專利名稱：檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種免疫層析試條及制備方法，具體來說是一種檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條及制備方法。
背景技術(shù)：
棘球蝴病(echinococcosis)又稱包蟲病(Hydatiddisease 或 Hydatidosis), 是由棘球?qū)俳{蟲的幼蟲寄生于人、畜體內(nèi)引起的一種人畜共患寄生蟲病，能感染人類的棘球?qū)俳{蟲有4種細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus, Eg)、多房棘球絳蟲 (Echinococcusmulti locularis, Em)、少節(jié)棘球絳蟲(E. oligarthrus)和伏氏棘球絳蟲 (E. vogeli)。這4種棘球絳蟲的成蟲和幼蟲期形態(tài)不同，可引起不同類型的棘球蝴病。我國(guó)有兩種棘球蝴病即細(xì)粒棘球蝴病(cysticechinococ-cosis, CE)又稱囊型包蟲病,和多房棘球蝴病(alveolarechinococcosis, AE)又稱泡型包蟲病。包蟲病是一個(gè)重要的世界性公共衛(wèi)生問題，廣泛流行于歐、亞、非和地中海區(qū)域沿岸國(guó)家，以及澳洲和南美。在我國(guó)，包蟲病主要流行于西部等12個(gè)省、自治區(qū)的牧區(qū)和農(nóng)牧區(qū)，其中新疆、青海、甘肅、寧夏、西藏、內(nèi)蒙和四川西部最為嚴(yán)重，是世界上包蟲病患病率最高的地區(qū)。此外，吉林、陜西、云南、貴州和河南等省局部地區(qū)也有小范圍流行。包蟲病流行區(qū)受威脅人口約7000萬。衛(wèi)生部《全國(guó)人體重要寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查》報(bào)告顯示，這12省 (區(qū))包蟲病患病率為I. 084%，據(jù)此推算，目前流行區(qū)約有病人38萬人。由于B超診斷結(jié)果有一定的漏檢率，實(shí)際患病人數(shù)可能達(dá)60萬人以上。血清學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)人群的感染率平均為11. 98%，感染人數(shù)約為700萬人，受威脅人口約7000萬。包蟲病需要手術(shù)或長(zhǎng)期服藥治療，效果有限。其中囊型包蟲病包囊破裂可導(dǎo)致過敏休克而致患者死亡。泡型包蟲病被稱為“惡性包蟲病”是一種致死性寄生蟲病，10-15年的病死率高達(dá)90%以上。漏診的包蟲病患者失去治療時(shí)機(jī)而危及生命。包蟲病不但給患者帶來極大的痛苦和沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，且發(fā)病的高峰為20-50歲的青壯年，嚴(yán)重的患者失去勞動(dòng)力，給社會(huì)帶來極大的壓力，系西部農(nóng)牧區(qū)群眾因病致貧，因病返貧的重要原因。此外， 由于包蟲病在牛羊的感染率相當(dāng)高(可達(dá)90% )，每年因包蟲病也給我國(guó)畜產(chǎn)品造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億。因此包蟲病不但嚴(yán)重危害人民的生命健康，而且嚴(yán)重影響社會(huì)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展、邊疆穩(wěn)定。包蟲病的感染可長(zhǎng)期(數(shù)年或十多年)無癥狀，一旦癥狀顯現(xiàn)，藥物治療效果差 (因有兩層厚實(shí)的囊包裹使藥物難以進(jìn)入達(dá)到有效濃度)，而不得不進(jìn)行手術(shù)治療，甚至要反復(fù)進(jìn)行手術(shù)。因此，研究合適有效的免疫診斷技術(shù)用于早期診斷，以提高藥物治療效果， 是最有效的降低發(fā)病率和死亡率的根本途徑，是包蟲病防治中亟待解決的問題。目前對(duì)包蟲病的診斷極大地依賴影像學(xué)方法，如X光檢查、B型超聲診斷、CT掃描、 核磁共振等物理診斷方法。但這些方法不能進(jìn)行早期診斷(影像學(xué)診斷出的包蟲病人已不太適合藥物治療)，且對(duì)有些囊腫、膿腫或腫塊不能進(jìn)行有效鑒別而誤診。由于影像檢查設(shè)備攜帶不便，加之昂貴，且對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高，在疾病診斷與流行病學(xué)調(diào)查中(特別在邊遠(yuǎn)地區(qū)連電力供應(yīng)都受到限制)的應(yīng)用受到限制。免疫學(xué)方法在包蟲病診斷上的應(yīng)用越來越受到重視，最有效的免疫學(xué)診斷方法是應(yīng)用純化天然抗原或重組抗原檢測(cè)包蟲病人特異抗體，常用檢測(cè)方法有間接血凝法 (Indirect haemagglutinationassay ;IHA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印潰法(Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay ;EITBA),以及金標(biāo)免疫點(diǎn)印潰法(Gold-labelled dotblotting ;( Β ;俗稱膜法或滲濾法)。