專利名稱：用于生物學(xué)樣品中大量熒光標(biāo)記物的定位的系統(tǒng)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體涉及聚焦帶電粒子束系統(tǒng)，并且具體地涉及用于對(duì)樣品中的熒光標(biāo)記物進(jìn)行激發(fā)和定位的系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
目前生物學(xué)研究正在日益集中于將多種細(xì)胞組分的細(xì)胞內(nèi)位置確定至甚至更高的空間分辨率。對(duì)于電子顯微鏡(TEMs、STEMs、SEMs等)以及所有類型的光學(xué)顯微鏡，這涉及用以增強(qiáng)圖像分辨率和對(duì)比度的很多不同的技術(shù)，包括最新的超分辨率技術(shù)。對(duì)于細(xì)胞結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和運(yùn)動(dòng)的研究獲得廣泛認(rèn)可的一種強(qiáng)效技術(shù)是應(yīng)用 重組遺傳技術(shù)將“報(bào)告”基因連接到“目標(biāo)基因”(GoIs)上。因此，當(dāng)特定GoI在正常的基因轉(zhuǎn)錄/翻譯過程中表達(dá)時(shí)，報(bào)告基因也將表達(dá)，產(chǎn)生末端附著于由GoI編碼的“目標(biāo)蛋白質(zhì)”(PoI)上的小蛋白質(zhì)。一種公認(rèn)的報(bào)告基因是編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因，這些報(bào)告基因可以以野生形式或者經(jīng)遺傳修飾的形式利用，并且所表達(dá)的GFPs具有發(fā)射波長(zhǎng)從藍(lán)色擴(kuò)展至黃色的熒光。GFP相對(duì)小(29.6kDa，直徑為3nm，長(zhǎng)度為4nm)，其中其發(fā)色團(tuán)被充分地保護(hù)在里面并且不需要任何輔因子以發(fā)射光。使GFP “發(fā)光”所需要的所有條件是利用波長(zhǎng)比GFP的發(fā)射波長(zhǎng)稍短的激光進(jìn)行照射。GFPs顯示對(duì)其所附著的PoI的適當(dāng)功能基本上是“惰性的”，這在一些情況下通過利用短且靈活的多肽“接頭”使GFP與PoI相連得以保證，所述接頭使得GFP能夠自由圍繞蛋白質(zhì)而搖擺，這可能是為了保持研究者所研究的細(xì)胞功能而必須不被干擾的一些胞內(nèi)結(jié)構(gòu)或者機(jī)制的一部分。顯然，如果可以精確地確定GFP在細(xì)胞內(nèi)的X-Y-Z位置(比如說精確度為IOnm)，則可以以類似的精確度得知PoI的位置?？梢酝ㄟ^光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)熒光的GFP，因而可以在顯微鏡中看到PoI相對(duì)于樣品中可觀察到的結(jié)構(gòu)的位置。已經(jīng)提出并且在一些情況下闡述了現(xiàn)有技術(shù)中的幾種技術(shù)，其用于由多種熒光標(biāo)記物(FMs)例如GFPs以及量子點(diǎn)獲得主要的位點(diǎn)信息。在一種技術(shù)中，使用綠色激光對(duì)樣品中的熒光標(biāo)記物(FMs)中的一小部分進(jìn)行激發(fā)，接著使樣品成像。利用高斯曲線(Gaussian curve)擬合,可以在基本小于成像系統(tǒng)的衍射極限的20nm的FWHM內(nèi)確定FMs的位置。利用多次綠色激光閃光并且交替使用使熒光消失的紅色熒光閃光，可以在通?？珊馁M(fèi)數(shù)十分鐘的過程中確定大量FMs的位置。在描述于Buijsse等人的美國(guó)專利號(hào)7，317，515 “對(duì)熒光標(biāo)記物進(jìn)行定位的方法”(轉(zhuǎn)讓于本申請(qǐng)的受讓人，通過引用并入本文)的另一種技術(shù)中，帶電粒子束對(duì)樣品表面進(jìn)行掃描，當(dāng)束擊中FM時(shí)破壞標(biāo)記物并使熒光消失。當(dāng)熒光消失時(shí)，F(xiàn)M的位置對(duì)應(yīng)于帶電粒子束的位點(diǎn)。由于可以將帶電粒子束聚焦于比照射標(biāo)記物的激光小得多的點(diǎn)，并且可以非常精確地確定掃描過程中任何時(shí)間處帶電粒子束的位點(diǎn)，F(xiàn)M的位點(diǎn)以及因而PoI的位點(diǎn)可以以類似的精確度確定。在本文對(duì)本發(fā)明的所有描述中，術(shù)語GFP將用于表示可以被帶電粒子束(包括電子或者離子)破壞的FMs較大家族，包括GFPs、有機(jī)染料以及無機(jī)標(biāo)記物例如量子點(diǎn)(通常使其功能化，以使得能夠選擇性地附著于特定細(xì)胞內(nèi)組分例如蛋白質(zhì)、核酸等上)。
用于對(duì)生物學(xué)樣品中的FMs進(jìn)行定位的很多現(xiàn)有技術(shù)方法僅對(duì)相對(duì)少量的FMs起作用，從中在任何一次使小的子集活化，因此成像時(shí)間可以是很多分鐘并且仍然受到光學(xué)成像的一些限制。使用帶電粒子束選擇性地破壞樣品中FMs的現(xiàn)有技術(shù)方法利用了僅能夠處理相對(duì)少量FMs的圖像處理方法，對(duì)于這些方法，統(tǒng)計(jì)學(xué)信噪比將其應(yīng)用限制于不固有地以大密度出現(xiàn)的FMs。這特別是對(duì)于GFPs存在障礙，因?yàn)樵诨蜣D(zhuǎn)錄成mRNA隨后翻譯成蛋白質(zhì)(GoI+接頭+GFP)的正常細(xì)胞過程中可以產(chǎn)生非常大量的任何類型的可表達(dá)標(biāo)簽(與功能化標(biāo)簽例如量子點(diǎn)相對(duì))。因此，需要一種快速的方法以在時(shí)間框架內(nèi)例如I分鐘級(jí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞組分中非常大量(彡10000)的FMsjB CFPs進(jìn)行定位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種改進(jìn)的方法和設(shè)備，以定位樣品中的目標(biāo)蛋白質(zhì)。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包括能夠使含有熒光標(biāo)記物(FMs)，例如綠色熒光蛋白(GFPs)或者量子點(diǎn)的樣品成像的帶電粒子設(shè)備和方法，其中利用標(biāo)準(zhǔn)的電子顯微信號(hào)，例 如二次電子(secondary electrons, SEs)或者透射電子(未散射、彈性散射和/或非彈性散射)，同時(shí)利用激光激發(fā)FMs并收集由被激發(fā)的FMs發(fā)射的光?！