專利名稱：考馬斯亮藍(lán)染色液及其染色方法和在蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)染色領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及考馬斯亮藍(lán)染色液及其染色方法和在蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的蛋白質(zhì)染色方法大致有以下四種，考馬斯亮藍(lán)染色法、熒光染色法、硝酸銀染色法、同位素顯色法等。其中，熒光染色以SYPRO試劑為主，蛋白質(zhì)檢測(cè)靈敏度高，能兼容質(zhì)譜，但由于需要配備特殊的檢測(cè)儀器及昂貴的試劑，未被作為常規(guī)方法使用；同位素顯色法則存在安全性和操作局限性等問題，也未能被廣泛使用；硝酸銀染色法是目前公認(rèn)的除放射性標(biāo)記以外的一種最為靈敏的蛋白檢測(cè)方法，可在納克級(jí)水平上檢測(cè)SDS-PAGE膠上的蛋白質(zhì)，但是，其步驟繁瑣，成本高，對(duì)環(huán)境的污染嚴(yán)重；更為嚴(yán)重的是，其在脫色過(guò)程中所使用的戊二醛等醛類物質(zhì)會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行不可逆的修飾，嚴(yán)重干擾后期的質(zhì)譜鑒定工作。因此，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，更傾向于采用經(jīng)典的考馬斯亮藍(lán)染色法。經(jīng)典的考馬斯亮藍(lán)染色法具有良好的重復(fù)性、極低的染色背景、較高的靈敏度 (大約O. 5 μ g/mm2)以及優(yōu)良的質(zhì)譜兼容性。特別是經(jīng)過(guò)Neuhoff等人(Neuhoff,V. ,Arold, N. , Taube, D. , Ehrhardt ff. , Electrophoresis 1988,9,255)的開創(chuàng)性工作之后，發(fā)明了改良型考馬斯亮藍(lán)染色法，該方法的靈敏度得到了顯著提高，可以檢測(cè)到蛋白質(zhì)總量約為 30納克的條帶，其所使用的考馬斯亮藍(lán)染色液的成分如下2%磷酸、10%硫酸銨、20%甲醇、O. I %考馬斯亮藍(lán)G250。隨后，在Neuhoff等人的研究基礎(chǔ)上，Candiano及其合作者 (Giovanni C. , Maurizio B. , Luca M. , Electrophoresis 2004, 25,1327-1333)發(fā)明了一種被稱為Blue Silver的考馬斯亮藍(lán)染色方法，該方法能夠檢測(cè)到僅含有10納克蛋白的條帶，靈敏度接近銀染法，據(jù)稱是目前所報(bào)道的考馬斯亮藍(lán)染色方法中靈敏度最高的一種，其所使用的考馬斯亮藍(lán)染色液的成分與NeuhofT等人的研究相比，區(qū)別在于增加考馬斯亮藍(lán) G250的含量(由O. I %升至O. 12% )、磷酸的含量(由2%升至10% )。但這種方法需要在水中脫色很長(zhǎng)的時(shí)間，使得膠吸水膨大，變得非常脆，極易破裂，不利于后續(xù)的研究工作。因此，需要一種新的考馬斯亮藍(lán)染色液和染色方法，能夠在保證靈敏度的情況下， 以更低的成本實(shí)現(xiàn)對(duì)SDS-PAGE膠的染色。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種考馬斯亮藍(lán)染色液及其染色方法和在蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用，旨在保證靈敏度(IOng)的情況下，進(jìn)一步降低SDS-PAGE膠染色成本，并解決脫色后膠容易破碎的問題。為了實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種考馬斯亮藍(lán)染色液，所述染色液是包含體積百分濃度為10% 20%的醇，體積百分濃度為4. 5% 10%的酸，質(zhì)量體積濃度為5% 10%的硫酸銨，質(zhì)量體積濃度為O. 01% O. 1%的考馬斯亮藍(lán)的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍(lán)包括G250和 R250中的至少一種。優(yōu)選的，所述染色液是包含體積百分濃度為10% 20%的醇，體積百分濃度為
