專利名稱：一種桉葉脂肪酸成分測定方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物資源的綜合開發(fā)技術領域，涉及采用現(xiàn)代分析檢測儀器檢測桉葉化學成分的檢測方法，具體的說是一種桉葉脂肪酸成分測定方法。
背景技術：
多不飽和脂肪酸(PUFAs)是指含有2個或2個以上雙鍵且碳鏈長18_22個碳原子的直鏈脂肪酸。功能性PUFAs根據(jù)結構分為兩大類一類是《-3PUFAs和《_6PUFAs。Co -6PUFAs的重要性，早在20世紀50年代就開始研究，而co_3PUFAs的生理調節(jié)功能和保健作用，是在近20年才被人們逐漸認識并做了大量的研究工作。藥理實驗證明，a-亞麻酸、EPA和DHA等《_3PUFAs都具有降血脂、降血壓、促進脂肪代謝、于治療和防治心血管系統(tǒng)疾病。目前，許多國家都在開發(fā)以a-亞麻酸、EPA和DHA為主要成分的保健食品和醫(yī)療藥品。但《-3PUFAS的來源較少，主要來自海洋哺乳動物及魚類的油脂。陸地動物和植物油中含《_3PUFAs甚微，僅發(fā)現(xiàn)亞麻油(15. 60%)、紫蘇油(56. 14% -64. 82% )和蠶蛹油(31.63% )等少數(shù)植物和動物油含有較高的亞麻酸。目前已有許多《-3PUFAs產(chǎn)品上市，大都來自海魚的油脂，來源有限，必須開發(fā)新資源，從陸地動植物和微生物油脂中尋找和開發(fā)含《-3PUFAs的原料，使用生產(chǎn)效率更高的生產(chǎn)方法。以滿足市場的需要。桉樹在醫(yī)藥、化工等方面利用價值很高。在生物醫(yī)學方面對桉葉揮發(fā)性油(eucalyptus oil)的研究較多。桉樹不飽和脂肪酸藥用成份研究及產(chǎn)業(yè)化應用幾乎沒有。當前，國內外桉樹不飽和脂肪酸面主要研究僅在植物生理方面。根據(jù)我們對巨桉莖葉中脂肪酸成分的測試分析，結果表明，膜脂脂肪酸的成分主要有棕櫚酸(16:0)、棕櫚油酸(16:1)、油酸(18:1)、亞油酸(18:2)和亞麻酸(18:3).其中，亞麻酸的含量最高，達36. 45% -54. 86% .各種源中的亞麻酸含量，以巨桉18592號種源含量最高，17562號種源含量最低.其次是棕櫚酸含量，達21. 86% -29. 54%，最高者為巨桉16594號種源，也是不抗寒種源.棕櫚桐油酸、油酸、亞油酸的含量較少。以赤桉為材料.結果表明在赤桉樹葉中未檢出十四酸，檢出了棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸等脂肪。從上述研究和我們的研究表明桉樹含有多不飽和脂肪酸的含量是相特別是相當豐富的，特別是含有資源稀少的《_3PUFAs類型的亞麻酸。目前文獻中關于桉樹藥用成份研究及產(chǎn)業(yè)化應用幾乎是空白，因此開展桉樹不飽和脂肪酸特別是多不飽和脂肪酸產(chǎn)業(yè)研究具有巨大的市場和潛力。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為了彌補現(xiàn)有技術存在的不足，提供一種桉葉脂肪酸成分測定方法。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術方案是該桉葉脂肪酸成分測定方法，按以下步驟(I)樣品脂肪酸甲酯化或乙酯化、
甲酯化將提取物置于三角瓶中，加入濃度為I %硫酸甲醇溶液，加入量為lg/50mL，充分振蕩，55°C水浴加熱回流I小時，取出靜置后，加入溶劑，加入量為提取物與溶劑之比lg/50mL，振蕩均勻并靜置30分鐘，取上清液放入離心管中IOOOOrpm下離心10分鐘，離心后取上清部分作為分析試樣；乙酯化將提取物置于三角瓶中，加入濃度為0. 5mol/L的NaOH乙醇溶液，加入量為lg/10mL，充分振蕩，80°C水浴加熱5-10分鐘，加入三氟化硼-乙醚溶液與無水乙醇配制的混合溶液，加入量為lg/20mL，80°C水浴加熱10分鐘，取出冷卻，加入飽Nacl溶液，加入量lg/70mL，和正己烷，加入量lg/4mL，振搖混勻，靜置分層，取上層液進行分析試樣；所述三氟化硼-乙醚溶液與無水乙醇配制的混合溶液按體積比I:3配制；(2) GC-MS聯(lián)用儀測定 A.