專利名稱：籽瓜hplc指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然植物分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及天然植物指紋圖譜的構(gòu)建方法，尤其是籽瓜高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
背景技術(shù)：
指紋圖譜技術(shù)是目前國(guó)際公認(rèn)的同時(shí)具備實(shí)用性和科學(xué)性的天然植物及其制品質(zhì)量控制方法。目前國(guó)際上各種符合天然藥物(植物)特色的指紋圖譜控制技術(shù)體系正在研究和建立，美國(guó)食品藥品管理局(FDA)允許草藥保健品申報(bào)資料中提供色譜指紋圖譜；世界衛(wèi)生組織(WHO)在1996年草藥評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則中也規(guī)定，如果草藥的活性成分不明確，可以提供色譜指紋圖譜以證明產(chǎn)品質(zhì)量的一致；歐共體在草藥質(zhì)量指南中亦稱，單靠測(cè)定某種有效成分考查質(zhì)量的穩(wěn)定性是不夠的，因?yàn)椴菟幖捌渲苿┦且哉w為活性物質(zhì)。國(guó)外指紋圖譜的應(yīng)用，目的在于解決成分復(fù)雜、有效成分不明確的植物藥質(zhì)量檢測(cè)和產(chǎn)品批次間質(zhì)量差異的問題。指紋圖譜已經(jīng)是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的鑒別中藥品種與評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的最有效的手段之一。桿瓜(Citrulluslanatus. Convar megalaspermus. Lin et Chao),又名打瓜，主要產(chǎn)于我國(guó)北方地區(qū)，特別是西北地區(qū)。籽瓜屬西瓜一個(gè)特殊品種，營(yíng)養(yǎng)豐富，民間一直流傳著食用籽瓜治療某些疾病的驗(yàn)方，它是一種藥食同源的農(nóng)作物。研究證明，籽瓜瓜瓤富含果酸、核黃素、尼克酸及多種維生素、礦質(zhì)元素和微量元素，含有18種氨基酸，特別是含有人體必需卻又不能合成的8種必需氨基酸，是一種理想的保健食品原料；籽瓜汁可以明顯提高細(xì)胞活性，具有明顯的抗氧化作用，可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，對(duì)細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用，又是一種理想的護(hù)膚品原料。但是籽瓜的某些特殊活性成分目前尚不清楚,這對(duì)籽瓜深加工質(zhì)量控制帶來難題。本發(fā)明力求借鑒中藥材指紋圖譜作為鑒別中藥品種與評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的有效手段， 通過高效液相色譜法(HPLC)對(duì)籽瓜進(jìn)行指紋圖譜的研究，建立籽瓜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，達(dá)到準(zhǔn)確反映籽瓜及籽瓜深加工制品中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量的目的，進(jìn)而對(duì)籽瓜深加工制品中籽瓜有效成分和添加劑進(jìn)行科學(xué)的鑒別和測(cè)定，達(dá)到控制籽瓜深加工制品質(zhì)量和監(jiān)控食品安全生產(chǎn)的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種籽瓜HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。本發(fā)明的另一目的是提供一種籽瓜制品質(zhì)量控制方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述第一目的采取的技術(shù)方案是一種籽瓜高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，包括如下步驟(1)供試品溶液的制備籽瓜去籽，將瓜瓤取出置于果汁攪拌器中粉碎30s，抽濾取濾液，得籽瓜汁用0. 45 ii m濾膜過濾后作為供試品溶液；
