專利名稱：用Fe₃O₄@Au核殼納米探針檢測生物分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜，尤其是涉及一種采用Fe3O4OAu核殼納米探針快速檢測生物分子的方法。
背景技術(shù)：
在生物樣品中進(jìn)行生物分子的快速、準(zhǔn)確檢測，對獲取生命過程中的化學(xué)與生物信息、進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)疾病的診斷以及化學(xué)分析具有重要的研究意義和實際價值。對生物分子的檢測，包括對器官、組織、細(xì)胞，甚至DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的探測。這就要求我們的檢測器件必須逐步微型化，同時也要保證檢測的高效和靈敏度，這是目前許多傳統(tǒng)的生物分析方法所面臨的極大挑戰(zhàn)。隨著納米科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，采用納米材料所構(gòu)成的納米生物探針成為新一代的生物檢測微型器件。其中，磁性納米粒子和貴金屬納米粒子由于具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)和巨大的應(yīng)用潛力，已經(jīng)引起了人們廣泛的研究興趣。磁性納米粒子，如納米氧化鐵 (Fe3O4)具有獨(dú)特的磁學(xué)性能和較好的生物相容性，在細(xì)胞和生物分子分離，磁共振成像、藥物靶向傳輸和干細(xì)胞標(biāo)記等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出潛在的應(yīng)用前景。金納米粒子具有獨(dú)有的光學(xué)性質(zhì)(表面等離子體吸收和共振光散射)，可以極大地增強(qiáng)表面吸附分子的拉曼散射信號。此外，金納米粒子具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、生物相容性以及易于對其表面進(jìn)行生物分子修飾的特點(diǎn)，因而在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域尤其是結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜進(jìn)行生物分子如核酸、 蛋白質(zhì)及其組分等的超靈敏檢測中越來越受到重視。然而，由于磁性Fe3O4納米粒子具有較高的比表面積和強(qiáng)烈的聚集傾向，且化學(xué)穩(wěn)定性不高，易被氧化，在一定程度上限制了其直接應(yīng)用于生物體系。而以Fe3O4和Au為基本單元構(gòu)筑的復(fù)合納米材料不僅可以將納米氧化鐵的磁學(xué)特性和納米金的等離子體發(fā)光特性和生物相容性集合于一體，賦予其增強(qiáng)的物理化學(xué)性能和多元化的功能；而且，更重要的是，核/殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4Au納米復(fù)合物可進(jìn)一步將“核”和“殼”的優(yōu)勢結(jié)合起來，改善磁性納米材料的分散穩(wěn)定性并促進(jìn)表面修飾和生物功能化，進(jìn)而拓展其在生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。本申請人在中國專利CN101773810A中公開一種金包覆四氧化三鐵納米顆粒的合成方法，將FeSO4 · 7H20、KNO3溶液、NaOH溶液和PEI溶液混溶，放入微波反應(yīng)器反應(yīng)，再分散于水中，得四氧化三鐵納米顆粒；將HAuCl4溶液加入超純水中，再加入檸檬酸三鈉，攪拌后加入含NaBH4的檸檬酸三鈉，繼續(xù)攪拌，得金納米顆粒溶液；在Fe3O4-PEI溶液中加入金納米顆粒溶液，攪拌，再加入PEI溶液，置于烘箱中，磁性分離洗滌后再分散于去離子水中，加入NaOH,再第一次加入NH2OH · HCl和HAuCl4,其后間隔加入NH2OH · HCl和HAuCl4共4次， 每次間隔至少lOmin。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種方便快捷的用Fe3O4OAu核殼納米探針檢測生物分子的方法。
