專利名稱：一種用于汞離子快速檢測的納米生物傳感器方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用汞離子特異性寡核苷酸探針和納米金構(gòu)建一種快速比色檢測水中汞離子的納米生物傳感器方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
汞離子的檢測長期以來一直受到研究人員的高度關(guān)注。自工業(yè)革命起，汞被運用到生產(chǎn)生活中，環(huán)境里的汞含量日益增長，汞污染范圍也逐年擴(kuò)大。據(jù)統(tǒng)計，汞在全球水體中的含量比數(shù)年前已增加了三倍左右，工業(yè)區(qū)附近汞的含量則更高。由于汞污染具有高遷移性和持久性，可通過甲基化、生物富集以及食物鏈放大作用，會對環(huán)境以及人類健康造成極大的危害。傳統(tǒng)的汞離子檢測方法包括原子吸收光譜、質(zhì)譜法等，往往需要大型儀器，成本昂貴，操作復(fù)雜耗時，且需要熟練人員操作。近年來，國內(nèi)外已發(fā)展了許多汞離子檢測方法，其中利用汞離子可使胸腺嘧啶(Thymine，T)之間形成特異的錯配結(jié)合(T-Hg2+-T)這一特性構(gòu)建的一系列納米金方法尤為突出。納米金是指顆粒尺寸為納米數(shù)量級的金微小顆粒，通常在水溶液中以膠體的形態(tài)存在，故又稱膠體金。納米金的最大吸收波長與納米金的粒徑和彼此間距離相關(guān)，納米金粒徑從小到大的變化過程中，其顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色；同樣地，納米金的聚集會使吸收峰產(chǎn)生明顯的紅移而變?yōu)樗{(lán)色。此外，單鏈DNA能夠以很高的親和性自發(fā)吸附到未加修飾的帶負(fù)電荷的納米金顆粒上，而雙鏈DNA的吸附則較弱。因此，在一定濃度的鹽離子條件下，有單鏈DNA吸附的納米金在單鏈DNA的保護(hù)下較為穩(wěn)定，在鹽溶液中保持良好的分散性而仍然呈紅色，而雙鏈DNA溶液中的納米金粒子會因為聚集而呈現(xiàn)由紅變紫的顏色變化。利用DNA-納米金這種距離-顏色效應(yīng)的光學(xué)性質(zhì)，研究者們發(fā)展了很多基于納米金的聚集、分散狀態(tài)變化的Hg2+檢測方法。2007 年初，Mirkin 課題組(Angewandte Chemie 2007，119，(22)，4171-4174)設(shè)計了兩段寡核苷酸探針，序列分別為5’HS-C1Q-A1(I-T-A1(I3’和5’HS-C1Q-T1(I-T-T1(I3’。而當(dāng)溶液中有Hg2+存在時，T-T錯配之間因Hg2+而形成特異的鍵合，使得兩探針之間的Tm值明顯升高，從而定量分析Hg2+。但該方法需要嚴(yán)格的溫度控制，不易于推廣使用。Xuejia Xue等人 (Angewandte Chemie 2007,119, (22) ,4171-4174)通過改良組裝到納米金表面的寡核苷酸探針，并引入了第三段序列l(wèi)inker DNA,使linker DNA能與兩個探針序列同時雜交。該檢測方法在室溫下即可進(jìn)行，但需要三條寡核苷酸探針，其中兩條仍需要經(jīng)過巰基修飾，繁瑣耗時且價格昂貴。Lihua Wang等(Gold Bulletin 2008，41，(I)，37-41)報道利用一條聚 T寡核苷酸探針，通過Hg2+特異性穩(wěn)定T-T錯配形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使與聚T寡核苷酸探針結(jié)合的納米金失去保護(hù)而在高鹽條件下聚集，并產(chǎn)生紅色-藍(lán)色的顏色變化，實現(xiàn)對Hg2+的快速便捷分析，但靈敏度有待提聞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有的汞離子檢測方法存在的不足，提供一種利
