專利名稱：一種孔狀生物傳感器、制作及應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物傳感器，特別是一種連孔狀結(jié)構(gòu)的生物傳感器，及該生物傳感器制作方法和應(yīng)用于生物醫(yī)療方面的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
生物傳感器利用生物活性物質(zhì)的親和性，如酶-底物、酶-輔基、抗原-抗體、激素-受體等的分子識(shí)別功能，可以有選擇地檢測(cè)待測(cè)物。由于生物活性物質(zhì)具有專一識(shí)別功能，使得生物傳感器具有較高的選擇性，能直接用于復(fù)雜樣品的檢測(cè)。生物傳感器已被廣泛地應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)、工業(yè)過程控制、環(huán)境檢測(cè)、化學(xué)物質(zhì)安全性評(píng)價(jià)以及食品，制藥等許多領(lǐng)域。在生物傳感器構(gòu)建中，其關(guān)鍵技術(shù)之一就是如何將生物分子穩(wěn)定、高活性地固定到換能器表面。納米材料，因其具有較大的表面積、高表面活性、強(qiáng)吸附力及高催化效率等優(yōu)異特性，可在增加生物分子(酶、抗原或抗體等)的吸附量和穩(wěn)定性的同時(shí)，提高生物分子(酶)的催化活性，提高傳感器的反應(yīng)靈敏度。氧化鋅納米材料，如氧化鋅納米梳，納米線等已成功應(yīng)用于生物傳感器的構(gòu)建(如尿酸，過氧化氫，葡萄糖傳感器等)，因?yàn)檠趸\納米材料有很好的生物兼容性，而且由于周圍有利的微環(huán)境，它們能很好地保持生物分子的活性，并且能增強(qiáng)活性位點(diǎn)和電極之間的電子轉(zhuǎn)移能力。氧化鋅具有較高的等電點(diǎn)，低等電點(diǎn)的生物分子(如葡萄糖氧化酶，尿酸酶等)可通過靜電作用吸附在高等電點(diǎn)的氧化鋅納米材料表面，起到固定生物活性物質(zhì)在電極表面的作用。基于氧化鋅納米材料的生物傳感器顯示出高靈敏度和快速反應(yīng)的特點(diǎn)，但是測(cè)定的線性范圍往往較小，限制了其應(yīng)用范圍，比如基于氧化鋅納米線的葡萄糖傳感器測(cè)定的線性范圍是O. 01 3. 45mM，但是正常的人體血糖含量卻在3. 5 6. ImM之間。而且隨著時(shí)間的推移，吸附在氧化鋅電極表面的生物分子的活性會(huì)降低，導(dǎo)致生物傳感器的靈敏度下降，穩(wěn)定性較差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的克服上述現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種具有連孔狀結(jié)構(gòu)的包裹層的生物傳感器，并提供一種該生物傳感器制作和應(yīng)用方法。本發(fā)明通過如下方案實(shí)現(xiàn)—種孔狀生物傳感器，依次具有基板、電極層、和聚合物薄膜層。基板電極傳感區(qū)域聚合物薄膜被去除，暴露的基板電極區(qū)域與聚合物薄膜層邊緣形成井狀結(jié)構(gòu)區(qū)陣列；呈連孔狀結(jié)構(gòu)的氧化鋅包裹層填充在各井狀結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)；帶負(fù)電的生物活性物質(zhì)分子通過靜電作用吸附在氧化鋅孔狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。呈連孔狀結(jié)構(gòu)的包裹層內(nèi)孔與孔之間的采用納米級(jí)的狹窄瓶頸結(jié)構(gòu)。生物活性物質(zhì)為酶、抗原或抗體等，聚合物薄膜層為聚二甲基硅氧烷。一種制作孔狀生物傳感器的方法，其特征在于包括步驟一，基板電極制作；
