎炎(pyelonephritis)、內(nèi)源性后葡萄膜炎(endogenous posterior uveitis)、血液疾病(haematological conditions)(例如白血病(leukaemia))、發(fā)熱性疾病(febrile conditions)(感染性的與非感染性的)、急性心肌梗塞(acute myocardial infarction) 與分離輸血(apheresis)。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在心臟直視手術(shù)期間鈣衛(wèi)蛋白的血漿濃度增加(Semb，A. G.等，Eur. J. Cardio-thorac Surg. (1991)5:363-367, Saatvedt, K.等，Scand. J. Thor. Cardiovasc. Surg. (1996) 30 :53-60, Moen, O.等，Perfusion (1994) 9 :109-117)。更具體地說，Saatvedt 等報(bào)道了在心肺分流手術(shù)開始之后鈣衛(wèi)蛋白濃度上升，并且在術(shù)后48小時(shí)達(dá)到最高值。已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)可以通過測(cè)定從所述宿主取得的含鈣衛(wèi)蛋白樣品中的鈣衛(wèi)蛋白的濃度來檢測(cè)宿主的CVD可能性或CVD傾向。換言之，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)測(cè)定從宿主取得的含鈣衛(wèi)蛋白樣品中的鈣衛(wèi)蛋白的濃度可被用于在對(duì)宿主和第三方(例如內(nèi)科醫(yī)師)明顯可見的癥狀發(fā)作之前，預(yù)測(cè)該宿主是否或者多大可能罹患CVD。所謂“具有可能性”或“具有傾向性”是指對(duì)當(dāng)前接受測(cè)試的無癥狀宿主在將來罹患CVD疾病的可能性或幾率。這可以采用反映將來(例如在隨后的I 2年中，至少在隨后的6個(gè)月中)的CVD的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)的指數(shù)、比例、百分?jǐn)?shù)或類似的數(shù)字的形式。因此，從一個(gè)方面來看，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人或非人類動(dòng)物宿主患有CVD可能性或傾向性的檢測(cè)方法，所述的方法包括測(cè)定取自所述宿主的含鈣衛(wèi)蛋白樣品，例如血液、血衆(zhòng)、血清、腦脊液(cerebrospinal fluid)、口腔液(oral fluid)、尿液、排泄物、滑液或膿液(synovial or empyema fluid)中的I丐衛(wèi)蛋白的濃度。所謂“檢測(cè)”是指測(cè)定鈣衛(wèi)蛋白濃度的定量或半定量值。這個(gè)值可以是測(cè)試樣品， 例如進(jìn)行處理以除去細(xì)胞或其它的非測(cè)試樣品組分、或者濃縮或稀釋該樣品或者將該樣品轉(zhuǎn)移到一個(gè)單獨(dú)的介質(zhì)例如固體基質(zhì)中之后的濃度的值?；蛘撸摍z測(cè)可以簡(jiǎn)單地是定性的，即只表明該鈣衛(wèi)蛋白是否高于或低于一個(gè)或多個(gè)預(yù)選的閾值，例如表示通過該測(cè)試檢測(cè)不會(huì)出現(xiàn)CVD可能性或CVD傾向的值。這些鈣衛(wèi)蛋白的閾值或其它參考值的精確值取決于樣品的性質(zhì)、宿主的年齡、體重、性別和種族， 并可以以常規(guī)方式通過測(cè)量未患有CVD和處于CVD的不同發(fā)展階段的相同宿主的相關(guān)體液的鈣衛(wèi)蛋白濃度來測(cè)定該值。根據(jù)本發(fā)明的方法指示“檢測(cè)的”或測(cè)定鈣衛(wèi)蛋白濃度的值可以是鈣衛(wèi)蛋白的絕對(duì)濃度，或者可以是反映鈣衛(wèi)蛋白濃度的指數(shù)、比例、百分比或類似數(shù)字?？杀挥糜诒景l(fā)明的檢測(cè)方法的人體樣品可以是任何包含鈣衛(wèi)蛋白的樣品，例如體液或組織樣品，或者懸浮液等。優(yōu)選樣品為體液，例如尿液、腦脊液、口腔液、滑液或膿液，或者更優(yōu)選血液或者血液衍生的樣品。在這種情況下(即，使用血液和血液衍生的樣品時(shí))， 優(yōu)選用于分析的樣品不含細(xì)胞(例如血清或血漿)?；蛘撸梢允褂门判刮?。在用于本發(fā)明的檢測(cè)方法之前，可以預(yù)先對(duì)該樣品進(jìn)行處理。因此，可以對(duì)樣品進(jìn)行處理以除去任何細(xì)胞和/或任何非測(cè)定的樣品組分。還可以對(duì)樣品進(jìn)行濃縮、稀釋處理， 或者將鈣衛(wèi)蛋白轉(zhuǎn)移到一個(gè)單獨(dú)的介質(zhì)上，例如固體基質(zhì)上。例如，可以通過加入緩沖液或者其它的水溶性介質(zhì)稀釋該樣品。或者，可以直接使用該樣品，例如血漿或血清。例如可以在用于本發(fā)明的檢測(cè)方法之前任選地使用鈣或者鈣類似物(例如另一個(gè)堿土金屬的離子)處理該樣品。該鈣或鈣類似物可以是提供Ca2+離子的任何形式(例如 CaCl2)。如果使用鈣，優(yōu)選將足夠的鈣或鈣類似物加入到樣品中以飽和鈣衛(wèi)蛋白的結(jié)合部位。例如，可以加入10摩爾過量、或者更優(yōu)選5摩爾過量、或特別優(yōu)選3摩爾過量的I丐源。盡管鈣衛(wèi)蛋白的檢測(cè)是已知的并且可被用于本發(fā)明的方法，此前并沒有任何暗示說鈣衛(wèi)蛋白是CVD可能性或CVD傾向的標(biāo)記子或指示子。換言之，先前并沒有任何這樣的暗示無癥狀宿主的鈣衛(wèi)蛋白濃度可被用作CVD的可能性或傾向性的標(biāo)記子或指示子，并且，具體地并沒有這樣的暗示鈣衛(wèi)蛋白濃度可作為健康宿主(即無癥狀宿主)普查的檢測(cè)方法中的標(biāo)記子或指示子使用。在本發(fā)明的檢測(cè)方法中可以使用任何已知的檢測(cè)鈣衛(wèi)蛋白的方法。因此，例如 US-A-4833074(Fagerhol等)所公開的分離鈣衛(wèi)蛋白以及隨后產(chǎn)生單特異性抗血清的方法可被用于制造用于任何常規(guī)方法的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體。所產(chǎn)生的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體可被用于例如酶連接免疫試驗(yàn)和放射免疫試驗(yàn)。對(duì)于I丐衛(wèi)蛋白還可以使用例如Nyco Card (Axis-Shield PoC,Oslo,挪威)免疫測(cè)定格式。該檢測(cè)使用一個(gè)固相、夾心形式，其中的測(cè)試裝置包括涂布有固定的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體的膜。因此，將樣品(任選地被稀釋的)施加到該裝置上并且當(dāng)該樣品流過該膜時(shí)，可以俘獲任何存在的鈣衛(wèi)蛋白。然后使用與鈣衛(wèi)蛋白抗體復(fù)合物結(jié)合的金抗體共軛處理固定在膜上的鈣衛(wèi)蛋白，并且通過對(duì)紅光吸光率所測(cè)定的(由于金珠產(chǎn)生的)色強(qiáng)度與鈣衛(wèi)蛋白的量成正比。因此，可以從常規(guī)方式制訂的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到鈣衛(wèi)蛋白的濃度?；蛘?，可以對(duì)例如排泄物(購自Eurospital )中的鈣衛(wèi)蛋白使用商業(yè)試驗(yàn)( Calpresto )。該檢測(cè)使用針對(duì)酶連接的免疫吸收劑檢測(cè)系統(tǒng)中的鈣衛(wèi)蛋白的多克隆抗體。因此，存在于取自宿主的樣品中的鈣衛(wèi)蛋白與抗體結(jié)合，其中該抗體被吸收到塑料井的表面。然后加入酶的基質(zhì)，并且所產(chǎn)生的著色產(chǎn)品的強(qiáng)度與酶的量成正比，并因此與鈣衛(wèi)蛋白的量成正比。因此，可以從常規(guī)方式制訂的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到鈣衛(wèi)蛋白的濃度。實(shí)際上，單克隆和多克隆抗鈣衛(wèi)蛋白抗體都可從商業(yè)途徑獲得。雞蛋和兔子多克隆是分別從例如 Norwegian Antibodies AS 和 Axis-Shield Diagnostics 得到的，而老鼠單克隆抗體可從丹麥的Dako A/S獲得。任何可以通過例如任何用于制造抗體的常規(guī)方法得到的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體都可被用于本發(fā)明的方法。例如，可根據(jù)Harlow and Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, NY 所述的規(guī)程制造兔子抗鈣衛(wèi)蛋白以及單克隆抗體。
