專利名稱：核酸分子在固態(tài)納米孔中的減速方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核酸分子在固態(tài)納米孔中的減速方法。
背景技術(shù)：
基于固態(tài)納米孔器件的DNA單分子探測分析被認為是最有希望實現(xiàn)第三代快速低成本人類基因測序(在24小時內(nèi)花費1000美元以下實現(xiàn)單個人的基因組測序)的技術(shù)路線之一，成為目前研究和應(yīng)用探索的熱點，除哈佛大學(xué)、波士頓大學(xué)、布朗大學(xué)、加州理工學(xué)院、荷蘭代爾夫特工業(yè)大學(xué)等研究小組外，IBM公司也在2009年10月宣布加入下一代人類基因組測序-1000美元計劃，以基于納米孔器件的測序技術(shù)為實現(xiàn)方法，使納米孔的研究由基礎(chǔ)研究開始走向應(yīng)用(D. Branton, et al. Nature Biotechnology26 (10), 1146(2008) ；M. Zwolak and M. Di Ventra, Reviews of Modern Physics 80(1), 141 (2008).)。納米孔是指納米薄膜上直徑5-10納米的介孔。在電解溶液中通過電泳驅(qū)動生物分子如DNA穿過納米孔以實現(xiàn)基于納米孔器件的單分子探測和分析能力。在納米孔的有限空間里可以通過各種手段對大量分子進行快速的分析，當(dāng)高聚物分子穿過納米孔時， 高聚物分子的結(jié)構(gòu)信息和探測的信號特征有一一對應(yīng)關(guān)系。利用該特性可以直接對數(shù)千堿基對長度的單鏈DNA分子進行表征，避免了擴增或標(biāo)記實驗準(zhǔn)備環(huán)節(jié)，使得快速低成本DNA 測序技術(shù)成為可能。目前阻礙這一技術(shù)長足發(fā)展的最大困難在于在電場驅(qū)動電壓下，DNA穿孔速度過快，超出了通用儀器的分辨率，從而無法實現(xiàn)對單堿基的差別識別。目前國際上較為常用的實驗技術(shù)是在納米孔兩端加一個電壓，通過電場驅(qū)動，使 DNA分子從孔一端電泳通過納米孔，在外電路收集的離子電流會出現(xiàn)一個突然下降，電流的突然下降值和阻滯時間，可以對應(yīng)DNA的生物學(xué)信息。但是單純使用電場調(diào)節(jié)，DNA的穿孔速度太快，基本在一個堿基一微秒的量級，而目前儀器的最小分辨率為4微秒，也就是說，如果想要區(qū)別不同堿基之間的差別，通過現(xiàn)有手段，時間分辨率是無法達到的。要提高時間分辨率，就必須使DNA分子的穿孔時間延長，有效減慢DNA在孔中的運動速度。美國 Boston College的Amit Meller等人通過改變Cis和Trans腔填充的溶液鹽濃度,可以在 5nm的SiN納米孔中，實現(xiàn)DNA分子毫秒量級的穿孔過程(M. ffanunu,ff. Morrison, Y. Rabin, A. Y. Grosberg and A. Meller, Nature Nanotechnology, 5,160, (2010))。但是他們對產(chǎn)生這種現(xiàn)象的機理解釋不清楚，而且他們使用的納米孔很小，DNA與納米孔壁之間的相互作用可能會起作用，而這對實驗的可控性大打折扣。而且直徑很小的納米孔在實驗實現(xiàn)起來非常困難，成功率很低。美國哈佛大學(xué)的Mark等人通過快速改變電場方向的方法，可以使通過納米孔的DNA分子再次被捕捉，重新返回并再次穿過納米孔，實現(xiàn)部分的控制DNA在孔中和孔附近的運動(M. Gershow, J. A. Golovchenko, Nature Nanotechnology, 2, 775 (2007))。