專利名稱：卵巢癌相關抗原自身抗體譜液相芯片檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術領域的液相芯片檢測試劑盒，尤其是一種卵巢癌相關抗原自身抗體譜液相芯片檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術：
卵巢癌是目前國內(nèi)外常見的婦科惡性腫瘤，其死亡率已排全部婦女惡性腫瘤的第四位，在女性生殖道惡性腫瘤中居首位，并有上升趨勢。卵巢癌發(fā)病隱匿，早期缺乏典型的臨床癥狀。由于卵巢特殊的解剖學位置，常規(guī)體格檢查和盆腔雙合診很難在早期發(fā)現(xiàn)卵巢癌。到目前為止，在病變I期被確診病人僅有25%，而且當病變發(fā)展到晚期(III、IV)時，即使得到恰當?shù)闹委熎?年存活率也由I期的95%下降到20-25%。因此，加強卵巢癌的二級預防，及早發(fā)現(xiàn)、診斷、治療是提高卵巢癌治療效果的關鍵。故篩選和鑒定有高度敏感性及特異性、能用于早期卵巢癌診斷的血清標志，對于改善臨床預后和提高存活率有重要意義。CA125是目前臨床上應用最廣泛的卵巢癌血清標志物，它在50%的I期、90%的晚期(III期、IV期)卵巢癌中升高，同時在婦科的良性病變、非婦科惡性腫瘤病人中也可升高。即便如此，CA125與超聲聯(lián)合檢測時對卵巢癌的陽性預測值也只有20%左右。正是因為其特異性及陽性預測值較低，限制了它在卵巢癌早期診斷中的應用。為此，有研究者將CA125 與其它血清標志物聯(lián)合應用，以提高對卵巢癌的診斷效能。越來越多的研究證實，在腫瘤形成過程中，腫瘤可刺激機體產(chǎn)生針對腫瘤相關抗原的免疫反應，其中最明顯的特征就是抗體的產(chǎn)生，這種由廣泛表達于腫瘤細胞的異常蛋白誘導產(chǎn)生的自身抗體，一般稱之為腫瘤自身抗體。研究發(fā)現(xiàn)，檢測抗原自身抗體的敏感度與特異度均高于傳統(tǒng)檢測抗原的方法，且自身抗體在許多惡性腫瘤患者術前的血清中升高，術后明顯下降；而炎癥反應等良性病變引起的短暫性抗原升高并不能刺激機體產(chǎn)生自身抗體；另外，檢測抗原自身抗體還可以很好地避免假陽性?？梢姡逯心[瘤自身抗體可能是腫瘤發(fā)生的報告分子，檢測腫瘤自身抗體用于惡性腫瘤的診斷是一個很有前景的方法，并可用于病情預測。然而，腫瘤患者由腫瘤抗原誘導產(chǎn)生的自身抗體陽性率過低，平均為15% 20 %，很少超過50 %，這限制了單個自身抗體作為腫瘤發(fā)生報告分子的可能性。分析單個腫瘤相關抗原自身抗體在診斷卵巢惡性腫瘤時均不理想，這說明卵巢惡性腫瘤的發(fā)生是一個多階段、多步驟、多基因參與的過程，每個階段都有其特異性開放表達的抗原，因此，通過尋找卵巢惡性腫瘤各個階段的腫瘤相關抗原的自身抗體，組成自身抗體譜就可能為卵巢惡性腫瘤的分期、診斷及篩查等提供更全面的血清學標志物，聯(lián)合多個標志物則可彌補其不足。SEREX方法由Sahin等創(chuàng)立，即用腫瘤患者自體血清中的高滴度IgG抗體篩選腫瘤cDNA文庫，獲得腫瘤抗原的方法。運用該方法篩選得到的大量腫瘤抗原構成了一個刺激機體對腫瘤產(chǎn)生體液免疫應答的抗原庫,而腫瘤患者體內(nèi)針對這些抗原的相應自身抗體，則構成了一個既可用于篩選腫瘤特異性或相關性抗原，又可作為腫瘤診斷標志物的抗體譜。用SEREX方法可在多種腫瘤患者血液中檢測到與腫瘤細胞胞內(nèi)成分反應的自身抗體，獲得了大量的由胞內(nèi)抗原誘導產(chǎn)生的自身抗體，這也是以往方法所無法做到的。 SSH(Suppression Subtractive Hybridization,抑制性消減雜交技術)是抑制性PCR與消減雜交技術相結合的更簡單、更快速分離差異表達基因的方法，它不僅提高了特異性，降低了假陽性率，而且靈敏性高，保證了低豐度片段的檢測成功。免疫學檢測最常用的技術有免疫斑點、免疫印跡、ELISA等，其中，ELISA方法最受重視，它簡單、快速、敏感且易于自動化，適于大規(guī)模篩選樣本。然而，ELISA每次一般只能對一種抗原/抗體進行分析，如果要對多種抗原抗體同時進行分析，其工作量就要大幅度增加，操控難度也相應增加。