(2)高效液相色譜分析色譜分離柱填料為SinochromODS-BP C18, 5 u m, 250X4. 6mm ;流動(dòng)相為甲醇和質(zhì)量百分濃度是0. 2%的乙酸水(以下同)；采用梯度洗脫的方式0min — 2min — 42min — 45min,甲醇2% — 2% — 70% — 70%,進(jìn)樣量 20 u L,檢測(cè)波長(zhǎng) 260 nm;柱溫25°C ;在上述條件下分析供試品溶液，得到籽瓜HPLC指紋圖譜；
(3)重復(fù)上述步驟(I)與(2)，對(duì)不同產(chǎn)地的10批次籽瓜建立HPLC指紋圖譜，通過分析比較，確定了 24個(gè)共有特征峰，其保留時(shí)間分別為3. 520min、4. 938min、5. 407min、 6.530min、7.413min、7. 856min、9. 750min、10. 303min、12. 637min、12. 832min、13. 147min、 13.686min、14. 494min、17. 487min、17. 88Omin、19. 129min、19.468min、20. 287min、 21. 288min、21. 805min、22. 320min、29. 835min、36.655min、37.867min，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD):
0.05 0. 25 min ;這些共有特征峰構(gòu)成了籽瓜HPLC指紋特征，作為籽瓜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述第二目的采取的技術(shù)方案是一種籽瓜制品質(zhì)量控制方法，包括如下步驟
(1)供試品溶液的制備潔凈條件下將籽瓜飲料原料一籽瓜汁的澄清液作為供試品溶液，或者將籽瓜粉、籽瓜濃縮汁用去離子水稀釋還原成籽瓜原汁濃度，作為供試品溶液；
(2)高效液相色譜分析色譜分離柱填料為SinochromODS-BP C18， 5 u m, 250X4. 6mm ;流動(dòng)相為甲醇和0. 2%乙酸水；采用梯度洗脫的方式 Omin — 2min — 42min — 45min,甲醇2% — 2% — 70% — 70%,進(jìn)樣量 20 u L,檢測(cè)波長(zhǎng) 260 nm ;柱溫25°C;在上述條件下分析供試品溶液，得到籽瓜飲料原料一籽瓜汁或籽瓜粉或籽瓜濃縮汁的HPLC指紋圖譜；
(3)將步驟(2)所得籽瓜飲料原料一籽瓜汁或籽瓜粉或籽瓜濃縮汁的HPLC指紋圖譜與籽瓜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相比對(duì)，鑒別籽瓜制品所含籽瓜有效成分以及是否添加了其它添加劑。本發(fā)明將籽瓜原汁作為一個(gè)整體對(duì)待，通過比較其共有峰，可以找出不同產(chǎn)地籽瓜甚至不同季節(jié)收獲的籽瓜成分之間的細(xì)微差別，可鑒別籽瓜制品中是否含有籽瓜有效成分；同時(shí)，可以準(zhǔn)確鑒別出籽瓜汁中是否添加了其它添加劑，適用于對(duì)籽瓜深加工過程中籽瓜制品質(zhì)量的控制和食品安全生產(chǎn)的監(jiān)控。本發(fā)明為籽瓜深加工過程中籽瓜制品質(zhì)量的控制以及食品安全生產(chǎn)的監(jiān)控提供了一種科學(xué)有效的方法，其檢測(cè)手段先進(jìn)，操作性強(qiáng)。


圖I是本發(fā)明提供的籽瓜的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，
圖2是甘肅景泰-I產(chǎn)地籽瓜的原汁色譜圖，
圖3是甘肅景泰-2產(chǎn)地籽瓜的原汁色譜圖，
圖4是甘肅靖遠(yuǎn)-I產(chǎn)地籽瓜的原汁色譜圖，
圖5是甘肅會(huì)寧-I產(chǎn)地籽瓜的原汁色譜圖，
圖6是籽瓜飲料原料一籽瓜汁1-1批次色譜圖，
圖7是籽瓜飲料原料一籽瓜汁1-2批次色譜圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
(1)儀器和試劑使用安捷倫高效液相色譜儀(Agilent1200)，DAD 二級(jí)陣列檢測(cè)器； 籽瓜共10批次，產(chǎn)地來自甘肅景泰、靖遠(yuǎn)、會(huì)寧等地；試劑中甲醇為色譜純，乙酸為分析純， 試驗(yàn)用水為去離子水；
(2)供試品溶液的制備籽瓜去籽，將瓜瓤(距瓜皮0.5 Icm)取出置于果汁攪拌器中粉碎30s，抽濾取濾液即籽瓜汁并用0. 45 y m濾膜過濾后作為供試品溶液；
(3)高效液相色譜分析色譜分離柱填料為SinochromODS-BP C18， 5 u m, 250X4. 6mm ;流動(dòng)相為甲醇和0. 2%乙酸水；采用梯度洗脫的方式 Omin — 2min — 42min — 45min,甲醇2% — 2% — 70% — 70%,進(jìn)樣量 20 u L,檢測(cè)波長(zhǎng) 260 nm ;柱溫25°C ;在此條件下分析供試品溶液，得到籽瓜HPLC指紋圖譜；