但是這種方法實驗條件繁瑣，成功率很低，可控性不好，很難實現(xiàn)真正意義上的實用價值。美國阿肯色大學(xué)的Jiali Li等通過在溶液中加入甘油，可以增加DNA的穿孔時間，但是實驗條件要求非?？量?，對實驗技術(shù)要求很高Φ. Fologea, J. Uplinger,B. Thomas,D. S. McNabb, and J. L. Li, Nano Letters 5,1734(2005))。而且隨著甘油的增加，導(dǎo)致溶液粘滯系數(shù)增加，DNA穿孔阻滯電流值幅度下降，這樣測試的信噪比下降，導(dǎo)致測量誤差增大。另外可以通過降低電壓，使DNA穿孔速度減慢，但是電壓降低導(dǎo)致電流信號降低，信噪比變差，導(dǎo)致測量非常困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種納米孔測序法中降低核酸分子穿孔速度的方法。本發(fā)明所提供的降低核酸分子穿孔速度的方法，是基于現(xiàn)有的固態(tài)納米孔測序法，包括下述步驟將待測的核酸分子加入到盛有電解液的納米孔測序裝置中，所述納米孔測序裝置包括設(shè)有正極和負極的電解池、以及分隔所述電解池正極和負極的固態(tài)納米孔薄膜，所述待測的核酸分子置于所述電解池的負極腔室，測定時在正極和負極間施加電壓； 其改進在于測定時同時引入一個壓強外場作為電場的反向外場，從而實現(xiàn)核酸分子的穿孔減速。本發(fā)明中所述核酸分子包括雙鏈或單鏈DNA、RNA以及肽核酸。所引入的壓強外場產(chǎn)生的壓強可為O. 5-2. 5個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓。具體測定時，可根據(jù)所要達到的穿孔速度或穿孔時間以及電解液濃度和電壓值， 在上述壓強范圍內(nèi)經(jīng)過有限次試驗，確定所施加的最佳壓強。測定時，所采用的電解液的濃度為O. 1-3. 2mol/L, pH值為8_10 ;所施加的電壓為 100-250mV。所述電解液可為納米孔測序法中所采用的電解液。通常采用氯化鉀溶液作為 DNA測序時的電解液，其余比如NaCl，LiCl都是可以的。所述固態(tài)納米孔薄膜中納米孔的直徑可為10-20nm，孔深可為20_100nm。本發(fā)明的方法簡單易行，在不降低測量信號信噪比的前提下，使用IOnm左右的 SiN固態(tài)納米孔，有效降低DNA分子穿過納米孔器件的速度，提高現(xiàn)有工作的時間分辨率， 為使用固態(tài)納米孔器件進行DNA測序打下堅實的基礎(chǔ)。本發(fā)明的再一個目的是基于上述減速方法提供一種納米孔測序裝置。該裝置包括設(shè)有正極和負極的電解池、以及分隔所述電解池正極和負極的固態(tài)納米孔薄膜，其還包括一供氣系統(tǒng)，所述供氣系統(tǒng)與電解池的正極腔室通過導(dǎo)管相連。所述固態(tài)納米孔薄膜中納米孔的直徑為10-20nm，孔深為20-100nm。本發(fā)明的方法在外加電場驅(qū)動下，通過反向施加壓強外場作用，可以使DNA分子在通過固態(tài)納米孔時的速度有效降低，實現(xiàn)約50 80%的減速，從而大大提高了 DNA單分子探測技術(shù)的時間分辨率。該方法既可以保持高的電流信號信噪比，又可以避免引入由于使用很小的納米孔(直徑小于5nm)帶來的DNA分子與納米孔壁不可控的相互作用問題，并且實驗簡單易行，重復(fù)性和可控性都比現(xiàn)有技術(shù)有顯著提高。