4.75 % 8. 5 %的酸，質(zhì)量體積濃度為5 % 8. 5 %的硫酸銨，質(zhì)量體積濃度為O. 01 % O. I %的考馬斯亮藍(lán)的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍(lán)包括G250和R250中的至少一種。更優(yōu)選的，所述染色液是包含體積百分濃度為15% 20%的乙醇，體積百分濃度為4. 75 % 8. 5 %的磷酸，質(zhì)量體積濃度為5 % 8. 5 %的硫酸銨，質(zhì)量體積濃度為 O. 01% O. 03%的考馬斯亮藍(lán)G250的水溶液。本發(fā)明還提供了一種基于上述任一種考馬斯亮藍(lán)染色液的染色方法，包括以下步驟A.染色將SDS-PAGE膠置于考馬斯亮藍(lán)染色液中，染色45min以上；B.脫色用水沖洗染色后的SDS-PAGE膠，將染色液沖洗干凈即可；所述考馬斯亮藍(lán)染色液是包含體積百分濃度為10% 20%的醇，體積百分濃度為4. 5% 10%的酸，質(zhì)量體積濃度為5% 10%的硫酸銨，質(zhì)量體積濃度為O. 01%
O.I %的考馬斯亮藍(lán)的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍(lán)包括G250和R250中的至少一種；。其中，在步驟A之前還包括步驟A’.固定將SDS-PAGE膠在固定液中固定5min 30min ;所述固定液是包含體積百分濃度為20% 50%的醇，體積百分濃度為I % 5%的酸的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸、乙酸和三氯乙酸中的至少一種。優(yōu)選的，步驟A’所述固定液是包含體積百分濃度為25% 35%的乙醇，體積百分濃度為3% 5%的磷酸的水溶液；固定時(shí)間為IOmin 20min。其中，在步驟A’之前還可包括步驟A”.漂洗用水沖洗SDS-PAGE膠。上述任一方案中，優(yōu)選的，步驟A所述染色液是包含體積百分濃度為10% 20% 的醇，體積百分濃度為4. 75% 8. 5%的酸，質(zhì)量體積濃度為5% 8. 5%的硫酸銨，質(zhì)量體積濃度為O. 01% O. I %的考馬斯亮藍(lán)的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍(lán)包括G250和R250中的至少一種。更優(yōu)選的，步驟A所述染色液是包含體積百分濃度為15% 20%的乙醇，體積百分濃度為4. 75% 8. 5%的磷酸，質(zhì)量體積濃度為5% 8. 5 %的硫酸銨，質(zhì)量體積濃度為
O.01% O. 03%的考馬斯亮藍(lán)G250的水溶液，染色時(shí)間為45min 70min。通過(guò)上述任一種染色液處理過(guò)的SDS-PAGE膠均能應(yīng)用于蛋白質(zhì)的定性和/或定
量檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)Blue Sliver法相比，本發(fā)明通過(guò)降低考馬斯亮藍(lán)等的濃度，使得本發(fā)明的考馬斯亮藍(lán)染色液和染色方法能夠在保證靈敏度(IOng)的情況下，以更低的成本實(shí)現(xiàn)對(duì)SDS-PAGE膠的染色，且脫色后的膠不易破碎，不會(huì)給后續(xù)的質(zhì)譜等研究工作造成困難。


圖I是本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)組一的染色結(jié)果2是本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)組二的染色結(jié)果3是本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)組三的染色結(jié)果4是本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)組四的染色結(jié)果5是本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)組五的染色結(jié)果6是本發(fā)明的對(duì)照組的染色結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。