或者，可以將含鈣衛(wèi)蛋白溶液定期注射到小雞上，并然后收集雞蛋的蛋黃來制備抗鈣衛(wèi)蛋白抗體。然后可以按照常規(guī)方法分離雞蛋多克隆抗體并通過親和色譜法純化。優(yōu)選將本發(fā)明的方法用于健康(例如無CVD癥狀)宿主的普查。當(dāng)檢測(cè)出患CVD 可能性或患CVD傾向性時(shí)，可對(duì)該宿主進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)試(例如使用專門針對(duì)CVD的更昂貴的技術(shù))以證實(shí)CVD的存在與否。通常，除了測(cè)樣品之外，在實(shí)施該檢測(cè)方法時(shí)，還將檢測(cè)含有已知鈣衛(wèi)蛋白含量的校準(zhǔn)樣品。這種測(cè)試可被用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，而根據(jù)該曲線可以測(cè)定所研究的樣品的鈣衛(wèi)蛋白的含量。校準(zhǔn)樣品的性質(zhì)以及對(duì)于在鈣衛(wèi)蛋白的檢測(cè)中所使用的轉(zhuǎn)化和修正因子的選擇可以變化，并取決于例如所實(shí)際使用的檢測(cè)技術(shù)中鈣衛(wèi)蛋白的檢測(cè)方式，并取決于該方法中影響檢測(cè)結(jié)果的其它方面，例如緩沖液組合物、檢測(cè)條件等。通常，使用鈣衛(wèi)蛋白含量為O 5000mg/L的校準(zhǔn)樣品。鈣衛(wèi)蛋白濃度的值通常出現(xiàn)的參考范圍為O. I 10mg/L。通常，沒有或具有很低患CVD可能性或患CVD傾向性的人的血漿或血清中的鈣衛(wèi)蛋白濃度將為O. 01 O. 75mg/L。更具體地說，沒有或具有很低患CVD可能性或患CVD 傾向性的人的血漿或血清中的鈣衛(wèi)蛋白濃度將為O. 05 O. 70mg/L，更具體地為O. 10 O. 66mg/L，例如為O. 15 O. 45mg/L。例如，沒有或具有很低患CVD可能性或患CVD傾向性的女性血清或血漿中的鈣衛(wèi)蛋白濃度為O. 09 O. 53mg/L，例如約O. 31mg/L或O. 30mg/ L0沒有或具有很低患CVD可能性或患CVD傾向性的男性血清或血漿中的鈣衛(wèi)蛋白濃度為 O. 12 O. 66mg/L，例如 O. 30 O. 39mg/L，特別是 O. 31mg/L。血清或血漿中鈣衛(wèi)蛋白濃度大于O. 75mg/L的將通常是患CVD可能性或患CVD傾向性非常強(qiáng)烈的表現(xiàn)。因此，可用于預(yù)測(cè)患CVD可能性或患CVD傾向性的檢測(cè)的閾值為
O.32 O. 77mg/L,例如約O. 67mg/L,優(yōu)選約O. 70mg/L,特別是約O. 76mg/L。更優(yōu)選可用于預(yù)測(cè)患CVD可能性或患CVD傾向性的檢測(cè)的閾值為O. 30 O. 50mg/L，更優(yōu)選O. 32 O. 47mg/ L，例如約 O. 45mg/L。通常，沒有或具有很低患CVD可能性或患CVD傾向性的人的排泄物中的鈣衛(wèi)蛋白濃度將為O. 01 10mg/L。更具體地說，這種人的排泄物中的鈣衛(wèi)蛋白濃度將為O. 05 9. Omg/L,更具體地為 O. 50 8. Omg/L。排泄物中鈣衛(wèi)蛋白濃度大于10mg/L的將通常是患CVD可能性或患CVD傾向性非常強(qiáng)烈的表現(xiàn)。因此，可被用于預(yù)測(cè)患CVD可能性或患CVD傾向性的閾值通常為大約9mg/ L,優(yōu)選大約10. 5mg/L,特別是大約llmg/L。然而，優(yōu)選使用對(duì)于從相似類型(年齡、性別、體重、種族等)病人得到的相同體液樣品類型進(jìn)行相同檢測(cè)技術(shù)所測(cè)定的鈣衛(wèi)蛋白來計(jì)算該閾值，其中所述相似類型病人為從健康階段到CVD早期階段到CVD嚴(yán)重階段。更優(yōu)選該閾值為在早期、健康階段對(duì)相同病人的測(cè)定值。因此，特別是在有風(fēng)險(xiǎn)的情況下，可以基于常規(guī)情況(例如每6個(gè)月或I年) 按照普查程序檢測(cè)其鈣衛(wèi)蛋白水平。在本發(fā)明優(yōu)選的檢測(cè)方法中，所述的方法還包括另外檢測(cè)從宿主取得的樣品中其它CVD的可能性標(biāo)記子的濃度。適宜的標(biāo)記子的實(shí)例可以是高半胱氨酸、活化接觸因子XII、膽固醇、膽固醇HDL比、纖維蛋白原、組織型纖維蛋白溶酶原活化因子、第V、VII和 VIII因子、脂蛋白(a)、馮維勒布蘭德氏因子(von Willebrand factor)抗原、纖溶酶_α 2抗血纖維蛋白酶復(fù)合物、凝血酶原片段1+2、凝血酶-抗凝血酶III復(fù)合物、纖維蛋白肽A、 纖維蛋白降解產(chǎn)物、D-二聚物、活化蛋白C-抵抗劑、第VIIc和VIIa因子、凝血酶、血清淀粉狀蛋白A、脈管粘著分子和冠狀動(dòng)脈鈣。第二標(biāo)記子優(yōu)選選自高半胱氨酸或C反應(yīng)蛋白。本發(fā)明的檢測(cè)方法更優(yōu)選進(jìn)一步包含另外檢測(cè)取自該宿主的樣品中的C-反應(yīng)蛋白(CRP)的濃度。優(yōu)選在檢測(cè)所述鈣衛(wèi)蛋白的同時(shí)或隨后檢測(cè)CRP的濃度?？梢允褂萌魏螛?biāo)準(zhǔn)的免疫技術(shù)(例如ELISA、RIA等)進(jìn)行CRP的測(cè)量?；蛘呖梢酝ㄟ^ Nyco Card (購自 Axis-Shield PoC, Oslo,挪威)測(cè)定。除了 CRP濃度大于I. 75mg/L之外，血清或血漿中鈣衛(wèi)蛋白濃度大于O. 75mg/L通常將是患CVD可能性或患CVD傾向性的一個(gè)非常強(qiáng)的表現(xiàn)。優(yōu)選，上述濃度的出現(xiàn)與鈣衛(wèi)蛋白或CRP濃度單獨(dú)出現(xiàn)比較而言是更強(qiáng)的患CVD可能性或患CVD傾向性的表現(xiàn)。因此，鈣衛(wèi)蛋白和CRP的閾值通常分別為O. 32 O. 77mg/L和L 70mg/L，更優(yōu)選分別為大約O. 67mg/L和I. 75mg/L,更優(yōu)選分別為O. 70mg/L和2. 00mg/L,特別優(yōu)選分別為大約O. 76mg/L和2. 25mg/L，其中超過所述閾值時(shí)將進(jìn)行檢測(cè)以高度預(yù)測(cè)患CVD可能性或患 CVD傾向性。更優(yōu)選的閾值分別為O. 30 O. 50mg/L和O. 75mg/L,更優(yōu)選O. 32 O. 47mg/ L和O. 75mg/L，例如分別為大約O. 45mg/L和O. 75mg/L，其中超過所述閾值時(shí)將進(jìn)行檢測(cè)以預(yù)測(cè)患CVD可能性或患CVD傾向性。從另一個(gè)方面來看，本發(fā)明提供了一種用于本發(fā)明方法的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括試劑以及用于實(shí)施所述檢測(cè)法和用于解釋檢測(cè)結(jié)果的說明，并任選地，含鈣衛(wèi)蛋白參比樣品，以及任選地含檢測(cè)器。優(yōu)選所述的試劑盒進(jìn)一步包含用于測(cè)定CRP濃度的試劑和說明。試劑盒中的說明可以是例如標(biāo)簽、手冊(cè)或者指導(dǎo)傳單的形式，但是，它們也可以采用計(jì)算機(jī)程序或數(shù)據(jù)載體，例如電腦磁盤的形式。存在檢測(cè)器時(shí)，該檢測(cè)器通常是能夠檢測(cè)一個(gè)報(bào)告種類，如分光計(jì)、核輻射探測(cè)器、散射光檢測(cè)器等的檢測(cè)器。