另外，通過調(diào)節(jié)合適的電解液濃度，電壓大小和壓強大小，可以探測到長度低于Ikb的DNA短鏈分子的穿孔過程，這一技術(shù)顯著解放了固態(tài)納米孔對DNA分子探測的長度限制，可以探測到之前相同孔徑納米孔基本無法探測到的DNA長度。而短鏈DNA分子正是下一代基因測序需要攻克的方向之一。本發(fā)明相比與現(xiàn)有對基于固態(tài)納米孔對DNA分子探測的報道，集中的優(yōu)勢體現(xiàn)在1、在不影響信噪比的前提下，反向壓強的引入有效的減慢了 DNA分子在納米孔中的運動速度，大大提高了現(xiàn)有報道的時間分辨率。而時間分辨率低的問題正是困擾固態(tài)納米孔 DNA測序最大的障礙之一，常規(guī)的很多辦法無法實現(xiàn)這一目的。
2、方法簡單，易于操作。相比其他使DNA減速的文獻報道，我們使用的方法非常簡單，只需要購買一個壓強顯示計和一個氣瓶，還有通過簡單連接，即可實現(xiàn)對壓強的引入。 這種方法可重復(fù)性好，非常利于推廣，不需要復(fù)雜的電路設(shè)計和程序設(shè)計。不需要引入復(fù)雜的體系和制作工藝，對技術(shù)要求不高，實驗成功率很高，大大提高了實驗效率。3、使用該技術(shù)可以探測到長度更短的DNA，而不引入壓強時，同樣孔徑的納米孔很難探測到3kb以下的DNA。利用該技術(shù)，我們可以成功探測到3kb，lkb,甚至是600bp的DNA 短鏈分子的穿孔過程。這大大提高了固態(tài)納米孔對DNA長度的探測范圍，擴展了其應(yīng)用范圍，對于早日實現(xiàn)利用固態(tài)納米孔對DNA進行單分子測序打下了很好的基礎(chǔ)。


圖I為本發(fā)明所用固態(tài)納米孔的光刻掩模板的圖形；其中，(a)為4英寸硅片設(shè)計的光刻掩模板圖形，(b)對圖Ia的局部放大圖，白色圓孔區(qū)對應(yīng)的是每個芯片中的圓形透光區(qū)域。(c)對Ib的進一步放大圖,可以清楚看到對應(yīng)于每個芯片中對應(yīng)的圓形透光區(qū)域。(d)為方便從4英寸大硅片上解理單個小芯片，而特殊設(shè)計的劃片線， 用白色虛線表示。圖2為納米孔器件芯片)制作流程示意圖；(a)甩膠，曝光，顯影，去膠， 出圖形(b)反應(yīng)離子束刻蝕刻透一面的氧化娃和氮化娃(C)去掉光刻膠(d)KOH溶液各向異性腐蝕掉硅，露出氧化硅和氮化硅懸空膜(e)用聚焦離子束在氧化硅刻出一個深度為 I. 5μπι的小窗格(f)RCA反應(yīng)將剩余O. 5μπι氧化硅層去掉，只暴露出2μπιΧ2μπι小窗格大小，厚度為70nm的氮化硅懸空膜。圖3(a)離子電流測量與反向壓強加載示意圖；(b)泳池和電極加載裝置圖；(C) 壓強加載裝置圖；(d)壓強顯示計。圖4為長度為IOkb的DNA的穿孔電流-穿孔時間分布圖，其中，(a)不加壓強，(b) 加載一個大氣壓反向壓強。圖5為長度為IOkb的DNA不加載壓強時對應(yīng)的DNA穿孔時間T0，與加載壓強之后穿孔時間T比值與加載反向壓強大小的關(guān)系圖(藍圈為實驗數(shù)據(jù)點，藍線，紅線對應(yīng)為I. 6M 鹽濃度下模擬曲線)。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明的方法進行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實施例、I)制備芯片器件本步驟的目的是制備可以放入透射電子顯微鏡中進行操作的固態(tài)納米孔器件，從而實現(xiàn)利用透射電子顯微鏡中高能會聚電子束對器件懸空薄膜進行打孔操作，從而實現(xiàn)納米孔器件。