一種考馬斯亮藍(lán)染色液，所述染色液是包含體積百分濃度(v/v)為10% 20%的醇，體積百分濃度(v/v)為4. 5% 10%的酸，質(zhì)量體積濃度(w/v)為5% 10%的硫酸銨， 質(zhì)量體積濃度(w/v)為O. 01% O. I %的考馬斯亮藍(lán)的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍(lán)包括G250和R250中的至少一種?？捡R斯亮藍(lán)濃度越高，其對(duì)SD-PAGE膠中的蛋白質(zhì)的雜色越深，即靈敏度越高，但可能加深凝膠的背景，Candiano等在綜合考慮這兩種影響以后，在改良型考馬斯亮藍(lán)染色法的基礎(chǔ)上，將考馬斯亮藍(lán)G250的含量提高了 20%，同時(shí)將磷酸的含量提高了 400%，從而得出了目前靈敏度最高的考馬斯亮藍(lán)染色液(Blue Sliver法)。本發(fā)明的染色液降低了考馬斯亮藍(lán)等的濃度，但是其靈敏度與Blue Sliver法相同(IOng)或更高，又因?yàn)槔帽景l(fā)明的考馬斯亮藍(lán)染色液對(duì)SDS-PAGE膠進(jìn)行染色時(shí)，染色液與SDS-PAGE膠體積的對(duì)應(yīng)關(guān)系， 與Blue Silver法中的染色液與SDS-PAGE膠體積的對(duì)應(yīng)關(guān)系相同，只需將SDS-PAGE膠完全沒入染色液中即可。在目前的市場(chǎng)上，甲醇的價(jià)格較乙醇高，G250和R250的單價(jià)相同，磷酸的價(jià)格較乙酸高，因此本發(fā)明方案中的醇的成本至多為Blue Sliver法中的50% 100%， 酸的成本至多為Blue Sliver法中的45% 100%,硫酸銨的成本至多為Blue Sliver法中的50% 100%,考馬斯亮藍(lán)的成本為Blue Sliver法中的十二分之一至六分之五。所以本發(fā)明的考馬斯亮藍(lán)染色液能夠在保證靈敏度(IOng)的情況下，以更低的成本實(shí)現(xiàn)對(duì) SDS-PAGE膠的染色?，F(xiàn)有技術(shù)中，染色液中使用的醇為甲醇，而在本發(fā)明的染色液中，醇包括甲醇和乙醇中的至少一種。當(dāng)該醇為甲醇和乙醇的混合液時(shí)，混合液中的甲醇可用等體積的乙醇替代。本發(fā)明的考馬斯亮藍(lán)染色液能夠在保證靈敏度(IOng)的情況下，以更低的成本實(shí)現(xiàn)對(duì) SDS-PAGE膠的染色。優(yōu)選的，所述醇為乙醇，以降低染色液的毒性，使操作更安全，且能進(jìn)一步降低成本。蛋白質(zhì)著色顯示的靈敏度與染色試劑直接相關(guān)，本發(fā)明中采用是考馬斯亮藍(lán) G250、R250或G250和R250的混合物。因?yàn)镚250與蛋白的結(jié)合速度比R250更快，因此，當(dāng)僅是考馬斯亮藍(lán)種類(G250或R250)不同時(shí)，含G250的染色液能進(jìn)一步的縮短染色時(shí)間； 而含R250的染色液的靈敏度更高，染色后的脫色更快，背景更清晰。優(yōu)選的，考馬斯亮藍(lán)含量為O. 01% O. 05% (w/v);該方案中，考馬斯亮藍(lán)的成本僅為Blue Silver法中的十二分之一至十二分之五。更優(yōu)選的，考馬斯亮藍(lán)含量為O. 01% O. 03% (w/v)，即該方案中， 考馬斯亮藍(lán)的成本僅為Blue Silver法中的十二分之一至四分之一。與Blue Silver法相比，上述方案中的考馬斯亮藍(lán)含量更低，因?yàn)榭捡R斯亮藍(lán)的溶解度不高，所以，本發(fā)明的染色液在保證了靈敏度(IOng)的情況下，既降低了成本，又使得染色液的配置更為方便，不易出現(xiàn)沉淀；而沉淀的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致染色液在染色過(guò)程中出現(xiàn)染色不均勻的現(xiàn)象。在本發(fā)明的染色液中，所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種。當(dāng)所述酸含有多種組分時(shí)，磷酸和乙酸相互之間能夠以相同的體積分?jǐn)?shù)替換，例如1% (v/v)的磷酸可用1% (v/v)的乙酸替換。