但這些方法或費(fèi)時(shí)費(fèi)力、或需要冷鏈系統(tǒng)保存試劑、或?qū)x器設(shè)備及操作人員的要求較高而不適合現(xiàn)場(chǎng)使用。在上述免疫方法中抗原的使用直接決定了檢測(cè)的敏感性和特異性。包蟲病免疫診斷抗原的研究經(jīng)歷了粗抗原、純化抗原和重組抗原三個(gè)階段。細(xì)粒棘球蝴包囊液粗抗原(HCF)廣泛應(yīng)用于囊型包蟲病的診斷，其特點(diǎn)是檢測(cè)的敏感性較高，可達(dá)75% -95%，但易于其他疾病如囊蟲病等發(fā)生交叉反應(yīng)。針對(duì)這一問題許多學(xué)者采用不同的方法對(duì)囊液粗抗原進(jìn)行分離和純化，顯著提高了檢測(cè)的敏感性和特異性。EmlS抗原是泡球蝴種特異性抗原組分，有報(bào)道表明將純化的天然EmlS抗原用于泡型包蟲病的診斷，敏感性和特異性分別高達(dá)90. 91%和93. 80%，陽(yáng)性預(yù)期值和陰性預(yù)期值分別為83. 33%和96. 80%，還能在一定程度上區(qū)分活動(dòng)性和非活動(dòng)性病灶，因而是一種具有診斷和免疫隨訪意義的診斷抗原，但天然EmlS是從人工感染的泡球蝴原頭節(jié)中提取的，提取難度大、產(chǎn)量少，不能滿足診斷需要，因而人工合成的重組EM18抗原成為一種在泡型包蟲病鑒別診斷和病程隨訪中有應(yīng)用價(jià)值的特異性診斷抗原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條及制備方法，所述的這種檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條及制備方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中的檢測(cè)囊型包蟲病和泡型包蟲病的方法復(fù)雜，而且不能早期診斷的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條，包括一個(gè)樣品墊和一個(gè)吸水墊，在所述的樣品墊和吸水墊之間設(shè)置有一個(gè)纖維素膜，所述的吸水墊和纖維素膜緊密連接，在所述的樣品墊和所述的纖維素膜之間設(shè)置有一個(gè)金標(biāo)墊，所述的樣品墊、金標(biāo)墊和纖維素膜之間緊密連接，在所述纖維素膜上遠(yuǎn)離金標(biāo)墊的一端設(shè)置質(zhì)控線，在所述的質(zhì)控線和金標(biāo)墊之間的纖維素膜上設(shè)置一條檢測(cè)線，所述的檢測(cè)線由重組的泡型包蟲病的抗原EmlS組成，所述的金標(biāo)墊上設(shè)置有膠體金標(biāo)記的探針，所述的膠體金標(biāo)記的探針是以人 IgG為抗原免疫動(dòng)物獲得的抗體或金黃色葡萄球菌A蛋白或鏈球菌G蛋白，所述的質(zhì)控線含有能與膠體金標(biāo)記探針特異性結(jié)合的抗體或抗抗體。進(jìn)一步的，所述的纖維素膜的一端設(shè)置在所述的金標(biāo)墊的下側(cè)，所述的金標(biāo)墊的一端設(shè)置在所述的樣品墊的下側(cè)。進(jìn)一步的，所述的樣品墊、金標(biāo)墊、纖維素膜和吸水墊設(shè)置在一個(gè)背板上。進(jìn)一步的,所述金標(biāo)墊中的膠體金標(biāo)記探針是以人IgG作為抗原免疫小鼠獲得的單克隆抗體，所述質(zhì)控線含有羊抗鼠抗抗體。進(jìn)一步的，所述金標(biāo)墊中的膠體金標(biāo)記探針可以為金黃色葡萄球菌A蛋白或鏈球菌G蛋白，所述質(zhì)控線含有抗金黃色葡萄球菌A蛋白抗體或抗鏈球菌G蛋白抗體。
進(jìn)一步的，重組的泡型包蟲病的抗原Eml8的蛋白濃度為O. 1-lOmg/mL，噴涂量為
8-12 μ L/cm ;膠體金標(biāo)記探針的濃度以蛋白濃度計(jì)為l-5mg/15-20mL。進(jìn)一步的，羊抗鼠抗抗體溶液的濃度為O. l-5mg/mL,噴涂量為8_12 μ L/cm。進(jìn)一步的，抗金黃色葡萄球菌A蛋白抗體或抗鏈球菌G蛋白抗體溶液濃度為 O. l-5mg/mL,噴涂量為 8-12 μ L/cm。進(jìn)一步的，所述的維素膜選自硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜，所述支持膠體金標(biāo)記探針的金標(biāo)墊選自玻璃纖維膜或聚脂膜，所述樣品墊選自濾血膜、玻璃纖維或吸水紙，所述吸水墊為吸水紙。