獋€(gè)實(shí)施方案包括一種檢測(cè)器光學(xué)器件(detector optics)配置,其對(duì)于二次電子和發(fā)射光均表現(xiàn)非常大的收集立體角，其中不存在兩種類型檢測(cè)器之間的干擾，所述干擾會(huì)傾向于使Ses和光各自的收集立體角減小。本發(fā)明的一些實(shí)施方案包括一種示例性圖像處理方法，與利用現(xiàn)有技術(shù)中較簡(jiǎn)單的圖像處理方案而可能發(fā)生的相比，其潛在地能夠同時(shí)對(duì)較大(例如> 10000)數(shù)目的FMs進(jìn)行定位(在持續(xù)大約I分鐘的單次成像掃描過程中)。前面相當(dāng)寬泛地概括了本發(fā)明的特性和技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，以便可以更好地理解以下對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述。本發(fā)明的附加特性和優(yōu)點(diǎn)將在下文中描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，可以容易地利用所公開的構(gòu)思和具體實(shí)施方案作為改動(dòng)或者設(shè)計(jì)其他結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，以實(shí)施本發(fā)明的相同目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，這種等同構(gòu)造不背離所附權(quán)利要求中所說明的本發(fā)明的精神和范圍。


為了更全面地理解本發(fā)明和其優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)參考以下描述以及所附附圖，其中圖I顯示目標(biāo)蛋白質(zhì)(PoI)的示意圖，其中綠色熒光蛋白(GFP)通過接頭附著于其上。圖2是X-Y掃描光柵的示意圖，圖解了含有GFPs的像素和不含GFPs的像素。圖3是本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案的示意圖，其包括位于樣品上方的檢測(cè)器光學(xué)器件。圖4A是圖3中的檢測(cè)器光學(xué)器件的光和二次電子軌跡的側(cè)視圖。圖4B是圖3和4A中檢測(cè)器光學(xué)器件的剖面等軸視圖。圖5是本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案的示意圖，其包括位于樣品下方的檢測(cè)器光學(xué)器件。圖6是本發(fā)明的第三個(gè)實(shí)施方案的示意圖，其包括位于樣品上方和下方的檢測(cè)器光學(xué)器件。圖7是在對(duì)含有100個(gè)GFPs的掃描場(chǎng)進(jìn)行光柵掃描的過程中信號(hào)作為時(shí)間函數(shù)的圖。圖8是顯示圖7中圖表初始階段的特寫圖，其顯示總共100個(gè)GFPs中前8個(gè)GPFs的破壞。圖9是在對(duì)含有10000個(gè)GFPs的掃描場(chǎng)進(jìn)行光柵掃描的過程中信號(hào)作為時(shí)間函數(shù)的圖。
圖10是顯示圖9中圖表初始階段的特寫圖，其顯示總共10000個(gè)GFPs中前8個(gè)GPFs的破壞。圖11是顯示光柵掃描過程中具有統(tǒng)計(jì)噪聲的原始信號(hào)和平滑信號(hào)作為時(shí)間函數(shù)的圖，其顯示總共100個(gè)GFPs中前3個(gè)GPFs的破壞。圖12 是顯不平滑函數(shù)和導(dǎo)函數(shù)(smoothing function and the derivativefunction)的圖。圖13是顯示光柵掃描過程中具有統(tǒng)計(jì)噪聲的原始信號(hào)、平滑信號(hào)和平滑導(dǎo)數(shù)作為時(shí)間函數(shù)的圖，其顯示總共100個(gè)GFPs中前3個(gè)GPFs的破壞。圖14是顯示光柵掃描過程中具有統(tǒng)計(jì)噪聲的原始信號(hào)和平滑信號(hào)作為時(shí)間函數(shù)的圖，其顯示總共10000個(gè)GFPs中前3個(gè)GPFs的破壞。圖15是顯示光柵掃描過程中具有統(tǒng)計(jì)噪聲的原始信號(hào)、平滑信號(hào)和平滑導(dǎo)數(shù)作為時(shí)間函數(shù)的圖，其顯示總共10000個(gè)GFPs中前3個(gè)GPFs的破壞。圖16是顯示圖像處理方法的性能的柱狀圖，所述方法用于對(duì)掃描場(chǎng)中總共10000個(gè)GFPs中的前3個(gè)GFPs進(jìn)行檢測(cè)的過程中在大量統(tǒng)計(jì)噪聲的存在下確定掃描信號(hào)內(nèi)GFPs的位置。圖17是該圖像處理方法的優(yōu)化結(jié)果圖。圖18是本發(fā)明中用于對(duì)樣品中的可表達(dá)標(biāo)簽例如GFPs進(jìn)行定位的方法的流程圖。圖19是本發(fā)明中用于對(duì)樣品中的功能化標(biāo)簽例如量子點(diǎn)進(jìn)行定位的方法的流程圖。圖20是聯(lián)合二次電子和熒光標(biāo)記物圖像的示意圖。圖21是用于對(duì)熒光標(biāo)記物進(jìn)行定位的圖像處理方法的流程圖。
具體實(shí)施方案本發(fā)明的一些實(shí)施方案提供了帶電粒子系統(tǒng)，其包括檢測(cè)器光學(xué)器件系統(tǒng)，其經(jīng)優(yōu)化以同時(shí)對(duì)二次電子和光的收集效率均非常高，而不存在兩種類型檢測(cè)器之間的空間干擾。在一些實(shí)施方案中，這通過樣品上方和/或下方的至少一個(gè)鏡、優(yōu)選拋物面鏡以使由帶電粒子束碰撞的樣品表面上的點(diǎn)在或接近于拋物面(一個(gè)或者兩個(gè))的焦點(diǎn)而完成。焦點(diǎn)“接近于”帶電顆粒是指由鏡反射的光所照射的區(qū)域包括并且大于帶電粒子束所碰撞的區(qū)域。此外，拋物面光鏡的傳導(dǎo)表面(通常是金屬的)是被電偏置(通常負(fù)幾百伏)，以在樣品和鏡之間提供電場(chǎng)，使二次電子偏轉(zhuǎn)以使其不碰撞鏡并將二次電子反射至檢測(cè)器。因此，從樣品發(fā)射的光子和二次電子(SEs)均可被收集入大的立體角中，優(yōu)選大于π/4球面度，更優(yōu)選大于η/2球面度，甚至更優(yōu)選大于π球面度，提供其中光和SE立體角空間上分離并且互相干擾的檢測(cè)器系統(tǒng)以前不能達(dá)到的效率(和產(chǎn)生的較高信噪比)。優(yōu)選使二次電子檢測(cè)器位于帶電粒子束離開圖3、4Α和4Β中鏡314的點(diǎn)的下方。除了這些高效光檢測(cè)系統(tǒng)之外，一些實(shí)施方案中提出光信號(hào)的統(tǒng)計(jì)(隨機(jī))噪聲問題。這種噪聲源于本發(fā)明的成像模式利用由于高能帶電粒子(電子或者離子)束對(duì)單個(gè)FMs例如GFPs的選擇性破壞對(duì)每個(gè)FM進(jìn)行定位。破壞單個(gè)FM導(dǎo)致來自樣品的總光發(fā)射的增量損耗，例如如果總共10000個(gè)FMs中一個(gè)FM被破壞，那么所發(fā)射的光將減少大約