3用優(yōu)化的汞離子特異性寡核苷酸探針和納米金快速比色檢測水中汞離子的納米生物傳感器方法及其試劑盒。本發(fā)明的第一個目的是公開一種新型的納米生物傳感器，以及利用此傳感技術(shù)進(jìn)行快速檢測汞離子的方法。這種新方法可包括以下步驟(I)將待檢測水溶液和汞離子寡核苷酸探針混合，室溫反應(yīng)；(2)將納米金加入到上述溶液中，室溫反應(yīng)；(3)最后加入NaNO3,觀察顏色變化，并進(jìn)行可見光光譜檢測。本發(fā)明的第二個目的是提供一種基于納米生物傳感器的汞離子快速檢測試劑盒， 它含有(I)納米金,其粒徑約15nm,濃度約為2. 97nmol/L ；(2)兩種汞離子寡核苷酸探針,最適濃度都為ΙΟμπιοΙ/L ；(3) NaNO3 溶液，最適濃度為 O. 5mol/L ；(4)陽性對照溶液和陰性對照溶液；(5)說明書。試劑盒中的納米金、汞離子寡核苷酸探針和NaNO3溶液等可以是濃縮液。我們對已有汞離子寡核苷酸探針的進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計，去除非特異的環(huán)部分(4bp)， 截取兩端的莖部分(9bp)，經(jīng)試驗成功獲得信噪比更高的汞離子特異性核苷酸探針。原因可能是單鏈DNA吸附于納米金的效率與序列的長度有關(guān)，即短序列比長序列吸附效率更高， 從而能使納米金在高鹽條件下更穩(wěn)定，這與Huixiang Li等人報道一致。我們在此基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了一種可以快速比色檢測Hg2+的納米生物傳感器。該納米生物傳感器通過兩條截短MSO吸附的納米金顏色變化和A65tlA522的改變實現(xiàn)對Hg2+的初步檢測。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的條兩截短的汞離子特異性核苷酸探針(9bp)，寡核苷酸探針序列更短、無需標(biāo)記；納米生物傳感器方法和試劑盒在不使用任何特殊儀器條件下就可以實現(xiàn)對Hg2+可視化便捷分析，操作簡便，檢測時間短，靈敏度較高，特異性強(qiáng)，對很多非特異性金屬離子的響應(yīng)都非常小，特別適合野外現(xiàn)場大批量樣本檢測。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。圖IMSO優(yōu)化設(shè)計圖2NaN03濃度優(yōu)化圖3A65(i/A522值隨時間變化曲線圖4Hg2+檢測靈敏度分析圖5Hg2+檢測特異性評價圖6汞離子納米生物傳感器的TEM圖(注a圖為陰性對照(X 100000) ；b圖為陽性對照(X 100000)。圖7比色檢測混合溶液圖8比色檢測河水模擬標(biāo)本
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。以下是部分本發(fā)明實施例中所用的儀器和設(shè)備，其他未注明的實驗條件按照常規(guī)或以其制造廠商所建議的條件Varioskan Flash多功能讀數(shù)儀(美國Thermo Scientific 公司)；透射電子顯微鏡H-7500(日本日立株式會)；加熱磁力攪拌器DF-IOlS(鞏義予華儀器責(zé)任有限公司)；紫外-可見光光譜分光光度計U-3010 (日本日立株式會)；5417R小型臺式高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司);PURELAB Classic超純水儀(英國ELGA Labffater 公司)。實施例IMSO優(yōu)化設(shè)計本研究選用的MSO序列見表1，其中MSO1為Lihua Wang等人報道的汞離子特異性寡核苷酸探針(莖環(huán)結(jié)構(gòu))。為了能夠提高汞離子檢測的靈敏度，并降低DNA的合成成本， 對MSO1進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，去除非特異的環(huán)部分(4bp)，截取兩端的莖部分(9bp)，分別標(biāo)記為 MSO2 和 MSO3。表I汞離子特異性寡核苷酸
權(quán)利要求