本發(fā)明還提供了上述的一種檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條的制備方法，包括一個(gè)制備重組的泡型包蟲病的抗原Eml8的步驟、一個(gè)制備標(biāo)記的抗人IgG的探針的步驟和一個(gè)制備與膠體金標(biāo)記探針特異結(jié)合的抗抗體的步驟，在上述步驟完成之后，將重組的泡型包蟲病的抗原EmlS溶液噴涂到纖維素膜上形成檢測(cè)線，將能與膠體金標(biāo)記探針特異結(jié)合的抗體或抗抗體溶液噴涂到靠近吸水墊的纖維素膜上形成質(zhì)控線，所述的質(zhì)控線和檢測(cè)線相鄰設(shè)置，將噴涂有檢測(cè)線、質(zhì)控線的纖維膜在相對(duì)濕度40%以下的環(huán)境中干燥1-2小時(shí)， 然后進(jìn)行制備金標(biāo)墊的步驟，在所述的制備金標(biāo)墊的步驟中，將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入膠體金標(biāo)記的探針溶液中，取出后將金標(biāo)墊在相對(duì)濕度40%以下的環(huán)境中干燥1-2小時(shí)， 將所述纖維素膜粘貼在一個(gè)背板的中部，吸水墊粘貼在所述纖維素膜的靠近質(zhì)控線的一端，將金標(biāo)墊粘貼在纖維素膜的靠近檢測(cè)線的一端，將樣品墊粘貼于金標(biāo)墊的遠(yuǎn)離纖維素膜的一端，得到檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條。進(jìn)一步的，所述的重組的泡型包蟲病的抗原Eml8按如下方法制備將感染泡型包蟲病的羊肝多房棘球蝴原頭節(jié)用試劑盒進(jìn)行原頭節(jié)總RNA的抽提，以反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，上游引物序列如SEQ ID NO 1所示，下游引物序列如SEQ ID NO 2 所示，在上游引物中引入了 BamHI位點(diǎn)，在下游引物中引入了 EcoRI酶切位點(diǎn)，以合成cDNA 第一鏈為模板，RT-PCR方法擴(kuò)增目的基因片段。本發(fā)明還提供了一種試劑盒，由一個(gè)盒體構(gòu)成,將上述的檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條設(shè)置在一個(gè)所述的盒體中，所述的盒體的一個(gè)側(cè)面上設(shè)置有一個(gè)加樣孔和一個(gè)觀察孔，所述的加樣孔位于樣品端吸水墊的上方，所述的觀察孔位于所述的檢測(cè)線和質(zhì)控線的上方。能感染人類的棘球?qū)俳{蟲的4種棘球絳蟲的成蟲和幼蟲期形態(tài)不同，可引起不同類型的棘球蝴病。包蟲病患者體內(nèi)血液中含有能特異性結(jié)合所感染的棘球蝴抗原的抗棘球蝴抗體，檢測(cè)受試者體內(nèi)血液中是否含有抗棘球蝴抗體，可作用受試者是否患有包蟲病的指標(biāo)。本發(fā)明的檢測(cè)包蟲病以及病原體種屬的免疫層析試條適用于從泡型包蟲病患者體內(nèi)抽取的全血樣品和血清樣品。對(duì)于全血樣品，本發(fā)明的檢測(cè)泡型包蟲病以及病原體種屬的免疫層析試條中的樣品墊采用濾血膜樣品墊；如果僅檢測(cè)血清樣品，本發(fā)明的檢測(cè)泡型包蟲病免疫層析試條中的樣品墊可采用玻璃纖維或吸水紙樣品墊。本發(fā)明將包蟲抗原固定在纖維素膜等支持物上作為固相抗原，用以捕獲受試者者血樣中的抗多房棘球蝴抗原抗體。本發(fā)明將將重組的泡型包蟲病的抗原EmlS固定在纖維膜上形成檢測(cè)線，該固相抗原可以捕獲受試者血樣中相應(yīng)的抗泡型包蟲抗原EM18抗體，在檢測(cè)線位置形成抗原抗體復(fù)合物沉淀。包蟲病患者體內(nèi)血液中含有的抗多房棘球蝴抗體的優(yōu)勢(shì)抗體類型為IgG抗體。膠體金標(biāo)記探針采用抗人IgG抗體或金黃色葡萄球菌A蛋白或鏈球菌G蛋白制備，該抗人IgG 抗體或金黃色葡萄球菌A蛋白或鏈球菌G蛋白可以是購(gòu)買的商品化抗體，或按照常規(guī)方法自行制備。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方案中采用膠體金標(biāo)記鏈球菌G蛋白為檢測(cè)探針，該膠體金標(biāo)記抗體附著于金標(biāo)墊上。檢測(cè)過程中，復(fù)溶的膠體金標(biāo)記抗體可與受試者血樣中的人IgG 抗體結(jié)合，從而當(dāng)受試者血樣中存在包蟲病特異性抗體時(shí)在檢測(cè)線位置形成色帶。膠體金標(biāo)記抗體不限于金黃色葡萄球菌A蛋白或鏈球菌G蛋白也可采用鼠抗人 IgG的單抗或多抗，或者采用其他動(dòng)物如兔抗人IgG抗體，同樣能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的， 這是本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員都知曉的。本發(fā)明將與膠體金標(biāo)記探針特異性結(jié)合的抗體或抗抗體固定在纖維素膜上作為質(zhì)控線。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方案中，膠體金標(biāo)記探針是鏈球菌G蛋白，相應(yīng)的，質(zhì)控線采用雞抗SPG的IgY抗體。無論待檢樣品中是否含有抗棘球蝴抗體，本發(fā)明的檢測(cè)包蟲病以及病原體種屬的免疫層析試條中質(zhì)控線位置總能形成色帶，該條色帶是判定檢測(cè)過程是否正常和免疫層析試條是否變質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)控線不限于雞抗SPG的IgY抗體，只要能與選定的膠體金標(biāo)記探針特異性結(jié)合， 同樣能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，這是領(lǐng)域的一般技術(shù)人員都知曉的。