0.01%。為了檢測(cè)光發(fā)射的這種少量減少，在該示例中，像素滯留時(shí)間內(nèi)由于光發(fā)射中的波動(dòng)而產(chǎn)生的隨機(jī)噪聲的平均值基本上不大于O. 01%是有必要的?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述了對(duì)于較少量FMs的類似方法，如轉(zhuǎn)讓于本發(fā)明的受讓人的美國(guó)專利號(hào)7，317，515。在所有這些情況下，可以定位的FMs數(shù)量受到限制。 由于樣品中來自標(biāo)記物(如GFPs、有機(jī)染料、或量子點(diǎn))的突光發(fā)射而產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)中這種改進(jìn)的信噪比的益處被本發(fā)明的另一方面進(jìn)一步放大，所述另一些方面是圖像處理方法，其使得能夠確定FM破壞事件的時(shí)間(以及因而其位置)，即使在原始成像信號(hào)中隨機(jī)噪聲非常大的情況下。作為可表達(dá)標(biāo)簽的熒光標(biāo)記物圖I顯示目標(biāo)蛋白質(zhì)(PoI) 102的示意圖100，其中綠色熒光蛋白(GFP) 104通過接頭肽110附著于其上。通常GFP的直徑106為3nm，長(zhǎng)度108為4nm，此處省略GFP104 “ β -桶，，(“ β -barrel”)結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)。一般來講，如所顯示，PoI 102將大于GFP 104。使用可表達(dá)標(biāo)簽中一個(gè)重要的考慮因素是標(biāo)簽不干擾PoI 102在細(xì)胞內(nèi)的適當(dāng)功能，無論該功能是代謝性的、轉(zhuǎn)運(yùn)、結(jié)構(gòu)性的等。因此，常常用短肽接頭110使非常剛性的GFP 104附著于PoI 102上，使GFP 104能夠在半徑114的孤112周圍搖擺，如所顯示的。注意的是，半徑114決定能夠確定GFP 104位置的最大精確度，因?yàn)镚FP 104自由地占據(jù)環(huán)112上的任何位置。因此，可能將GFP 104的位置確定在5至Snm內(nèi)對(duì)于本發(fā)明中以及現(xiàn)有技術(shù)中任何位點(diǎn)確定方法來說均是足夠的，所述現(xiàn)有技術(shù)例如描述于轉(zhuǎn)讓于本發(fā)明的受讓人且通過引用并入本文的美國(guó)專利號(hào)7，317，515中。對(duì)于報(bào)告基因的重組連接基因方法是熟知的，例如對(duì)于來源于水螅蟲類水母種維多利亞多管發(fā)光水母(Aequorea victoria)的多種“綠色突光蛋白”(GFPs)形式。自從最初于1950s發(fā)現(xiàn)GFPs以來，已經(jīng)開發(fā)了幾種遺傳變體，其具有改進(jìn)的熒光譜，發(fā)射范圍從藍(lán)光跨越至黃光，具有簡(jiǎn)化的光譜吸收分布。GFPs是相對(duì)小的圓柱體(“β_桶”，直徑為3nm，長(zhǎng)度為4nm)，其包含238個(gè)氨基酸(26. 9kDa)，顯示對(duì)可遠(yuǎn)離水母的物種的全部細(xì)胞機(jī)制基本上是“惰性的”。因此，GFPs的使用在生物學(xué)群落中被廣泛認(rèn)可。尤其重要的是，對(duì)GFPs作為可表達(dá)標(biāo)記物的廣泛認(rèn)可使得本發(fā)明潛在地在目前的GFP定位方法不夠精確的應(yīng)用中對(duì)生物群落極其有用。在下面對(duì)三個(gè)實(shí)施方案的操作的描述中，GFPs應(yīng)當(dāng)理解為包括多種GFP變體，其表示在被測(cè)生物學(xué)樣品中同時(shí)表達(dá)的多種重組報(bào)告基因。類似地，三個(gè)實(shí)施方案中的光檢測(cè)器應(yīng)當(dāng)理解為包括獨(dú)立運(yùn)行并且并行的多個(gè)檢測(cè)器，其中每個(gè)對(duì)來自樣品中多種GFP類型內(nèi)的特定GFP類型的光進(jìn)行檢測(cè)。 本發(fā)明可以用于成像視場(chǎng)內(nèi)存在較少量(10至數(shù)百個(gè))GFPs的情況以及存在很多(直至至少10000個(gè))GFPs的情況中。本發(fā)明的改進(jìn)的圖像處理方法可以用于這兩種情況中。每個(gè)GFP變體具有其自己獨(dú)特的光譜吸收和發(fā)射特征。一個(gè)示例是針對(duì)最初的“野生型”GFPs (WtGFP)，其在395nm下具有吸收峰，在509nm下具有發(fā)射峰。由于wtGFP在475nm下具有不期望的第二吸收峰，努力開發(fā)了改進(jìn)類型，例如S65T突變，其在484nm下具有吸收峰，在507nm下具有發(fā)射峰，無第二吸收峰。使用GFPs作為可表達(dá)標(biāo)簽的一個(gè)關(guān)鍵方面是其可在樣品中大量存在，使得有必要進(jìn)行本發(fā)明的有效光檢測(cè)和成像處理。熒光標(biāo)記物在帶電粒子系統(tǒng)中的成像方法圖2是32 X 32的X-Y掃描光柵200的示意圖，其展示了含有GFPs的像素208和不含GFPs的像素206?？焖賿呙栎S202是沿X方向，而慢速掃描軸204是沿Y方向。對(duì)于正常的光柵掃描，首先使束位于左上方，接著沿頂部行移動(dòng)至右上方。接著，束“折回”至左側(cè)并且向下移動(dòng)一行，隨后再次水平掃描至右側(cè)。重復(fù)該過程，直至使所有的32X32 = 1024個(gè)像素成像。在此處的示例中，白色像素206表示不含GFP的那些，而黑色像素208含有單 個(gè)GFP。假設(shè)GFP密度足夠低，使得可以應(yīng)用泊松(Poisson)統(tǒng)計(jì)法,而且我們可以近似認(rèn)為無像素含有多于一個(gè)的GFP。由于GFPs是表示特定目標(biāo)蛋白質(zhì)(PoI)在細(xì)胞內(nèi)(或者細(xì)胞切片內(nèi))的位置的可表達(dá)標(biāo)簽，GFPs的分布將常常是非一致的，表示PoIs的非一致分布，這是因?yàn)槠溥m當(dāng)功能所需的細(xì)胞內(nèi)位置。