專利名稱：馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
馬鈴薯紡錘塊莖類病毒病是威脅我國(guó)馬鈴薯生產(chǎn)的檢疫性病害，但該病害在我國(guó)卻普遍存在，因此，準(zhǔn)確的檢驗(yàn)技術(shù)和方法對(duì)于防治馬鈴薯紡錘塊莖類病毒病至關(guān)重要。然而，無論采用哪種技術(shù)，都必須有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，即陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，沒有這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，檢測(cè)工作就無法進(jìn)行。然而目前馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要采用繁殖陽(yáng)性或陰性植株的方式來獲得，這種方式進(jìn)行活體保存非常不方便，需要不斷的繁殖，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要解決現(xiàn)有馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保存非常不方便，需要不斷的繁殖，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的問題，提供馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法。本發(fā)明馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，按以下步驟進(jìn)行一、采用常規(guī)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢驗(yàn)方法對(duì)馬鈴薯植物組織進(jìn)行檢驗(yàn)，將感染了馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的馬鈴薯植物組織作為陽(yáng)性組織，將沒有感染馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的馬鈴薯植物組織作為陰性組織；二、將陽(yáng)性組織在常溫下自然干燥至恒重，之后進(jìn)行粉碎至80 目，得到陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；將陰性組織在常溫下自然干燥至恒重，之后進(jìn)行粉碎至80目，得到陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行密封，于室溫、干燥條件下保存，即完成馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備。步驟一所述常規(guī)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)方法為聚丙烯酰胺往返電泳 (R-PAGE)、核酸斑點(diǎn)雜交(NASH)或 RT-PCR。本發(fā)明的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在使用時(shí)所取用量為待檢新鮮樣品所取質(zhì)量的1/5 1/2，其他使用方法與待檢新鮮樣品相同。本發(fā)明創(chuàng)造以非常簡(jiǎn)潔的方式研制出了馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作簡(jiǎn)單，保存和使用都很方便，對(duì)于防治馬鈴薯紡錘塊莖類病毒必不可少。本發(fā)明制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保存容易，保存時(shí)間長(zhǎng)，在室溫、干燥條件下保存I年后仍可以使用。常規(guī)的馬鈴薯類病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備一般采用組織培養(yǎng)繼代或種植保存法，這些方法消耗大量的人力、物力、財(cái)力和空間，而且，一旦操作不當(dāng)，隔離控制不嚴(yán)格還容易是病原外流，傳染健康的馬鈴薯，對(duì)生產(chǎn)造成威脅。本發(fā)明的制備過程極為簡(jiǎn)單，無需高端設(shè)備，使用方便，準(zhǔn)確性好，保存和運(yùn)輸方便，填補(bǔ)了我國(guó)沒有馬鈴薯紡錘塊莖類病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的空白。


圖I為傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與具體實(shí)施方式
一制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行核酸斑點(diǎn)雜交的檢測(cè)結(jié)果；圖2為傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與具體實(shí)施方式