本發(fā)明的檢測(cè)原理是測(cè)定時(shí)將樣本血清或全血加在濾血膜樣品墊上，I分鐘后滴一滴(約50μ 樣本稀釋液，稀釋液帶動(dòng)樣品按樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水墊的方向移動(dòng)，流經(jīng)金標(biāo)墊時(shí)使金標(biāo)墊上的膠體金標(biāo)記抗體復(fù)溶，并帶動(dòng)其向硝酸纖維素膜、 吸水墊移動(dòng)。膠體金標(biāo)記探針可與樣品中的抗體或抗體亞類結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。此免疫復(fù)合物流至檢測(cè)線時(shí)，若標(biāo)本中有針對(duì)抗原ΕΜ18的抗體或抗體亞類(抗泡型包蟲病抗原的抗體)，即被檢測(cè)線的特異性固相抗原所捕獲，在硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線位置顯出紅色檢測(cè)線條；此免疫復(fù)合物流經(jīng)質(zhì)控線時(shí)，即被質(zhì)控線的固相抗體所捕獲，在硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線位置顯出紅色質(zhì)控線條。陽(yáng)性標(biāo)本既顯示檢測(cè)線，又顯示質(zhì)控線；陰性標(biāo)本沒有檢測(cè)線，僅顯示質(zhì)控線。如果質(zhì)控線不顯示，則表示試條失效。本發(fā)明的免疫層析試條具有以下優(yōu)點(diǎn)(I)敏感性及特異性高實(shí)驗(yàn)室考核結(jié)果顯示，本發(fā)明的免疫層析試條檢測(cè)泡型包蟲病患者血清的敏感性為94% (泡型陽(yáng)性例數(shù)/ 泡型總例數(shù))，特異性為100% (非包蟲病患者陰性例數(shù)/非包蟲病患者總例數(shù))；(2)檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)過程中標(biāo)本處理簡(jiǎn)單，血清或全血都可以直接使用，無需處理，不需要專門儀器和人員培訓(xùn)，非專業(yè)技術(shù)人員按照說明書即可操作，并可迅速觀察結(jié)果，標(biāo)本中的抗體經(jīng)10分鐘左右的層析后，即可出現(xiàn)肉眼可見的檢測(cè)線，從而為包蟲病人的治療爭(zhēng)取了時(shí)間，很適合現(xiàn)場(chǎng)和基層使用；(3)制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉，易于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明將在包蟲病的檢測(cè)及其相關(guān)疾病的診斷和治療中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。


圖I是檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條的正面結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條的縱截面結(jié)構(gòu)示意圖。
其中I為樣品墊；2為金標(biāo)墊；3為纖維素膜；4為吸水墊；5為檢測(cè)線；6為質(zhì)控線；7為背板。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所述百分含量如無特別說明均為質(zhì)量/體積百分含量或體積/體積百分含量。實(shí)施例I本發(fā)明一種檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條，包括一個(gè)背板7，所述的背板7的上側(cè)的一端設(shè)置有一個(gè)樣品墊1，所述的背板8的上側(cè)的另外一端設(shè)置有一個(gè)吸水墊4，在所述的樣品墊I和吸水墊4之間設(shè)置有一個(gè)纖維素膜3，所述的吸水墊4和纖維素膜3緊密連接，在所述的樣品墊I和所述的纖維素膜3之間設(shè)置有一個(gè)金標(biāo)墊2，所述的樣品墊I、金標(biāo)墊2和纖維素膜3之間緊密連接，在所述纖維素膜3上遠(yuǎn)離金標(biāo)墊2的一端設(shè)置質(zhì)控線6， 在所述的質(zhì)控線6和金標(biāo)墊2之間的纖維素膜3上設(shè)置檢測(cè)線5，所述的檢測(cè)線5由重組的泡型包蟲病的抗原Eml8組成,所述的金標(biāo)墊2上設(shè)置有膠體金標(biāo)記的探針,所述的膠體金標(biāo)記的探針是以人IgG為抗原免疫動(dòng)物獲得的抗體或金黃色葡萄球菌A蛋白或鏈球菌G蛋白，所述的質(zhì)控線7含有能與膠體金標(biāo)記探針特異性結(jié)合的抗體或抗抗體。進(jìn)一步的，所述的纖維素膜3的一端設(shè)置在所述的金標(biāo)墊2的下側(cè)，所述的金標(biāo)墊 2的一端設(shè)置在所述的樣品墊I的下側(cè)。