該試劑將是適合用于鈣衛(wèi)蛋白測(cè)定的試劑，例如在所引用的與由Eurospital 和 NycoCard(購自Axis Shield ASA, Oslo,挪威)得到的I丐衛(wèi)蛋白現(xiàn)有測(cè)試相關(guān)的文獻(xiàn)中所描述的適宜的試劑，。US-A-4833074中所述的試劑也是合適的。在本發(fā)明中用于檢測(cè)鈣衛(wèi)蛋白濃度的特別優(yōu)選的方法為基于顆粒的免疫測(cè)定。這是一項(xiàng)基于鈣衛(wèi)蛋白濃度的濁度法測(cè)定的靈敏技術(shù)。該檢測(cè)方法所具有的靈敏度能夠有利地使得在體液(例如血漿或血清)樣品中相對(duì)低的鈣衛(wèi)蛋白濃度進(jìn)行高精度地測(cè)定。同時(shí)， 也可以準(zhǔn)確地測(cè)定較高的鈣衛(wèi)蛋白濃度。濁度法測(cè)定還具有如下優(yōu)點(diǎn)，在檢測(cè)中的物理分離不需要固體表面，并且也不需要多個(gè)洗滌和/或分離步驟。因此，與現(xiàn)有技術(shù)(例如ELISA)相比，鈣衛(wèi)蛋白的均相濁度法測(cè)定可以快速、方便地進(jìn)行，并且可以例如實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。和涉及例如固體表面的非均相技術(shù)的自動(dòng)化相比，基于濁度檢測(cè)法的自動(dòng)化是相對(duì)容易的。并且，得到的自動(dòng)化的均相處理通常更可靠，例如更不易中止。自動(dòng)化的濁度檢測(cè)法還是快速的，允許樣品高的流通量，并且運(yùn)行起來相對(duì)便宜。 通?？梢允褂蒙虡I(yè)可得機(jī)器人例如從Roche Diagnostics購得的Cobas Mira或Hitachi 711來進(jìn)行該檢測(cè)方法。當(dāng)對(duì)具有CVD可能性或傾向性的個(gè)體進(jìn)行例行測(cè)試時(shí)，這種自動(dòng)化的檢測(cè)是特別有吸引力的。對(duì)于鈣衛(wèi)蛋白濃度的濁度法測(cè)定，包含鈣衛(wèi)蛋白的樣品通常為體液，例如尿液、腦脊液、口腔液、滑液或膿液，或更優(yōu)選血液或血液衍生的樣品。在這時(shí)，用于分析的樣品通常將優(yōu)選為無細(xì)胞的(例如血清或血漿)。因此，可以對(duì)樣品進(jìn)行處理以除去任何細(xì)胞和/或任何非檢測(cè)的樣品組分?？梢詫?duì)樣品進(jìn)行濃縮或稀釋處理，或者將鈣衛(wèi)蛋白轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的介質(zhì)，例如固體基質(zhì)中。例如， 可以通過加入水、緩沖液或其它的水溶性介質(zhì)來稀釋樣品?；蛘撸梢灾苯邮褂脴悠?，具體是血清或血漿樣品。任選地，可以在用于該檢測(cè)方法之前使用鈣或鈣類似物處理樣品。鈣或鈣類似物可以是能夠提供Ca2+離子的任何形式(例如CaCl2)。如果使用鈣，優(yōu)選將足夠量的鈣或鈣類似物加入到樣品中以飽和鈣衛(wèi)蛋白的鈣結(jié)合部位。例如，可以加入10摩爾過量、更優(yōu)選 5摩爾過量、或特別優(yōu)選3摩爾過量的I丐源。鈣衛(wèi)蛋白濃度的濁度法測(cè)定的不透明度通常是，通過將含鈣衛(wèi)蛋白樣品或其等分部分與抗鈣衛(wèi)蛋白抗體、抗體片段或抗鈣衛(wèi)蛋白抗體的混合物(例如單克隆抗體的混合物)接觸而產(chǎn)生?？梢允褂觅徸訬orwegian Antibodies AS的卵多克隆抗人I丐衛(wèi)蛋白抗體產(chǎn)生不透明度。任何可以通過例如任何用于制造抗體的常規(guī)方法得到的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體都可被用于本發(fā)明的方法。用于鈣衛(wèi)蛋白濃度的濁度法測(cè)定的抗體或抗體片段優(yōu)選與其它的可能存在于洗脫物中的血蛋白不發(fā)生或幾乎不發(fā)生交叉反應(yīng)。因?yàn)槿闈崾怯捎诙嘀剽}衛(wèi)蛋白結(jié)合產(chǎn)生乳池中心的鉤形效應(yīng)(hook effect)產(chǎn)生的,所使用的抗體或抗體片段的數(shù)量當(dāng)然應(yīng)相對(duì)于含鈣衛(wèi)蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行優(yōu)化的。如上所述，鈣衛(wèi)蛋白具有多個(gè)抗體結(jié)合部位，并且特別適合用于在這種檢測(cè)中進(jìn)行檢測(cè)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以通過直接或間接地結(jié)合或偶合到任何已知的通常用于固定的固體載體或基質(zhì)上來固定抗鈣衛(wèi)蛋白抗體、抗體片段。優(yōu)選該固體載體或基質(zhì)采用顆粒，優(yōu)選納米顆粒的形式。方便地，該固體載體可以是由玻璃、二氧化硅、膠乳、金屬 (如金)或聚合材料(例如聚乙烯)制成。優(yōu)選載體是由聚合材料例如聚乙烯制成?？梢酝ㄟ^任何常規(guī)方法來實(shí)現(xiàn)抗鈣衛(wèi)蛋白抗體或抗體片段的固定和結(jié)合。例如， 可以通過在緩沖液中攪拌(例如在室溫下攪拌24小時(shí))并然后結(jié)合使用生物素標(biāo)記的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體(按照現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)方法制備的)，將抗生物素蛋白固定到氯甲基活化的聚苯乙烯納米顆粒(購自美國Interfacial Dynamic公司)上。因此,例如,將用于測(cè)試 CVD可能性或傾向性的取自該宿主的血漿加入到分光光度計(jì)石英池中的涂布有抗生物素蛋白的納米顆粒的溶液中，隨后加入生物素標(biāo)記的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體。然后采用濁度計(jì)讀數(shù)?；蛘?，可以在加入血漿或血清之前加入生物素標(biāo)記抗體。換句話說，盡管無論使用何種用于濁度檢測(cè)的儀器通常都是使用相同的試劑，但是不同試劑的精確的加入順序是可以改變的。通常，所使用的順序應(yīng)當(dāng)與所使用的分光光度計(jì)(例如島津UV-160分光光度計(jì))所附的說明一致。得到濁度計(jì)讀數(shù)(即，定期測(cè)量適宜的波長(zhǎng)下的吸光率)并測(cè)定相對(duì)于參比樣品的吸光率。任選地，可以使用多波長(zhǎng)儀器以得到濁度計(jì)讀數(shù)并可以提供更精確的結(jié)果。用于獲取池度計(jì)讀數(shù)的適宜的儀器包括Cobas Mira、Roche Integra和Merck’s Turbiquant0
在另一種可供選擇的試驗(yàn)裝置中，可以將抗鈣衛(wèi)蛋白抗體或抗體片段直接固定在氯甲基活化的納米顆粒(購自美國Interfacial Dynamic公司)上。例如,可以將抗I丐衛(wèi)蛋白抗體(例如購自Norwegian Antibodies AS的卵多克隆抗體)在緩沖液(IOmM硼酸鹽, 15mM氯化鈉、pH值9. O)中與上述活化顆?；旌喜嚢?例如在室溫下攪拌24小時(shí))，以得到涂布有抗鈣衛(wèi)蛋白抗體的納米顆粒。這種納米顆?？梢酝ㄟ^將其加入到取自測(cè)試CVD 可能性或傾向性的宿主的溶于緩沖液的血清或血漿樣品中，并以運(yùn)動(dòng)模式獲取濁度計(jì)讀數(shù)用于鈣衛(wèi)蛋白濃度的濁度測(cè)試。或者，可以將血漿或血清加到抗鈣衛(wèi)蛋白抗體涂布的納米顆粒上。換句話說，盡管無論使用何種用于濁度檢測(cè)的儀器通常都是使用相同的試劑，但是不同試劑的精確的加入順序是可以改變的。通常，所使用的順序應(yīng)當(dāng)與所使用的分光光度計(jì)(例如島津UV-160分光光度計(jì))所附的說明一致。適合按照本發(fā)明的檢測(cè)方法獲得濁度計(jì)讀數(shù)的自動(dòng)化機(jī)器人的實(shí)例包括Roche Diagnostics 制造的 Cobas Mira 和和 Hitachi 711?？贵w或抗體片段可以結(jié)合的顆粒通常為球狀。檢測(cè)中所使用的顆粒的大小可以影響鈣衛(wèi)蛋白濃度測(cè)量的精度。盡管更大的顆粒允許檢測(cè)更低的鈣衛(wèi)蛋白濃度，但是它們降低了的表面積意味著它們的結(jié)合量也較低。