本發(fā)明采用Fe3O4OAu核殼納米探針，結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜，方便快捷地檢測生物分子的方法。本發(fā)明包括以下步驟I)制備 Fe3O4OAu 探針；2)制備金探針取Au膠體溶液，加入孔雀石綠(MGITC)溶液，得混合溶液A， 再加入HS-PEG-C00H和HS-PEG第I次混合，再離心洗滌懸浮于MES中，接著加入EDC和 NHS-Sulfo第2次混合，并加入生物分子B (某一可與檢測分子特異性結(jié)合的生物分子B)， 溫孵，最后離心洗滌重新分散于PBS緩沖液中；3)拉曼檢測各取分別修飾有生物分子A和生物分子B的Fe3O4OAu和Au溶液混合，加入待檢測的生物分子，溫孵，磁性分離，重新分散于超純水中，采用拉曼光譜儀進(jìn)行檢測。在步驟I)中，所述制備Fe3O4OAu探針的具體方法可為先制備Fe3O4OAu納米顆粒，在Fe3O4OAu溶液中加入HS-PEG-COOH和HS-PEG混合， 再離心洗滌，懸浮于2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)中，接著加入I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(NHS-Sulf0)，并加入生物分子A (某一可與檢測分子特異性結(jié)合的生物分子A)，溫孵，最后離心洗滌，重新分散于磷酸鹽緩沖液(PBS)中；所述HS-PEG-C00H即為一端修飾羧基的巰基聚乙二醇，HS-PEG即為巰基聚乙二醇。所述制備Fe3O4OAu納米顆?？砂凑罩袊鴮＠鸆N101773810A所公開的方法制備，具體方法如下(I)四氧化三鐵納米顆粒的制備稱取O. 26g FeSO4 ·7Η20溶于2. 5ml 2M/L的KNO3 溶液中，加入2.5ml 1M/L的NaOH溶液，攪拌，加入20ml I 5g/L的分子量為1，800 25，000的PEI溶液，放入微波反應(yīng)器90°C，反應(yīng)時間30 120min，反應(yīng)完后，磁性分離用去離子水洗滌5次，分散于25ml水中保存，最終所得溶液四氧化三鐵含量濃度為O. 012M(物質(zhì)量比為 FeSO4 · 7H20 KNO3 NaOH = I. 87 10 5)；(2) 2. 6nm 金納米顆粒的制備參照文獻(xiàn)(Brown, K. R. ；ffalter, D. G. ；Natan, M. J. Chem. Mater. 2000,12 (2), 306-313)方法，具體步驟為，量取 Iml 1% HAuCl4 溶液滴入 90ml超純水中磁力攪拌Imin,再滴加2ml朽1檬酸三鈉(38. 8mM)攪拌lmin。最后加入Iml 新鮮配制含O. 075% NaBH4的檸檬酸三鈉(38. 8mM)。繼續(xù)磁力攪拌5min。然后置于4°C冰
箱保存。(3)Fe3O4OAu納米顆粒的合成量取2ml Fe3O4-PEI溶液與金種子溶液機(jī)械攪拌 90 120min，轉(zhuǎn)速300 600rpm。再加入5g/L PEI 20ml置于50 60°C烘箱60min，磁性分離洗滌5次，最終分散于20ml去離子水中，加入IlOml O. OlM的NaOH，第一次加入O. 75ml NH2OH .HCl (鹽酸羥胺)、0.5ml I % HAuCl4,其后間隔加入 O. 5ml NH2OH · HC1、0. 5ml 1% HAuCl4共4次,每次間隔lOmin。最終離心洗漆3次,每次6000rpm IOmin0所述Fe3O4OAu溶液的摩爾濃度可為12. 3pmol/L,所述Fe3O4OAu溶液HS-PEG_C00H 和HS-PEG的摩爾比可為I : (I 6) (I 6)，所述HS-PEG-C00H的Mw = 486，所述 HS-PEG的Mw = 2000 ;所述混合的時間可為0. 5 2h ;所述MES的摩爾濃度可為IOmM ;所述I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)的摩爾濃度可為O. 1M，所述NHS-Sulfo的摩爾濃度可為O. 5M ;所述生物分子A的摩爾濃度可為6. 7 μ M ;所述溫孵的條件可于37°C下，溫孵3h ;所述MES、EDC、NHS、生物分子A和PBS緩沖液的體積比可為 1000 (3 5) (I 3) (4 6) 200。