進(jìn)一步的,所述金標(biāo)墊2中的膠體金標(biāo)記探針是以人IgG作為抗原免疫小鼠獲得的單克隆抗體，所述質(zhì)控線6含有羊抗鼠抗抗體。進(jìn)一步的，所述金標(biāo)墊2中的膠體金標(biāo)記探針可以為金黃色葡萄球菌A蛋白或鏈球菌G蛋白，所述質(zhì)控線7含有抗金黃色葡萄球菌A蛋白抗體或抗鏈球菌G蛋白抗體。實(shí)施例2檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條的制備I、重組的泡型包蟲病的抗原Eml8按如下方法制備I. I目的基因的克隆、轉(zhuǎn)化在新疆采集自然感染的羊肝多房棘球蝴原頭節(jié)。用試劑盒(E.Z.N.A Kit I)進(jìn)行原頭節(jié)總RNA的抽提。以反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PR0MEGA)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物，為便于定向克隆在引物中分別引入了 BamHI (上游引物)和EcoRI (下游引物)酶切位點(diǎn)(斜體字母表示)。引物序列如下Eml8 F(5’-GCGGATCCAAGGAGTCTGACTTAGC GGA-3’)和 Eml8 R (5’ -GCGAATTCGGCTTCACTTTCATCATCCTG-3’)，引物由上海生工公司合成。 以合成cDNA第一鏈為模板，RT-PCR方法擴(kuò)增目的基因片段，所述的重組的泡型包蟲病的抗原 Eml8 的核苷酸序列如 SEQ ID NO :3 所示。采用 HiFi DNA Amplification Kit(BBST) 試劑盒，聚合酶為Pfu。擴(kuò)增條件反應(yīng)在50ul.體系中進(jìn)行，循環(huán)參數(shù)為94°C變性3min， 94°C 30s, 50°C 45s, 72°C 60s，共35個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin。擴(kuò)增的產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢查。將酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行I. 2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下將凝膠中的目的片段(_380bp)和pGEX-3X表達(dá)載體(_5000bp)切下，用Solarbio公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化，將目的基因和表達(dá)載體用T4連接酶連接，連接體系如下
4 μ L
4 μ L
I μ L
I μ L
10 μ L連接反應(yīng)條件16°C下過夜連接取5yL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a細(xì)胞，具體方法為將5 μ L的連接產(chǎn)物與 200 μ L Ε. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴30分鐘，之后于42°C水浴熱休克90秒鐘，再置于冰上1-2分鐘，然后加入800 μ L預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，370C，200rpm震蕩培養(yǎng)45分鐘，取 200 μ L菌液涂LB+Amp平板，倒置于37°C溫箱過夜培養(yǎng)。在平板中挑取5-10個(gè)單菌落，分別置于5mLLB+Amp液體培養(yǎng)基中，37°C，200rpm 過夜震蕩培養(yǎng)，送生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序檢測(cè)連接是否成功，將連接成功的重組載體，用OMEGA公司的Plasmid MiniKit I抽提質(zhì)粒，取I μ L質(zhì)粒照以上方法轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)細(xì)胞。同時(shí)取IyL PGEX-3X空載體轉(zhuǎn)化E. coli DH5a細(xì)胞。2重組蛋白的表達(dá)和純化2. I.重組蛋白的小量表達(dá)分別取轉(zhuǎn)化重組載體及含有PGEX-3X空載體的E. coli BL21 (DE3)單菌落于 3mLLB (含100μ g/mL Amp)培養(yǎng)基，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，而后將ImL菌液加入到2mL 新鮮LB (含100 μ g/mL Amp)培養(yǎng)基中，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)2h，而后加入IPTG至終濃度為lmM，37°C，200rpm誘導(dǎo)表達(dá)3h。離心收集菌體，用PBS溶液洗兩次，將兩者同時(shí)進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，觀察重組蛋白是否表達(dá)。2. 