步驟二，將聚合物薄膜材料粘附在基板，并把電極傳感區(qū)域的聚合薄膜材料去除， 使底部的電極區(qū)域暴露出來，暴露的基板電極區(qū)域與聚合薄膜材料邊緣形成井狀結(jié)構(gòu)區(qū)陣列；步驟三，將聚苯乙烯微納米球狀模板多層整齊分布在基板電極上，聚苯乙烯微納米球體之間緊密相連，形成多孔相連狀的模板結(jié)構(gòu)；步驟四，用電沉積的方法在暴露的電極上沉積氧化鋅晶體，沉積的氧化鋅填充了井狀結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)聚苯乙烯微納米球體間的間隙；步驟五，將聚苯乙烯微納米球狀模板用化學(xué)腐蝕的方法去除，得到連孔狀結(jié)構(gòu)氧化鋒包裹層；步驟六，使生物活性物質(zhì)分子帶上負(fù)電，在氧化鋅包裹層的正電吸附作用和滲透原理，生物活性物質(zhì)分子進(jìn)入氧化鋅包裹層的連孔狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。作為優(yōu)化，所述的步驟一，傳統(tǒng)半導(dǎo)體工藝在基板上制備一層惰性金屬或石墨電極陣列，然后用光刻技術(shù)在玻璃基板上腐蝕出電極陣列圖案形成；所述的步驟二，所述聚合物薄膜材料為聚二甲基硅氧烷；所述的步驟三，將聚苯乙烯微球粉末與去離子水均勻混合得到親水膠體，然后將聚苯乙烯粉末親水膠體滴入井狀結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)，并經(jīng)水分蒸發(fā)形成多孔相連狀的模板結(jié)構(gòu)；所述的步驟五，將聚苯乙烯微納米球被苯溶液溶解去除，基板電極取出后反復(fù)用去離子水沖洗。另外，應(yīng)用本發(fā)明的孔狀生物傳感器進(jìn)行目標(biāo)分析物檢測(cè)時(shí)，先將孔狀生物傳感器浸入含有目標(biāo)分析物的溶液中，然后采用三電極體系，以孔狀生物傳感器電極為工作電極，以Ag/AgCl電極為參比電極，以白金Pt電極為輔助電極，檢測(cè)孔狀生物傳感器電極表面發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生的電流信號(hào)以檢測(cè)含有目標(biāo)分析物溶液的濃度。綜上所述本發(fā)明具有如下顯著特點(diǎn)和效果I).特殊的連孔狀結(jié)構(gòu)的氧化鋅包裹層可以將大量的生物活性物質(zhì)(酶、抗原或抗體等)穩(wěn)定、高活性地固定到電極表面上；由于具有有利的微孔環(huán)境，它們能很好地保持包裹在孔內(nèi)的生物活性物質(zhì)分子的活性，并且能增強(qiáng)生物活性物質(zhì)分子活性位點(diǎn)和電極之間的電子轉(zhuǎn)移能力。2).孔與孔之間的連接處是納米級(jí)的狹窄瓶頸結(jié)構(gòu)，包裹在孔內(nèi)的生物活性物質(zhì)不易從瓶頸處逸出；減緩了目標(biāo)分析物進(jìn)入孔內(nèi)的滲透速度，即使是在目標(biāo)分析物樣品濃度高的情況下，也能使目標(biāo)分析物進(jìn)入電極孔內(nèi)的滲透速度和孔內(nèi)的生物活性物質(zhì)的催化反應(yīng)速度保持一致，從而確保生物傳感器有較大的測(cè)定線性范圍。3).微孔結(jié)構(gòu)中可以存儲(chǔ)大量的生物活性物質(zhì)，即使一部分的生物活性物質(zhì)隨著時(shí)間的推移而失去活性，其剩余生物分子的生物活性也足以起到識(shí)別或催化的作用，使?jié)B入孔內(nèi)的目標(biāo)分析物全部參與氧化或還原反應(yīng)，將目標(biāo)物濃度轉(zhuǎn)換成可被檢測(cè)到的電流信號(hào)，確保了高靈敏性和穩(wěn)定性。


圖I孔狀生物傳感器制備流程及結(jié)構(gòu)示意圖；圖2孔狀生物傳感器電極及包裹層截面示意圖3采用循環(huán)伏安法舉例實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖；圖4電流信號(hào)與目標(biāo)分析物濃度的線性關(guān)系測(cè)試數(shù)據(jù)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述首先是孔狀生物傳感器的制作方法。參考圖1，制作孔狀生物傳感器主要包括如下步驟步驟一基板電極制作。電極材料可以用貴金屬、石墨等材料制作。以貴金屬電極制作為例，首先采用蒸發(fā)鍍膜設(shè)備在玻璃基板的表面沉積一層貴金屬，然后用光刻技術(shù)在玻璃基板上腐蝕出電極陣列圖案，每個(gè)電極通過基板上的導(dǎo)電連線與恒電位儀等伏安法分析電路相連。