(4)重復(fù)上述步驟(I)至(3)，對(duì)不同產(chǎn)地的10批次籽瓜建立HPLC指紋圖譜如圖I 所示，通過分析比較，確定出24個(gè)共有特征峰，其保留時(shí)間分別為3. 520min、4. 938min、 5. 407min、6. 530min、7. 413min、7. 856min、9. 750min、10. 303min、12. 637min、12. 832min、 13. 147min、13.686min、14. 494min、17. 487min、17. 88Omin、19. 129min、19. 468min、 20. 287min、21. 288min、21. 805min、22. 320min、29. 835min、36. 655min、37. 867min，這些共有特征峰構(gòu)成了籽瓜HPLC指紋特征，作為籽瓜的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。圖I中，從左到右分別標(biāo)出了其共有特征峰I至24號(hào)。在測(cè)試具體籽瓜供試樣品過程中，以上特征峰的保留時(shí)間可能會(huì)出現(xiàn)0. 05 0. 25 min的標(biāo)準(zhǔn)偏差，不影響樣品相似度的比對(duì)。實(shí)施例2
實(shí)施例2的目的在于對(duì)不同產(chǎn)地籽瓜指紋圖譜與籽瓜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比較，證明本發(fā)明的準(zhǔn)確性及實(shí)用性。以甘肅景泰-I產(chǎn)地籽瓜為試驗(yàn)樣品，使用安捷倫高效液相色譜儀(Agilent 1200)，DAD 二級(jí)陣列檢測(cè)器；試劑中甲醇為色譜純，乙酸為分析純，試驗(yàn)用水為去離子水； 按照下述方法制作甘肅景泰-I產(chǎn)地籽瓜的色譜(1)供試品溶液的制備籽瓜去籽，將瓜瓤(距瓜皮0.5 Icm)取出置于果汁攪拌器中粉碎30s，抽濾取濾液即籽瓜汁并用0. 45 y m濾膜過濾后作為供試品溶液；
(2)高效液相色譜分析色譜分離柱填料為SinochromODS-BP C18， 5 u m, 250X4. 6mm ;流動(dòng)相為甲醇和0. 2%乙酸水；采用梯度洗脫的方式 Omin — 2min — 42min — 45min,甲醇2% — 2% — 70% — 70%,進(jìn)樣量 20 u L,檢測(cè)波長(zhǎng) 260 nm ;柱溫25°C ;在上述條件下分析供試品溶液，得到甘肅景泰_1產(chǎn)地的籽瓜HPLC色譜圖， 如圖2所示。按照上述方法，以甘肅景泰-2產(chǎn)地籽瓜為試驗(yàn)樣品，得到甘肅景泰-2產(chǎn)地的籽瓜 HPLC色譜圖，如圖3所示。同樣，按照上述方法，以甘肅靖遠(yuǎn)-I產(chǎn)地籽瓜為試驗(yàn)樣品，得到甘肅靖遠(yuǎn)-I產(chǎn)地的籽瓜HPLC色譜圖，如圖4所示；以甘肅會(huì)寧-I產(chǎn)地籽瓜為試驗(yàn)樣品，得到甘肅會(huì)寧-I產(chǎn)地的籽瓜HPLC色譜圖，如圖5所示。(3)將各個(gè)籽瓜制品供試品溶液HPLC色譜圖與籽瓜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，表明各個(gè)籽瓜供試品與籽瓜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜具有共有特征峰；從圖2 圖5明顯可見各產(chǎn)地籽瓜原汁中所含物質(zhì)在種類和含量上略有差別，每個(gè)色譜峰代表籽瓜原汁中所含的一類化合物。采用國(guó)家藥典委員會(huì)提供的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版軟件》 對(duì)樣品SI至樣品SlO色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)各批次籽瓜色譜圖相似度給予計(jì)算分析，各批次籽瓜指紋圖譜相似度計(jì)算分析結(jié)果見表I。表I提供的指紋圖譜評(píng)價(jià)軟件相似度計(jì)算結(jié)果顯示，樣品SI為甘肅景泰產(chǎn)西瓜與籽瓜雜交品種，其對(duì)照指紋圖譜的相似度最低為0. 397。樣品S3與對(duì)照指紋圖譜的相似度稍低為0. 825，該樣品產(chǎn)地是甘肅靖遠(yuǎn)，分析該差異可能與地域相關(guān)。其他樣品色譜圖與對(duì)照指紋圖譜的相似度均達(dá)0. 99以上，表明本發(fā)明確定的籽瓜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜是準(zhǔn)確的。