2重組蛋白的大量表達(dá)取確定表達(dá)的E. coli BL21(DE3)單菌落于 IOOmLLB (含 100 μ g/mL Amp)培養(yǎng)基，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，而后將IOOmL菌液加入到IOOOmL新鮮LB (含IOOyg/ mL Amp)培養(yǎng)基中，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)2h，而后加入加入IPTG至終濃度為lmM，28°C， 200rpm誘導(dǎo)表達(dá)4h。離心收集菌體，用PBS溶液洗兩次，而后在液氮和37°C水浴中反復(fù)凍融三次，加入20倍壓積的PBS溶液，超聲8次(每次30s，間隔Imin)，而后加入4mL 20% TritonX-100溶液至終濃度為I %，冰上攪拌Ih后，20000g離心30min，收集上清和沉淀，進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，以檢驗(yàn)蛋白的溶解性。2. 3.重組蛋白的純化由于該蛋白存在于上清中，故用GE Healthcare公司的Glutathione Sepharose 4B純化柱純化上清獲得重組蛋白，具體操作方法按照純化柱的說明書進(jìn)行，獲得重組蛋白的濃度為2. 6mg/mL。
3、鏈球菌G蛋白可以購(gòu)買獲得。4、制備免疫膠體金探針及金標(biāo)墊用下述方法制備鏈球菌G蛋白標(biāo)記的免疫膠體金探針及金標(biāo)墊I)采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，具體方法為將HAuCl4 (滬試牌購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)配制成O. 01 %水溶液，取IOOmL加熱至沸騰，攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入I. 6mL的I %的檸檬酸三鈉水溶液，待液體顏色穩(wěn)定成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液。2)確定膠體金偶聯(lián)探針飽和濃度用O. 2M K2CO3調(diào)節(jié)步驟I)制備的膠體金溶液的pH值至6. 0，準(zhǔn)備5支潔凈試管， 分別加入ImL膠體金溶液。將步驟I)制備的經(jīng)純化的鏈球菌G蛋白稀釋為lmg/mL，分別向 4支試管中加入20 μ L、25 μ L、30 μ L、35 μ L，另一支為空白對(duì)照，混勻后于室溫下放置5分鐘，加入10% NaCl水溶液，混勻，靜置10-20分鐘后觀察液體顏色。膠體金溶液顏色不變時(shí)所含最少量即為穩(wěn)定ImL膠體金溶液所需蛋白的最適濃度，以此為基礎(chǔ)增加20%蛋白量即為膠體金探針飽和溶液。結(jié)果維持膠體金溶液顏色不變的蛋白量為20 μ L，即探針濃度為 20 μ g/mLο3)鏈球菌G蛋白(SPG)標(biāo)記的免疫膠體金探針及金標(biāo)墊的制備取取50mL膠體金溶液，用O. 2M K2CO3調(diào)節(jié)pH值為6. 0，按25 μ g/mL加入已純化的金黃色葡萄球菌A蛋白，得到含有濃度為25 μ g/mL鏈球菌G蛋白的免疫膠體金探針溶液 50mL，攪拌I小時(shí)，再加入終濃度為O. 05% PEG20000，攪拌I小時(shí)，IOOOOrpm離心30分鐘， 棄上清，用20mM硼酸緩沖液洗滌沉淀，并將其保存于IOmL含15%蔗糖的IOmMHEPES緩沖液中，得到鏈球菌G蛋白標(biāo)記的膠體金探針溶液。取5mL鏈球菌G蛋白標(biāo)記的膠體金探針溶液均勻加在玻璃纖維膜上，相對(duì)濕度40%下干燥I小時(shí)，得到金標(biāo)墊。5、檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條的制備該試條的制備方法包括以下步驟I) NC膜的包被重組抗原EM18 :用O. OlM pH7. 4 PBS稀釋實(shí)施例I制備的重組抗原EM18至終濃度為O. 5mg/mL,用于包被檢測(cè)線5 ；質(zhì)控抗體雞抗SPG IgY的包被用O. OlM pH7. 4 PBS稀釋羊抗鼠IgG至終濃度為
O.5mg/mL,用于包被質(zhì)控線；BIODOT公司XZ1000噴膜機(jī)將分別噴于300mm長(zhǎng)、25mm寬的硝酸纖維素膜(購(gòu)自 Sartorius公司)上,噴涂量為10 μ L/cm,形成一條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線,相對(duì)濕度40%下， 干燥2小時(shí)。2)檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條的制備用一塊單面涂了不干膠的PVC背板7，中間粘貼上處理好的NC膜3 ；NC膜3靠近質(zhì)控線6的一端緊密粘貼吸水墊4 (購(gòu)于MILLIP0RE公司);NC膜3遠(yuǎn)離質(zhì)控線6的一端緊密粘貼金標(biāo)墊2 ;金標(biāo)墊2另一端緊密粘貼濾血膜樣品墊I (購(gòu)自WHATMAN公司)。得到檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條母板，可按所需大小進(jìn)行切割，加干燥劑后密封保存。6、檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試劑盒的制備為了方便使用，將上述制備的檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條裝入試劑盒體中， 加干燥劑后密封保存。所述的盒體的一個(gè)側(cè)面上設(shè)置有一個(gè)加樣孔和一個(gè)觀察孔，所述的
