專(zhuān)利名稱(chēng)：一種化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)型檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種農(nóng)用化學(xué)品的分析方法，特別涉及一種痕跡量農(nóng)用化學(xué)品的化學(xué)發(fā)光分析檢測(cè)方法，具體地說(shuō)是一種利用表面配位抑制自由基清除原理發(fā)展的化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)型檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法。
背景技術(shù)：
農(nóng)藥作為一種重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，在防治作物病、蟲(chóng)、草害，保證農(nóng)業(yè)豐收，促進(jìn)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)發(fā)展等方面發(fā)揮著不可替代的作用。然而，無(wú)節(jié)制的農(nóng)藥使用已經(jīng)對(duì)生態(tài)壞境、食品安全和人體健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，同時(shí)也成為國(guó)際貿(mào)易爭(zhēng)端的焦點(diǎn)之一。由于實(shí)際樣品中農(nóng)藥殘留組分含量往往很小，共存組分復(fù)雜，因此建立快速、高靈敏、 高選擇性的分析方法在農(nóng)殘檢測(cè)中顯得尤為迫切，這對(duì)于保護(hù)生態(tài)環(huán)境、保障人類(lèi)健康、減少農(nóng)業(yè)損失、促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有十分重要意義。我國(guó)的農(nóng)藥殘留分析技術(shù)始于20世紀(jì)50 年代，近年來(lái)出現(xiàn)了不少行之有效的鑒別和分析檢測(cè)方法。目前，農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的實(shí)驗(yàn)室分析與檢測(cè)主要依賴(lài)于大型儀器來(lái)完成，例如，氣相色譜法、液相色譜法、氣-質(zhì)聯(lián)用分析法等。這些方法靈敏度高，但是所需要儀器昂貴，樣品前處理復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)并且無(wú)法做到現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。未來(lái)的農(nóng)殘檢測(cè)要求向快速現(xiàn)場(chǎng)、廉價(jià)、減少溶劑、減少對(duì)環(huán)境污染、微型化和自動(dòng)化方向發(fā)展，這是國(guó)家和社會(huì)亟待解決的挑戰(zhàn)性難題?；瘜W(xué)發(fā)光分析以其靈敏度高、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、分析快速和容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)， 在生化分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)及食品安全等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，利用化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)農(nóng)藥殘留也受到人們的關(guān)注。Roda等人利用農(nóng)藥抑制乙酰膽堿酶(AchE)活性的原理，采用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)了對(duì)氧磷、涕滅威等有機(jī)磷農(nóng)藥，對(duì)氧磷和涕滅威的檢測(cè)限分別是0. 75y g I71和g L'與其它檢測(cè)系統(tǒng)相比，該方法簡(jiǎn)單、快速，而且有更高的靈敏度和重現(xiàn)性。Ayyagari等報(bào)道了基于堿性磷酸酯酶催化化學(xué)發(fā)光檢測(cè)了樂(lè)果。堿性磷酸酯酶可以催化含磷酸酯發(fā)生去磷酸化作用，樂(lè)果抑制磷酸酯酶的行為，產(chǎn)生微弱的發(fā)光信號(hào)， 檢測(cè)限為500ppb。Gao等將酶固定在纖維尖端催化反應(yīng)，產(chǎn)生的發(fā)光信號(hào)通過(guò)同一根纖維收集、傳遞到CCD檢測(cè)器檢測(cè)。此外，Pande等利用生物共聚物固定堿性磷酸酯酶在一個(gè)玻璃毛細(xì)管內(nèi)壁，對(duì)甲基對(duì)硫磷等進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)500-700ppb。這些檢測(cè)農(nóng)藥殘留的化學(xué)發(fā)光體系都利用酶來(lái)改善檢測(cè)敏感性和選擇性，因此使用壽命短、價(jià)格昂貴，不利于推廣使用。此外，有人報(bào)道利用有機(jī)磷農(nóng)藥形成氧化能力更強(qiáng)的過(guò)氧化磷酸酯發(fā)展出化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)型農(nóng)殘檢測(cè)傳感器，然而這種增強(qiáng)檢測(cè)方法敏感性和選擇性均較差。