在酸的體積百分比一定的情況下，磷酸的染色效果更佳。優(yōu)選的，所述酸的含量為4. 75% 8. 5% (v/v) 0更優(yōu)選的，所述酸為磷酸；該方案中，磷酸的成本僅為 Blue Silver法中的4. 75% 8. 5%。其中，磷酸在染色液中既能輔助固定蛋白質(zhì),又維持了染色液的PH值，有利于考馬斯亮藍(lán)G250或R250與蛋白質(zhì)的結(jié)合，使得染色背景更清晰， 有利于獲得信噪比高的圖像；此外，磷酸的揮發(fā)性較乙酸更低，使得本發(fā)明的染色液的刺激性降低，更易為操作者接受。上述方案均在保證了靈敏度(IOng)的情況下，降低了染色液的成本。優(yōu)選的，硫酸銨的含量為5% 8. 5% (w/v);該方案中，硫酸銨的成本僅為Blue Silver法中的50% 85%。當(dāng)把本發(fā)明的染色液中的硫酸銨去除后，染色液的靈敏度僅為IOOng左右，硫酸銨的加入，使得染色液成為酸性的離子溶液，在該溶液中蛋白質(zhì)的葡萄胺和天冬酰胺發(fā)生質(zhì)子化，使得考馬斯亮藍(lán)與蛋白的結(jié)合更為緊密，從而極大的提高了染色液的靈敏度。上述方案均在保證了靈敏度(IOng)的情況下，降低了染色液的成本。水質(zhì)對(duì)染色液的靈敏度也有一定的影響，本發(fā)明中所述的水可采用蒸餾水、雙蒸水或超純水，優(yōu)選超純水。一種基于上述任一種考馬斯亮藍(lán)染色液的染色方法，包括以下步驟A.染色將SDS-PAGE膠置于考馬斯亮藍(lán)染色液中，染色45min以上；B.脫色用水沖洗染色后的SDS-PAGE膠，將染色液沖洗干凈即可；所述染色液是包含體積百分濃度為10% 20%的醇，體積百分濃度為4. 5% 10 %的酸，質(zhì)量體積濃度為5 % 10 %的硫酸銨，質(zhì)量體積濃度為O. 01 % O. I %的考馬斯亮藍(lán)的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍(lán)包括G250和R250中的至少一種。上述的染色方法，能夠在更短的時(shí)間內(nèi)完成對(duì)SDS-PAGE膠的染色，且其染色背景較Blue Silver法更低，靈敏度為IOng或更高。其中，在步驟A之前還包括步驟A’ .固定將SDS-PAGE膠在固定液中固定5min 30min ;所述固定液是包含體積百分濃度為20% 50%的醇，體積百分濃度為1% 5%的酸的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸、乙酸和三氯乙酸中的至少一種。通過(guò)固定步驟, SDS-PAGE膠中的蛋白被固定在凝膠中，不易擴(kuò)散，進(jìn)一步提高了染色液的靈敏度；且通過(guò)固定步驟可去除在電泳過(guò)程中遺留在SDS-PAGE膠上的干擾染色過(guò)程的物質(zhì)，如去垢劑、還原劑和緩沖液等成分。在酸的體積百分比一定的情況下，固定液中酸的成本排列如下乙酸< 磷酸 <三氯乙酸，但是經(jīng)固定以后染色的效果以三氯乙酸最佳，其次是磷酸，最后是乙酸。優(yōu)選的，步驟A’所述固定液是包含體積百分濃度為25% 35%的乙醇，體積百分濃度為3% 5%的磷酸的水溶液；固定時(shí)間為IOmin 20min。本方案中，所述醇為乙醇， 不含甲醇，降低了固定液的毒性，使操作更安全；所述酸為磷酸，本方案綜合考慮了固定液中酸的成本，酸的揮發(fā)性對(duì)操作者的影響，以及固定液的效果。其中，在步驟A’之前還包括步驟A”.漂洗用水沖洗SDS-PAGE膠。通過(guò)漂洗步驟，可沖去在電泳過(guò)程中遺留在 SDS-PAGE膠上的干擾染色過(guò)程的物質(zhì)，如去垢劑、還原劑和緩沖液等成分，尤其是SDS,而 SDS的存在會(huì)使染色液在染色過(guò)程中出現(xiàn)沉淀，干擾考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)的集合，從而影響染色效果。優(yōu)選的，步驟A所述染色液是包含體積百分濃度為15% 20%的乙醇，體積百分濃度為4. 75 % 8. 5 %的磷酸，質(zhì)量體積濃度為5 % 8. 5 %的硫酸銨，質(zhì)量體積濃度為O. 01% O. 03%的考馬斯亮藍(lán)G250的水溶液，染色時(shí)間為45min 70min。本方案對(duì) SDS-PAGE膠的染色效果更好，背景更低，靈敏度在5ng IOng之間，較Blue Sliver法更聞?？