例如，直徑擴(kuò)大一倍，單位質(zhì)量的顆粒的結(jié)合量減半。此外，粒徑的增加將導(dǎo)致在這種檢測(cè)所通常使用的波長(zhǎng)下(例如330 600nm)的背景光吸光率以及光懸浮(light suspension)的增加。因此，盡管更大的顆粒提高了檢測(cè)的靈敏度，但這也可能伴隨一些精確度的損失，并且具體是增加了得到的假陰性結(jié)果的數(shù)目。這是在含有較高鈣衛(wèi)蛋白濃度的樣品(即，取自那些具有較高CVD可能性或傾向性的個(gè)體的樣品)中特別容易發(fā)生的情形，其中該納米顆粒結(jié)合的結(jié)合部位可以在并非所有的鈣衛(wèi)蛋白被結(jié)合的條件下變得飽和。這些與改變粒徑相關(guān)的相反作用(例如增加粒徑提高了靈敏度但是降低了精確度)代表了在發(fā)展用于檢測(cè)存在于體液中鈣衛(wèi)蛋白的含量范圍的靈敏檢測(cè)法過程中需要克服的重要問題。在本發(fā)明的檢測(cè)方法中還優(yōu)選所使用的顆粒能夠精確測(cè)定各種范圍內(nèi)的濃度。這可能表示對(duì)否定的結(jié)果(即，低于閾值的濃度)以及肯定的結(jié)果都具有很高的置信度。特別優(yōu)選在本發(fā)明的檢測(cè)方法中可以測(cè)量鈣衛(wèi)蛋白濃度為O. 5 50mg/L(例如I 40mg/L) 的樣品?？贵w或抗體片段可以結(jié)合的顆粒通常為粒徑為I 150nm，例如10 90nm或15 60nm，例如44nm的球狀顆粒。在特別優(yōu)選的本發(fā)明的檢測(cè)方法中，抗體或抗體片段所結(jié)合的顆粒的粒徑為55 104nm,更優(yōu)選65 IlOnm,例如70 90nm。或者，可以一旦抗體或抗體片段結(jié)合到其表面就測(cè)定顆粒的直徑。在這種情況下， 涂布有抗體或抗體片段的顆粒的直徑優(yōu)選為65 140nm，更優(yōu)選為75 120nm，并更優(yōu)選為80 lOOnm。當(dāng)所測(cè)試的樣品為血漿時(shí)，特別優(yōu)選這些大小的涂布顆粒。顆粒無論是“裸露的”還是“涂布的”狀態(tài)，都優(yōu)選具有的直徑不會(huì)導(dǎo)致顆粒本身吸收用于分光光度進(jìn)行測(cè)定的光的波長(zhǎng)。因此，涂布納米顆粒的懸浮液大致(例如基本上) 為透明的，直至由鈣衛(wèi)蛋白誘導(dǎo)的聚集體形成出現(xiàn)以導(dǎo)致形成的聚集體具有更大直徑。這種聚集體能夠吸收分光光度計(jì)所使用的光的波長(zhǎng)。此外，優(yōu)選顆?；旧洗笮∠嗤?，并且，更具體地說全部具有相同直徑。優(yōu)選使用單分散金屬(例如金)或聚合物顆粒。單分散聚合物顆粒購自Dynal Biotech AS, Oslo, 挪威。雖然不限于任何理論，但可能是應(yīng)用固定的抗體或抗體片段通過增加任何由鈣衛(wèi)蛋白衍生得到的不透明位點(diǎn)的大小而增加了檢測(cè)的靈敏度，并因此增加了從中散射的量。 通過使用基本上具有相同大小的固體載體或基質(zhì)(例如納米顆粒)，可以進(jìn)一步提高濁度檢測(cè)法檢測(cè)的靈敏度。在常規(guī)的濁度檢測(cè)法中，通常優(yōu)選向洗脫物中加入聚合乳濁化增強(qiáng)劑，例如聚乙二醇。在進(jìn)行濁度測(cè)定之前，可以將流分、抗體或抗體片段，優(yōu)選與納米顆粒結(jié)合，以及任選地增強(qiáng)劑在室溫下孵化較短的時(shí)間，例如5分鐘 I小時(shí)，優(yōu)選大約10分鐘。任選地， 在使用濁度法技術(shù)測(cè)定鈣衛(wèi)蛋白的濃度的過程中，可以使用運(yùn)動(dòng)讀數(shù)模式。在乳濁測(cè)定中所使用的光應(yīng)當(dāng)具有合適的波長(zhǎng)，例如300 600nm。在這一點(diǎn)上， 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用300 450nm的過濾器,優(yōu)選340nm或405nm的過濾具有特別好的效果。使用560nm過濾器也可以具有特別好的結(jié)果。通常，除了測(cè)樣品之外，在實(shí)施檢測(cè)方法時(shí)，還將檢測(cè)含有已知鈣衛(wèi)蛋白含量的校準(zhǔn)樣品。這種測(cè)試可被用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，而根據(jù)該曲線可以測(cè)定所測(cè)試的樣品的鈣衛(wèi)蛋白的含量。優(yōu)選使用鈣衛(wèi)蛋白的含量至多為5000mg/L(例如1500、1000、750、250、100)或者至多為100mg/L(例如75、50、25、5、l.(^P0.5mg/L)的鈣衛(wèi)蛋白樣品。更優(yōu)選鈣衛(wèi)蛋白樣品的鈣衛(wèi)蛋白含量至多為I Omg/L (例如10、8、6、4、2mg/L)，更優(yōu)選至多5mg/L (5、4. 5、4、
3.5、3、2· 5、2、1· 5、1、0· 5mg/L)。上述用于檢測(cè)鈣衛(wèi)蛋白的濁度檢測(cè)法令人吃驚地可靠、快捷、廉價(jià)、易行和易于自動(dòng)化。這與當(dāng)前可用的相對(duì)復(fù)雜、且不能直接被診斷實(shí)驗(yàn)室所通常使用的自動(dòng)化多任務(wù)診斷機(jī)器進(jìn)行應(yīng)用的檢測(cè)方法相比形成了鮮明的對(duì)照。當(dāng)涉及許多混合、添加和/或稀釋步驟時(shí)，自動(dòng)化是特別需要的，因?yàn)檫@可以實(shí)現(xiàn)更高程度的精確度。也可以使用機(jī)器人以得到更高水平的可靠性和/或重現(xiàn)性。自動(dòng)化還提聞了處理量。然而現(xiàn)有的可以提供合理的精確度的檢測(cè)方法(例如ELISA)難以自動(dòng)化。這至少是部分因?yàn)樗鼈兺ǔＩ婕岸鄠€(gè)洗滌和分離步驟(例如附著到固體表面)，并且非均相過程的自動(dòng)化通常是困難的。此外，這些方法通常涉及相對(duì)大量的步驟，這又增加了任何自動(dòng)化過程的復(fù)雜性。其它的測(cè)定鈣衛(wèi)蛋白的常規(guī)方法(例如濁度法)提供了較高的精確度但是需要專門的設(shè)備實(shí)施測(cè)量。而專門的設(shè)備通常不易被結(jié)合到自動(dòng)化過程中。實(shí)際上，一直需要一種用于診斷技術(shù)的廉價(jià)、可靠、快捷和易行的鈣衛(wèi)蛋白檢測(cè)方法。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于測(cè)定含鈣衛(wèi)蛋白體液中的鈣衛(wèi)蛋白的檢測(cè)方法，所述的方法包括(a)獲得所述體液的、或者來自所述體液的含鈣衛(wèi)蛋白的液體樣品；(b)將所述體液的所述樣品與任選地與納米顆粒結(jié)合的、抗鈣衛(wèi)蛋白抗體或抗體片段接觸，以結(jié)合所述的鈣衛(wèi)蛋白；(C)任選地，加入一個(gè)不透明度增強(qiáng)劑；和(d)通過濁度測(cè)定法測(cè)定鈣衛(wèi)蛋白含量。這種檢測(cè)可被用于各種疾病狀況的診斷，所述疾病狀況的特征在于不正常水平 (例如高水平)的鈣衛(wèi)蛋白。這類疾病狀況包括風(fēng)濕性疾病(例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡)、斯耶格倫氏綜合癥、眼內(nèi)炎癥、囊性纖維化、急性與慢性肺疾病、肺癌瘤(鱗狀細(xì)胞)、肺癌、結(jié)腸直腸癌、炎癥性腸病、胃癌、結(jié)腸直腸腺瘤或癌、克隆氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、胃腸粘膜炎、尿路結(jié)石、酒精性肝臟病、口腔粘膜炎性疾病、CNS炎性疾病(例如多發(fā)性硬化與急性腦炎)、HIV感染、HIV感染病人的繼發(fā)CNS感染、尿路感染、 膀胱炎、腎盂腎炎、內(nèi)源性后葡萄膜炎、血液疾病(例如白血病)、發(fā)熱性疾病(感染性的與非感染性的)、急性心肌梗塞與分離輸血。因此，從另一個(gè)方面來看，本發(fā)明提供了一種診斷上述任何疾病的方法，其包括前文所述的方法，并隨后將所述的鈣衛(wèi)蛋白含量與預(yù)定的閾值比較。表示任何特定疾病狀態(tài)的閾值可通過任何本領(lǐng)域已知的方法加以測(cè)定。