在步驟2)中，所述Au膠體的粒徑可為30nm ;所述Au溶膠和孔雀石綠溶液的物質(zhì)量比可為(10-3 10_2) I ;所述混合溶液A與HS-PEG-C00H和HS-PEG的摩爾比可為 I (I 6) (I 6))，所述 HS-PEG-C00H 的 Mw = 486，所述 HS-PEG 的 Mw = 2000 ;所述第I次混合的時間可為O. 5 2h ;所述MES、EDC、NHS_Sulfo、生物分子B和PBS緩沖溶液的體積比可為1000 (3 5) (I 3) (4 6) 200 ;所述MES的摩爾濃度可為 IOmM,所述EDC的摩爾濃度可為O. 1M，所述NHS-Sulfo的摩爾濃度可為O. 5M ;所述第2次混合的時間可為15min 2h ;所述生物分子B的摩爾濃度可為6. 7 μ M ;所述溫孵的條件可為于37°C下溫孵3h。在步驟3)中，所述修飾生物分子之后的Fe3O4OAu與Au溶液的體積比可為I : I ; 所述溫孵的條件可為37°C下溫孵I 3h ;所述拉曼光譜儀可采用LabRam I型共焦顯微拉曼光譜儀，所述檢測的條件可為633nm，4mff下進(jìn)行檢測。本發(fā)明提供一種采用Fe3O4OAu核殼納米探針，結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜，方便快捷地檢測檢測生物分子的方法。Fe3O4OAu納米顆粒進(jìn)行表面羧基化修飾后，通過羧基和生物分子A相連接形成捕獲探針。而直徑為30nm的納米金顆粒在經(jīng)過修飾拉曼信號分子后，同樣經(jīng)過羧基化與生物分子B相連形成檢測探針。通過捕獲探針捕獲待檢測的生物分子，并與檢測探針組成“夾心”結(jié)構(gòu)，即帶有拉曼標(biāo)記分子的Au納米顆粒就和Fe3O4OAu通過目標(biāo)檢測生物分子結(jié)合。這樣，經(jīng)過磁性分離，目標(biāo)生物分子被快速分離收集，并采用拉曼光譜儀進(jìn)行檢測，通過表面增強(qiáng)拉曼信號檢測。與其他制備方法相比，該方法具有以下顯著的優(yōu)點(diǎn)；I)該探針可以方便地利用外加磁場將目標(biāo)生物分子從復(fù)雜的生物樣品基質(zhì)中進(jìn)行提取、洗滌和濃縮，省去離心，過濾等繁雜的操作，大大提高生物分子檢測的效率。2)該探針具有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性，可以安全的使用在生物分子檢測中。3)該探針結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜，檢測體系具有很強(qiáng)的表面增強(qiáng)拉曼信號，通過檢測標(biāo)記分子的增強(qiáng)拉曼信號，實現(xiàn)了對生物分子的快速高靈敏度檢測，在實驗中檢測靈敏度為10_7m。4)相對于傳統(tǒng)的生物方法，該方法操作簡單快捷。5)該方法重現(xiàn)性好，可實現(xiàn)臨床樣品的檢測。


圖I為Fe3O4OAu的掃描電鏡圖片。在圖I中，標(biāo)尺為Ιμπι;由圖I中可見單分散性較好，顆粒直徑范圍在IOOnm左右。圖2為Au(30nm)顆粒掃描電鏡圖片。在圖2中，標(biāo)尺為200nm。圖3為Au(30nm)顆粒透射電鏡圖片。在圖3中，標(biāo)尺為50nm。由圖2和3可見，單分散性較好，顆粒直徑范圍在30nm左右。
圖4為在沒有待檢測生物分子的空白溶液中，經(jīng)磁性分離出來的Fe3O4OAu-A納米顆粒、拉曼信號分子的拉曼圖譜以及經(jīng)過磁性分離所檢測到的生物分子的拉曼圖譜。在圖 4中,橫坐標(biāo)為拉曼位移Rama shift (cm-1);標(biāo)尺為500counts s-1mW-1;曲線(a)是在沒有待檢測生物分子的空白溶液中，經(jīng)磁性分離出來的Fe3O4OAu-A納米顆粒；曲線(b)代表拉曼信號分子的拉曼圖譜；曲線(c)是經(jīng)過磁性分離，所檢測到的生物分子的拉曼圖譜。將譜線 (C)對照(a)可以明顯看出，在檢測到目標(biāo)生物分子后，有明顯的拉曼增強(qiáng)信號；而沒有檢測到目標(biāo)生物分子時，幾乎沒有拉曼信號。