1加樣孔位于樣品端吸水墊的上方，所述的觀察孔位于所述的檢測(cè)線和質(zhì)控線的上方。實(shí)施例3檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試劑盒免疫層析試條的制備用購(gòu)買自上海業(yè)力生物科技有限公司的羊抗人IgG制備膠體金標(biāo)記檢測(cè)探針，用購(gòu)買自捷寧生物公司的兔抗羊IgG包被質(zhì)控線，其他步驟同實(shí)施例I。實(shí)施例4檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條的實(shí)驗(yàn)室考核I、檢測(cè)方法于實(shí)施例2制備的免疫層析試條的濾血膜樣品墊加入待測(cè)血清，I分鐘后加入樣本稀釋液(PBS) I滴(約50 μ L)，5分鐘后開始觀察結(jié)果，15分鐘觀察終止。結(jié)果判定如果檢測(cè)線5和質(zhì)控線6均出現(xiàn)紅色條帶，即判為泡型包蟲病，如果僅有質(zhì)控線6出現(xiàn)紅色條帶，即判為陰性，如果質(zhì)控線沒有紅色條帶，即試條失效。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果用本發(fā)明實(shí)施例2制備的檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室考核結(jié)果如表I所示。上述檢測(cè)結(jié)果表明本發(fā)明的免疫層析試條可用于泡型包蟲病的快速檢測(cè)。表I本發(fā)明檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條的實(shí)驗(yàn)室考核結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條，包括一個(gè)樣品墊和一個(gè)吸水墊，在所述的樣品墊和吸水墊之間設(shè)置有一個(gè)纖維素膜，吸水墊和所述的纖維素膜緊密連接，在樣品墊和纖維素膜之間設(shè)置有一個(gè)金標(biāo)墊，所述的樣品墊、金標(biāo)墊和纖維素膜之間緊密連接，在纖維素膜上靠近吸水墊的一端設(shè)置質(zhì)控線，在所述的質(zhì)控線和金標(biāo)墊之間的纖維素膜上設(shè)置一條檢測(cè)線，其特征在于所述的檢測(cè)線含有重組的泡型包蟲病的抗原Eml8，所述的金標(biāo)墊上設(shè)置有膠體金標(biāo)記的探針，所述的質(zhì)控線含有能與膠體金標(biāo)記探針特異性結(jié)合的抗體或抗抗體。
2.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條，其特征在于所述的樣品墊、 金標(biāo)墊、纖維素膜和吸水墊設(shè)置在一個(gè)背板上。
3.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條，其特征在于所述的纖維素膜的一端設(shè)置在所述的金標(biāo)墊的下側(cè)，所述的金標(biāo)墊的一端設(shè)置在所述的樣品墊的下側(cè)。
4.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條，其特征在于所述的膠體金標(biāo)記的探針是以人IgG為抗原免疫動(dòng)物獲得的抗體、或金黃色葡萄球菌A蛋白、或鏈球菌G 蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條，其特征在于所述的膠體金標(biāo)記探針是以人IgG作為抗原免疫小鼠獲得的單克隆抗體，所述的質(zhì)控線含有羊抗鼠抗抗體。
6.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條，其特征在于所述的質(zhì)控線含有抗金黃色葡萄球菌A蛋白抗體、或抗鏈球菌G蛋白抗體。
7.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條，其特征在于重組的泡型包蟲病的抗原Eml8的蛋白濃度為O. 1-lOmg/mL,噴涂量為8_12 μ L/cm,膠體金標(biāo)記探針的濃度以蛋白濃度計(jì)為l-5mg/15-20mL。
8.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條，其特征在于所述的羊抗鼠抗抗體溶液的濃度為O. l-5mg/mL,噴涂量為8-12 μ L/cm。
9.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條，其特征在于抗金黃色葡萄球菌A蛋白抗體或抗鏈球菌G蛋白抗體溶液濃度為O. l-5mg/mL,噴涂量為8_12 μ L/cm。