色譜條件進樣口溫度253°C，流速ImL/分鐘，進樣量I. Oii L，分流比20 : I ；B.程序升溫初溫80 V，保持I. I分鐘，以17 °C /分鐘升至240 V，保持0. 7分鐘，再以I °C /分鐘升至253 °C，保持4分鐘；C.質譜條件EI電離源，電子能量70eV，離子源溫度230°C，四極桿溫度150°C，EM電壓1024V，質量掃描范圍40 600u ；(3)標準溶液配制及標準曲線制作配制各種濃度的標準成分溶液，以標準系列濃度為橫坐標，標準目標化合物定量離子峰面積為縱坐標制作標準曲線，然后分別以GC-MS進行測定，并保證檢測的GC-MS條件與所述色譜條件、程序升溫及質譜條件一致；(4)脂肪酸定性、定量分析根據(jù)利用GC-MS譜圖庫進行的自動檢索或根據(jù)標準成分，對各成分進行定性分析；對色譜峰面積歸一化法確定各成分的相對百分含量或與相應的標準曲線方程比較獲得含量。所述溶劑為正己烷。所述步驟(4)脂肪酸定性、定量分析時，樣品譜圖與標準譜圖庫匹配度在0.9以上，與標準樣品出峰時間差小于2秒。本發(fā)明桉葉脂肪酸成分測定方法，是通過GC-MS系統(tǒng)對桉葉中的化學成分特別是脂肪酸類化合物作了一個系統(tǒng)的分析，試圖揭示桉葉脂肪酸成分資源，為林木遺傳育種評估或合理利用了桉葉資源等提供技術支持。


圖I是按葉提取物化學成分的GC-MS分析結果圖。
具體實施例方式實施例一本發(fā)明具更加優(yōu)選的實例，測定方法條件有
儀器是GC-MS 聯(lián)用儀(Agilent 7890GC-5975MS，美國)色譜條件HP-5MS石英彈性毛細管柱(30mX0. 25mmX0. 25 u m)，載氣為高純氦氣圖庫NIST08標準譜圖庫試劑濃硫酸、甲醇、正己烷、無水硫酸鈉和氫氧化鈉均為分析純。測定方法(I)脂肪酸甲酯化將提取物/樣品0. 4g置于三角瓶中，加入I %硫酸甲醇溶液20mL，充分振蕩，55°C水浴加熱回流lh，取出靜置后，加入15mL正己烷，振蕩均勻并靜置30分鐘，取上清液放入離 心管中IOOOOrpm下離心10分鐘，離心后取上清部分作為分析試樣。(2) GC-MS聯(lián)用儀測定A.色譜條件進樣口溫度253°C ;流速ImL/分鐘，進樣量I. Oii L，分流比20 : I。B.程序升溫初溫80 V，保持I. I分鐘，以17 °C /分鐘升至240 V，保持0. 7分鐘，再以I °C /分鐘升至253 °C，保持4分鐘。C.質譜條件EI電離源，電子能量70eV，離子源溫度230°C，四極桿溫度150°C，EM電壓1024V，質量掃描范圍40 600u。(3)標準溶液配制及標準曲線制作標準溶液配制及標準曲線制作過程配制各種濃度的標準成分溶液，以標準系列濃度為橫坐標，標準目標化合物定量離子峰面積為縱坐標制作標準曲線。然后分別以GC-MS進行測定。并保證檢測的GC-MS條件與色譜條件、程序升溫及質譜條件一致。(4)脂肪酸定性、定量分析。根據(jù)利用GC-MS譜圖庫進行的自動檢索或根據(jù)標準成分，對各成分進行定性分析。對色譜峰面積歸一化法確定各成分的相對百分含量，或與相應的標準曲線方程比較獲
得含量。實施例二 本發(fā)明具更加優(yōu)選的實例，測定方法條件有儀器是GC-MS 聯(lián)用儀(Agilent 7890GC-5975MS，美國)色譜條件HP-5MS石英彈性毛細管柱(30mX0. 25mmX0. 25 u m)，載氣為高純氦氣圖庫NIST08標準譜圖庫試劑無水乙醇、三氟化硼-乙醚、氯化鈉、正己烷、氫氧化鈉均為分析純測定方法(I)脂肪酸乙酯化將0. 5g提取物置于三角瓶中，加入濃度為0. 5mol/L的NaOH乙醇溶液溶液5ml，充分振蕩，80°C水浴加熱5-10分鐘，加入IOmL三氟化硼-乙醚溶液與無水乙醇配制的混合溶液，80°C水浴加熱10分鐘，取出冷卻，加入35mL飽和氯化鈉溶液和2mL正己烷，振搖混勻，靜置分層，取上層液進行分析試樣。三氟化硼-乙醚溶液與無水乙醇的混合溶液按I : 3的比例配制；