具體實施例方式以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實施例IDFe3O4OAu探針的制備首先可按照中國專利CN101773810A所公開的方法制備， 具體方法如下(I)四氧化三鐵納米顆粒的制備稱取O. 26g FeSO4 · 7H20溶于2. 5ml 2M/L 的KNO3溶液中，加入2. 5ml 1M/L的NaOH溶液，攪拌，加入20ml I 5g/L的分子量為 (1,800-25,000)的PEI溶液，放入微波反應(yīng)器90°C，反應(yīng)時間30 120min。反應(yīng)完后，磁性分離用去離子水洗滌5次，分散于25ml水中保存，最終所得溶液四氧化三鐵含量濃度為 O. 012M(物質(zhì)量比為 FeSO4 · 7H20 KNO3 NaOH = I. 87 : 10 : 5)。(2) 2. 6nm 金納米顆粒的制備參照文獻(xiàn)Brown, K. R. ；ffalter, D. G. ；Natan, M. J. Chem. Mater. 2000,12 (2), 306-313.方法，具體步驟為，量取 Iml I ^HAucl4 溶液滴入 90ml超純水中磁力攪拌lmin,再滴加2ml朽1檬酸三鈉(38. 8mM)攪拌lmin。最后加入Iml 新鮮配制含O. 075% NaBH4的檸檬酸三鈉(38. 8mM)。繼續(xù)磁力攪拌5min。然后置于4°C冰箱保存。(3)Fe3O4OAu納米顆粒的合成量取2ml Fe3O4-PEI溶液與金種子溶液機(jī)械攪拌 90 120min，轉(zhuǎn)速 300 600rpm。再加入 5g/L PEI 20ml 置于 50 60°C烘箱 60min，磁性分離洗滌5次。最終分散于20ml去離子水中，加入IlOml O. OlM的NaOH，第一次加入 O. 75ml NH2OH^Hcl (鹽酸羥胺)、0· 5ml I % HAuCl4,其后間隔加入 O. 5ml NH2OH *HC1,0. 5ml I % HAuCl4共4次，每次間隔lOmin。最終離心洗漆3次,每次6000rpm IOmin0取所制備的Fe3O4OAu 溶液 ImL (12. 3pmol/L)，分別加入 50HS-PEG-C00H (Mw = 486，10 μ M)和 50 μ L HS-PEG(Mw = 2000，10 μ Μ)，混合 2h，并離心洗滌最終懸浮于 ImL MES(IOmM)中。接著加入 EDC 4. 75 μ L(O. 1Μ)和 NHS-Sulfo 3. O μ L(0. 5M)混合 2h 并加入 Biotin-PEO-Amine 5. 6 μ L (6. 7 μ Μ)。于37°C條件下,溫孵3h。最后離心洗漆重新分散于 200 μ L PBS緩沖溶液中。2)金探針的制備首先取新制備的粒徑為30nm的Au膠體溶液，向其中滴加新配制的孔雀石綠溶液。Au溶膠和孔雀石綠溶液的物質(zhì)量比為(1.65*10_3 I)。然后取Iml 上述溶液，分別加入 15 μ L HS-PEG-C00H (Mw = 486，10 μ Μ)和 85 μ L HS-PEG (Mw = 2000Da, 10 μ Μ)，混合0. 5h，并離心洗滌懸浮于ImL MES (10m Μ)中。接著加入EDC 3. 75 μ L (O. 1Μ) 和 NHS-Sulfo I. 89 μ L (O. 5Μ)混合 15min 并加入 Biotin-PEO-Amine 4. 4 μ L (6. 7 μ M)，于 37°C條件下，溫孵3h。最后離心洗滌重新分散于200 μ L PBS緩沖溶液中。
3)拉曼檢測各取修飾生物分子之后的Fe3O4OAu和Au溶液100 μ L混合。加入 Streptavidin 4. 5 μ L (10. 5 μ Μ)，置于37°C溫孵Ih0磁性分離，重新分散于200 μ L超純水中，采用LabRam I型共焦顯微拉曼光譜儀,在633nm,4mW條件下進(jìn)行檢測。實施例2DFe3O4OAu探針的制備首先可按照中國專利CN101773810A所公開的方法制備， 具體方法如下(I)四氧化三鐵納米顆粒的制備稱取O. 26g FeSO4 · 7H20溶于2. 5ml 2M/L 的KNO3溶液中，加入2. 5ml 1M/L的NaOH溶液，攪拌，加入20ml I 5g/L的分子量為 (1,800-25,000)的PEI溶液，放入微波反應(yīng)器90°C，反應(yīng)時間30 120min。反應(yīng)完后，磁性分離用去離子水洗滌5次，分散于25ml水中保存，最終所得溶液四氧化三鐵含量濃度為 O. 012M(物質(zhì)量比為 FeSO4 · 7H20 KNO3 NaOH = I. 87 : 10 : 5)。(2) 2. 6nm 金納米顆粒的制備參照文獻(xiàn)(Brown, K. R. ；ffalter, D. G. ；Natan, M. J. Chem. Mater. 