下面提出了三種示例性系統(tǒng)配置，第一種配置可以應(yīng)用于厚的樣品，且收集來自樣品前表面的所有信號(hào)(即以SEM模式運(yùn)行)；第二種配置具有用于電子和光的檢測(cè)器光學(xué)器件，其位于樣品下方(即以TEM或者STEM模式運(yùn)行)；并且第三種配置具有位于樣品上方和下方的聯(lián)合檢測(cè)器系統(tǒng)，以提供對(duì)樣品內(nèi)被激發(fā)的FMs所發(fā)射光的最大可能收集效率。第一個(gè)實(shí)施方案-位于樣品上方的檢測(cè)器光學(xué)器件圖3是本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案300的示意圖，其包括位于樣品306上方的檢測(cè)器光學(xué)器件。樣品306可以包括包含由與目標(biāo)基因連接的基因表達(dá)的熒光標(biāo)記物或者包含選擇性地附著于特定的細(xì)胞內(nèi)組分的無機(jī)標(biāo)記物的生物學(xué)樣品。樣品306還可以包括包含染料或者其他無機(jī)標(biāo)記物例如量子點(diǎn)(其被功能化以使得能夠選擇性地附著于特定的細(xì)胞內(nèi)組分)的生物學(xué)樣品。樣品306處于限定樣品平面的樣品位點(diǎn)處的樣品臺(tái)上。帶電粒子柱302例如電子束柱或者聚焦離子束柱產(chǎn)生帶電粒子束304，其通過柱302聚焦于樣品306表面的位置308處。束中的電子通常具有1，OOOeV至25，OOOeV的能量。離子通常具有5，OOOeV至5，OOOeV的能量。配置可以包含磁性線圈、靜電多極或者磁性線圈和靜電多極二者組合的X-Y束偏轉(zhuǎn)器310，以使束304在樣品306的表面上來回移動(dòng)，通常如圖2中以X-Y光柵模式進(jìn)行成像。在本發(fā)明的本第一個(gè)實(shí)施方案300中，假設(shè)樣品306足夠厚，以阻止束304穿透樣品306，因此收集樣品表面上方的所有成像信號(hào)(光和帶電粒子)，如所顯示。拋物面鏡314位于偏轉(zhuǎn)器310和樣品306之間。鏡314中的孔312使得束304穿過向下至樣品306。鏡314下面是屏蔽平板316，通常其偏置為與樣品306相等的電壓。為了達(dá)到對(duì)光的最大收集效率，配置鏡314，以在位置308處對(duì)向最大可能的立體角，優(yōu)選大于Ji球面度。接著將收集位置308處由熒光標(biāo)記物(FMs)發(fā)射的最大可能量的光，并傳送通過分束器326，接著通過濾色器372，最后到達(dá)檢測(cè)器360，這使得光學(xué)信號(hào)中可達(dá)到的信噪比最大化。
熒光標(biāo)記物(FMs)通過來自激光器322的光324被激發(fā)，其向上發(fā)射，首先反射出分束器326，接著被拋物面鏡314反射并聚焦于樣品306表面上的位置308處。需要注意的是，最大可能地將來自FMs的發(fā)射的光傳送通過分束器326是理想的，以增加到達(dá)檢測(cè)器360的光量。如果分束器326的傳送是50%，那么來自位置308的信號(hào)光327的一半將到達(dá)檢測(cè)器360，且來自激光器322的激發(fā)光324的一半將到達(dá)位置308。因此，為了使來自激光器322的3mW聚焦于位置308上將需要6mW的激光輸出324 (忽略其他反射損耗)。如果可以獲得充足的激光功率，可優(yōu)選使分束器326的傳送增加(因而減少反射性)例如至80%。接著來自位置308的80%的光(再次忽略反射損耗)將穿過分束器326，而來自激光器322的光324的僅20%將到達(dá)位置308，因此為了使3mW聚焦于位置308，將需要15mW的激光輸出功率324(12mW將穿過分束器326，在位于分束器326上方的束流收集器(未顯不)中被吸收)。在本實(shí)施方案中，來自激光322的光被鏡314反射至樣品306的頂部表面， 即光在被鏡314反射前不首先穿過樣品306，且來自光源的光最初從樣品上方照射樣品。類似地，由樣品306內(nèi)的熒光標(biāo)記物發(fā)射的光通過樣品306的頂部表面發(fā)射，被位于樣品306上方的鏡314收集，并反射至光檢測(cè)器360，而不如美國(guó)專利號(hào)7，317，515中所述完全通過樣品306并在鏡反面被收集。拋物面鏡314的第二個(gè)功能是提供可以經(jīng)電偏置的導(dǎo)體，以提供阻止二次電子碰撞鏡314的電場(chǎng)，其通過使由于初級(jí)帶電粒子束304的碰撞而從位置308處發(fā)射的二次電子(SEs) 322反射進(jìn)行。這更加詳細(xì)地顯示于圖4A和4B中。通過施加數(shù)百伏負(fù)電勢(shì)至(導(dǎo)電的)鏡表面，使SEs 322偏轉(zhuǎn)。需要注意的是，SEs不以與光328相同的方式反射，因?yàn)镾Es通過由施加至鏡314或者其他導(dǎo)體的電壓所產(chǎn)生的靜電場(chǎng)反射，且該靜電場(chǎng)延伸至拋物面鏡314的整個(gè)體積(對(duì)于鏡314的等軸視圖參見圖4B)。SEs 322向檢測(cè)器320偏轉(zhuǎn)并被顯示位于樣品306側(cè)面的檢測(cè)器320收集。因此，光和二次電子均從位置308被高效收集，因?yàn)楣夂蚐Es的收集立體角之間沒有沖突。優(yōu)選使孔312的大小保持在最小，以使光反射的損耗和對(duì)使二次電子偏轉(zhuǎn)的靜電場(chǎng)的任何擾亂均減少。拋物面鏡314的焦點(diǎn)大約位于樣品306表面上的位置308處，因此從位置308附近發(fā)射的光將聚焦入大致平行的光束328中，其指向圖3右側(cè)。盡管優(yōu)選由導(dǎo)電鏡產(chǎn)生引導(dǎo)SEs離開鏡的電場(chǎng),然而可以由與鏡分離的導(dǎo)體產(chǎn)生電場(chǎng)。還可以對(duì)帶電粒子檢測(cè)器320的入口施加電偏置。系統(tǒng)控制器362通過電纜370與柱302、通過電纜368與X-Y偏轉(zhuǎn)器310、通過電纜366與鏡314、通過電纜376與屏蔽板316、通過電纜378與樣品306、通過電纜380與SE檢測(cè)器320以及通過電纜374與激光器322電連接。系統(tǒng)控制器362利用在監(jiān)視器(未顯示)上顯現(xiàn)圖像通過X-Y偏轉(zhuǎn)器310調(diào)節(jié)束304的掃描，以及進(jìn)行下面描述的圖像處理運(yùn)算，以確定樣品表面上FMs的位置。通常帶電粒子束必須在真空中行進(jìn)，因此真空殼334包含柱302的出口、X_Y偏轉(zhuǎn)器310、鏡314、屏蔽板316和樣品306，如所顯示。通常使光學(xué)儀器盡可能地位于真空外面容易得多，因此視口 356使得來自激光器322的光327 (反射離開分束器326)穿入殼334，而使位置308處由FMs發(fā)射的光能夠穿出殼334，通過分束器326，接著通過濾色器372并進(jìn)入檢測(cè)器360。濾色器372用于使能夠穿入檢測(cè)器360的激光激發(fā)光324的量減少。