10.一種制備權(quán)利要求I所述的檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條的方法，其特征在于 包括一個(gè)制備重組的泡型包蟲病的抗原Eml8的步驟、一個(gè)制備膠體金標(biāo)記探針的步驟和一個(gè)制備與膠體金標(biāo)記探針特異結(jié)合的抗抗體的步驟，在上述步驟完成之后，將重組的泡型包蟲病的抗原EmlS溶液噴涂到纖維素膜上形成檢測(cè)線，將能與膠體金標(biāo)記探針特異結(jié)合的抗體或抗抗體溶液噴涂到靠近吸水墊的纖維素膜上形成質(zhì)控線，所述的質(zhì)控線和檢測(cè)線相鄰設(shè)置，將噴涂有檢測(cè)線、質(zhì)控線的纖維膜在相對(duì)濕度40%以下的環(huán)境中干燥1-2小時(shí)，然后進(jìn)行制備金標(biāo)墊的步驟，在所述的制備金標(biāo)墊的步驟中，將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入膠體金標(biāo)記的探針溶液中，取出后將金標(biāo)墊在相對(duì)濕度40%以下的環(huán)境中干燥1-2小時(shí)，吸水墊粘貼在所述纖維素膜的靠近質(zhì)控線的一端，將金標(biāo)墊粘貼在纖維素膜的靠近檢測(cè)線的一端，將樣品墊粘貼于金標(biāo)墊的遠(yuǎn)離纖維素膜的一端，得到檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條。
11.如權(quán)利要求10所述的制備檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條的方法，其特征在于 所述的重組的泡型包蟲病的抗原Eml8按如下方法制備將感染泡型包蟲病的羊肝多房棘球蝴原頭節(jié)用試劑盒進(jìn)行原頭節(jié)總RNA的抽提，以反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，上游弓I物序列如SEQ ID NO : I所示，下游弓I物序列如SEQ IDNO : 2所示，在上游引物中引入了 BamHI位點(diǎn)，在下游引物中引入了 EcoRI酶切位點(diǎn)，以合成cDNA第一鏈為模板，RT-PCR 方法擴(kuò)增目的基因片段。
12.—種試劑盒，包括一個(gè)盒體，其特征在于將權(quán)利要求I所述的檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條設(shè)置在所述的盒體中，所述的盒體的一個(gè)側(cè)面上設(shè)置有一個(gè)加樣孔和一個(gè)觀察孔，所述的加樣孔位于樣品端吸水墊的上方，所述的觀察孔位于所述的檢測(cè)線和質(zhì)控線的上方。
13.一種檢測(cè)泡型包蟲病的試劑，其特征在于包括以下組分1)重組的泡型包蟲病的抗原Eml8，所述的重組的泡型包蟲病的抗原Eml8的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示；2)膠體金標(biāo)記探針。
14.如權(quán)利要求13所述的檢測(cè)泡型包蟲病的試劑，其特征在于所述的重組的泡型包蟲病的抗原EmlS按如下方法制備將感染泡型包蟲病的羊肝多房棘球蝴原頭節(jié)用試劑盒進(jìn)行原頭節(jié)總RNA的抽提，以反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，上游引物序列如 SEQ ID NO 1所示，下游引物序列如SEQ ID NO 2所示，在上游引物中引入了 BamHI位點(diǎn)， 在下游引物中引入了 EcoRI酶切位點(diǎn)，以合成cDNA第一鏈為模板，RT-PCR方法擴(kuò)增目的基因片段。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，公開了一種檢測(cè)泡型包蟲病的免疫層析試條，包括一個(gè)樣品墊和一個(gè)吸水墊，在樣品墊和吸水墊之間設(shè)置有一個(gè)纖維素膜，在樣品墊和纖維素膜之間設(shè)置有一個(gè)金標(biāo)墊，樣品墊、金標(biāo)墊和纖維素膜之間緊密連接，在纖維素膜上靠近吸水墊的一端設(shè)置質(zhì)控線，在質(zhì)控線和金標(biāo)墊之間的纖維素膜上設(shè)置一條檢測(cè)線，檢測(cè)線含有重組的泡型包蟲病的抗原Em18，金標(biāo)墊上設(shè)置有膠體金標(biāo)記的探針，質(zhì)控線含有能與膠體金標(biāo)記探針特異性結(jié)合的抗體或抗抗體。本發(fā)明的免疫層析試條具有簡(jiǎn)便性、敏感性、特異性和快速性的優(yōu)點(diǎn)，適于臨床和現(xiàn)場(chǎng)使用。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102608330SQ201210062778
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者丁丹, 楊玥濤, 汪俊云, 石鋒, 高春花 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所