2000,12 (2), 306-313)方法，具體步驟為，量取 Iml 1% HAuCl4 溶液滴入 90ml超純水中磁力攪拌lmin,再滴加2ml朽1檬酸三鈉(38. 8mM)攪拌lmin。最后加入Iml 新鮮配制含O. 075% NaBH4的檸檬酸三鈉(38. 8mM)。繼續(xù)磁力攪拌5min。然后置于4°C冰箱保存。(3)Fe3O4OAu納米顆粒的合成量取2ml Fe3O4-PEI溶液與金種子溶液機(jī)械攪拌 90 120min，轉(zhuǎn)速 300 600rpm。再加入 5g/L PEI 20ml 置于 50 60°C烘箱 60min，磁性分離洗滌5次。最終分散于20ml去離子水中，加入IlOml O. OlM的NaOH，第一次加入 O. 75ml 順20!1*!1(1(鹽酸羥胺)、0.51111 I % HAuCl4,其后間隔加入 O. 5ml NH2OH *HC1,0. 5ml I % HAuCl4共4次，每次間隔lOmin。最終離心洗漆3次,每次6000rpm IOmin0取所制備的Fe3O4OAu 溶液 ImL (12. 3pmol/L)，分別加入 15HS-PEG-C00H (Mw = 486，10 μ M)和 85 μ L HS-PEG(Mw = 2000,10 μ Μ)，混合 O. 5h,并離心洗滌最終懸浮于 ImL MES(IOmM)中。接著加入 EDC 3. 75 μ L (O. 1Μ)和 NHS-Sulfo I. 89 μ L (O. 5Μ)混合 15min 并加入 free-PSA 抗體(Monoclonal Antibody to H Man free-PSA) 4· 4 μ L (6· 7 μ M)。于 37°C 條件下，溫孵3h。最后離心洗滌重新分散于200 μ L PBS緩沖溶液中。2)金探針的制備首先取新制備的粒徑為30nm的Au膠體溶液，向其中滴加新配制的孔雀石綠溶液。Au溶膠和孔雀石綠溶液的物質(zhì)量比為(1.65*10_3 I)。然后取Iml 上述溶液，分別加入 15 μ L HS-PEG-C00H (Mw = 486，10 μ Μ)和 85 μ L HS-PEG (Mw = 2000Da, 10 μ Μ)，混合O. 5h，并離心洗滌懸浮于ImL MES (IOmM)中。接著加入EDC 3. 75 μ L (0. 1Μ)和 NHS-Sulfo I. 89 μ L (0. 5Μ)混合 15min 并加入 McAb PSA (Monoclonal Antibody to H Man PSA)4. 4yL(6. 7μΜ)，于37°C條件下，溫孵3h。最后離心洗滌重新分散于200 μ L PBS緩沖溶液中。3)拉曼檢測各取修飾抗體之后的Fe3O4OAu和Au溶液100 μ L混合。加入free-PSA 抗原4. 5 μ L (10. 5 μ Μ)，置于37°C溫孵lh。磁性分離，重新分散于200 μ L超純水中，采用 LabRam I型共焦顯微拉曼光譜儀,在633nm,4mW條件下進(jìn)行檢測。實施例3DFe3O4OAu探針的制備首先可按照中國專利CN101773810A所公開的方法制備， 具體方法如下
(I)四氧化三鐵納米顆粒的制備稱取O. 26g FeSO4 · 7H20溶于2. 5ml 2M/L 的KNO3溶液中，加入2. 5ml 1M/L的NaOH溶液，攪拌，加入20ml I 5g/L的分子量為 (1,800-25,000)的PEI溶液，放入微波反應(yīng)器90°C，反應(yīng)時間30 120min。反應(yīng)完后，磁性分離用去離子水洗滌5次，分散于25ml水中保存，最終所得溶液四氧化三鐵含量濃度為 O. 012M(物質(zhì)量比為 FeSO4 · 7H20 KNO3 NaOH = I. 87 : 10 : 5)。(2) 2. 6nm 金納米顆粒的制備參照文獻(xiàn)Brown, K. R. ；ffalter, D. G. ；Natan, M.J. Chem. Mater. 2000，12 (2)，306-313.方法，具體步驟為，量取 Iml I ^HAuCl4 溶液滴入 90ml超純水中磁力攪拌lmin,再滴加2ml朽1檬酸三鈉(38. 8mM)攪拌lmin。最后加入Iml 新鮮配制含O. 075% NaBH4的檸檬酸三鈉(38. 8mM)。繼續(xù)磁力攪拌5min。然后置于4°C冰箱保存。