優(yōu)選該方法用于CVD的診斷。用于濁度檢測(cè)法中人體樣品可以是任何含鈣衛(wèi)蛋白的樣品，例如體液或者組織樣品，或者懸浮液等。優(yōu)選該樣品為體液，例如尿液、腦脊液、口腔液、滑液或膿液，或更優(yōu)選血液或血液衍生的樣品。在這種情況下(即，使用血液或者血液衍生的樣品)，用于分析的樣品優(yōu)選為無細(xì)胞的(例如血清或血漿)?；蛘呖梢允桥判刮?。人體樣品優(yōu)選選自對(duì)所診斷的疾病提供最大靈敏度指示的。因此，血液、血漿或血清可被同時(shí)用于診斷感染(例如HIV、細(xì)菌感染)、風(fēng)濕性疾病、白血病等，在診斷與胃腸道相關(guān)的疾病(例如克隆氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸直腸癌)的過程中可以測(cè)試排泄物。從另一個(gè)方面看，本發(fā)明提供一種用于本發(fā)明的診斷性濁度檢測(cè)法的試劑盒，所述試劑盒包含優(yōu)選一種已知濃度的鈣衛(wèi)蛋白溶液，并更優(yōu)選具有鈣衛(wèi)蛋白濃度范圍的一組這類溶液；一個(gè)或多個(gè)抗鈣衛(wèi)蛋白抗體或抗體片段，任選地固定在固體載體(例如納米顆粒)上；優(yōu)選透光容器；優(yōu)選乳濁化增強(qiáng)劑；和優(yōu)選檢測(cè)器。如果需要，可以安裝一個(gè)自動(dòng)化裝置以接收含鈣衛(wèi)蛋白體液樣品；以將該抗鈣衛(wèi)蛋白抗體或抗體片段施加到，任選地固定到載體(例如納米顆粒)上；以任選地施加乳濁化增強(qiáng)劑；并以估計(jì)鈣衛(wèi)蛋白含量。相信這樣的裝置也落入了本發(fā)明的范圍內(nèi)。現(xiàn)在，參照下面非限制性的實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，其中


圖I為在200個(gè)受試宿主中的鈣衛(wèi)蛋白的分布曲線。圖I的概括統(tǒng)計(jì)如下Anderson-Darling 正態(tài)檢驗(yàn)

A2:8.160P-值0.000平均值0.403標(biāo)準(zhǔn)偏差0.238方差0.057偏度1.679峰度3.302N199最小值0.070第一四分值0.240中值0.340第三四分值0.500最大值1.370Mu的95 %置信區(qū)間0.3700.436Sigma的95 %置信區(qū)間0.2170.264中值的95%置信區(qū)間0.3100.370
圖2為200個(gè)測(cè)試宿主中的鈣分?jǐn)?shù)的分布曲線。表2的概括統(tǒng)計(jì)如下 Anderson-Darling 正態(tài)檢驗(yàn)A2:25.037
P-值0.000
平均值217.060
標(biāo)準(zhǔn)偏差399.000
方差159201
偏度3.462
峰度15.341
N200
最小值0.00
第一四分值0.00
中值78.00
第三四分值259.25
最大值2794.00
Mu的95 %置信區(qū)間161.42
272.70
Sigma的95 %置信區(qū)間363.35
442.46
中值的95%置信區(qū)間0.00
117.33圖3為200個(gè)測(cè)試宿主中的hsCRP的分布曲線。表3的概括統(tǒng)計(jì)如下Anderson-Darling 正態(tài)檢驗(yàn)
A2:21.221
P-值0.000
平均值2.331
標(biāo)準(zhǔn)偏差2.970
方差8.819
偏度2.243
峰度5.103
N197
最小值0.150
第一四分值0.540
中值1.150
第三四分值2.580
最大值16.30
Mu的95%置信區(qū)間1.913
2.748
Sigma的95 %置信區(qū)間2.703
3.296
中值的95%置信區(qū)間0.933
1.375圖4為200個(gè)測(cè)試宿主中的高半胱氨酸的分布曲線。表4的概括統(tǒng)計(jì)如下Anderson-Darling 正態(tài)檢驗(yàn)
A2:2.535
P-值0.000
平均值8.391
標(biāo)準(zhǔn)偏差1.966
偏差3.867
偏度0.875
峰度0.730
N199
最小值5.100
第一四分值7.100
中值8.100
第三四分值9.600最大值
Mu的95 %置信區(qū)間
8.117
15.300
8.666
Sigma的95 %置信區(qū)間
1.790
2.181
中值的95%置信區(qū)間
7.620
8.400圖5為鈣陽性結(jié)果和鈣陰性結(jié)果之間的鈣衛(wèi)蛋白的分布的點(diǎn)圖；和圖6和7分別為全部200個(gè)測(cè)試宿主和男性測(cè)試宿主的鈣衛(wèi)蛋白和hsCRP的ROC 曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :抗鈣衛(wèi)蛋白抗體(a)鈣衛(wèi)蛋白的分離可以按照如US-A-4，833，074 (Fagerhol)的實(shí)施例I和2所述的方法分離鈣衛(wèi)蛋白?；蛘呖梢詮娜祟愌磷攸S層純化鈣衛(wèi)蛋白。將EDTA(50mM，pH 7)加入的細(xì)胞中制得2. 5mM EDTA的細(xì)胞懸浮液。然后將細(xì)胞在160mM氯化銨/IOmM碳酸氫鈉中洗3分鐘并在4°C溫度下離心(160xg)10分鐘。在EDTA(2.5mM)/NaCl(150mM)中洗所得的片狀沉淀物 (pellet)，并在4°C溫度下再離心分離(55xg)10分鐘。然后將該片狀沉淀物懸浮于pH 7.4 的O. 625mM EDTA/18. 75mM巴比妥中，并在_70°C溫度下冷凍至少24小時(shí)。隨后解凍，將所得的材料離心分離(在3700xg)30分鐘，然后除去上清液并過濾(使用Millipore制造的O. 45 μ m過濾器)，然后將其裝填在DEAE ( 二乙氨基乙基) 瓊脂糖凝膠離子交換柱(Pharmacia制造)上，所述柱為由結(jié)合緩沖液(例如O. 63mM EDTA/18. 75mM巴比妥，pH 7.4)預(yù)先準(zhǔn)備的。任何非結(jié)合性材料流過柱子并被洗脫出來。 一旦全部的非結(jié)合性材料從柱中洗脫出來，就使用含鈣洗脫緩沖液(例如75mM巴比妥緩沖液/IOmM CaCl2)洗脫純鈣衛(wèi)蛋白。每個(gè)血沉棕黃層中得到大約25mg鈣衛(wèi)蛋白。(b)抗鈣衛(wèi)蛋白抗體的制備可以按照如US-A-4, 833，074(Fagerhol)實(shí)施例3所述的方法制備抗I丐衛(wèi)蛋白抗體。作為選擇可以制備雞蛋多克隆。每14天4次(或者2個(gè)月)，然后每月I次向小雞注射包含鈣衛(wèi)蛋白(O. 5mg/ml)和弗氏佐劑的溶液。12星期之后，可以收集該鈣衛(wèi)蛋白注入的小雞的雞蛋，并除去它們的蛋黃(不含膜)。在HCl (5mM)中稀釋后，離心分離蛋黃并收集上清液。然后過濾上清液并使用飽和硫酸銨處理使得最終的濃度達(dá)到3. SM。離心分離該混合物并收集所得到的沉淀，并將其溶于緩沖液中(O. IlM乙酸鈉、O. 15M NaCUpH 7.4)。 最后使用孔徑為10，OOOkD的薄膜透析所得到的溶液并然后使用親和色譜法精制。通常用作親和色譜的柱子包括琥珀酰亞胺活化瓊脂糖凝膠的活化基質(zhì)(Amersham-Pharmacia制造的HiTrap NHS activated),該基質(zhì)適合用于I丐衛(wèi)蛋白的固定。 更具體地說，該活化的樹脂在PH為7 8的條件下與鈣衛(wèi)蛋白中的游離胺自發(fā)地反應(yīng)。對(duì)于色譜分離，在施加到色譜柱中之前，通常將透析溶液在PBS中稀釋至大約3mg/ml的濃度。 隨后使用溶于冰凍PBS的6M脲或O. IM的檸檬酸鈉溶液pH 3. O洗脫該抗鈣衛(wèi)蛋白抗體。優(yōu)選使用O. IM的檸檬酸鈉溶液。洗脫后，立即稀釋該含抗鈣衛(wèi)蛋白抗體的餾分并在PBS中透析。實(shí)施例2 丐衛(wèi)蛋白的濁度檢測(cè)(a)抗生物素蛋白涂布的納米顆粒的制備使用孔徑為10，OOOkD的薄膜對(duì)購自美國Interfacial Dynamic公司的600 μ m的
