專(zhuān)利名稱(chēng)：一種慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因tmem2的突變蛋白、編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程及醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因TMEM2的突變蛋白、編碼基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
慢性乙型病毒性肝炎(慢性乙肝)是由乙型肝炎病毒(HBV)感染而引起的以肝臟損害為主要表現(xiàn)的傳染性疾病，是關(guān)系到我國(guó)乃至全球公共衛(wèi)生的重大疾病。宿主的遺傳背景在其易感性及免疫應(yīng)答中起重要作用。而人群對(duì)乙肝免疫力的高低存在明顯的個(gè)體差
已中國(guó)專(zhuān)利200810004159. 5公開(kāi)了一種與肝細(xì)胞癌相關(guān)的乙型肝炎病毒基因組標(biāo)志物以及預(yù)測(cè)HBV感染個(gè)體發(fā)展成肝細(xì)胞癌(HCC)的遺傳素因的試劑盒。該試劑盒包括一種或更多種探針，當(dāng)其與HBV基因組接觸時(shí)，如果所述基因組為T(mén)MEM2基因型、且包括至少一種對(duì)應(yīng)于某段核苷酸序列上的核苷酸(170C;和/或2170G2;和/或?qū)?1(;和/或799G) 時(shí)會(huì)選擇性地與所述基因組雜交。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因TMEM2突變蛋白。本發(fā)明的另一目的是提供上述慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因TMEM2突變蛋白的編碼基因。本發(fā)明的又一目的是提供上述慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因TMEM2突變蛋白、該突變蛋白的編碼基因的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
一種慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因TMEM2的突變蛋白，是在慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因TMEM2蛋白的氨基酸序列第12M位絲氨酸Ser突變?yōu)樘於０稟sn，本發(fā)明中用 p. Serl254Asn 表不。上述慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因TlffiM 的突變蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0:1 所示。上述慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因TMEM2的突變蛋白的編碼基因。該編碼基因的核苷酸序列優(yōu)選如SEQ ID NO:2所示。慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因TMEM2的突變蛋白在制備慢性乙型病毒性肝炎的檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因TMEM2的突變蛋白的編碼基因在制備慢性乙型病毒性肝炎的檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。一種慢性乙型病毒性肝炎檢測(cè)試劑盒，由以下成分組成核苷酸序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的引物，PCR反應(yīng)液，PCR產(chǎn)物純化盒和測(cè)序反應(yīng)液；所述PCR反應(yīng)液為溶解了 Tag DNA聚合酶、dNTPs、鎂離子(如MgCl2)、PCR反應(yīng)緩沖液 (如10 X Taq Buffer)。以上試劑均可直接購(gòu)買(mǎi)相應(yīng)商品，如(10mM)dNTPs購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Tag DNA聚合酶及其配套的IOXTaq Buffer、MgCl2購(gòu)自!^ermentas 公司。各試劑的用量及濃度均為本領(lǐng)域常規(guī)值，如Iu/μ L Tag DNA聚合酶lyL、2mmol/L 的 dNTP (即濃度均為 2mmol/L 的 4 種 dNTP 的混合物)3 μ L、25mmol/L MgCl2 3 μ LUOXTaq Buffer (內(nèi)含(NH4)2SO4) 3 μ L、滅菌 ddH20 17yL。所述PCR產(chǎn)物純化盒為純化PCR產(chǎn)物的溶液和DNA吸附柱Labell ；所述純化PCR 產(chǎn)物的溶液為lu/ μ L蝦堿性磷酸酶(SAP，可購(gòu)于!^ermentas公司)0. 6 μ L、20u/ μ L外切酶(位ο I，可購(gòu)于Fermentas公司)0. 15 μ L和滅菌ddH20 1. 25-1. 