(3)Fe3O4OAu納米顆粒的合成量取2ml Fe3O4-PEI溶液與金種子溶液機(jī)械攪拌 90 120min，轉(zhuǎn)速 300 600rpm。再加入 5g/L PEI 20ml 置于 50 60°C烘箱 60min，磁性分離洗滌5次。最終分散于20ml去離子水中，加入IlOml O. OlM的NaOH，第一次加入 O. 75ml 順20!1*!1(1(鹽酸羥胺)、0.51111 I % HAucl4,其后間隔加入 O. 5ml NH2OH *HC1,0. 5ml I % HAucl4共4次，每次間隔lOmin。最終離心洗漆3次,每次6000rpm IOmin0取所制備的Fe3O4OAu 溶液 ImL (12. 3pmol/L)，分別加入 15HS-PEG-C00H (Mw = 486，10 μ M)和 85 μ L HS-PEG(Mw = 2000,10 μ Μ)，混合 O. 5h,并離心洗滌最終懸浮于 ImL MES(IOmM)中。接著加入 EDC 3. 75 μ L (O. 1Μ)和 NHS-Sulfo I. 89 μ L (O. 5Μ)混合 15min 并加人Biotin-PEO-Amine 4. 4 μ L (6. 7 μ M)。于37°C條件下，溫孵3h。最后離心洗滌重新分散于200 μ L PBS緩沖溶液中。2)金探針的制備首先取新制備的粒徑為30nm的Au膠體溶液，向其中滴加新配制的孔雀石綠溶液。Au溶膠和孔雀石綠溶液的物質(zhì)量比為(1.65*10_3 I)。然后取Iml 上述溶液，分別加入 15 μ L HS-PEG-C00H (Mw = 486，10 μ Μ)和 85 μ L HS-PEG (Mw = 2000Da, 10 μ Μ)，混合0. 5h，并離心洗滌懸浮于ImL MES (10m Μ)中。接著加入EDC 3. 75 μ L (O. 1Μ) 和 NHS-Sulfo I. 89 μ L (O. 5Μ)混合 15min 并加入 Biotin-PEO-Amine 4. 4 μ L (6. 7 μ M)，于 37°C條件下，溫孵3h。最后離心洗滌重新分散于200 μ L PBS緩沖溶液中。3)拉曼檢測各取修飾生物分子之后的Fe3O4OAu和Au溶液200 μ L混合。加入 Streptavidin9 μ L(IOyM),置于37°C溫孵3h。磁性分離，重新分散于400 μ L超純水中，采用LabRam I型共焦顯微拉曼光譜儀,在633nm,4mW條件下進(jìn)行檢測。實施例4DFe3O4OAu探針的制備首先可按照中國專利CN101773810A所公開的方法制備， 具體方法如下(I)四氧化三鐵納米顆粒的制備稱取O. 26g FeSO4 ·7Η20溶于2. 5ml 2M/L的KNO3 溶液中，加入2.5ml 1M/L的NaOH溶液，攪拌，加入20ml I 5g/L的分子量為(1，800 25, 000)的PEI溶液，放入微波反應(yīng)器90°C，反應(yīng)時間30 120min。反應(yīng)完后，磁性分離用去離子水洗滌5次，分散于25ml水中保存，最終所得溶液四氧化三鐵含量濃度為
O.012M(物質(zhì)量比為 FeSO4 · 7H20 KNO3 NaOH = I. 87 : 10 : 5)。(2) 2. 6nm 金納米顆粒的制備參照文獻(xiàn)Brown, K. R. ；ffalter, D. G. ；Natan, M.J. Chem. Mater. 2000，12 (2)，306-313.方法，具體步驟為，量取 Iml I ^HAuCl4 溶液滴入90ml超純水中磁力攪拌lmin,再滴加2ml朽1檬酸三鈉(38. 8mM)攪拌lmin。最后加入Iml 新鮮配制含O. 075% NaBH4的檸檬酸三鈉(38. 8mM)。繼續(xù)磁力攪拌5min。然后置于4°C冰
箱保存。(3)Fe3O4OAu納米顆粒的合成量取2ml Fe3O4-PEI溶液與金種子溶液機(jī)械攪拌 90 120min，轉(zhuǎn)速 300 600rpm。再加入 5g/L PEI 20ml 置于 50 60°C烘箱 60min，磁性分離洗滌5次。最終分散于20ml去離子水中，加入IlOml O. OlM的NaOH，第一次加入