一制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺往返電泳的檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法， 按以下步驟進(jìn)行一、采用常規(guī)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢驗(yàn)方法對(duì)馬鈴薯植物組織進(jìn)行檢驗(yàn)，將感染了馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的馬鈴薯植物組織作為陽(yáng)性組織，將沒有感染馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的馬鈴薯植物組織作為陰性組織；二、將陽(yáng)性組織在常溫下自然干燥至恒重，之后進(jìn)行粉碎至80目，得到陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；將陰性組織在常溫下自然干燥至恒重，之后進(jìn)行粉碎至80目，得到陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行密封，于室溫、干燥條件下保存，即完成馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備。為驗(yàn)證馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用效果，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)(一)核酸斑點(diǎn)雜交I、類病毒樣品RNA的提取取O. 2g傳統(tǒng)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(即感染紡錘塊莖類病毒的馬鈴薯)和O. 04g O. Ig本實(shí)施方式制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別進(jìn)行以下操作放于研樣袋中， 加入O. 3mL提取緩沖液，磨碎，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，37°C孵育15min，加入等體積的氯仿 (O. 3mL)，振蕩離心管，直至出現(xiàn)乳狀液，短暫離心至溶液分離，吸出上清液即為RNA樣品， 4°C保存，備用。2、點(diǎn)樣及固定吸取2 μ L受檢樣品RNA提取液，點(diǎn)在尼龍膜的方塊格中，將點(diǎn)樣后的膜放在紫外交聯(lián)儀上正反面各交聯(lián)lmin，能量為1200。3、雜交取5mL的雜交液，加入I μ L探針，混勻，將固定好的膜放入雜交管中，排除氣泡， 68。。，8 15rpm雜交過夜。4、洗膜a.用鑷子取出膜，放入裝有20mL 2 X SSC, O. 1% SDS溶液的平皿中，在室溫下振蕩洗漆2次，每次5min。b.用鑷子將膜轉(zhuǎn)入雜交管，加入適量O. I X SSC, O. 1% SDS溶液(先55°C預(yù)熱)， 在雜交管中用最大轉(zhuǎn)速洗漆2次,每次15min, 55 °C。c.將膜取出轉(zhuǎn)入裝有20mL洗滌緩沖液的平皿中振蕩洗滌5min。5、孵育(在15 25 °C下攪拌進(jìn)行)I)在20 30mL阻斷液中孵育30min ；2)在IOmL抗體液中孵育30min ；3)在20 30mL洗滌液中洗滌2 X 15min ；4)在15mL檢測(cè)緩沖液中平衡2 5min ；6、信號(hào)檢測(cè)將膜夾在兩層保鮮膜中間，將上層保鮮膜提起，在膜上均勻涂上新鮮配制的NBT/BCIP顯色液，然后避光存放，顯色，當(dāng)達(dá)到所需的點(diǎn)強(qiáng)度后(約30min)，照相或復(fù)印備存。7、結(jié)果尼龍膜上出現(xiàn)藍(lán)紫色斑點(diǎn)者為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒陽(yáng)性樣品。檢測(cè)結(jié)果如圖I 所示，圖中I和2為傳統(tǒng)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，3和4為本實(shí)施方式制備的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)?？梢钥闯鰞烧叩臋z測(cè)效果相當(dāng)。( 二)聚丙烯酰胺往返電泳I、樣品粗提液制備取傳統(tǒng)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)O. 5g(5cm以上的試管苗)和O. Ig O. 25g本實(shí)施方式制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別進(jìn)行以下操作放入冷凍后的研缽中，加入少許皂土和SDS進(jìn)行研磨。研碎后向研缽中加入ImL核酸提取緩沖液，ImL Tris飽和酹，ImL氯仿， 10 μ L巰基乙醇,充分研磨。4°C, 10000r/min離心15min,將上層水相轉(zhuǎn)移到另一清潔的離心管中，約400 μ L。加入150 μ L NaAc，lmL冷無水乙醇，靜置于-20°C的冰箱中I. 5h以上。2、核酸提取將凍存的離心管取出，4°C、10000r/min離心15min，棄上清，控干。待水吸干后，向離心管中加75%冷乙醇，加入量是離心管容積的1/3，清洗3次，將剩余乙醇全部揮發(fā)掉。3、試樣獲得將TAE緩沖液300 μ L加入到盛有核酸的I. 5mL離心管中進(jìn)行溶解，_20°C備用。4、測(cè)定步驟4. I制板取潔凈電泳槽，瓊脂糖溶液封底，注入聚丙烯酰胺凝膠，加樣梳插入做成泳道。4. 2加樣取核酸提取物10 20 μ L，與5 10 μ L指示劑混勻加入樣品孔。4. 3正向電泳加入TBE電泳緩沖液工作液，進(jìn)行從負(fù)極到正級(jí)電泳，電泳儀電壓調(diào)到200V。當(dāng)示蹤染料遷移到凝膠底部時(shí)，停止正向電泳。將電泳槽中緩沖液倒入燒杯，把電泳槽置于電熱烘箱中75°C變性15min，向電泳槽中加入75°C的TBE緩沖液工作液。4. 4反向電泳在烘箱中進(jìn)行從正極到負(fù)極的反向電泳，電泳儀電壓調(diào)至100 200V，當(dāng)二甲苯蘭示蹤染料帶遷移到距膠板上方2cm左右時(shí)停止電泳，取出凝膠片進(jìn)行染色。4. 5固定把凝膠片放在置有500mL核酸固定液的培養(yǎng)皿中，輕輕振蕩IOmin,固定