75 μ L，或按上述比例配制的其他體積的混合液。純化PCR產(chǎn)物的溶液優(yōu)選2-2. 5 μ L0所述測(cè)序反應(yīng)液為BigDye (購(gòu)自ABI公司)和5Xkquence buffer (購(gòu)自ABI 公司)的混合液，BigDye和5 Xkquence buffer的體積比優(yōu)選為1:2，如1 μ LBigDye與 2 μ L5 X Sequence buffer 混合。上述慢性乙型病毒性肝炎檢測(cè)試劑盒，優(yōu)選核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4所示的引物濃度分別為3. 2ymol/L。本發(fā)明的慢性乙型病毒性肝炎的相關(guān)基因TMEM2及其突變p. Serl254Asn,是通過(guò)對(duì)“相對(duì)極端性狀的” 50例慢性乙肝患者及40例未注射過(guò)乙肝疫苗正常對(duì)照進(jìn)行全基因組外顯子測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)分析及進(jìn)一步的數(shù)據(jù)篩選找到最有可能的候選基因；然后再對(duì)所找到的候選基因進(jìn)行大樣本量的病例-對(duì)照(其中慢性乙肝患者17 例，未注射乙肝疫苗正常對(duì)照1636例)相關(guān)關(guān)系研究；最后通過(guò)相關(guān)基因的作用機(jī)理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果 (TlffiM 基因突變與慢性乙肝相關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)P值<1. OX 10_7，優(yōu)勢(shì)比(OR)為2. 45，說(shuō)明兩者有顯著相關(guān)性)最終確定了 7M3泛基因突變與慢性乙型肝炎相關(guān)。本發(fā)明的人基因核苷酸全長(zhǎng)序列(包含突變位點(diǎn))通常是用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)進(jìn)行合成。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)TM^ 基因的核苷酸序列，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并以所檢測(cè)的患慢性乙型肝炎患者抽提的DNA作為模板，擴(kuò)增目的序列。最后通過(guò)測(cè)序反應(yīng)檢測(cè)及確定相關(guān)基因的突變。由于前期的研究已經(jīng)證明了慢性乙型肝炎與7 基因突變的高度相關(guān)性，因此檢測(cè)這個(gè)基因的突變可用于鑒定慢性乙型肝炎患者的宿主遺傳背景的易感性及對(duì)免疫應(yīng)答的反應(yīng)能力，進(jìn)一步地用于之后靶向個(gè)體化治療。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
我們通過(guò)全基因組外顯子測(cè)序及大樣本量的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)了與慢性乙型病毒性肝炎的相關(guān)基因——？及其突變。因此，找尋及檢測(cè)慢性乙肝相關(guān)基因及其突變，不僅是了解及闡明本病的發(fā)病機(jī)理的必要途徑，同時(shí)也為建立鑒定本病的基因診斷和個(gè)體化治療提供了新的契機(jī)。在已了解與本病相關(guān)的7M3泛基因及其突變之后，我們可以建立起基于 7M3泛基因及其變異的診斷技術(shù)，以期對(duì)臨床上慢性乙肝患者進(jìn)行基因水平的診斷，還可以對(duì)其臨床用藥情況予以指導(dǎo)和個(gè)體化治療。由于基因的突變是導(dǎo)致本病遺傳背景發(fā)生改變從而致使其易感性及免疫應(yīng)答發(fā)生改變的重要因素，從長(zhǎng)遠(yuǎn)看，對(duì)本病進(jìn)行7M3泛基因的突變檢測(cè)使我們有可能在今后通過(guò)糾正突變的基因療法或其它針對(duì)這一突變的生物學(xué)效應(yīng)的方法去治療本病。因此，從長(zhǎng)遠(yuǎn)看，與本病相關(guān)的？基因突變的發(fā)現(xiàn)在臨床治療方面有深遠(yuǎn)的意義和前景。


圖1基因的部分測(cè)序結(jié)果，圖中上部為T(mén)lffiM 野生型的測(cè)序結(jié)果，中部為 TMEM2 p. Serl254Asn雜合性突變的測(cè)序結(jié)果(箭頭所示為突變位點(diǎn))，圖中下部為T(mén)MEM2 p. Serl254Asn純合性突變的測(cè)序結(jié)果(箭頭所示為突變位點(diǎn))。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1病例收集
來(lái)自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院傳染科的17 例慢性乙型肝炎患者和來(lái)自同一地區(qū)的1636例未注射乙肝疫苗或自報(bào)疫苗注射史不明的健康自愿者，在取得上述患者、自愿者及家屬知情同意后，取外周血于EDTA抗凝管中備用。用Qiagen公司生產(chǎn)的QIAamp DNA Blood Mini Kits (試劑盒)從抗凝外周血中提取DNA，TE溶解，_80°C保存，備用。實(shí)施例2 TlffiM 基因的突變檢測(cè)