由于激發(fā)光常常具有比來自FMs的發(fā)射光短的波長(zhǎng)，因此有可能調(diào)整濾色器372的通頻帶，以傳送來自FMs的大部分光，同時(shí)阻斷大部分激光。在一些情況下，檢測(cè)器360內(nèi)可發(fā)生額外的光過濾。電穿通器(Electrical feedthrough) 354使得電纜366、368和370穿入和穿出殼334，而穿通器352使得電纜376、378和380穿入和穿出殼334。用于高效收集光和二次電子的檢測(cè)器光學(xué)器件圖4A是利用SIMION射線跟蹤(ray-tracing)程序產(chǎn)生的側(cè)視圖400,其顯示圖3中的檢測(cè)器光學(xué)器件的光和二次電子軌跡?？梢钥吹匠跫?jí)束304向下穿過拋物面鏡314中的孔312通過。束304碰撞位置308處的樣品306誘導(dǎo)發(fā)射二次電子332為余弦(朗伯定律(Lambert Law))分布。屏蔽板316和樣品306 —般具有由系統(tǒng)控制器362施加相等的電壓(參見圖3)。對(duì)傳導(dǎo)性鏡表面314施加數(shù)百伏的負(fù)偏置，以排斥(O至50eV) 二次電子332，如所顯示。這種反射不同于反光反射出鏡314的光反射，因此SEs被收集到位于樣品306側(cè)面的檢測(cè)器320上。位置308處的收集立體角非常大，優(yōu)選在該配置中大于π球面度，提供良好信噪比的SE圖像。由樣品306中的熒光標(biāo)記物(FMs)發(fā)射的光還發(fā)射為余弦分布，其中大部分指向鏡314，如所顯示。由于樣品306上的位置308是拋物面鏡314的焦點(diǎn)，鏡314反射出的光328 —般平行穿至圖4Α的右側(cè)。將理解的是，鏡314的益處可以 用于其他應(yīng)用中，在所述應(yīng)用中，光指向樣品或者由帶電粒子束系統(tǒng)中的樣品檢測(cè)。將從鏡314受益的這些系統(tǒng)包括收集對(duì)于光學(xué)顯微鏡的光(與帶電粒子束同軸)的系統(tǒng)，例如描述于授予Rasmussen的美國(guó)專利號(hào)6，373，070 “用于帶有聚焦離子束的同軸光學(xué)顯微鏡的方法設(shè)備”中的系統(tǒng)和收集來自由帶電粒子束或發(fā)光引起的光致發(fā)光的光的系統(tǒng)。圖4B是圖4A中檢測(cè)器光學(xué)器件的剖面等軸視圖，其也利用SMION產(chǎn)生。此外，分束器326顯示于右側(cè)較低處?？梢钥吹絊E 332的橢圓形模式碰撞檢測(cè)器320，因此檢測(cè)器320的面積不需要過大，較小的檢測(cè)器面積可使檢測(cè)器帶寬增加(至少對(duì)于固態(tài)檢測(cè)器)，且因而一般是優(yōu)選的。第二個(gè)實(shí)施方案-位于樣品下方的檢測(cè)器光學(xué)器件圖5是本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案500的示意圖，其包含位于樣品506下方的檢測(cè)器光學(xué)器件。帶電粒子柱502例如電子束柱或者聚焦離子束柱產(chǎn)生帶電粒子束504，其通過柱502聚焦于樣品506表面上的位置508處。束504通常包含能量在大約50keV至300keV的電子。配置可以包含磁性線圈、靜電多極或者磁性線圈和靜電多極二者組合的X-Y束偏轉(zhuǎn)器510，以使束504在樣品506的表面上來回移動(dòng)，通常以X-Y光柵模式進(jìn)行成像。在本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案500中，假設(shè)樣品506足夠薄，以允許束504穿透樣品506，因此收集樣品表面下方的所有成像信號(hào)(光和帶電粒子)，如所顯示。拋物面鏡580位于樣品506的下面。鏡580中的孔582使得所傳送的帶電粒子束584在穿過樣品506后向下行進(jìn)。束584可通常包含來自初級(jí)束504的未散射粒子、彈性散射粒子、非彈性散射粒子、二次電子和/或離子，以及樣品506中經(jīng)彈性和非彈性散射的粒子。穿過孔582后，束584進(jìn)入檢測(cè)器586，所述檢測(cè)器586可包含能量過濾器，以區(qū)分上面提到的多種類型的所傳送粒子，以及可能地平行運(yùn)行的多個(gè)檢測(cè)器。為了達(dá)到最大的光收集效率，配置鏡580，以對(duì)向位置508處最大可能的立體角(通常> π球面度)。因此，位置508處由熒光標(biāo)記物(FMs)發(fā)射的最大可能的光量將被收集并傳送通過分束器596，接著通過濾色器598，最終到達(dá)光檢測(cè)器590，這使得光學(xué)信號(hào)中可達(dá)到的信噪比最大化。FMs通過來自激光器522的光594被激發(fā)，其向上發(fā)射，首先反射出分束器596，接著被拋物面鏡580反射并聚焦，在位置508處穿過樣品506。需要注意的是，最大可能地將光傳送通過分束器596是理想的，以增加到達(dá)檢測(cè)器590的光量，此處應(yīng)用與上面圖3中相同的傳送百分比考慮。重要的是，使孔582的大小保持在最小，以減少光反射損耗，同時(shí)保持足夠大以能夠容納束584中彈性散射的電子。拋物面580的焦點(diǎn)大約位于樣品506上的位置508處，因此從位置508附近發(fā)射的光將聚焦入大致平行的光束587中，其指向圖右側(cè)。系統(tǒng)控制器562通過電纜570與柱502、通過電纜568與X-Y偏轉(zhuǎn)器510、通過電纜566與樣品506、通過電纜574與激光器522、通過電纜564與檢測(cè)器590以及通過電纜588與檢測(cè)器586電連接。系統(tǒng)控制器562利用在監(jiān)視器(未顯示)上顯現(xiàn)圖像通過X-Y偏轉(zhuǎn)器510調(diào)節(jié)束504的掃描，以及進(jìn)行下面描述的圖像處理運(yùn)算，以確定樣品表面上FMs的位置。通常帶電粒子束必須在真空中行進(jìn)，因此真空殼534包含柱502的 出口、X_Y偏轉(zhuǎn)器510、樣品506、鏡580和檢測(cè)器586，如所顯示。視口 556使得來自激光器522的光587 (反射出分束器596)穿入殼534，而使位置508處由FMs發(fā)射的光能夠穿出殼534，通過分束器596，接著通過濾色器598并進(jìn)入檢測(cè)器590。如同圖3中的第一個(gè)實(shí)施方案，濾色器598用于使能夠穿入檢測(cè)器590的激光激發(fā)光594的量減少。此處對(duì)分束器596應(yīng)用與對(duì)圖3中的分束器326相同的反射性考慮。電穿通器554使得電纜566、568和570穿入和穿出殼534，而穿通器552使得電纜588穿入和穿出殼534。第三個(gè)實(shí)施方案-位于樣品上方和下方的檢測(cè)器光學(xué)器件圖6是本發(fā)明第三個(gè)實(shí)施方案600的不意圖，其包含位于樣品606上方和下方的檢測(cè)器光學(xué)器件。