捡R斯亮藍(lán)染色液的配置，以體積百分濃度為20%的乙醇，體積百分濃度為5% 的磷酸，質(zhì)量體積濃度為5%的硫酸銨，質(zhì)量體積濃度為O. 02%的考馬斯亮藍(lán)G250的水溶液為例。在終體積IOOmL的超純水中加入相應(yīng)的磷酸，使其終濃度為5 % (v/v)，攪拌均勻；然后加入硫酸銨，使其終濃度為5% (w/v)，攪拌使其徹底溶解；然后加入考馬斯亮藍(lán) G2500. 02g，邊加邊攪拌，當(dāng)G250全部溶解后，加入600mL的超純水，然后加入適量的無(wú)水乙醇，使其終濃度為20% (v/v)，然后用超純水定容至1000mL。配置好后置于棕色瓶中密封保存。其它配比的考馬斯亮藍(lán)染色液均可參照上述方法進(jìn)行配置。例如配比一:0.01% (w/v)G250,10% (v/v)磷酸,9% (w/v)硫酸銨，18% (v/v)乙醇。 本配比的考馬斯亮藍(lán)染色液的靈敏度為10ng，與Blue Sliver考馬斯亮藍(lán)染色法中的染色液相同，成本則更低。配比二0.1% (w/v) G250, 2% (v/v)磷酸,2.8% (v/v)乙酸,5% (w/v)硫酸銨， 11% (v/v)甲醇。本配比的考馬斯亮藍(lán)染色液的靈敏度為5ng，比Blue Sliver考馬斯亮藍(lán)染色法中的染色液高，成本則更低。配比三0.07%(w/v)G250,5. 5% (v/v)乙酸，7.5% (w/v)硫酸銨,7% (v/v)乙醇，7% (v/v)甲醇。本配比的考馬斯亮藍(lán)染色液的靈敏度為5ng，比Blue Sliver考馬斯亮藍(lán)染色法中的染色液高，成本則更低。配比四:0.02%(w/v) R250, 7. I % (v/v)磷酸,8% (w/v)硫酸銨，7% (v/v)乙醇， 9% (v/v)甲醇。本配比的考馬斯亮藍(lán)染色液的靈敏度為5ng，比Blue Sliver考馬斯亮藍(lán)染色法中的染色液更高，成本則更低。配比五0.04%(w/v)R250,6% (v/v)磷酸，5% (w/v)硫酸銨，20% (v/v)甲醇。 本配比的考馬斯亮藍(lán)染色液的靈敏度為5ng，比Blue Sliver考馬斯亮藍(lán)染色法中的染色液高，成本則更低。
配比六0.07%(w/v) R250,4. 5% (v/v)乙酸,9.5% (w/v)硫酸銨，13% (v/v)乙醇。本配比的考馬斯亮藍(lán)染色液的靈敏度為5ng，比Blue Sliver考馬斯亮藍(lán)染色法中的染色液高，成本則更低。配比七0.I % (w/v) R250,10% (v/v)乙酸,6. 3% (w/v)硫酸銨，10% (v/v)乙醇。 本配比的考馬斯亮藍(lán)染色液的靈敏度為5ng，比Blue Sliver考馬斯亮藍(lán)染色法中的染色液高，成本則更低。配比八0.009%(w/v)G250,0. 001 % (w/v)R250,10% (v/v)憐酸，10% (w/v)硫酸銨，18% (v/v)乙醇。本配比的考馬斯亮藍(lán)染色液的靈敏度為10ng，與Blue Sliver考馬斯亮藍(lán)染色法中的染色液相同，成本則更低。配比九0.015%(w/v)G250,0. 005% (w/v)R250,9% (v/v)磷酸，9. 5% (w/v)硫酸銨，10% (v/v)乙醇，5% (v/v)甲醇。本配比的考馬斯亮藍(lán)染色液的靈敏度為5ng，比 Blue Sliver考馬斯亮藍(lán)染色法中的染色液更高，成本則更低。配比十0.01%(w/v)G250,0. 03 % (w/v) R250, 3 % (v/v)憐酸，3% (v/v)乙酸， 7% (w/v)硫酸銨，12% (v/v)甲醇。本配比的考馬斯亮藍(lán)染色液的靈敏度為5ng，比Blue Sliver考馬斯亮藍(lán)染色法中的染色液更高，成本則更低。配比十一:0.03% (w/v)G250,0. 04% (w/v)R250,4. 5% (v/v)憐酸，5% (w/v)硫酸銨，10% (v/v)乙醇。本配比的考馬斯亮藍(lán)染色液的靈敏度為5ng，比Blue Sliver考馬斯亮藍(lán)染色法中的染色液更高，成本則更低?？捡R斯亮藍(lán)染色液靈敏度實(shí)驗(yàn)以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)樣品，配置系列濃度的溶液，分別為20ng/ μ L、 16ng/ μ L、10ng/ μ L、6ng/ μ L、4ng/ μ L、2ng/ μ L、lng/ μ L、0. 