這其中包括了一系列傳統(tǒng)半導(dǎo)體加工工藝中涉及的微納加工工藝，并且還涉及了一系列現(xiàn)代前沿的納米尺度加工技術(shù)。具體方法如下首先，將(100)面4英寸硅片，兩面分別先后生長2微米的氧化硅，用低壓化學(xué)氣相沉積方法沉積150到200納米左右的低應(yīng)力氮化硅。然后制作光刻掩模版， 目的是要在4英寸的硅片上做成很多3mmX3mm的小基片周期分布(圖Ia),每個3mmX3mm小基片圖形中心有一個直徑為584 μ m的圓形透光區(qū)域 (圖lb，c)。為保證后期在4英寸硅片上分離每個3mmX3mm的小基片，保證分離劃片時走刀的準(zhǔn)確，又使得硅片不會破損成隨機小片，在每個小基片圖案邊界加了一些透光的短劃線透光條的寬度為5 μ m，長度為20μπι(圖Id)。光刻掩模版的具體制作參數(shù)為制版尺寸5英寸；圖形分布范圍Φ100ι πι圓形分布；晶向條距離中心49mm,長50mm,寬O. 8mm。 然后利用光刻(圖2a)和反應(yīng)離子束刻蝕(圖2b)將Si片一面的二氧化硅和氮化硅按照光刻掩模版的圖形刻透，露出Si表面。隨后去掉光刻膠(圖2c)，使用KOH各向異性腐蝕， (40%K0H，80°C，6小時)腐蝕硅，腐蝕沿著(111)面進行。腐蝕穿的標(biāo)準(zhǔn)是小窗格透光后再過腐蝕一段時間。光學(xué)顯微鏡下氧化硅面很平整，沒有島狀結(jié)構(gòu)。這樣就實現(xiàn)了一面只有二氧化娃和氮化娃的小窗格(20 80μηι)懸空膜,下面有娃襯底作支撐(圖2d)。接下來，為了從4英寸的大硅片上分離3_X3mm小基片，需要進行劃片操作。劃片時需要在硅片背面貼上一層強力藍膠做保護，因為在劃片過后，撕開藍膠時容易把懸空膜撕破，所以必須做好防護。辦法是用高溫?zé)崛谙灠汛齽澒杵土硪槐Ｗo硅片用高溫?zé)崛谙炚吃谝黄稹Ｈ缓蟀阉{膠粘在保護硅片的背面，放進劃片機進行劃片，劃片深度為200到250微米左右。劃片過后，把藍膠撕下。把熱融蠟粘在一起的硅片放在熱板上加熱，蠟融化，把硅片分開。上面的蠟用丙酮沖洗干凈即可。這一步可以保證順利解理得到大量3mmX 3mm小基片。一般來講，一張4英寸的娃片，可以解理得到800片3mmX3mm小基片。之后將3mmX3mm小基片放入熱磷酸160°C加熱減薄氮化娃膜厚度,減薄速率為I 5nm每分鐘,減薄到70納米或其它需要的厚度，厚度可以通過橢偏儀監(jiān)控。之后為了降低暴露在溶液中氮化硅膜的面積以減小電容噪聲，并且降低氮化硅膜在溶液中破裂的可能，我們使用聚焦離子束(FIB，DB 235，F(xiàn)EI)刻蝕2微米氧化硅，離子束流300pA，大約刻蝕I分鐘，可以在氮化硅下面形成一個I 2μηιΧ1 2μηιΧ1.5μηι的小窗格,I. 5 μ m是深度。目前我們得到了還剩余500nm 厚氧化硅，I 2μπιΧ1 2μπι的小窗格(圖2e)。然后使用RCA反應(yīng)，將剩余的500nm厚氧化娃腐蝕掉，只剩下I 2 μ mX I 2 μ m小窗格大小,厚度為70nm的氮化娃懸空膜(圖 2f)。其中RCA反應(yīng)為NH3 ·Η20 H2O2 = I I 5 (v/v)，70°C加熱10分鐘，去除硅片上的有機污染，也為了下一步BOE腐蝕時更好的浸潤；BOE (HF NH4F : H2O = I : 2 : 3)腐蝕6分鐘(腐蝕速率為100nm/min)，可以把剩余的500nm氧化硅去除干凈得到懸空的氮化硅膜；HCl H2O2 H2O = I I 5(V/V/V)，，70°C，清洗 10 分鐘，去除無機雜質(zhì)。