帶電粒子柱602例如電子束柱或者聚焦離子束柱產(chǎn)生帶電粒子束604，其通過柱602聚焦于樣品606表面上的位置608處。配置可包含磁性線圈、靜電多極或者磁性線圈和靜電多極二者組合的X-Y束偏轉(zhuǎn)器610，以使束604在樣品606的表面上來回移動(dòng)，通常以X-Y光柵模式進(jìn)行成像。在本發(fā)明的該第三個(gè)實(shí)施方案600中，假設(shè)樣品606足夠薄，以允許束604穿透樣品606。為了達(dá)到較高的光收集效率，使兩個(gè)拋物面鏡614和680分別位于樣品606的上方和下方。鏡614中的孔612使得束604穿過樣品606。鏡680中的孔682使得所傳送的帶電粒子束684在穿過樣品606后向下穿行。束684可通常包含來自初級(jí)束604的未散射粒子、彈性散射粒子、非彈性散射粒子、二次電子和/或尚子，以及樣品606中經(jīng)彈性和非彈性散射的粒子。穿過孔682后，束684進(jìn)入檢測(cè)器686，所述檢測(cè)器686可以包含能量過濾器，以區(qū)分上面提到的多種類型的所傳送粒子，以及可能地平行運(yùn)行的多個(gè)檢測(cè)器。對(duì)將由于初級(jí)束604的碰撞而從位置608發(fā)射的SEs 632收集入檢測(cè)器620的考慮與圖3、4Α和4Β中相同。為了達(dá)到最大的光收集效率，配置鏡614和680 二者，以對(duì)向位置608處最大可能的立體角(對(duì)于鏡614和680中每個(gè)鏡，通常> 球面度，總共>2 球面度)。位置608處由熒光標(biāo)記物(FMs)發(fā)射的最大可能量的向上發(fā)射光將被收集并傳送通過分束器626，接著通過濾色器672，并進(jìn)入檢測(cè)器660，這使得光學(xué)信號(hào)中可達(dá)到的信噪比最大化。類似地，位置608處來自FMs的最大可能量的向下發(fā)射光將被收集并傳送通過濾色器698，接著到達(dá)檢測(cè)器690。FMs通過來自激光器622的光624被激發(fā)，其向上發(fā)射，首先反射出分束器626，接著被拋物面鏡614反射并聚焦在位置608處樣品606上。需要注意的是，最大可能地將光傳送通過分束器626是理想的，以增加到達(dá)檢測(cè)器660的光量，此處應(yīng)用與上面圖3和5中相同的傳送百分比考慮。重要的是，使孔612和682的大小保持在最小，以減少光反射損耗。拋物面614和680的焦點(diǎn)大約位于樣品606上的位置608處，因此從位置608附近發(fā)射的光將分別聚焦入大致平行的光束628和687中，其指向圖的右側(cè)。系統(tǒng)控制器662通過電纜670與柱602、通過電纜668與X-Y偏轉(zhuǎn)器610、通過電纜666與鏡614、通過電纜664與檢測(cè)器660和690、通過電纜676與屏蔽板616、通過電纜678與樣品606、通過電纜688與檢測(cè)器686、以及通過電纜674與激光器622電連接。顯示檢測(cè)器690和660通過電纜699互相連接，但是可選的配置將具有單獨(dú)的電纜到達(dá)系統(tǒng)控制器662。系統(tǒng)控制器662利用在監(jiān)視器(未顯示)上顯現(xiàn)圖像通過X-Y偏轉(zhuǎn)器610調(diào)節(jié)束604的掃描，以及進(jìn)行下面描述的圖像處理運(yùn)算，以確定樣品表面上FMs的位置。通常帶電粒子束必須在真空中行進(jìn)，因此真空殼634包含柱602的出口、X_Y偏轉(zhuǎn)器610、鏡614、屏蔽板616、樣品506、鏡680和檢測(cè)器686,如所顯不。使光學(xué)儀器盡可能地 位于真空外面容易得多，因此視口 656使得來自激光器622的光624 (反射出分束器626)穿入殼634，而使位置608處來自FMs的向上發(fā)射的光能夠穿出殼634，通過分束器626，接著通過濾色器672并進(jìn)入檢測(cè)器660。位置608處來自FMs的向下發(fā)射的光通過視口 656穿出殼634，通過濾色器698，接著進(jìn)入檢測(cè)器690。如同圖3和5中的第一個(gè)實(shí)施方案，濾色器672和698分別用于使能夠穿入檢測(cè)器660和690的激光激發(fā)光624的量減少。電穿通器654使得電纜666、668和670穿入和穿出殼334，而穿通器652使得電纜676、678、688和680穿入和穿出殼634。需要注意的是，在該雙拋物面鏡配置中，來自激光器622的光(穿過樣品606但未被吸收)將反射出鏡680，至檢測(cè)器690，因此必須配置濾色器698，以抵抗高于圖3和5中的情況的潛在高水平的激光照射。掃描場(chǎng)中較少量熒光標(biāo)記物的成像圖7是在對(duì)含有100個(gè)GFPs的掃描場(chǎng)進(jìn)行光柵掃描的過程中信號(hào)704(每個(gè)像素所收集的光子數(shù)量)作為時(shí)間702函數(shù)的圖700。掃描總時(shí)間是60s，其分布于512 X 512 (256k)像素中，像素滯留時(shí)間是229 μ S。曲線706表示對(duì)于被照射區(qū)域內(nèi)所有未被破壞的GFPs，每個(gè)像素所收集的光子數(shù)量。在最左端，假設(shè)所有100個(gè)GFPs響應(yīng)于激光激發(fā)而發(fā)射光。隨著曲線706向右下方降落，被破壞的GFPs的數(shù)量從O逐漸增加至100，最終在60s光柵掃描結(jié)束時(shí)所有GFPs均被破壞。由于GFPs是隨機(jī)定位的，從Os至60s，曲線706具有一些不規(guī)則但遵循總體降落。3mW的激光功率分布于樣品處28 μ m2區(qū)域中，在該示例中，假設(shè)光柵具有該相同面積，因此在掃描結(jié)束時(shí)，無GFPs保持未被破壞。一般來講，被照射區(qū)域可以大于光柵，因此在60s的掃描結(jié)束時(shí)一些GFPs會(huì)保持未被破壞。圖8是顯示圖7中圖表700初始階段的特寫圖800，其顯示總共100個(gè)GFPs中前8個(gè)GPFs的破壞。在被激光照射區(qū)域內(nèi)對(duì)GFPs進(jìn)行定位的最難點(diǎn)在初始階段，此時(shí)發(fā)射的GFPs數(shù)量最大(并且已被破壞的GFPs數(shù)量最小)。這是因?yàn)榘l(fā)射光的未被破壞的GFPs數(shù)量最大時(shí)，從所有GFPs收集的全部光中的統(tǒng)計(jì)波動(dòng)將最大(以像素滯留時(shí)間中收集的光子數(shù)量的平方根來計(jì)算)。利用表I中列出的假設(shè)條件制備圖表700和800。曲線806表示從被照射區(qū)域中所有未被破壞的GFPs收集的光子平均數(shù)量，其作為掃描時(shí)間的函數(shù)，僅顯示了前8秒，在此期間8個(gè)GFPs被帶電粒子束(電子或者離子)攻擊并破壞。這些破壞事件中的每個(gè)事件由信號(hào)的垂直下降表示，例如左上方的下降812。曲線806的上方是+3 σ曲線808 (長(zhǎng)斷線)，其表示高于平均信號(hào)水平806 3倍標(biāo)準(zhǔn)差的預(yù)期信號(hào)波動(dòng)，這是相對(duì)不可能的事件。類似地，曲線806下方是-3 σ曲線810 (短斷線)，其表示低于平均信號(hào)水平806 3倍標(biāo)準(zhǔn)差的預(yù)期信號(hào)波動(dòng)，這也是相對(duì)不可能的事件。此處需要注意的關(guān)鍵之處是在突變(jump) 812處，其表示一個(gè)GFP的損失(由于破壞)，突變812左側(cè)的曲線810正好位于突變812右側(cè)的曲線808的上方，也就是說，極其不可能的是，在激光聚焦區(qū)域內(nèi)僅有100個(gè)GFPs被照射(和從而發(fā)射)的情況下，從所有未被破壞的GFPs收集的光子數(shù)量所產(chǎn)生的內(nèi)在統(tǒng)計(jì)信噪比使得難以檢測(cè)單個(gè)GFP破壞事件。表I.用于圖7和8中圖表700和800的假設(shè)條件