1.一種特異性檢測汞離子的納米生物傳感方器法，其特征在于，依次包括以下步驟(1)將待檢測水溶液和汞離子寡核苷酸探針混合,室溫反應(yīng)；(2)將納米金加入到上述溶液中，室溫反應(yīng)；(3)最后加入NaNO3,觀察顏色變化，并進(jìn)行可見光光譜檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的特異性檢測汞離子的納米生物傳感方器法，其特征在于，將汞離子寡核苷酸探針通過范德華力吸附到納米金表面，實現(xiàn)納米生物傳感器的組裝。如果溶液中不存在汞離子，在高鹽條件下，MSO可以穩(wěn)定溶液中的納米金而不會發(fā)生聚集；如果溶液中存在汞離子，MSO與汞離子特異性結(jié)合所形成的穩(wěn)定的T-Hg2+-T配位化合物(類似雙鏈的結(jié)構(gòu))，從而因靜電斥力不能吸附到納米金顆粒表面，導(dǎo)致納米金顆粒相互聚集，表面等離子吸收峰發(fā)生紅移，通過顏色變化和A65cZA522改變即可定性或定量檢測溶液中的汞離子。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的特異性檢測汞離子的納米生物傳感方器法，其特征在于，步驟(I)所述的汞離子寡核苷酸探針堿基組成為5’ -TTCTTTCTT-3’和5’ -TTGTTTGTT-3’，室溫反應(yīng)時間為5分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的特異性檢測汞離子的納米生物傳感方器法，其特征在于，步驟(2)所述納米金的粒徑為15 20nm，室溫反應(yīng)時間為5分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的特異性檢測汞離子的納米生物傳感方器法，其特征在于，步驟⑵所述納米金溶液配制方法將IOOmL的O. 01%的氯金酸水溶液加熱至劇烈沸騰后， 劇烈攪拌下快速加入3. 5mL的I %檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱攪拌20min后，停止加熱，繼續(xù)攪拌30min后靜置,室溫自然冷卻,用O. 22 μ m濾膜過濾。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的特異性檢測汞離子的納米生物傳感方器法，其特征在于，步驟(3)所述NaNO3的濃度為的O. 5mol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的特異性檢測汞離子的納米生物傳感方器法，其特征在于，步驟(3)所述NaNO3加入后的最佳反應(yīng)為15分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的定性檢測溶液中的汞離子的判斷方法，其特征在于，加入 NaNO3后納米金顏色由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樽仙蛩{(lán)色，提示待測溶液中含有汞離子。
9.一種納米生物傳感器試劑盒，其特征在于，適用于環(huán)境水中汞離子的快速檢測，含有(1)納米金，其粒徑約15nm,濃度約為2.97nmol/L ；(2)兩種汞離子寡核苷酸探針,最適濃度都為lOymol/L;(3)NaNO3溶液，最適濃度為O. 5mol/L ；(4)陽性對照溶液和陰性對照溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能快速比色檢測水中Hg2+的納米生物傳感器，該傳感器基于汞離子特異性寡核苷酸探針和納米金，對汞離子特異性核苷酸探針進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，并吸附到納米金顆粒表面，實現(xiàn)生物傳感器的組裝；利用汞離子特異性穩(wěn)定T-T錯配和納米金顆粒在高鹽條件下的顏色變化，從而實現(xiàn)對Hg2+的定量分析。該納米生物傳感器不需要標(biāo)記探針或者修飾納米金，在不使用任何特殊條件下就可以實現(xiàn)對汞離子可視化便捷分析，具有操作簡便、檢測時間短、靈敏度較高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點，易于推廣使用。
文檔編號G01N21/31GK102608108SQ20121005263
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月21日
發(fā)明者呂建新, 吳文鶴 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院