步驟二 聚合物薄膜層井狀結(jié)構(gòu)區(qū)陣列井陣列制作。將一層I毫米厚(可以根據(jù)需要選取其它厚度)的聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜貼附在基板表面，按照基板電極的圖案制作成PDMS井狀結(jié)構(gòu)區(qū)陣列，將電極區(qū)域暴露出來。(參考圖I)。步驟三將聚苯乙烯微納米球狀模板多層整齊有序地分布在基板電極上。所使用的模板球體需具有一致的直徑，在本實(shí)施例中，優(yōu)選方案，聚苯乙烯微納米球體具有I微米的均勻直徑(可以根據(jù)實(shí)際選取其它直徑)。聚苯乙烯微納米球呈現(xiàn)粉末狀態(tài)，為了方便操作，可以將O. 08克的聚苯乙烯微球粉末與20mL的去離子水均勻混合得到親水膠體。然后將聚苯乙烯粉末親水膠體滴入井狀結(jié)構(gòu)區(qū)中的電極表面上。為了讓聚苯乙烯微納米球均勻多層分布，將基板放在95°C的熱板上加速水分蒸發(fā)，而水分蒸發(fā)產(chǎn)生的表面張力使得每個(gè)聚苯乙烯微納米球都能與鄰近的微球體彼此相連，形成多孔相連狀的模板結(jié)構(gòu)(參考圖 I)。步驟四用電沉積的方法在暴露的電極上沉積氧化鋅晶體，沉積的氧化鋅填充了井狀結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)聚苯乙烯微納米球體間的間隙。具體為將排布了聚苯乙烯微納米球模板的電極基板浸入0.04mL Zn(N03)2的水溶液中，聚苯乙烯微球表面經(jīng)化學(xué)處理后呈現(xiàn)親水性， Zn (N03) 2溶液可以輕易地滲透進(jìn)分層排布的聚苯乙烯微球陣列的間隙之間。將一個(gè)白金 Pt電極作為基準(zhǔn)電極浸入在電解溶液中。將-IV的直流電壓加在基板電極上開始氧化鋅電化學(xué)沉積。氧化鋅從基板電極開始沉積，約半小時(shí)后，逐漸填滿聚苯乙烯微納米球狀模板之間的間隙(參考圖I)。步驟五去除聚苯乙烯微納米球狀模板，得到連孔狀結(jié)構(gòu)氧化鋅包裹層。具體為， 將沉積好氧化鋅的電極基板浸入甲苯溶液中，約24小時(shí)后，聚苯乙烯微納米球全部被化學(xué)腐蝕溶解在甲苯中，然后將基板電極取出，反復(fù)用去離子水沖洗干凈，再放在烘干爐中進(jìn)行干燥處理，得到具有多孔的連孔狀結(jié)構(gòu)氧化鋅包裹層(參考圖I和圖2)?？着c孔之間的采用納米級(jí)的狹窄瓶頸結(jié)構(gòu)(參考圖2)。步驟六使生物活性物質(zhì)分子帶上負(fù)電，在氧化鋅包裹層的正電吸附作用和滲透原理，生物活性物質(zhì)分子進(jìn)入氧化鋅包裹層的連孔狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。具體為，將生物活性物質(zhì)溶于 PH緩沖溶液，將溶液的pH值調(diào)至到適當(dāng)范圍(可以參考現(xiàn)有技術(shù)確定)，使得生物活性物質(zhì)分子有較好的活性，同時(shí)使生物活性物質(zhì)分子在溶液中帶上負(fù)電，而讓連孔狀氧化鋅表面帶上正電，通過靜電作用吸附作用將生物活性物質(zhì)分子包裹在氧化鋅孔狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。以制備葡萄糖傳感器中葡萄糖氧化酶GOx為例，在O. OlML磷酸鹽PBS緩沖液(pH7. 4)中混入葡萄糖氧化酶G0x(3900U/mL)，低等電點(diǎn)的GOx (IEP 4. 2)在(pH7. 4)的緩沖液中表面帶上負(fù)電荷。將制備好的葡萄糖氧化酶GOx溶液滴入孔狀電極井狀結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)，利用帶負(fù)電的葡萄糖氧化酶分子與帶正電的氧化鋅產(chǎn)生靜電吸附作用和滲透原理，將葡萄糖氧化酶GOx載入到電極孔狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。