2ng/ μ L ;各樣品的上樣量均為5 μ L,即各孔上樣量分別為100ng、80ng、50ng、30ng、20ng、10ng、5ng、lng。電泳完成后分別按下述方法進(jìn)行染色處理。實(shí)驗(yàn)組一考馬斯亮藍(lán)染色液0.02% (w/v)G250,5% (v/v)磷酸，5% (w/v)硫酸銨，20% (v/v)乙醇。固定液30%(v/v)乙醇、5% (v/v)磷酸。染色方法I)漂洗蒸餾水沖洗SDS-PAGE膠兩次，每次30s ；2)固定固定液固定15min ；3)染色染色液染色I(xiàn)h ；4)脫色蒸餾水沖洗染色后的SDS-PAGE膠，每次30s，重復(fù)4次。實(shí)驗(yàn)組二 考馬斯亮藍(lán)染色液0.01%(w/v)R250,2% (v/v)乙酸，8% (v/v)磷酸，10% (w/ v)硫酸銨，15% (v/v)乙醇。染色方法I)漂洗蒸餾水沖洗SDS-PAGE膠兩次，每次30s ；2)染色染色液染色70min ；3)脫色蒸餾水沖洗染色后的SDS-PAGE膠，每次30s，重復(fù)4次。
實(shí)驗(yàn)組三考馬斯亮藍(lán)染色液0.03% (w/v)G250,4. 5% (v/v)磷酸，8· 5% (w/v)硫酸銨， 20% (v/v)甲醇。固定液20% (v/v)甲醇、3% (v/v)三氯乙酸。染色方法I)漂洗蒸餾水沖洗SDS-PAGE膠兩次，每次30s ；2)固定固定液固定30min ；3)染色染色液染色a ；4)脫色蒸餾水沖洗染色后的SDS-PAGE膠，每次30s，重復(fù)4次。實(shí)驗(yàn)組四考馬斯亮藍(lán)染色液0.05% (w/v)G250,8. 5% (v/v)乙酸，7% (w/v)硫酸銨，10% (v/v)乙醇。固定液50%(v/v)乙醇、O. 5% (v/v)磷酸,0.5% (v/v)三氯乙酸。染色方法I)漂洗蒸餾水沖洗SDS-PAGE膠兩次，每次30s ；2)固定:固定液固定5min ；3)染色染色液染色45min ；4)脫色蒸餾水沖洗染色后的SDS-PAGE膠，每次30s，重復(fù)4次。實(shí)驗(yàn)組五考馬斯亮藍(lán)染色液0.05% (w/v)G250,0. 05% (w/v)R250,4. 75% (v/v)磷酸，6% (w/v)硫酸銨，20% (v/v)乙醇。固定液40%(v/v)乙醇、2% (v/v)乙酸。染色方法I)漂洗蒸餾水沖洗SDS-PAGE膠兩次，每次30s ；2)固定固定液固定20min ；3)染色染色液染色I(xiàn)h ；4)脫色蒸餾水沖洗染色后的SDS-PAGE膠，每次30s，重復(fù)4次。對(duì)照組的染色液按Blue Sliver 法(Giovanni C. , Maurizio B. , Luca Μ., Electrophoresis 2004，25，1327-1333)進(jìn)行配置和染色。實(shí)驗(yàn)組一至五和對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別如圖I至6所示。其中，實(shí)驗(yàn)組一的靈敏度為5ng,較對(duì)照組(Blue Sliver法)高,且成本更低。另外，其脫色過(guò)程中，SDS-PAGE膠在水中浸泡的時(shí)間僅為2min，脫色后的膠與脫色前相比，觀察不到膨大現(xiàn)象，仍然能夠保持很好的韌性，不易破碎，不會(huì)給后續(xù)的質(zhì)譜等研究工作造成困難。實(shí)驗(yàn)組二的靈敏度為10ng，與對(duì)照組相同，但其成本更低。另外，其脫色過(guò)程中， SDS-PAGE膠在水中浸泡的時(shí)間僅為2min，脫色后的膠與脫色前相比，觀察不到膨大現(xiàn)象， 仍然能夠保持很好的韌性，不易破碎，不會(huì)給后續(xù)的質(zhì)譜等研究工作造成困難。實(shí)驗(yàn)組三的靈敏度為5ng,較對(duì)照組(Blue Sliver法)高,且成本更低。另外,其脫色過(guò)程中，SDS-PAGE膠在水中浸泡的時(shí)間僅為2min，脫色后的膠與脫色前相比，觀察不到膨大現(xiàn)象，仍然能夠保持很好的韌性，不易破碎，不會(huì)給后續(xù)的質(zhì)譜等研究工作造成困難。實(shí)驗(yàn)組四的靈敏度為5ng,較對(duì)照組(Blue Sliver法)高,且成本更低。