O.75ml 順20!1*!1(1(鹽酸羥胺)、0.51111 I % HAuCl4,其后間隔加入 O. 5ml NH2OH *HC1,0. 5ml I % HAucl4共4次，每次間隔lOmin。最終離心洗漆3次,每次6000rpm IOmin0取所制備的Fe3O4OAu 溶液 ImL (12. 3pmol/L)，分別加入 15HS-PEG-C00H (Mw = 486，10 μ M)和 85 μ L HS-PEG(Mw = 2000,10 μ Μ)，混合 O. 5h,并離心洗滌最終懸浮于 ImL MES(IOmM)中。接著加入 EDC 3. 75 μ L (O. 1Μ)和 NHS-Sulfo I. 89 μ L (O. 5Μ)混合 15min 并加入 free-PSA 抗體(Monoclonal Antibody to H Man free-PSA) 4· 4 μ L (6· 7 μ M)。于 37°C 條件下，溫孵3h。最后離心洗滌重新分散于200 μ L PBS緩沖溶液中。2)金探針的制備首先取新制備的粒徑為30nm的Au膠體溶液，向其中滴加新配制的孔雀石綠溶液。Au溶膠和孔雀石綠溶液的物質(zhì)量比為(1.65*10_3 I)。然后取 Iml 上述溶液，分別加入 50 μ L HS-PEG-C00H (Mw = 486，10 μ Μ)和 50 μ L HS-PEG (Mw = 2000Da, 10 μ Μ)，混合lh,并離心洗滌懸浮于ImL MES (10m M)中。接著加入EDC 5 μ L (0. 1Μ) 和 NHS_Sulfo3y L (0. 5M)混合 2h 并加入 McAb PSA (Monoclonal Antibody to H Man PSA)6 μ L(6. 7 μ M)，于37°C條件下，溫孵3h。最后離心洗滌重新分散于200 μ L PBS緩沖溶液中。3)拉曼檢測各取修飾抗體之后的Fe3O4OAu和Au溶液100 μ L混合。加入free-PSA 抗原4. 5 μ L (10. 5 μ Μ)，置于37°C溫孵lh。磁性分離，重新分散于200 μ L超純水中，采用 LabRam I型共焦顯微拉曼光譜儀,在633nm,4mW條件下進(jìn)行檢測。
權(quán)利要求
1.用Fe3O4OAu核殼納米探針檢測生物分子的方法，其特征在于包括以下步驟1)制備Fe3O4OAu探針；2)制備金探針取Au膠體溶液，加入孔雀石綠溶液，得混合溶液A，再加入 HS-PEG-C00H和HS-PEG第I次混合，再離心洗滌懸浮于MES中，接著加入EDC和NHS-Sulfo 第2次混合，并加入生物分子B，溫孵，最后離心洗滌重新分散于PBS緩沖液中；3)拉曼檢測各取分別修飾有生物分子A和生物分子B的Fe3O4OAu和Au溶液混合，加入待檢測的生物分子，溫孵，磁性分離，重新分散于超純水中，采用拉曼光譜儀進(jìn)行檢測。
2.如權(quán)利要求I所述的用Fe3O4OAu核殼納米探針檢測生物分子的方法，其特征在于在步驟I)中，所述制備Fe3O4OAu探針的具體方法為先制備Fe3O4OAu納米顆粒，在Fe3O4OAu溶液中加入HS-PEG-C00H和HS-PEG混合，再離心洗滌，懸浮于2-(N-嗎啉代)乙磺酸中，接著加入I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽，并加入生物分子A，溫孵，最后離心洗滌，重新分散于磷酸鹽緩沖液中。
3.如權(quán)利要求I所述的用Fe3O4OAu核殼納米探針檢測生物分子的方法，其特征在于在步驟I)中，所述制備Fe3O4OAu納米顆粒的具體方法如下(1)四氧化三鐵納米顆粒的制備稱取O.26g FeSO4 · 7H20溶于2. 5ml 2M/L的KNO3溶液中，加入2. 5ml 1M/L的NaOH溶液，攪拌，加入20ml I 5g/L的分子量為1，800 25，000 的PEI溶液，放入微波反應(yīng)器90°C，反應(yīng)時間30 120min，反應(yīng)完后，磁性分離用去離子水洗滌5次，分散于25ml水中保存，最終所得溶液四氧化三鐵含量濃度為O. 012M，物質(zhì)量比為 FeSO4 · 7H20 KNO3 NaOH = I. 87 10 5 ；(2)2. 6nm金納米顆粒的制備量取Iml I % HAuCl4溶液滴入90ml超純水中磁力攪拌 Imin,再滴加2ml朽1檬酸三鈉攪拌Imin,最后加入Iml新鮮配制含O. 075% NaBH4的朽1檬酸三鈉，繼續(xù)磁力攪拌5min。然后置于4°C冰箱保存；(3)Fe3O4OAu納米顆粒的合成量取2mlFe3O4-PEI溶液與金種子溶液機(jī)械攪拌90 120min,轉(zhuǎn)速300 600rpm，再加入5g/L PEI 20ml置于50 60°C烘箱60min，磁性分離洗滌5次，最終分散于20ml去離子水中，加入IlOml O. OlM的NaOH，第一次加入O. 75ml鹽酸羥胺、0.5ml I % HAuCl4,其后間隔加入 O. 5ml NH2OH · HC1、0. 5ml I % HAuCl4 共 4 次，每次間隔lOmin，最終離心洗漆3次,每次6000rpm IOmin0