該過程需在適度的溫度(4°C )中進(jìn)行，以保證生物分子的活性，載入過程持續(xù)一天的時(shí)間。然后用磷酸鹽PBS緩沖液反復(fù)沖洗電極表面，去除未被載入孔內(nèi)的葡萄糖氧化酶分子。綜上所述，本制作孔狀生物傳感器步驟中，生物活性物質(zhì)、包裹層材料、聚合物薄膜層、電極等材料可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)選用等效或相近的材料，在不脫離本發(fā)明方案核心的等效替代應(yīng)屬于其保護(hù)范圍內(nèi)。一種孔狀生物傳感器，為上述步驟制作而形成的生物傳感器。首先，參考圖1，它自下至上，依次具有基板、電極層、和聚合物薄膜層。其中，基板電極傳感區(qū)域聚合物薄膜被去除后，暴露的基板電極區(qū)域與聚合物薄膜層邊緣形成井狀結(jié)構(gòu)區(qū)陣列；呈連孔狀結(jié)構(gòu)的氧化鋅包裹層被填充在各井狀結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)；帶負(fù)電的生物活性物質(zhì)分子通過靜電作用吸附在氧化鋅孔狀結(jié)構(gòu)內(nèi)形成。呈連孔狀結(jié)構(gòu)的氧化鋅包裹層內(nèi)，孔與孔之間的采用納米級(jí)的狹窄瓶頸結(jié)構(gòu)(參考圖2)。生物活性物質(zhì)可以為酶、抗原或抗體等，聚合物薄膜層可以為聚二甲基硅氧烷或等效替代材料?？谞钌飩鞲衅鲀?nèi)的生物活性物質(zhì)不同，可以制作形成不同功能的生物傳感器，如葡萄糖等。參考圖3和圖4，本發(fā)明的孔狀生物傳感器用在測(cè)量葡萄糖溶液濃度的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖。使用孔狀生物傳感器檢測(cè)目標(biāo)分析物的方法時(shí)，將孔狀生物傳感器浸入含有目標(biāo)分析物的溶液中，然后采用三電極體系，以孔狀生物傳感器電極為工作電極，以Ag/AgCl電極為參比電極，以白金Pt電極為輔助電極。當(dāng)加載在孔狀氧化鋅工作電極上的電壓大于O. IV 時(shí)，能檢測(cè)到明顯的氧化反應(yīng)電流。孔狀電極中氧化反應(yīng)電流大小隨著葡萄糖濃度的增加而增加，在峰電位基本不變的情況下，峰電流大小與葡萄糖的濃度呈線性增加的關(guān)系(見圖3和圖4)。實(shí)施例中的孔狀氧化鋅電極的葡萄糖孔狀生物傳感器具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性，比其他氧化鋅納米電極，如氧化鋅納米線和納米梳電極等具有更大的線性測(cè)定范圍?？谞钌飩鞲衅鱾鞲羞^程中，電極利用包裹在孔內(nèi)的葡萄糖氧化酶(GOx)的催化特性將葡萄糖(Glucose)氧化生成葡萄糖酸，同時(shí)葡萄糖氧化酶(GOx)中的黃素基團(tuán) (FAD)自身被還原成(FADH2)基團(tuán)，GOx(FADH2)基團(tuán)被溶液中溶解的氧氣分子再次氧化成 GOx(FAD)，在此過程中生成過氧化氫(H2O2)產(chǎn)物，過氧化氫(H2O2)在電極表面發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生的氧化電流信號(hào)用于表示溶液中葡萄糖的濃度。這樣通過檢測(cè)孔狀生物傳感器電極表面發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生的電流信號(hào)以檢測(cè)含有目標(biāo)分析物溶液的濃度。
權(quán)利要求
1.一種孔狀生物傳感器，其特征在于電極表面具有呈連孔狀結(jié)構(gòu)的包裹層。
2.如權(quán)利要求I所述的孔狀生物傳感器，其特征在于，生物活性物質(zhì)被吸附并存儲(chǔ)在包裹層的孔內(nèi)。
3.如權(quán)利要求3所述的孔狀生物傳感器，其特征在于，所述包裹層孔與孔之間的連接處是納米級(jí)的狹窄瓶頸結(jié)構(gòu)。
4.如權(quán)利要求I至3任一所述的孔狀生物傳感器，其特征在于，所述包裹層材料為氧化鋅。