成像總時(shí)間60.00s
圖像尺寸512#像素/側(cè)
總#像素262144
像素時(shí)間228.9us
基質(zhì)處的激光功率O. 0030W = J/s
波長(zhǎng)550.00
能量/光子Γ25eV = (J)
入射光子 /s8. 306E+15Tl
被照射區(qū)域的直徑6700
被照射區(qū)域的面積28.27
GFP的直徑Γ00iim
GFP 的面積 Γ07iml
入射光子 /s/GFP2.077E+09Tl
量子效率估測(cè)值 Γδ
收集效率估測(cè)值0Γ25
所收集的光子 /s/GFP2. 596E+08/s/GFP
所收集的光子/像素/GFP59410.21
#光子/像素/GFP中的統(tǒng)計(jì)波動(dòng)243. 74
被照射區(qū)域中的GFP數(shù)量100
權(quán)利要求
1.一種帶電粒子系統(tǒng)，其包括 帶電粒子光柱，其用于將帶電粒子束引導(dǎo)至含有熒光標(biāo)記物的樣品上； 二次電子檢測(cè)器，其用于收集帶電粒子束撞擊后由樣品發(fā)射的二次電子； 光源，其用于激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記物； 光檢測(cè)器，其用于檢測(cè)由樣品中的熒光標(biāo)記物發(fā)射的熒光；和 電傳導(dǎo)鏡，配置所述鏡以 將來自光源的光引導(dǎo)至包含帶電粒子束與樣品的碰撞點(diǎn)的樣品區(qū)； 使由突光標(biāo)記物發(fā)射的突光向光檢測(cè)器反射；和 提供電場(chǎng)以使來自樣品的二次電子偏轉(zhuǎn)進(jìn)入二次電子檢測(cè)器。
2.權(quán)利要求I的系統(tǒng)，其中所述鏡是拋物面鏡，其用于使光聚焦到樣品區(qū)域上和用于收集來自樣品區(qū)域的光，其中焦點(diǎn)接近于帶電粒子束的碰撞點(diǎn)。
3.權(quán)利要求I的系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括位于鏡和光檢測(cè)器之間的分束器，配置所述分束器以 將由鏡反射的熒光傳送進(jìn)入光檢測(cè)器；和 使來自光源的光向鏡反射。
4.權(quán)利要求3的系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括位于分束器和光檢測(cè)器之間的濾色器，其中調(diào)整所述濾色器的透射比，以大大阻斷來自光源的光的傳送，而使由標(biāo)記物發(fā)射的熒光穿過。
5.權(quán)利要求I的系統(tǒng)，其中關(guān)于由樣品發(fā)射的光和二次電子的立體收集角均大于π/2球面度。
6.權(quán)利要求I的系統(tǒng)，其中所述熒光標(biāo)記物包括由與目標(biāo)基因連接的基因所表達(dá)的熒光標(biāo)記物或者包括選擇性地附著于特定細(xì)胞內(nèi)組分的無機(jī)突光標(biāo)記物。
7.權(quán)利要求I的系統(tǒng)，其中所述光檢測(cè)器包括多個(gè)檢測(cè)器，配置所述多個(gè)檢測(cè)器中的每個(gè)檢測(cè)器以收集來自特定類型的熒光標(biāo)記物的熒光。
8.權(quán)利要求I的系統(tǒng)，其中所述光檢測(cè)器和鏡位于樣品上方，其進(jìn)一步包括 位于樣品下方的透射式電子檢測(cè)器； 用于由樣品中的標(biāo)記物發(fā)射的熒光的第二光檢測(cè)器；和 位于樣品和透射式電子檢測(cè)器之間的第二鏡，所述第二鏡具有接近于帶電粒子束與樣品的碰撞點(diǎn)定位的焦點(diǎn)，配置所述第二鏡以使由標(biāo)記物發(fā)射的熒光向第二光檢測(cè)器反射。
9.一種帶電粒子系統(tǒng)，其包括 帶電粒子束源，其用于產(chǎn)生帶電粒子； 帶電粒子束光柱，其用于使來自帶電粒子束源的帶電粒子束聚焦于含有熒光標(biāo)記物的樣品上； 使樣品保持于樣品位點(diǎn)中的樣品臺(tái)，穿過樣品位點(diǎn)的樣品平面使空間分成包含帶電粒子束源的樣品平面上方的區(qū)域和樣品平面下方的區(qū)域； 二次電子檢測(cè)器，其用于收集由于帶電粒子束與樣品碰撞而由樣品發(fā)射的二次電子，所述二次電子檢測(cè)器位于樣品平面的上方； 光源，其用于對(duì)樣品中的熒光標(biāo)記物進(jìn)行照射，來自所述光源的光最初從樣品上方照射樣品； 光檢測(cè)器，其用于檢測(cè)由樣品中的標(biāo)記物發(fā)射的熒光；和位于樣品平面上方的鏡，配置所述鏡以將來自光源的光引導(dǎo)至樣品表面上，以使熒光標(biāo)記物發(fā)突光，并且用于在光不完全穿過樣品的情況下使由突光標(biāo)記物發(fā)射的光偏轉(zhuǎn)到光檢測(cè)器上。
10.權(quán)利要求9的帶電粒子束系統(tǒng)，其中所述鏡包括電傳導(dǎo)性拋物面鏡。
11.權(quán)利要求10的帶電粒子束系統(tǒng)，其中所述鏡具有光的焦點(diǎn)，所述焦點(diǎn)的位置接近于帶電粒子束與樣品的碰撞點(diǎn)。
12.權(quán)利要求11的帶電粒子束系統(tǒng)，其中配置所述鏡以 使來自光源的光聚焦于樣品上；和 使由突光標(biāo)記物發(fā)射的突光向光檢測(cè)器反射。
13.權(quán)利要求10的帶電粒子束系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括具有孔的電極，帶電粒子束穿過所述孔，并且配置所述電極以在電極和可配置以使來自樣品的二次電子偏轉(zhuǎn)進(jìn)入二次電子檢測(cè)器的電傳導(dǎo)性拋物面鏡之間提供電場(chǎng)。
14.權(quán)利要求13的帶電粒子束系統(tǒng)，其中所述電極經(jīng)偏置為大約樣品的電勢(shì)。