另外,其脫色過(guò)程中，SDS-PAGE膠在水中浸泡的時(shí)間僅為2min，脫色后的膠與脫色前相比，觀察不到膨大現(xiàn)象，仍然能夠保持很好的韌性，不易破碎，不會(huì)給后續(xù)的質(zhì)譜等研究工作造成困難。實(shí)驗(yàn)組五的靈敏度為5ng,較對(duì)照組(Blue Sliver法)高,且成本更低。另外,其脫色過(guò)程中，SDS-PAGE膠在水中浸泡的時(shí)間僅為2min，脫色后的膠與脫色前相比，觀察不到膨大現(xiàn)象，仍然能夠保持很好的韌性，不易破碎，不會(huì)給后續(xù)的質(zhì)譜等研究工作造成困難。總體來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)組背景均較對(duì)照組淺，實(shí)驗(yàn)組一、三、四、五的靈敏度均在5ng左右，實(shí)驗(yàn)組二和對(duì)照組的靈敏度在IOng左右，即本發(fā)明的考馬斯亮藍(lán)染色液和染色方法與 Blue Sliver法相同或更高，本發(fā)明能在保證靈敏度的情況下，進(jìn)一步降低考馬斯亮藍(lán)染色法的成本。另外，根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明人觀察，SDS-PAGE膠經(jīng)本發(fā)明的染色方法染色后脫色的時(shí)間極短(SDS-PAGE膠在水中浸泡的時(shí)間為2min)，脫色后的SDS-PAGE膠未見明顯脹大， 仍然保持較好的韌性，而Blue Sliver法處理的SDS-PAGE膠明顯脹大，在拍膠的時(shí)候需非常小心，以防膠破碎。應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，上述實(shí)驗(yàn)組所體現(xiàn)的染色液配方及染色方法是本發(fā)明的幾種具體實(shí)施方式
，是為了清楚的闡述本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)效果，各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)的染色液配方和染色方法之間并不是唯一的對(duì)應(yīng)關(guān)系，脫色的時(shí)間可根據(jù)需要進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，例如延長(zhǎng)或縮短 SDS-PAGE膠的浸泡總時(shí)間。應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，本發(fā)明的所有染色液配方均能通過(guò)本發(fā)明的染色方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)SDS-PAGE膠中蛋白質(zhì)的成功染色。另外，本發(fā)明的染色液和染色方法的應(yīng)用不限于蛋白質(zhì)質(zhì)譜研究，在其他的蛋白質(zhì)定性和定量檢測(cè)中的應(yīng)用也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種考馬斯亮藍(lán)染色液，其特征在于，所述染色液是包含體積百分濃度為10% 20%的醇，體積百分濃度為4. 5% 10%的酸，質(zhì)量體積濃度為5% 10%的硫酸銨，質(zhì)量體積濃度為O. 01% O. I %的考馬斯亮藍(lán)的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍(lán)包括G250和R250中的至少一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的考馬斯亮藍(lán)染色液，其特征在于，所述染色液是包含體積百分濃度為10% 20%的醇，體積百分濃度為4. 75% 8. 5%的酸，質(zhì)量體積濃度為5% 8.5%的硫酸銨，質(zhì)量體積濃度為O. 01% O. I %的考馬斯亮藍(lán)的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍(lán)包括G250和R250中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的考馬斯亮藍(lán)染色液，其特征在于，所述染色液是包含體積百分濃度為15 % 20 %的乙醇，體積百分濃度為4. 75 % 8. 5 %的磷酸，質(zhì)量體積濃度為 5% 8. 5%的硫酸銨，質(zhì)量體積濃度為O. 01% O. 03%的考馬斯亮藍(lán)G250的水溶液。