5.如權(quán)利要求4所述的孔狀生物傳感器，其特征在于，依次具有基板、電極層、和聚合物薄膜層，基板電極傳感區(qū)域聚合物薄膜被去除，暴露的基板電極區(qū)域與聚合物薄膜層邊緣形成井狀結(jié)構(gòu)區(qū)陣列；呈連孔狀結(jié)構(gòu)的氧化鋅包裹層填充在各井狀結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)；生物活性物質(zhì)分子通過靜電作用吸附在氧化鋅孔狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。
6.如權(quán)利要求5所述的孔狀生物傳感器，其特征在于，所述生物活性物質(zhì)為酶、抗原、 抗體或適配體；所述聚合物薄膜層為聚二甲基硅氧烷。
7.一種制作孔狀生物傳感器的方法，其特征在于包括步驟一，基板電極制作；步驟二，將聚合物薄膜材料粘附在基板，并把電極傳感區(qū)域的聚合薄膜材料去除，使底部的電極區(qū)域暴露出來，暴露的基板電極區(qū)域與聚合薄膜材料邊緣形成井狀結(jié)構(gòu)區(qū)陣列；步驟三，將聚苯乙烯微納米球狀模板多層整齊分布在基板電極上，聚苯乙烯微納米球體之間緊密相連，形成多孔相連狀的模板結(jié)構(gòu)；步驟四，用電沉積的方法在暴露的電極上沉積氧化鋅晶體，沉積的氧化鋅填充了井狀結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)聚苯乙烯微納米球體間的間隙；步驟五，將聚苯乙烯微納米球狀模板用化學(xué)腐蝕的方法去除，得到連孔狀結(jié)構(gòu)氧化鋅包裹層；步驟六，使生物活性物質(zhì)分子帶上負(fù)電，在氧化鋅包裹層的正電吸附作用和滲透原理， 生物活性物質(zhì)分子進(jìn)入氧化鋅包裹層的連孔狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。
8.如權(quán)利要求7所述的制作孔狀生物傳感器的方法，其特征在于，所述的步驟一，基板電極制作，采用傳統(tǒng)半導(dǎo)體工藝在基板上制備一層惰性金屬或石墨電極陣列；所述的步驟二，所述聚合物薄膜材料為聚二甲基硅氧烷；所述的步驟三，將聚苯乙烯微球粉末與去離子水均勻混合得到親水膠體，然后將聚苯乙烯粉末親水膠體滴入井狀結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)，并經(jīng)水分蒸發(fā)形成多孔相連狀的模板結(jié)構(gòu)；所述的步驟五，將聚苯乙烯微納米球被苯溶液溶解去除，基板電極取出后反復(fù)用去離子水沖洗。
9.一種孔狀生物傳感器檢測(cè)目標(biāo)分析物的方法，其特征在于將孔狀生物傳感器浸入含有目標(biāo)分析物的溶液中，然后采用三電極體系，以孔狀生物傳感器電極為工作電極，以 Ag/AgCl電極為參比電極，以白金Pt電極為輔助電極，檢測(cè)孔狀生物傳感器電極表面發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生的電流信號(hào)以檢測(cè)含有目標(biāo)分析物溶液的濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開一種孔狀生物傳感器、制作及應(yīng)用方法，其中孔狀生物傳感器其特征在于依次具有基板、電極層、和聚合物薄膜層。基板電極傳感區(qū)域聚合物薄膜被去除，暴露的基板電極區(qū)域與聚合物薄膜層邊緣形成井狀結(jié)構(gòu)區(qū)陣列；呈連孔狀結(jié)構(gòu)的氧化鋅包裹層填充在各井狀結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)；帶負(fù)電的生物活性物質(zhì)分子通過靜電作用吸附在氧化鋅孔狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，呈連孔狀結(jié)構(gòu)的包裹層內(nèi)孔與孔之間的采用納米級(jí)的狹窄瓶頸結(jié)構(gòu)。
文檔編號(hào)G01N27/327GK102590308SQ20121002539
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月3日
發(fā)明者盧家賓, 游學(xué)秋, 王曉誠 申請(qǐng)人:游學(xué)秋