4.2% w/v氯甲基活化的納米顆粒(直徑44nm)相對(duì)于水進(jìn)行透析。然后加入pH 9. O的 O. 5ml的硼酸鹽(IOmM)和氯化鈉(15mM)溶液并混合。然后加入IOmg抗生物素蛋白(購自 Pierce Chemical Company)并在室溫下攪拌24小時(shí),所述抗生物素蛋白溶于pH 9的0.5ml 的IOmM硼酸鹽和15mMNaCl溶液。然后加入40 μ I的甘氨酸溶液(2Μ，ρΗ 9. O)并在室溫下進(jìn)一步攪拌該混合物4小時(shí)。然后將該顆粒稀釋到IOOOml的體積，并首先在500ml的pH 9. O的IOmM的硼酸鹽和15mM氯化鈉溶液中，然后在pH 7. 4的25mM的Tris、150mM氯化鈉和O. 01% Tween 20 溶液(購自美國Sigma公司)中，使用Pellicon XL過濾器(截?cái)?cut off) 300, 000)和 labscale TTF系統(tǒng)(Millipore制造)按照儀器供應(yīng)商的說明進(jìn)行透析過濾。最后通過離心分離和在25mM TRIS、150mM氯化鈉和O. 01% Tween 20溶液中再懸浮該顆粒得到所需要的濃度的抗生物素蛋白涂布的納米顆粒?？梢酝ㄟ^緩慢離心將在此制備過程中所形成的任何聚集體除去。(b)使用抗生物素蛋白涂布的納米顆粒的鈣衛(wèi)蛋白的檢測(cè)具有濃度為每毫升大約O. 30mg上述抗生物素蛋白涂層納米顆粒的懸浮液是通過上述制劑在 pH 7.4的25禮 TRIS、150mM NaCl.O. 1% Tween 20 和 2% PEG 6000 溶液 (購自Sigma公司)中的離心分離和再懸浮來制備的。在記錄式分光光度計(jì)(例如島津 UV-160)的記錄石英透明容器中，將500 μ I的該顆粒懸浮液與取自測(cè)試CVD傾向性的宿主的血漿樣品(大約20 μ I)混合。記錄340nm的單色光的吸收，并且在60秒之后，將75 μ g 經(jīng)O. 15nmol生物素(例如購自挪威Norwegian Antibodies AS的生物素標(biāo)記親和精制卵多克隆)標(biāo)記的、且在 50 μ I 的 pH 7. 4 的 25mM TRIS、150mM NaCl 和 O. 1% Tween 20 溶液中稀釋的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體加入到石英容器中并混合。然后使用包含PH7. 4的25mM TRIS、 150mM NaCl和O. 1% Tween 20參比池立即記錄340nm單色光的吸收，并每隔一定間隔 (例如每2分鐘)再次測(cè)定，直至經(jīng)過大約15分鐘。按照運(yùn)動(dòng)模式的標(biāo)準(zhǔn)濁度計(jì)讀數(shù)或“終點(diǎn)”讀數(shù)計(jì)算在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的吸收的增加。也就是說，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的吸光率的增加是相對(duì)于在加入抗體涂布的納米顆粒之前和/或在記錄的末尾的讀數(shù)來計(jì)算的。鈣衛(wèi)蛋白曲線是通過使用具有已知鈣衛(wèi)蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相同的步驟得到的。然后可以從鈣衛(wèi)蛋白曲線計(jì)算樣品中的鈣衛(wèi)蛋白濃度。實(shí)施例3 :作為選擇的鈣衛(wèi)蛋白的濁度檢測(cè)(a)抗鈣衛(wèi)蛋白抗體涂層納米顆粒的制備使用孔徑為10, OOOkD的薄膜對(duì)購自美國Interfacial Dynamic公司的Iml的4.2% w/v氯甲基活化的納米顆粒(直徑44nm)相對(duì)于水進(jìn)行透析。然后加入O. 5ml的 pH 9. O的IOmM硼酸鹽和15mM氯化鈉溶液。將27mg精制的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體(例如購自 Norwegian Antibodies AS的親和精制卵多克隆抗體)相對(duì)于pH 9.0的IOmM硼酸鹽和 15mM氯化鈉溶液進(jìn)行透析。接著將納米顆粒加入到該精制的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體中，并在室溫下攪拌該混合物24 小時(shí)。然后加入40 μ I的甘氨酸溶液(在pH 9. O下為2M)并在室溫下進(jìn)一步攪拌該混合物4小時(shí)。然后將該顆粒稀釋到IOOOml的總體積，并在IOOOml加入了 O. 01 % Tween 20 和3mg/ml卵白蛋白的pH 9. O的IOmM硼酸鹽和15mM氯化鈉溶液中，使用Pellicon XL過濾器(截止300，000)和labscale TTF系統(tǒng)(Millipore制造)按照儀器供應(yīng)商的說明進(jìn)行透析過濾。最后通過溶液中顆粒的離心分離和再懸浮得到所需要濃度的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體涂布的納米顆粒?？梢酝ㄟ^緩慢離心將在此制備過程中所形成的任何聚集體除去。(b)使用抗鈣衛(wèi)蛋白抗體涂布的納米顆粒的鈣衛(wèi)蛋白的檢測(cè)制備懸浮液，其包含溶于50μ I的pH 9. O的IOmM硼酸鹽、15mM NaCUO. I % Tween 20、3g/l卵白蛋白溶液中400 μ g上述抗體涂布的納米顆粒。同時(shí)，將溶于500μ I檢驗(yàn)緩沖液(從Sigma公司購得的pH 7. 4的25mMTRIS、150mM NaCl,O. 1% Tween 20和2% PEG 6000)的20 μ I取自接受CVD可能性測(cè)試的宿主的血漿放入記錄式分光光度計(jì)(例如島津UV-160)的記錄石英池中，并測(cè)量對(duì)340nm單色光的吸光率。60秒之后，加入包含400 μ g抗體涂布的納米顆粒的上述懸浮液，并在池中混合。 在加入抗體涂布的納米顆粒之后立即記錄吸光率，并每隔一定間隔(例如每2分鐘)再次記錄直至經(jīng)過大約15分鐘。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的吸光率的增加是相對(duì)于在加入抗體涂布的納米顆粒之前和/或在記錄的末尾的讀數(shù)來計(jì)算的。換句話說，得到在運(yùn)動(dòng)模式中的濁度計(jì)讀數(shù)和“終點(diǎn)”讀數(shù)。鈣衛(wèi)蛋白曲線也是通過使用具有已知鈣衛(wèi)蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相同的步驟得到的。然后可以從該曲線計(jì)算樣品中的鈣衛(wèi)蛋白濃度。實(shí)施例4 :作為選擇的鈣衛(wèi)蛋白的濁度檢測(cè)法(a)抗生蛋白鏈菌素涂布的納米顆粒的制備使用孔徑為10，OOOkD的薄膜對(duì)購自美國Interfacial Dynamic公司的600 μ m的
4.2% w/v氯甲基活化的納米顆粒(直徑67nm)相對(duì)于水進(jìn)行透析。將O. 5ml的pH 7. 4的磷酸鹽(IOmM)和氯化鈉(150mM)緩沖溶液，與溶于O. 5ml的pH 7. 4的IOmM磷酸和150mM NaCl緩沖溶液(購自Pierce Chemical Company)的IOmg抗生蛋白鏈菌素一起加入,并在室溫下攪拌該混合物24小時(shí)。然后加入40 μ I的甘氨酸溶液(2Μ，ρΗ 9. O)，并在室溫下進(jìn)一步攪拌該混合物4小時(shí)。然后將該顆粒稀釋到IOOml的體積，并首先在500ml的pH 9. O的IOmM硼酸鹽和 15mM氯化鈉溶液中，然后在pH 7. 4的25mM的Tris、150mM氯化鈉和O. 01% Tween 20 溶液(購自美國Sigma公司)中，使用Pellicon XL過濾器(截止300，000)和labscale labscale TTF系統(tǒng)(Millipore制造)按照儀器供應(yīng)商的說明進(jìn)行透析過濾。最后通過離心分離和在25mM TRIS、150mM氯化鈉和O. 01% Tween 20溶液中再懸浮該顆粒得到所需要的濃度的抗生物素蛋白涂布的納米顆粒?？梢酝ㄟ^緩慢離心將在此制備過程中所形成的任何聚集體除去。通過挪威Sinteff AS測(cè)得抗生蛋白鏈菌素涂布的納米顆粒的的平均粒徑為 82nm。(b)使用抗生蛋白鏈菌素涂布的納米顆粒的鈣衛(wèi)蛋白的檢測(cè)濃度為每毫升約O. 60mg上述抗生物素蛋白涂層納米顆粒的懸浮液是通過上述制劑在 pH 7.4 的 25mM TRIS、150mM NaCl.O. 1% Tween 20 和 I % PEG 6000 溶液(購自 Sigma公司)中的離心分離和再懸浮來制備的。