目前，利用表面配位抑制自由基清除原理構(gòu)成的化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)型傳感器尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，其對(duì)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)更是無(wú)人涉及。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，旨在提供一種快速檢測(cè)滅線(xiàn)磷、丙溴磷等含至少一個(gè)硫磷單鍵的有機(jī)磷農(nóng)藥(硫趕式硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)殘留量的方法，所要解決的技術(shù)問(wèn)題是利用農(nóng)藥在類(lèi)酶活性粒子表面的配位去抑制自由基清除以實(shí)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)檢測(cè)。所述的化學(xué)發(fā)光信號(hào)是由于類(lèi)酶活性粒子催化水中的溶解氧產(chǎn)生過(guò)氧負(fù)離子，繼而氧化化學(xué)發(fā)光劑魯米諾產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光；這時(shí)若加入自由基清除劑，由于產(chǎn)生的自由基被消耗(亦稱(chēng)自由基清除)，因此化學(xué)發(fā)光信號(hào)減弱直至消失(猝滅)。發(fā)光信號(hào)減弱直至猝滅與自由基清除劑含量之間存在一定的線(xiàn)性關(guān)系。含至少一個(gè)磷硫單鍵的有機(jī)磷農(nóng)藥在類(lèi)酶活性粒子表面的配位作用有抑制自由基清除劑清除自由基的作用，因此與只加入自由基清除劑的空白相比，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，據(jù)此可確立樣品濃度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度之間的線(xiàn)性關(guān)系。本發(fā)明正是利用類(lèi)酶活性粒子催化溶解氧形成過(guò)氧負(fù)離子以及表面配位抑制自由基清除等性質(zhì)，將其聯(lián)合應(yīng)用到化學(xué)發(fā)光檢測(cè)中，開(kāi)發(fā)出一種化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)型檢測(cè)方法。所述的化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)是指以只加入自由基清除劑的魯米諾化學(xué)發(fā)光體系(空白) 為參考，將農(nóng)藥和自由基清除劑一起加入到類(lèi)酶活性粒子溶液后，再加入發(fā)光劑魯米諾溶液，這時(shí)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與空白相比明顯增強(qiáng)，當(dāng)自由基清除劑的含量和魯米諾的含量一定時(shí)，隨著農(nóng)藥濃度的增加，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸由弱到強(qiáng)。待測(cè)樣品濃度變化范圍對(duì)應(yīng)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度變化的過(guò)程。這就是說(shuō)通過(guò)化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)模式確立起待測(cè)樣品濃度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度之間的線(xiàn)性關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)待測(cè)樣品的定量檢測(cè)。本發(fā)明技術(shù)方案的關(guān)鍵是確立待測(cè)樣品濃度的增加與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度由弱到強(qiáng)的變化之間的線(xiàn)性關(guān)系，發(fā)光強(qiáng)度的變化是以空白體系為參考比較得到的。本發(fā)明的技術(shù)方案包括類(lèi)酶活性粒子的制備和魯米諾化學(xué)發(fā)光體系的建立，與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別是所述的化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)是將含至少一個(gè)磷硫單鍵的系列濃度有機(jī)磷農(nóng)藥樣品和自由基清除劑一道加入類(lèi)酶活性粒子溶液中，然后加入化學(xué)發(fā)光劑魯米諾溶液，此時(shí)與只加入等量自由基清除劑的空白相比，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，據(jù)此確立樣品濃度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度之間的線(xiàn)性關(guān)系。所述的魯米諾化學(xué)發(fā)光體系是由魯米諾水溶液(水中有溶解氧)和類(lèi)酶活性粒子所構(gòu)成。若在該體系中加入自由基清除劑則構(gòu)成空白體系。所述的類(lèi)酶活性粒子是具有類(lèi)酶催化活性的納米粒子，選自磁性Fe3CVCoFe2O4粒子或ZnO、ZnS等半導(dǎo)體粒子或Au、Pb等貴金屬粒子以及各種復(fù)合結(jié)構(gòu)。所述的自由基清除劑選自乙醇或甲醇。