O.5 lh，然后用50mL注射器吸掉固定液。4. 6染色向培養(yǎng)皿中加入300mL染色液，輕輕振蕩lOmin，染色30 60min，然后吸出染色液。4. 7漂洗用蒸餾水清洗凝膠板，以除掉殘留的染色液，共沖洗三次，每次用水 200 400mL，每次沖洗15S。4. 8顯影加入核酸顯影液200 400mL，輕輕搖蕩，直到核酸帶顯現(xiàn)清楚為止，吸出顯影液，將凝膠放入固定液中拍照或放入增色液中。4. 9增色吸出顯影液,加入增色液200 400mL,增色5min,吸掉增色液，自來水終止，拍照。5、結(jié)果出現(xiàn)特異性條帶的為陽(yáng)性結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，圖中泳道a和b為傳統(tǒng)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，泳道c和d為本實(shí)施方式制備的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。 可以看出兩者的檢測(cè)效果相當(dāng)。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一所述常規(guī)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)方法為聚丙烯酰胺往返電泳、核酸斑點(diǎn)雜交或RT-PCR。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一所述馬鈴薯植物組織為馬鈴薯塊莖、葉片或莖桿。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
權(quán)利要求
1.馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，按以下步驟進(jìn)行一、采用常規(guī)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢驗(yàn)方法對(duì)馬鈴薯植物組織進(jìn)行檢驗(yàn)，將感染了馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的馬鈴薯植物組織作為陽(yáng)性組織，將沒有感染馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的馬鈴薯植物組織作為陰性組織；二、將陽(yáng)性組織在常溫下自然干燥至恒重，之后進(jìn)行粉碎至80目，得到陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；將陰性組織在常溫下自然干燥至恒重，之后進(jìn)行粉碎至80目，得到陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行密封，于室溫、干燥條件下保存，即完成馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于步驟一所述常規(guī)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)方法為聚丙烯酰胺往返電泳、核酸斑點(diǎn)雜交或RT-PCR。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于步驟一所述馬鈴薯植物組織為馬鈴薯塊莖、葉片或莖桿。
全文摘要
馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，涉及一種馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法。是要解決現(xiàn)有馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保存非常不方便，需要不斷的繁殖，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的問題。方法采用常規(guī)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢驗(yàn)方法對(duì)馬鈴薯植物組織進(jìn)行檢驗(yàn)，將感染了馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的馬鈴薯植物組織作為陽(yáng)性組織，將沒有感染馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的馬鈴薯植物組織作為陰性組織；將陽(yáng)性組織和陰性組織在常溫下自然干燥至恒重，之后進(jìn)行粉碎至80目，于室溫、干燥條件下保存，即完成。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)潔，制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保存容易，保存時(shí)間長(zhǎng)。
文檔編號(hào)G01N1/28GK102607909SQ20121005359
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月2日
發(fā)明者劉尚武, 呂典秋, 宿飛飛, 張抒, 李勇, 王文重, 王紹鵬, 白艷菊, 董學(xué)志, 邱彩玲, 魏琪 申請(qǐng)人:黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所