表I各批次籽瓜指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種籽瓜高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，其特征在于包括如下步驟(O供試品溶液的制備籽瓜去籽，將瓜瓤取出置于果汁攪拌器中粉碎30s，抽濾取濾液，得籽瓜汁用O. 45 μ m濾膜過濾后作為供試品溶液；(2)高效液相色譜分析色譜分離柱填料為SinochromODS-BP C18, 5 μ m, 250X4. 6mm ;流動(dòng)相為甲醇和質(zhì)量百分濃度是O. 2%的乙酸水；采用梯度洗脫的方式 Omin — 2min — 42min — 45min,甲醇2% — 2% — 70% — 70%,進(jìn)樣量 20 μ L,檢測(cè)波長(zhǎng) 260 nm ;柱溫25°C ;在上述條件下分析供試品溶液，得到籽瓜HPLC指紋圖譜；(3)重復(fù)上述步驟(I)與(2)，對(duì)不同產(chǎn)地的10批次籽瓜建立HPLC指紋圖譜對(duì)不同產(chǎn)地的10批次籽瓜建立HPLC指紋圖譜，通過分析比較，確定了 24個(gè)共有特征峰，其保留時(shí)間分別為3. 520min、4. 938min、5. 407min、6. 530min、7. 413min、7. 856min、9. 750min、 10.303min、12.637min、12.832min、13.147min、13.686min、14.494min、17.487min、 17.880min、19. 129min、19.468min、20.287min、21. 288min、21. 805min、22. 320min、 29. 835min、36. 655min、37. 867min，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD) :0. 05 0. 25 min ;這些共有特征峰構(gòu)成了籽瓜HPLC指紋特征，作為籽瓜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
2.一種籽瓜制品質(zhì)量控制方法，其特征在于包括如下步驟(1)供試品溶液的制備潔凈條件下將籽瓜飲料原料一籽瓜汁的澄清液作為供試品溶液，或者將籽瓜粉、籽瓜濃縮汁用去離子水稀釋還原成籽瓜原汁濃度，作為供試品溶液；(2)高效液相色譜分析色譜分離柱填料為SinochromODS-BP C18, 5 μ m, 2 5 O X 4. 6mm ;流動(dòng)相為甲醇和質(zhì)量百分濃度是0. 2%的乙酸水；采用梯度洗脫的方式 Omin — 2min — 42min — 45min,甲醇2% — 2% — 70% — 70%,進(jìn)樣量 20 μ L,檢測(cè)波長(zhǎng) 260 nm ;柱溫25°C;在上述條件下分析供試品溶液，得到籽瓜飲料原料一籽瓜汁或籽瓜粉或籽瓜濃縮汁的HPLC色譜圖；(3)將步驟(2)所得籽瓜制品一籽瓜汁或籽瓜粉或籽瓜濃縮汁的HPLC色譜圖與籽瓜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相比對(duì)，鑒別籽瓜制品所含籽瓜有效成分以及是否添加了其它添加劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種籽瓜HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。籽瓜去籽，將瓜瓤取出置于果汁攪拌器中粉碎30s，抽濾取濾液即籽瓜汁并用0.45μm濾膜過濾后作為供試品溶液。對(duì)供試品溶液進(jìn)行高效液相色譜分析色譜柱為SinochromODS-BPC18，5μm，250×4.6mm，柱溫為25℃，流動(dòng)相為甲醇和0.2%乙酸水，采用梯度洗脫的方式，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm，得到籽瓜HPLC指紋圖譜。通過對(duì)10批次籽瓜HPLC指紋圖譜的比對(duì)，確定其共有指紋特征，得到籽瓜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。利用該標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜可以有效監(jiān)控籽瓜及籽瓜深加工制品的質(zhì)量。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102590384SQ20121003231
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月14日
發(fā)明者孫麗楓, 孫小明, 常蓬彬, 王勤 申請(qǐng)人:常蓬彬