2)透射電子顯微鏡進行納米孔制作芯片器件加工好之后,放入透射電子顯微鏡(FEI Tecnai F30)進行打孔操作，放大倍數(shù)調(diào)整到520k-890k，束斑大小為1，電子束聚到最小或稍大，5分鐘左右，即可得到直徑IOnm左右、深度為60nm的納米孔。打孔前后，樣品桿要放在等離子體清洗儀中 (O2 Ar = I 3, v/v)里清洗一分鐘，去除有機污染。納米孔器件制作好后，儲存在真空干燥箱里備用。3)離子電流信號測量然后我們通過一系列浸潤過程用PDMS墊片將芯片封裝入由PEEK (聚醚醚酮樹脂) 制成的電泳池中，泳池由Cis腔和Trans腔構(gòu)成，兩個腔之間只通過納米孔進行連接，無其他連接通道。然后向兩個腔中注入濃度為I. 6摩爾每升的氯化鉀溶液。溶液中含有ImM的 EDTA和IOmM的Tris (pH = 8)。我們使用兩個Ag/AgCl電極分別插入Cis腔和Trans腔中， 在納米孔兩端施加IOOmV電壓，Cis腔接負極，Trans腔接正極(圖3a)。首先在沒有注入 DNA分子之前，我們使用的膜片鉗放大器系統(tǒng)給出的是離子電流基準(zhǔn)電流信號，大約幾nA。 離子電流基準(zhǔn)值與納米孔的孔徑大小，孔道深度和離子溶液濃度有關(guān)。在得到穩(wěn)定的基準(zhǔn)離子電流后，我們向Cis腔注入長度為IOkb的DNA分子溶液。由于DNA在溶液中帶負電， 所以DNA在電場驅(qū)動下，由Cis腔向Trans腔運動。此時可以觀測到單個DNA分子的穿孔事件，對應(yīng)的是在基準(zhǔn)電流基礎(chǔ)上的電流突然下降和回復(fù)。這其中，有兩個重要參數(shù)用來表征DNA分子的單次穿孔事件,穿孔電流和穿孔時間。對應(yīng)IOkbDNA分子的穿孔電流為50 IOOpA,穿孔時間平均值為300us左右。4)反向壓強加載與DNA在納米孔中的減速在得到了正常的DNA分子穿孔信號后，在與電場方向相反的方向引入反向壓強。 具體引入方法是在與Trans腔相連的導(dǎo)管上連接于氣瓶相連的導(dǎo)管，使得氣瓶產(chǎn)生的壓強可以被引入到Trans腔中(圖3b，c)。引入壓強的示數(shù)通過氣壓計顯示(圖3d)。通過調(diào)節(jié)氣瓶上的壓強真空計，就可以調(diào)節(jié)被引入到Trans腔中的壓強大小。當(dāng)壓強大小為I 個大氣壓時，DNA分子對應(yīng)的穿孔時間被有效拉長為400us，速度被減慢了 33. 3% (圖4a， b)。進一步加大壓強至I. 5個大氣壓，穿孔時間為500us,穿孔時間延長66. 7% (圖5)。該技術(shù)的一大優(yōu)勢在于壓強的引入不改變電壓值，那么離子電流信號沒有減弱，保持了正常的測量信噪比，這是之前的報道所無法達到的。而之前的很多報道需要通過調(diào)節(jié)電壓或者粘滯系數(shù)的方法，離子電流信號將被減弱，從而造成信噪比的降低。通過調(diào)節(jié)反向壓強的大小，我們做到有效的將DNA分子的穿孔速度降低，在兩個大氣壓的反向壓強作用下，降速可以達到I倍以上。這種方法操作非常簡單，原理清晰，不影響正常測量信噪比，有效延長DNA 穿孔時間，大大提升了利用固態(tài)納米孔對DNA探測的時間分辨率。我們對DNA在壓強作用下的穿孔過程進行了模擬計算，得到的曲線值與我們的實驗數(shù)據(jù)點吻合的很好(圖5)。因為在納米孔中，反向壓強的作用可以抵消掉一部分電場力驅(qū)動作用，使得原來在單一電場力驅(qū)動下的DNA分子運動速度減慢。5)不同長度的DNA分子減速我們不僅嘗試了不同壓強下，DNA分子的減速。我們還對不同長度的DNA分子進行了測試。