(2) GC-MS聯(lián)用儀測定A.色譜條件進樣口溫度253°C ;流速ImL/分鐘，進樣量I. Oii L，分流比20 : I。B.程序升溫初溫80 V，保持I. I分鐘 ，以17 °C /分鐘升至240 V，保持0. 7分鐘，再以I °C /分鐘升至253 °C，保持4分鐘。C.質譜條件EI電離源，電子能量70eV，離子源溫度230°C，四極桿溫度150°C，EM電壓1024V，質量掃描范圍40 600u。(3)標準溶液配制及標準曲線制作標準溶液配制及標準曲線制作過程配制各種濃度的標準成分溶液，以標準系列濃度為橫坐標，標準目標化合物定量離子峰面積為縱坐標制作標準曲線。然后分別以GC-MS進行測定。并保證檢測的GC-MS條件與色譜條件、程序升溫及質譜條件一致。(4)脂肪酸定性、定量分析。根據(jù)利用GC-MS譜圖庫進行的自動檢索或根據(jù)標準成分，對各成分進行定性分析。對色譜峰面積歸一化法確定各成分的相對百分含量，或與相應的標準曲線方程比較獲
得含量。
權利要求
1.一種桉葉脂肪酸成分測定方法，其特征是按以下步驟 (1)樣品脂肪酸甲酯化或乙酯化 甲酯化將提取物置于三角瓶中，加入濃度為1%硫酸甲醇溶液，加入量為lg/50mL，充分振蕩，55°C水浴加熱回流I小時，取出靜置后，加入溶劑，加入量為提取物與溶劑之比lg/50mL，振蕩均勻并靜置30分鐘，取上清液放入離心管中IOOOOrpm下離心10分鐘，離心后取上清部分作為分析試樣； 乙酯化將提取物置于三角瓶中，加入濃度為0. 5mol/L的NaOH乙醇溶液，加入量為lg/10mL，充分振蕩，80°C水浴加熱5-10分鐘，加入三氟化硼-乙醚溶液與無水乙醇配制的混合溶液，加入量為lg/20mL，80°C水浴加熱10分鐘，取出冷卻，加入飽Nacl溶液，加入量lg/70mL，和正己烷，加入量lg/4mL，振搖混勻，靜置分層，取上層液進行分析試樣；所述三氟化硼-乙醚溶液與無水乙醇配制的混合溶液按體積比I:3配制； (2)GC-MS聯(lián)用儀測定 A.色譜條件 進樣口溫度253°C，流速ImL/分鐘，進樣量I. 0 y L，分流比20 : I ; B.程序升溫 初溫80°C，保持I. I分鐘，以17°C /分鐘升至240°C，保持0. 7分鐘，再以1°C /分鐘升至253 °C，保持4分鐘； C.質譜條件 EI電離源，電子能量70eV，離子源溫度230°C，四極桿溫度150°C，EM電壓1024V，質量掃描范圍40 600u ； (3)標準溶液配制及標準曲線制作 配制各種濃度的標準成分溶液，以標準系列濃度為橫坐標，標準目標化合物定量離子峰面積為縱坐標制作標準曲線，然后分別以GC-MS進行測定，并保證檢測的GC-MS條件與所述色譜條件、程序升溫及質譜條件一致； (4)脂肪酸定性、定量分析 根據(jù)利用GC-MS譜圖庫進行的自動檢索或根據(jù)標準成分，對脂肪酸成分進行定性分析；對色譜峰面積歸一化法確定脂肪酸成分的相對百分含量或與相應的標準曲線方程比較獲得含量。
2.根據(jù)權利要求I所述桉葉脂肪酸成分測定方法，其特征是所述步驟(I)樣品脂肪酸甲酯化或乙酯化。
3.根據(jù)權利要求I所述桉葉脂肪酸成分測定方法，其特征是所述溶劑為正己烷。
4.根據(jù)權利要求I所述桉葉脂肪酸成分測定方法，其特征是所述步驟(4)脂肪酸定性、定量分析時，樣品譜圖與標準譜圖庫匹配度在0. 9以上，與標準樣品出峰時間差小于2秒。
全文摘要
一種桉葉脂肪酸成分測定方法，該方法對獲得的等桉葉(包括尾葉桉、尾巨桉、巨桉等樹種)油脂樣品或桉葉提取物經(jīng)一定比例硫酸甲醇溶液的甲酯化(或乙酯化)處理后，采用特定的色譜條件、升溫程序、質譜條件進行氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(GC-MS)定性、定量測定其化學成分，并計算各成分的含量。本發(fā)明測定方法具有測定時間短，檢測樣品消耗量少，檢測脂肪酸成分多、檢測效率高，操作簡單，精確度高，穩(wěn)定性好等優(yōu)點，克服了因GC-MS檢測條件對測定數(shù)據(jù)影響較大的缺點，十分適合用于桉葉脂肪酸化學成分的快速分析，為林木遺傳育種評估或合理利用了桉葉資源等提供技術支持。
文檔編號G01N30/72GK102621242SQ20121007822
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月12日 優(yōu)先權日2012年3月12日
發(fā)明者吳志華, 張婧, 楊巧麗, 謝耀堅, 黃赤夫 申請人:國家林業(yè)局桉樹研究開發(fā)中心