TlffiM 基因的 mRNA 序列來(lái)自 Genbank (NM_013390)。Genomic DNA 序列來(lái)自 UCSC 數(shù)據(jù)庫(kù)(http//genome, ucsc. edu/)禾口 Ensembl 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://asia. ensembl. org/index, html)。主要步驟
1. PCR 擴(kuò)增PCR 反應(yīng)體積為 30 μ L =IOXiTaq Buffer (內(nèi)含(NH4)2S04) 3 μ L, 25mmol/ L MgCl2 3μ L,2mmol/L dNTP 混合物 3 μ L，3. 2 μ mol/L 上、下游引物各 1 μ L，lu/μ L Taq DNA聚合酶1 μ L，實(shí)施例1提取的DNA模板1 μ L，滅菌(MH2O補(bǔ)足體積至30 μ L。PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性:3min ；95°C 30s，引物特異性退火溫度lmin，72°C 45s, 36個(gè)循環(huán)；最后 720C 延伸 IOmin0檢測(cè)TMEM2基因突變位點(diǎn)的上游引物Pl (SEQ ID NO 3)的序列為 5，- CAAGTTCTGCCACAGGTAAGC-3，，下游弓丨物 P2 (SEQ ID NO 4)的序列為5，-CTAGGAACACAGACGCAATTTC-3’。2.測(cè)序反應(yīng)方案
(1)預(yù)反應(yīng)反應(yīng)體積共3μ L :lu/μ L蝦堿性磷酸酶(SAP) 0. 6μ L、20u/y L外切酶 (.Exo 1)0. 15 μ L (Fermentas 公司)、PCR 產(chǎn)物 0. 5_1· 0μ L、滅菌 ddH20 補(bǔ)足體積至 3 μ L。 反應(yīng)混合物在PCR儀上反應(yīng)，37°C溫浴15min，85°C 15min滅活酶。反應(yīng)完畢后反應(yīng)混合物直接作為測(cè)序反應(yīng)的模板用。(2)測(cè)序反應(yīng)用ABI公司的96孔板，在GeneAmp 9700 PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體積共 10μ L :3μ L 的預(yù)反應(yīng)產(chǎn)物、2μ L 的 5Xkquence buffer (ABI 公司)、1 μ L 的 Big-Dye (ABI 公司)、lyL 的引物(3.2ymol/L)，3yL 的滅菌 ddH20。反應(yīng)條件98°C 2min ；96 °C 10s，50°C 5s, 60°C 4min，30 個(gè)循環(huán)；最后 4°C保存。(3)測(cè)序純化直接在96孔板上進(jìn)行。a)測(cè)序反應(yīng)完畢后，配無(wú)水乙醇6mL+3mol/L醋酸鈉(pH5. 2)240 μ L混合溶液(即無(wú)水乙醇醋酸鈉體積比=25:1)，每個(gè)樣品中加入50yL混合溶液。用錫箔紙封閉，并振蕩混勻。
b)將測(cè)序產(chǎn)物放于_20°C避光靜置20min以上。c) 20°C,3700 rpm 離心 30min。d)倒去上清液，倒扣在四層吸水紙上，360rpm離心10s。e)配75%乙醇(無(wú)水乙醇7. 5mL+ddH20 2. 5mL混合溶液的比例)，每個(gè)樣品中加入 90yL混合溶液。用錫箔紙封閉，并振蕩混勻。f)將測(cè)序產(chǎn)物放于_20°C避光靜置20min以上。g) 20°C,3700 rpm 離心 30min。h)倒去上清液，倒扣在四層吸水紙上，360rpm離心10s。i)室溫通風(fēng)處，避光晾干，30min以上。j)每個(gè)樣品中加ddH20 10 μ L，用錫箔紙封閉，振蕩后離心。k)待測(cè)樣品放于4°C避光靜置1. 5h以上，以充分溶解，上ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。3.測(cè)序結(jié)果分析用ABI序列分析軟件進(jìn)行分析
發(fā)明人對(duì)來(lái)自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院傳染科的17 例慢性乙型肝炎患者和來(lái)自同一地區(qū)的1636例未注射乙肝疫苗或自報(bào)疫苗注射史不明的健康自愿者進(jìn)行TMEM2基因的突變檢測(cè)。結(jié)果如下