4.如權(quán)利要求I所述的用Fe3O4OAu核殼納米探針檢測生物分子的方法，其特征在于在步驟I)中，所述Fe3O4OAu溶液的摩爾濃度為12. 3pmol/L，所述Fe3O4OAu溶液HS-PEG_C00H 和 HS-PEG 的摩爾比為 I : (I 6) (I 6)，所述 HS-PEG-C00H 的 Mw = 486，所述 HS-PEG 的 Mw = 2000。
5.如權(quán)利要求I所述的用Fe3O4OAu核殼納米探針檢測生物分子的方法，其特征在于在步驟I)中，所述混合的時間為O. 5 2h ;所述MES的摩爾濃度為IOmM ;所述I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽的摩爾濃度為O. 1M，所述NHS-Sulfo的摩爾濃度為O. 5M ;所述生物分子A的摩爾濃度為6. 7μΜ ;所述溫孵的條件于37°C下，溫孵3h ;所述MES、EDC、NHS、生物分子A和PBS緩沖液的體積比為1000 (3 5) (I 3) (4 6) 200。
6.如權(quán)利要求I所述的用Fe3O4OAu核殼納米探針檢測生物分子的方法，其特征在于在步驟2)中，所述Au膠體的粒徑為30nm;所述Au溶膠和孔雀石綠溶液的物質(zhì)量比為(10_3 1(Γ2) I ;所述混合溶液A與HS-PEG-C00H和HS-PEG的摩爾比可為I : (I 6) (I 6)，所述 HS-PEG-C00H 的 Mw = 486，所述 HS-PEG 的 Mw = 2000。
7.如權(quán)利要求I所述的用Fe3O4OAu核殼納米探針檢測生物分子的方法，其特征在于在步驟2)中，所述第I次混合的時間為O. 5 2h ;所述MES、EDC、NHS_Sulfo、生物分子B和 PBS緩沖溶液的體積比為1000 (3 5) (I 3) (4 6) 200;所述MES的摩爾濃度可為10mM，所述EDC的摩爾濃度可為O. 1M，所述NHS-Sulfo的摩爾濃度可為O. 5M。
8.如權(quán)利要求I所述的用Fe3O4OAu核殼納米探針檢測生物分子的方法，其特征在于在步驟2)中，所述第2次混合的時間為15min 2h ;所述生物分子B的摩爾濃度為6. 7 μ M ; 所述溫孵的條件可為于37°C下溫孵3h。
9.如權(quán)利要求I所述的用Fe3O4OAu核殼納米探針檢測生物分子的方法，其特征在于在步驟3)中，所述修飾生物分子之后的Fe3O4OAu與Au溶液的體積比為I : I。
10.如權(quán)利要求I所述的用Fe3O4OAu核殼納米探針檢測生物分子的方法，其特征在于在步驟3)中，所述溫孵的條件為37°C下溫孵I 3h ;所述檢測的條件可為633nm，4mW下進(jìn)行檢測。
全文摘要
用Fe3O4@Au核殼納米探針檢測生物分子的方法，涉及一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜。先制備Fe3O4@Au探針；再制備金探針；最后拉曼檢測。優(yōu)點(diǎn)可方便利用外加磁場將目標(biāo)生物分子從復(fù)雜的生物樣品基質(zhì)中進(jìn)行提取、洗滌和濃縮，省去離心，過濾等繁雜的操作，大大提高生物分子檢測的效率。具有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性，可安全使用在生物分子檢測中。該探針結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜，檢測體系具有很強(qiáng)的表面增強(qiáng)拉曼信號，通過檢測標(biāo)記分子的增強(qiáng)拉曼信號，實現(xiàn)了對生物分子的快速高靈敏度檢測，在實驗中檢測靈敏度為10-7M。相對于傳統(tǒng)的生物方法，該方法操作簡單快捷。該方法重現(xiàn)性好，可實現(xiàn)臨床樣品的檢測。
文檔編號G01N21/65GK102590174SQ20121003248
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月14日
發(fā)明者周樨, 張其清, 徐文龍, 石延峰 申請人:廈門大學(xué)