在本發(fā)明中由于化學(xué)發(fā)光源自?xún)煞N溶液的混合，為獲得最大的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，每種溶液存有一最佳使用濃度，魯米諾溶液最佳使用濃度為I X 10_4M，對(duì)磁性Fe3O4納米粒子最佳使用濃度為25 μ g/mL。當(dāng)選擇磁性Fe3O4納米粒子和質(zhì)量百分濃度99%乙醇為自由基清除劑時(shí)，可以將含至少一個(gè)磷硫單鍵有機(jī)磷農(nóng)藥樣品溶于99%乙醇后加入濃度為25 μ g/mL、pH = 2的磁性Fe3O4納米粒子溶液中，然后加入濃度I X 10_4M的魯米諾溶液，與只加入等量99%乙醇的空白相比，發(fā)光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，據(jù)此確立樣品濃度和發(fā)光強(qiáng)度之間的線(xiàn)性關(guān)系。當(dāng)線(xiàn)性關(guān)系確立后就可按常規(guī)操作對(duì)實(shí)樣進(jìn)行農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明首次利用表面配位抑制自由基清除的原理，設(shè)計(jì)出化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)型傳感器，可用于特定農(nóng)藥成分的敏感檢測(cè)。以有機(jī)磷農(nóng)藥滅線(xiàn)磷為例，其線(xiàn)性范圍為0. I 1000nmol/L 和 I 100 u mol/L,檢出限為 0. lnmol/L。本發(fā)明方法具有化學(xué)發(fā)光傳感器的一切優(yōu)點(diǎn)，如無(wú)需大型儀器，方便快速，靈敏度高，效果顯著。化學(xué)發(fā)光抗干擾能力差，由于實(shí)樣中成分復(fù)雜因此會(huì)嚴(yán)重干擾化學(xué)發(fā)光信號(hào)。在該方法中，可通過(guò)磁性分離的方法克服實(shí)樣成分的干擾。因此不需要富集等復(fù)雜的前處理過(guò)程，操作更簡(jiǎn)單，成本更低。
四

圖I是利用表面配位抑制自由基清除原理構(gòu)筑的化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)型傳感器示意圖。圖2是對(duì)滅線(xiàn)磷的化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)檢測(cè)以及對(duì)應(yīng)的線(xiàn)性關(guān)系圖。圖3是化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)型傳感器對(duì)果汁、綠茶中添加農(nóng)藥的檢測(cè)原理和結(jié)果圖。圖4是化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)型傳感器的選擇性測(cè)試圖。
五具體實(shí)施例方式現(xiàn)以質(zhì)量百分濃度99%乙醇為自由基清除劑和磁性Fe3O4納米粒子為例非限定實(shí)施例敘述如下I、磁性Fe3O4納米粒子的制備參考文獻(xiàn)L. Z. Gao et al, Nat. Nanotech.，2007，2，577 報(bào)道的共沉淀方法。將10 ii L的HCl加入20mL去離子水中，通氮除氧30分鐘后，加入2. 4g的 FeCl2 *4H20和4. 6g的FeCl3 6H20，超聲溶解后經(jīng)過(guò)濾轉(zhuǎn)移到80mL通氮除氧過(guò)的去離子水中，并保持氮?dú)鈿夥?。隨后，將IOmL的氨水逐滴加到上述溶液中，溶液迅速變黃，且顏色逐漸加深，進(jìn)而變黑。滴加完畢，將體系升溫至40°C，反應(yīng)0. 5小時(shí)，再升溫到85°C反應(yīng)2小時(shí)。經(jīng)離心洗滌后重新分散到去離子水中，備用。從XRD花樣可以看出得到的粒子是立方相Fe3O4,晶粒尺寸10nm。使用前將磁性粒子稀釋到pH = 2的去離子水中，濃度為25 u g/
mLo2、滅線(xiàn)磷濃度與發(fā)光強(qiáng)度之間線(xiàn)性關(guān)系的確定將滅線(xiàn)磷溶解在乙醇溶液中，配成系列濃度(1-60 U M)的溶液。將30 ii L的磁性粒子稀釋液加入化學(xué)發(fā)光儀96孔板的孔中，再加入30 y L的滅線(xiàn)磷乙醇溶液，振蕩IOs后， 加入90 y L魯米諾溶液測(cè)試該孔的化學(xué)發(fā)光，以最強(qiáng)峰為標(biāo)準(zhǔn)。為確定化學(xué)發(fā)光檢測(cè)信號(hào)， 需以單純加入30y L乙醇的體系發(fā)光為參考，通過(guò)對(duì)比可以看出，滅線(xiàn)磷增強(qiáng)了化學(xué)發(fā)光， 并且隨著滅線(xiàn)磷濃度的增加化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸增加，如圖2A所示。因此可通過(guò)計(jì)算化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)量來(lái)定量分析滅線(xiàn)磷的濃度，圖2B所示，其線(xiàn)性范圍有兩部分構(gòu)成，分別為0. I 1000nmol/L 和 I 100 u mol/L,檢出限為 0. lnmol/L。3、對(duì)葡萄汁和綠茶中添加農(nóng)藥的檢測(cè)如果直接檢測(cè)葡萄汁中的農(nóng)藥分子，由于內(nèi)部成分的干擾將不能獲得化學(xué)發(fā)光信號(hào)。而在本方法中，通過(guò)磁性粒子的吸附-分離-再分散的過(guò)程(圖3)，可有效克服實(shí)樣成分的干擾，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)。