將500 μ I該顆粒懸浮液與取自CVD傾向性的宿主的血漿樣品(大約5 μ I)在一個(gè)記錄式分光光度計(jì)(例如島津UV-160)的記錄石英池中混合。記錄560nm的單色光的吸收,并且在60秒之后,將75 μ g經(jīng)O. 15nmol生物素 (例如購自挪威Norwegian Antibodies AS的生物素標(biāo)記親和精制卵多克隆)標(biāo)記的,且在 50 μ I的pH 7. 4的25mM TRIS、150mM NaCl和O. 1% Tween 20溶液中稀釋的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體加入到石英容器中并混合。然后使用包含PH 7.4的25mMTRIS、150mM NaCl和O. 1% Tween 20參比池立即記錄340nm單色光的吸收，并每隔一定間隔(例如每2分鐘)再次測(cè)定，直至經(jīng)過大約15分鐘。按照運(yùn)動(dòng)模式的標(biāo)準(zhǔn)濁度計(jì)讀數(shù)或“終點(diǎn)”讀數(shù)計(jì)算在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的吸收的增加。也就是說，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的吸光率的增加是相對(duì)于在加入抗體涂布的納米顆粒之前和/或在記錄的末尾的讀數(shù)來計(jì)算的。鈣衛(wèi)蛋白曲線是通過使用具有已知鈣衛(wèi)蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相同的步驟得到的。然后可以從該鈣衛(wèi)蛋白曲線計(jì)算樣品中的鈣衛(wèi)蛋白濃度。實(shí)施例5:(a)抗鈣衛(wèi)蛋白抗體涂布的納米顆粒的制備使用孔徑為10. OOOkD的薄膜對(duì)購自美國Interfacial Dynamic公司的Iml的
4.2% w/v氯甲基活化的納米顆粒(平均直徑67nm)相對(duì)于水進(jìn)行透析，然后使用水稀釋至 10ml。將27mg精制的卵多克隆抗體抗體(例購自Norwegian Antibodies AS的親和精制的卵多克隆抗體)相對(duì)于IOmM硼酸鹽和15mM氯化鈉緩沖溶液進(jìn)行透析，并最后在相同的 pH 9. O的IOmM硼酸鹽和15mM氯化鈉溶液中稀釋至6ml。在攪拌條件下，將該顆粒與抗體混合，并在室溫下持續(xù)攪拌24小時(shí)。然后加入 40 μ I的甘氨酸溶液(2Μ，pH 9. 0)，并在室溫下進(jìn)一步攪拌該混合物4小時(shí)。然后將該顆粒在加入了 0. 01% Tween 20和3mg/ml卵白蛋白的IOmM硼酸鹽、 15mM氯化鈉緩沖液中稀釋到的IOOml的總體積，并相對(duì)于1000ml所述的加入了 0.01% Tween 20和3mg/ml卵白蛋白的硼酸鹽/氯化鈉緩沖液，使用Pellicon XL過濾器(截止300，000)和labscale TTF系統(tǒng)(Millipore制造)按照儀器供應(yīng)商的說明進(jìn)行透析過濾，最后將顆粒濃縮至40 IOOml的體積。通過挪威Sinteff AS測(cè)得所得到的顆粒的平均直徑為81nm。(b)使用抗鈣衛(wèi)蛋白抗體涂布的納米顆粒的鈣衛(wèi)蛋白的檢測(cè)在pH 8.0的0.25禮 TRIS、0. 15M NaCl 和 0. 1% Tween 中，制備 0. 7mg/ml 的上述抗鈣衛(wèi)蛋白抗體涂布顆粒的懸浮液。在記錄式分光光度計(jì)(例如島津UV-160)的記錄石英池中將5 μ I的取自CVD宿主的血漿樣品溶于檢驗(yàn)緩沖液(460 μ I的25mM TRIS、150mM NaCl、0. 1% Tween、I. 0%聚乙二醇6000、pH= 7· 4)，并測(cè)量560nm單色光的吸光率。60秒后，加入100 μ I包含0. 7mg/ml的抗體涂布的納米顆粒的懸浮液，并在池中混合。在加入抗體涂布的納米顆粒之前或加入之后立即記錄吸光率，并每隔一定間隔(例如每20秒)再次記錄，直至經(jīng)過大約15分鐘。 也就是說，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的吸光率的增加是相對(duì)于在加入抗體涂布的納米顆粒之前和/ 或在記錄的末尾的讀數(shù)來計(jì)算的。換句話說，得到在運(yùn)動(dòng)模式中的濁度計(jì)讀數(shù)和/或“終點(diǎn)”讀數(shù)。鈣衛(wèi)蛋白曲線液是通過使用具有已知鈣衛(wèi)蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相同的步驟得到的。然后可從該曲線計(jì)算樣品中的鈣衛(wèi)蛋白濃度。實(shí)施例6:統(tǒng)計(jì)分析鈣衛(wèi)蛋白及其它用于檢測(cè)患CVD可能性或患CVD傾向性的標(biāo)記子的比較已經(jīng)表明冠狀動(dòng)脈鈣化與CVD的出現(xiàn)具有強(qiáng)烈的關(guān)聯(lián)，并且還已經(jīng)公開了用于預(yù)測(cè)CVD可能性(例如心肌梗塞或中風(fēng))有用的方法。冠狀動(dòng)脈鈣化的程度是使用電子束計(jì)算機(jī)斷層分析(EBCT)定量測(cè)定的并且是通過鈣分?jǐn)?shù)(CS)來表示的。一個(gè)高的鈣分?jǐn)?shù)表示高水平的鈣化并且表示導(dǎo)致心血管疾病 (CVD)的高風(fēng)險(xiǎn)。在下面的研究中，對(duì)200個(gè)年齡在45歲或以上的宿主的CS (100個(gè)CS < 100的對(duì)照組和100個(gè)CS > 100的病例)進(jìn)行了測(cè)試，同時(shí)還測(cè)試了他們的鈣衛(wèi)蛋白、CRP和高半胱氨酸血漿或血清水平。宿主為經(jīng)本人或醫(yī)師判斷為無癥狀的個(gè)體并且在此前2年內(nèi)(通常為6個(gè)月之內(nèi))進(jìn)行過EBCT掃描以測(cè)量他們的血漿或者血清中的鈣衛(wèi)蛋白、CRP和高半胱氨酸濃度。方法鈣衛(wèi)蛋白通過Calpreste 測(cè)試(意大利Eurospital 發(fā)布)測(cè)定鈣衛(wèi)蛋白，并且使用標(biāo)
準(zhǔn)偏差、中值、最小值和最大值總結(jié)病人和對(duì)照組的數(shù)據(jù)。計(jì)算中值的95%置信區(qū)間。使用 Anderson-Darling計(jì)算進(jìn)行正態(tài)測(cè)試。還通過使用相同的概括統(tǒng)計(jì)來通過性別概括鈣衛(wèi)蛋白。鈣分?jǐn)?shù)(CS)鈣分?jǐn)?shù)是通過電子束計(jì)算斷層分析(EBCT)掃描來測(cè)定的。總結(jié)了病例和對(duì)照組的數(shù)據(jù)。高靈敏度的C-反應(yīng)蛋白(hsCRP)通過Dade Behring 的 “N 高靈敏度 CRP” 檢測(cè)法(Roberts 等，Clinical Chemistry, 2000,46 :4，第461-468頁)測(cè)定hsCRP。使用平均、標(biāo)準(zhǔn)偏差、中值、最小值和最大值總結(jié)病人和對(duì)照組的數(shù)據(jù)。高半胱氨酸(Hyc)通過AbbottIMx方法(Shipchandler,Μ· Τ·和Moore E. G. ,Clinical Chemistry, 1995,41 :7，第991-994頁)測(cè)量血漿高半胱氨酸(Hcy) 0使用平均、標(biāo)準(zhǔn)偏差、中值、最小值和最大值總結(jié)病人和對(duì)照組的數(shù)據(jù)。CS和鈣衛(wèi)蛋白、hsCRP、Hcy的比較⑴卡方值使用卡方值測(cè)試測(cè)量一對(duì)標(biāo)記子之間的協(xié)方差。