15.一種用于在帶電粒子束系統(tǒng)中收集來自樣品的帶電粒子和光的裝置，其包括 鏡，其具有缺口以使帶電粒子束穿過，配置所述鏡以將來自樣品的光反射至光檢測(cè)器； 帶電粒子檢測(cè)器，其用于檢測(cè)來自樣品的粒子；和 導(dǎo)體，其經(jīng)電偏置以在鏡和樣品之間提供電場(chǎng)，所述電場(chǎng)阻止來自樣品的帶電粒子碰撞鏡并且將來自樣品的帶電粒子向帶電粒子檢測(cè)器偏轉(zhuǎn)。
16.權(quán)利要求15的裝置，其中所述帶電粒子檢測(cè)器位于帶電粒子束離開鏡的水平下方的平面中。
17.權(quán)利要求15的裝置，其中所述鏡的傳導(dǎo)部分包括用于在鏡和樣品之間提供電場(chǎng)的導(dǎo)體。
18.權(quán)利要求16的裝置，其中所述傳導(dǎo)部分包括金屬反射層。
19.一種用于對(duì)樣品中的熒光標(biāo)記物進(jìn)行定位的方法，其包括步驟 用光照射樣品，以激發(fā)熒光標(biāo)記物，其中照射樣品的光通過電傳導(dǎo)性第一鏡聚焦于樣品上; 將帶電粒子束以一種模式引導(dǎo)至樣品表面上，其中帶電粒子在小于由光照射的區(qū)域的區(qū)域中碰撞樣品； 檢測(cè)由熒光標(biāo)記物發(fā)射的光，其中通過第一鏡使來自樣品的光向檢測(cè)器反射，所述第一鏡中具有開口以使帶電粒子束穿過； 使帶電粒子束以一種模式移動(dòng)橫穿樣品表面，其中至少一些熒光標(biāo)記物在被帶電粒子束碰撞時(shí)減弱其熒光； 使由帶電粒子束在樣品上碰撞而產(chǎn)生的來自樣品的帶電粒子遠(yuǎn)離第一鏡并向檢測(cè)器偏轉(zhuǎn)； 當(dāng)檢測(cè)到來自樣品中的熒光標(biāo)記物的全部光發(fā)射的減少時(shí)根據(jù)帶電粒子束模式內(nèi)的已知位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，以確定熒光標(biāo)記物的位置。
20.權(quán)利要求19的方法，其進(jìn)一步包括顯示來源于帶電粒子束的圖像，所述圖像包含熒光標(biāo)記物的位置，其疊加于帶電粒子束圖像上。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述熒光標(biāo)記物包括遺傳表達(dá)的標(biāo)記物。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述遺傳表達(dá)的標(biāo)記物包括綠色熒光蛋白。
23.權(quán)利要求19的方法，其中所述熒光標(biāo)記物包括無機(jī)熒光標(biāo)記物，其經(jīng)功能化以能夠選擇性地附著于特定細(xì)胞內(nèi)組分。
24.權(quán)利要求19的方法，其中所述帶電粒子束包括電子束或者聚焦離子束。
25.權(quán)利要求19的方法,其中檢測(cè)由突光標(biāo)記物發(fā)射的光包括分開檢測(cè)來自樣品內(nèi)多種類型的熒光標(biāo)記物的光。
26.權(quán)利要求19的方法，其中所述帶電粒子檢測(cè)器位于與鏡相同的樣品一側(cè)并且位于鏡水平下方。
27.權(quán)利要求19的方法，其中使來自樣品的帶電粒子遠(yuǎn)離第一鏡并向檢測(cè)器偏轉(zhuǎn)包括在鏡上提供電偏置。
28.權(quán)利要求19的方法,其中通過位于與第一鏡相對(duì)的樣品側(cè)的第二鏡收集由樣品發(fā)射的光。
29.權(quán)利要求20的方法，其中對(duì)所儲(chǔ)存圖像數(shù)據(jù)的處理包括下列步驟 使圖像數(shù)據(jù)與平滑函數(shù)結(jié)合，以產(chǎn)生經(jīng)平滑處理的圖像數(shù)據(jù)； 使經(jīng)平滑處理的圖像數(shù)據(jù)與導(dǎo)函數(shù)結(jié)合，以產(chǎn)生導(dǎo)數(shù)圖像數(shù)據(jù)； 確定導(dǎo)數(shù)圖像數(shù)據(jù)中局部最小值的位置； 將最小值數(shù)值與預(yù)先確定的最大閾值數(shù)值相比較；和 如果局部最小值低于閾值數(shù)值，在圖像上對(duì)應(yīng)于帶電粒子束位點(diǎn)的圖像位點(diǎn)處顯示指示符。
30.一種用于所儲(chǔ)存圖像數(shù)據(jù)的圖像處理方法，其包括 將帶電粒子束以一種模式引導(dǎo)橫穿樣品區(qū)域； 對(duì)由于帶電粒子束的碰撞由樣品發(fā)射的帶電粒子進(jìn)行檢測(cè)，以形成帶電粒子成像信號(hào); 利用帶電粒子成像信號(hào)形成帶電粒子束圖像； 對(duì)由所述樣品區(qū)域發(fā)射的光進(jìn)行檢測(cè)，其中檢測(cè)到的光信號(hào)的振幅隨時(shí)間形成圖像曲線. 利用平滑函數(shù)對(duì)圖像曲線進(jìn)行卷積，以產(chǎn)生經(jīng)平滑處理的圖像數(shù)據(jù)； 使經(jīng)平滑處理的圖像數(shù)據(jù)與導(dǎo)函數(shù)結(jié)合，以產(chǎn)生導(dǎo)數(shù)圖像數(shù)據(jù)； 確定對(duì)應(yīng)于導(dǎo)數(shù)圖像數(shù)據(jù)中局部最小值的數(shù)值和對(duì)應(yīng)于導(dǎo)數(shù)圖像數(shù)據(jù)中局部最小值的帶電粒子束的位置；和 將最小值數(shù)值與預(yù)先確定的最大閾值數(shù)值相比較；和 如果個(gè)體局部最小值數(shù)值低于閾值數(shù)值，在帶電粒子束圖像上顯示指示符。
全文摘要
公開了一種用于對(duì)生物樣品內(nèi)的熒光標(biāo)記物例如熒光蛋白或者量子點(diǎn)進(jìn)行成像和定位的方法和系統(tǒng)。利用重組遺傳技術(shù)使“報(bào)告”基因插入很多物種中是被廣泛認(rèn)可的。特別是綠色熒光蛋白(GFPs)和范圍從藍(lán)色至黃色的其經(jīng)遺傳修飾的變體易于剪接到很多基因組中的目標(biāo)基因(GoIs)位點(diǎn)處，其中GFPs被表達(dá)，對(duì)于由GoIs編碼的目標(biāo)蛋白質(zhì)(PoIs)的功能沒有明顯影響。生物學(xué)家的一個(gè)目標(biāo)是細(xì)胞內(nèi)PoIs的更精確定位。本發(fā)明是利用帶電粒子束誘導(dǎo)的對(duì)GFPs的破壞使PoI定位更加快速和精確的方法和系統(tǒng)。提出了系統(tǒng)的多個(gè)實(shí)施方案以實(shí)施本方法，以及相對(duì)不受高統(tǒng)計(jì)噪聲水平影響的圖像處理方法。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102645423SQ201210056858
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月30日
發(fā)明者M·W·烏特勞特, N·W·帕克 申請(qǐng)人:Fei公司