典型的，將含一定濃度農(nóng)藥滅線(xiàn)磷的乙醇溶液添加進(jìn)葡萄汁中，攪拌5分鐘后加入磁性粒子，繼續(xù)攪拌10分鐘使農(nóng)藥配位結(jié)合到粒子表面，然后，通過(guò)外加磁場(chǎng)將磁性粒子分離，棄去果汁溶液再添加一定量的去離子水(pH = 2)，控制粒子濃度為25μ g/mL。按照同樣的步驟，在葡萄汁中加入不含農(nóng)藥的乙醇溶液得到參考粒子溶液。按照步驟2進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)試與檢測(cè)，由于農(nóng)藥分子已經(jīng)配位結(jié)合到磁性粒子上， 因此只需加入30 μ L的乙醇即可。同樣的過(guò)程也被用于綠茶中添加農(nóng)藥的檢測(cè)，但是由于更加復(fù)雜的成分，需要進(jìn)行兩次分離-再分散的過(guò)程。4、磁性Fe3O4納米粒子的選擇性測(cè)試化學(xué)發(fā)光敏感性高，但選擇性差。本發(fā)明對(duì)磁性Fe3O4納米粒子選擇滅線(xiàn)磷ΕΡ、丙溴磷PF、敵百蟲(chóng)DL、毒死蜱CP、甲基對(duì)硫磷ΡΜ、2，4- 二氯苯氧乙酸2，4_D進(jìn)行測(cè)試。如圖4 所示，在濃度均為I X KT4M的條件下，滅線(xiàn)磷引起化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度18倍的增強(qiáng)，丙溴磷的增強(qiáng)倍數(shù)為10，而其它農(nóng)藥對(duì)化學(xué)發(fā)光基本沒(méi)影響。對(duì)比上述幾種農(nóng)藥的分子結(jié)構(gòu)，可以看出該體系可以選擇性檢測(cè)含有硫磷單鍵的農(nóng)藥成分如滅線(xiàn)磷、丙溴磷。
權(quán)利要求
1.一種化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)型檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法，包括類(lèi)酶活性粒子的制備和魯米諾化學(xué)發(fā)光體系的建立，其特征在于所述的化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)是將含至少一個(gè)磷硫單鍵的系列濃度有機(jī)磷農(nóng)藥樣品和自由基清除劑一道加入類(lèi)酶活性粒子溶液中，然后加入化學(xué)發(fā)光劑魯米諾溶液，此時(shí)與只加入等量自由基清除劑的空白相比，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，據(jù)此確立樣品濃度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度之間的線(xiàn)性關(guān)系。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的類(lèi)酶活性粒子是具有類(lèi)酶催化活性的納米粒子，選自磁性Fe3O4XoFe2O4粒子或ZnO、ZnS半導(dǎo)體粒子或Au、Pb貴金屬粒子以及各種復(fù)合結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的自由基清除劑選自乙醇或甲醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于將含至少一個(gè)磷硫單鍵的系列濃度有機(jī)磷農(nóng)藥樣品溶于99%乙醇后加入濃度為25 μ g/mL、pH = 2的磁性Fe3O4納米粒子溶液中， 然后加入濃度1X10_4M的魯米諾溶液，與只加入等量99%乙醇的空白相比，發(fā)光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，據(jù)此確立樣品濃度和發(fā)光強(qiáng)度之間的線(xiàn)性關(guān)系。
全文摘要
一種化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)型檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法，包括類(lèi)酶活性粒子的制備和魯米諾化學(xué)發(fā)光體系的建立，所述的化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)是將含至少一個(gè)磷硫單鍵的系列濃度有機(jī)磷農(nóng)藥樣品和自由基清除劑一道加入類(lèi)酶活性粒子溶液中，然后加入化學(xué)發(fā)光劑魯米諾溶液，此時(shí)與只加入等量自由基清除劑的空白相比，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，據(jù)此確立樣品濃度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度之間的線(xiàn)性關(guān)系。本發(fā)明首次利用表面配位抑制自由基清除的原理，設(shè)計(jì)出化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)型傳感器，可用于特定農(nóng)藥成分的敏感檢測(cè)。以有機(jī)磷農(nóng)藥滅線(xiàn)磷為例，其線(xiàn)性范圍為0.1～1000nmol/L和1～100μmol/L，檢出限為0.1nmol/L。
文檔編號(hào)G01N21/76GK102590192SQ20121003733
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月17日
發(fā)明者關(guān)貴儉, 張忠平 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院