4.一種考馬斯亮藍(lán)染色方法，其特征在于，包括以下步驟A.染色將SDS-PAGE膠置于考馬斯亮藍(lán)染色液中，染色45min以上；B.脫色用水沖洗染色后的SDS-PAGE膠，將染色液沖洗干凈即可；所述考馬斯亮藍(lán)染色液是包含體積百分濃度為10% 20%的醇，體積百分濃度為4.5% 10%的酸，質(zhì)量體積濃度為5% 10%的硫酸銨，質(zhì)量體積濃度為O. 01% O. I % 的考馬斯亮藍(lán)的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍(lán)包括G250和R250中的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的考馬斯亮藍(lán)染色方法，其特征在于，在步驟A之前還包括步驟A’.固定將SDS-PAGE膠在固定液中固5min 30min ;所述固定液是包含體積百分濃度為20% 50%的醇，體積百分濃度為1% 5%的酸的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸、乙酸和三氯乙酸中的至少一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的考馬斯亮藍(lán)染色方法，其特征在于，步驟A’所述固定液是包含體積百分濃度為25 % 35 %的乙醇，體積百分濃度為3 % 5 %的磷酸的水溶液；固定時(shí)間為 IOmin 20min。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的考馬斯亮藍(lán)染色方法，其特征在于，在步驟A’之前還包括步驟A” .漂洗用水沖洗SDS-PAGE膠。
8.根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項(xiàng)所述的考馬斯亮藍(lán)染色方法，其特征在于，步驟A所述染色液是包含體積百分濃度為10% 20%的醇，體積百分濃度為4. 75% 8. 5%的酸，質(zhì)量體積濃度為5 % 8. 5 %的硫酸銨，質(zhì)量體積濃度為O. 01 % O. I %的考馬斯亮藍(lán)的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍(lán)包括G250和R250中的至少一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的考馬斯亮藍(lán)染色方法，其特征在于，步驟A所述染色液是包含體積百分濃度為15% 20%的乙醇，體積百分濃度為4. 75% 8. 5%的磷酸，質(zhì)量體積濃度為5% 8. 5%的硫酸銨，質(zhì)量體積濃度為O. 01% O. 03%的考馬斯亮藍(lán)G250的水溶液，染色時(shí)間為45min 70min。
10.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述考馬斯亮藍(lán)染色液在蛋白質(zhì)的定性和/或定量檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)染色領(lǐng)域，具體涉及一種考馬斯亮藍(lán)染色液及其染色方法和在蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用。所述考馬斯亮藍(lán)染色液是包含10％～20％(v/v)的醇，4.5％～10％(v/v)的酸，5％～10％(w/v)的硫酸銨，0.01％～0.1％(w/v)的考馬斯亮藍(lán)的水溶液。所述方法包括以下步驟A.染色將SDS-PAGE膠置于考馬斯亮藍(lán)染色液中，染色45min以上；B.脫色用水沖洗染色后的SDS-PAGE膠，將染色液沖洗干凈即可。本發(fā)明的考馬斯亮藍(lán)染色液和染色方法能夠在保證靈敏度不降低的情況下，以更低的成本實(shí)現(xiàn)對(duì)SDS-PAGE膠的染色，且脫色后的膠不易破碎，不會(huì)給后續(xù)的質(zhì)譜等研究工作造成困難。
文檔編號(hào)G01N1/30GK102604425SQ20121004787
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者盛司潼 申請(qǐng)人:盛司潼