對3kbDNA，在兩個大氣壓情況下(溶液濃度I. 6M，電壓IOOmV)，成功的將DNA穿孔時間由50us增加到lOOus，延長了一倍。對于lkbDNA，由于其長度較短，利用現(xiàn)有儀器時間分辨率，如果不加壓強，將很難探測到DNA的穿孔信號，因為其穿孔時間已經(jīng)短于儀器的最小分辨率。在施加兩個大氣壓的情況下，IkbDNA的穿孔過程被成功探測，平均穿孔時間為 50us。這是我們技術(shù)的另一大優(yōu)勢所在，可以成功探測到長度更短的DNA分子，而這是現(xiàn)有報道對相同大小孔徑的固態(tài)納米孔很難做到的。
權(quán)利要求
1.一種納米孔測序法中降低核酸分子穿孔速度的方法，包括下述步驟將待測的核酸分子加入到盛有電解液的納米孔測序裝置中，所述納米孔測序裝置包括設(shè)有正極和負極的電解池、以及分隔所述電解池正極和負極的固態(tài)納米孔薄膜，所述待測的核酸分子置于所述電解池的負極腔室，測定時在正極和負極間施加電壓；其特征在于測定時，引入一個壓強外場作為電場的反向外場。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述核酸分子為DNA、RNA或肽核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所引入的壓強外場產(chǎn)生的壓強為0.5-2. 5個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于所述電解液的濃度為0.1-3. 2mol/L, pH 值為 8-10 ;所述電壓為 100_250mv。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于所述固態(tài)納米孔薄膜中納米孔的直徑為10-20nm，孔深為20_100nm。
6.一種納米孔測序裝置，包括設(shè)有正極和負極的電解池、以及分隔所述電解池正極和負極的固態(tài)納米孔薄膜，其特征在于所述納米孔測序裝置還包括一供氣系統(tǒng)，所述供氣系統(tǒng)與電解池的正極腔室通過導(dǎo)管相連。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的納米孔測序裝置，其特征在于所述固態(tài)納米孔薄膜中納米孔的直徑為10-20nm，孔深為20_100nm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種納米孔測序法中降低核酸分子穿孔速度的方法。該方法包括下述步驟將待測的核酸分子加入到盛有電解液的納米孔測序裝置中，所述納米孔測序裝置包括設(shè)有正極和負極的電解池、以及分隔所述電解池正極和負極的固態(tài)納米孔薄膜，所述待測的核酸分子置于所述電解池的負極腔室，測定時在正極和負極間施加電壓，同時引入一個壓強外場作為電場的反向外場。該方法在外加電場驅(qū)動下，通過反向施加壓強外場作用，可以使DNA分子在通過固態(tài)納米孔時的速度有效降低，實現(xiàn)約50～80％的減速，從而大大提高了DNA單分子探測技術(shù)的時間分辨率。在固態(tài)納米孔DNA分子測序器件方向有著非常光明的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N27/403GK102590314SQ20121003985
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月20日
發(fā)明者俞大鵬, 趙清, 魯鉑 申請人:北京大學(xué)