突變位點(diǎn)為發(fā)生在riffiM 基因的氨基酸序列中第12M位絲氨酸突變?yōu)樘於０?(p. Serl254Asn),突變后的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。其中有225例患者和102例正常對(duì)照存在雜合性突變，10例患者和2例正常對(duì)照存在純合性突變。在17 例病例和1636 例對(duì)照研究中，其風(fēng)險(xiǎn)等位基因的個(gè)數(shù)分別是245個(gè)和106個(gè)，優(yōu)勢(shì)比值(OR值)為2. 45, 值<1.0Χ10_7。多基因遺傳病的研究中，通常是通過(guò)關(guān)聯(lián)分析來(lái)確定其風(fēng)險(xiǎn)基因的，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，/7值有顯著差異，且OR值為2. 45，說(shuō)明該基因的突變是導(dǎo)致該病的危險(xiǎn)因素。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1。實(shí)施例基因突變檢測(cè)試劑盒的制備制備一試劑盒，具體成分見(jiàn)表1
表權(quán)利要求
1.一種慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因TMEM2的突變蛋白，其特征在于在慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因TMEM2蛋白的氨基酸序列第12M位絲氨酸突變?yōu)樘於０贰?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因TMEM2的突變蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
3.權(quán)利要求2所述慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因TMEM2的突變蛋白的編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因TMEM2的突變蛋白的編碼基因， 其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
5.權(quán)利要求1所述慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因TMEM2的突變蛋白在制備慢性乙型病毒性肝炎的檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求4所述慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因？的突變蛋白的編碼基因在制備慢性乙型病毒性肝炎的檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
7.—種慢性乙型病毒性肝炎檢測(cè)試劑盒，其特征在于由以下成分組成核苷酸序列如 SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的引物，PCR反應(yīng)液，PCR產(chǎn)物純化盒和測(cè)序反應(yīng)液；所述PCR反應(yīng)液為溶解了 Tag DNA聚合酶、dNTPs、鎂離子的PCR反應(yīng)緩沖液；所述PCR產(chǎn)物純化盒由純化PCR產(chǎn)物的溶液和DNA吸附柱Labell組成，所述純化PCR 產(chǎn)物的溶液為Iu/ μ L蝦堿性磷酸酶、20u/ μ L外切I和滅菌ddH20的混合液；所述測(cè)序反應(yīng)液為BigDye和5Xkquence buffer的混合液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述慢性乙型病毒性肝炎檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述核苷酸序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的引物濃度分別為3. 2 μ mol/L。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因TMEM2的突變蛋白、編碼基因及其應(yīng)用。本發(fā)明的慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因TMEM2的突變蛋白是在慢性乙型病毒性肝炎相關(guān)基因TMEM2蛋白的氨基酸序列第1254位絲氨酸突變?yōu)樘於０?，同時(shí)得到了該突變蛋白的編碼基因，建立了基于TMEM2基因及其突變體的診斷試劑盒，該試劑盒可以對(duì)臨床上慢性乙肝患者進(jìn)行基因水平的診斷，還可以對(duì)其臨床用藥情況予以指導(dǎo)和個(gè)體化治療。從長(zhǎng)遠(yuǎn)看，對(duì)慢性乙型病毒性肝炎進(jìn)行TMEM2基因的突變檢測(cè)使我們有可能在今后通過(guò)糾正突變的基因療法或其它針對(duì)這一突變的生物學(xué)效應(yīng)的方法去治療本病，在臨床治療方面有深遠(yuǎn)意義和應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N33/576GK102558311SQ20121003135
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月13日
發(fā)明者彭亮, 李奇斌, 王一鳴, 袁萍, 裴元元, 趙強(qiáng), 高志良, 黃瑋俊 申請(qǐng)人:中山大學(xué)