(ii)優(yōu)勢(shì)率使用2X2縱橫列表(即卡方值桌子)的優(yōu)勢(shì)率為兩個(gè)共變測(cè)試的機(jī)率對(duì)兩個(gè)不一致測(cè)試的機(jī)率的比例。因此，優(yōu)勢(shì)率可被解釋為兩個(gè)測(cè)試之間的相關(guān)幅度的測(cè)量。分別計(jì)算CS對(duì)鈣衛(wèi)蛋白、hsCRP和Hcy的優(yōu)勢(shì)率。標(biāo)記子的中值的比較(i) Mann-Whitney 測(cè)試這是用于測(cè)試如果兩個(gè)標(biāo)記子的值顯著不同的無參數(shù)(數(shù)據(jù)不需要為正態(tài)分布) 測(cè)試。微型表將兩組數(shù)據(jù)中的數(shù)據(jù)整齊排列，并制訂I為最低、200為最高。然后軟件將兩組等級(jí)分相加比較，并報(bào)告“P”值，其中“P”值表示隨機(jī)抽樣將導(dǎo)致中值遠(yuǎn)離試驗(yàn)觀測(cè)值的幾率。鈣衛(wèi)蛋白、hsCRP和Hcy中值與被分成病例和對(duì)照組的CS進(jìn)行比較，并且使用 Mann-Whitney測(cè)試法來測(cè)量顯著性。(ii)鈣衛(wèi)蛋白和鈣分?jǐn)?shù)的ROC曲線可以使用宿主操作特性(ROC)曲線分析來衡量該測(cè)試區(qū)分患病病例與正常病例的能力。ROC曲線分析被用于鈣衛(wèi)蛋白hsCRP，并作為這兩個(gè)標(biāo)記子的比較。使用11截止極限制得ROC曲線以計(jì)算靈敏度(Y軸)和I-特異性(X軸)。將對(duì)照組和病例組的數(shù)據(jù)混合在一起并從高到低進(jìn)行排序。在總?cè)后w和在男性群體上進(jìn)行分析。使用梯形規(guī)則計(jì)算ROC曲線下的面積。結(jié)果鈣衛(wèi)蛋白的概括統(tǒng)計(jì)圖I顯示了所測(cè)試的全部200個(gè)宿主的分布曲線下表I給出了對(duì)照組與病例組中的鈣衛(wèi)蛋白的概括統(tǒng)計(jì)。對(duì)照組中的中值鈣衛(wèi)蛋白濃度為O. 31mg/L，而在病例組中則為O. 38mg/L。在對(duì)照組中，男性的中值鈣衛(wèi)蛋白濃度為O. 31mg/L，而女性的則為O. 30mg/L。在病例組中男性的中值鈣衛(wèi)蛋白濃度為O. 39mg/L，而女性的則為O. 31mg/L。表I :鈣衛(wèi)蛋白的概括統(tǒng)計(jì)
權(quán)利要求
1.一種用于測(cè)定含鈣衛(wèi)蛋白體液中的鈣衛(wèi)蛋白的檢測(cè)方法，所述的方法包括如下步驟(a)獲得所述體液的、或者來自所述體液的含鈣衛(wèi)蛋白的液體樣品；(b)將所述體液的所述樣品與納米顆粒結(jié)合的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體或抗體片段接觸，以便結(jié)合所述的鈣衛(wèi)蛋白；和(C)通過濁度測(cè)定法測(cè)定鈣衛(wèi)蛋白含量，其中，抗體或抗體片段涂布的納米顆粒的直徑為65 140nm。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述抗體或抗體片段涂布的納米顆粒的直徑為75 120nmo
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述納米顆粒是單分散性的。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(b)和(c)中間加入不透明度的增強(qiáng)劑。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的體液選自血液、血清、血漿、尿液、 腦脊液、口腔液、滑液或膿液。
6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其以自動(dòng)化檢測(cè)的形式進(jìn)行實(shí)施。
7.納米顆粒結(jié)合的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體或抗體片段在制備用于檢測(cè)方法的含鈣衛(wèi)蛋白組合物中的用途，所述檢測(cè)方法用于診斷選自下述的疾病風(fēng)濕性疾病、斯耶格倫氏綜合癥、 眼內(nèi)炎癥、囊性纖維化、急性與慢性肺疾病、肺癌瘤、肺癌、結(jié)腸直腸癌、炎性腸病、胃癌、結(jié)腸直腸腺瘤或癌、克隆氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、胃腸粘膜炎、尿路結(jié)石、酒精性肝臟病、口腔粘膜炎性疾病、CNS炎性疾病、HIV感染、HIV感染病人的繼發(fā)CNS感染、尿路感染、膀胱炎、腎盂腎炎、內(nèi)源性后葡萄膜炎、血液疾病、感染性的發(fā)熱性疾病或非感染性的發(fā)熱性疾病、CVD、 急性心肌梗塞與分離輸血，其中，所述的鈣衛(wèi)蛋白在取自宿主的樣品中，并且所述方法包括用權(quán)利要求I的方法檢測(cè)鈣衛(wèi)蛋白在所述樣品中的濃度。
8.如權(quán)利要求7的用途，其中所述的疾病為CVD。
9.鈣衛(wèi)蛋白在制備用于檢測(cè)方法的含鈣衛(wèi)蛋白組合物中的用途，所述檢測(cè)方法用于診斷選自下述的疾病風(fēng)濕性疾病、斯耶格倫氏綜合癥、眼內(nèi)炎癥、囊性纖維化、急性與慢性肺疾病、肺癌瘤、肺癌、結(jié)腸直腸癌、炎性腸病、胃癌、結(jié)腸直腸腺瘤或癌、克隆氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、胃腸粘膜炎、尿路結(jié)石、酒精性肝臟病、口腔粘膜炎性疾病、CNS炎性疾病、HIV感染、 HIV感染病人的繼發(fā)CNS感染、尿路感染、膀胱炎、腎盂腎炎、內(nèi)源性后葡萄膜炎、血液疾病、 感染性的發(fā)熱性疾病或非感染性的發(fā)熱性疾病、CVD、急性心肌梗塞與分離輸血，其中，所述的鈣衛(wèi)蛋白在取自宿主的樣品中，并且所述方法包括用權(quán)利要求I的方法檢測(cè)鈣衛(wèi)蛋白在所述樣品中的濃度。
10.如權(quán)利要求9的用途，其中所述的疾病為CVD。
11.納米顆粒結(jié)合的抗鈣衛(wèi)蛋白抗體或抗體片段在制備用于檢測(cè)方法的含鈣衛(wèi)蛋白組合物中的用途，所述檢測(cè)方法用于檢測(cè)患CVD可能性或患CVD傾向性，其中所述鈣衛(wèi)蛋白在取自宿主的樣品中，所述方法包括測(cè)定在所述樣品中的鈣衛(wèi)蛋白濃度。
12.鈣衛(wèi)蛋白在制備用于檢測(cè)方法的含鈣衛(wèi)蛋白組合物中的用途，所述檢測(cè)方法用于檢測(cè)患CVD可能性或患CVD傾向性，其中所述鈣衛(wèi)蛋白在取自宿主的樣品中，所述方法包括測(cè)定在所述樣品中的鈣衛(wèi)蛋白濃度。
13.如權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述的樣品為體液，該體液選自血液、 血清、血漿、尿液、腦脊液、口腔液、滑液或膿液。
14.如權(quán)利要求13所述的用途，其中所述的樣品為血液。
15.如權(quán)利要求13所述的用途，其中所述的樣品為血清或血漿。
16.如權(quán)利要求14或15所述的方法，其中鈣衛(wèi)蛋白濃度閾值為O.45mg/L，在該閾值之上則表示有患CVD可能性或患CVD傾向性。
17.如權(quán)利要求6-16中任一項(xiàng)所述的用途，其還包括測(cè)定所述樣品中CVD第二標(biāo)記子的濃度。
18.如權(quán)利要求6-17中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述CVD為急性心肌梗塞。
19.如權(quán)利要求17所述的用途，其中所述第二標(biāo)記子為C-反應(yīng)蛋白。
20.如權(quán)利要求11-19中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述的鈣衛(wèi)蛋白濃度是通過濁度檢測(cè)法來測(cè)定的。
全文摘要
本發(fā)明涉及心血管疾病的檢測(cè)。一種在人或者非人類動(dòng)物宿主中檢測(cè)CVD可能性和CVD傾向性的檢測(cè)方法，所述的方法包括檢測(cè)取自所述宿主含鈣衛(wèi)蛋白樣品中的鈣衛(wèi)蛋白的濃度。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102608326SQ20121002071
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2003年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月20日
發(fā)明者厄林.森德雷黑根 申請(qǐng)人:阿克西斯-希爾德公司