液相芯片(Suspension Array, Liquid Chip,也稱微球體懸浮芯片)是基于 xMAP (flexible Multi-Analyte Profiling)技術的新型生物芯片技術平臺，它是在不同突光編碼的微球上進行抗原/抗體、酶/底物、配體/受體的結合反應及核酸雜交反應，通過紅、綠兩束激光分別檢測微球編碼和報告熒光來達到定性和定量的目的，一個反應孔內(nèi)可以完成多達100種不同的生物學反應，是繼基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子檢測技術平臺。該技術將流式檢測與芯片技術有機地結合在一起，在保持高通量檢測的同時，將反應體系由液相-固相反應改變?yōu)榻咏锵到y(tǒng)內(nèi)部環(huán)境的完全液相反應體系，對于確保建立在正確的高級結構之上的真實的蛋白質(zhì)相互作用尤為關鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種卵巢癌相關抗原自身抗體譜液相芯片檢測試劑盒及其制備方法，以克服現(xiàn)有血清學檢測方法上的不足，實現(xiàn)準確快速檢測卵巢癌相關抗原自身抗體。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案卵巢癌相關抗原自身抗體譜液相芯片檢測試劑盒，主要包括分別包被6種基因工程卵巢癌相關抗原和人免疫球蛋白IgG、 IgM的八種熒光微球；6種基因工程卵巢癌相關抗原為TM4SF1、C1D、TIZ、OV-142, FXRU OV-189,它們分別具有序列表中SEQ. ID. No. I至SEQ. ID. No. 6的氨基酸序列。突光微球為稱聯(lián)輕基微球。上述卵巢癌相關抗原自身抗體譜液相芯片檢測試劑盒的制備方法取八種聚苯乙烯熒光微球分別包被具有序列表中SEQ. ID. No. I至SEQ. ID. No. 6的氨基酸序列的6種基因工程卵巢癌相關抗原TM4SF1、C1D、TIZ、0V-142、FXR1、0V-189和人免疫球蛋白IgG、IgM。該方法包括以下步驟取八種聚苯乙烯熒光微球，6種基因工程卵巢癌相關抗原和人免疫球蛋白IgG、IgM各對應一種聚苯乙烯熒光微球；每種聚苯乙烯熒光微球各取 2. 5 X IO6個，經(jīng)超聲霧化和旋渦振蕩充分重懸后，以O. lmol/L pH 6. 2的NaH2PO4溶液作為活化緩沖液，洗漆2次后置于I. 5ml Eppendorf管中，管中反應體系包括80 μ I NaH2PO4活化緩沖液、新鮮配制的濃度均為50g/L的表面活化劑Sulfo-NHS和EDC各10 μ 1，室溫下孵育20分鐘進行微球表面的碳氧化學修飾以利于耦聯(lián)；漂洗后的活化微球加入500μ I含 125118相應抗原蛋白的0.0511101/1 pH 5. OMES耦聯(lián)緩沖液，振蕩孵育后繼而以200 μ I封閉 /保存緩沖液PBS-TBN封閉微球表面的未結合位點，即得包被微球溶液。分別取八種上述包被微球溶液，以分析緩沖溶液按I : 5稀釋后，在血球記數(shù)儀下計算微球濃度并調(diào)整其終濃度至lX106/ml，4°C避光保存?zhèn)溆茫环治鼍彌_溶液為含濃度
O.1% BSA,O. 01mol/L 疊氮鈉的 O. 01mol/L pH 7. 4 的 PBS。封閉/ 保存緩沖液 PBS-TBN 是含濃度 O. 1% BSA,O. 02% Tween-20,0. 05% NaN3pH
7.4 的 PBS。發(fā)明人將改良的SEREX技術與SSH技術相結合從卵巢惡性腫瘤腹水腫瘤細胞中篩選出了 6個卵巢癌相關抗原(TM4SF1、C1D、TIZ、0V-142、FXR1、0V-189)，免疫斑點檢測顯示這6個卵巢癌相關抗原的IgG、IgM型自身抗體組成的自身抗體譜可用于卵巢癌的早期診斷。研究中發(fā)現(xiàn)單個卵巢癌相關抗原的自身抗體在檢測中有局限性，而聯(lián)合多處自身抗體組成自身抗體譜進行分析時就能彌補此缺陷。然而，常規(guī)免疫檢測手段無法實現(xiàn)同時分析多種抗原抗體。此前，國內(nèi)外亦尚無能高效用于卵巢癌早期診斷的液相芯片試劑盒商品。由此，發(fā)明人采用液相芯片技術，將上述6種基因工程抗原和人免疫球蛋白IgG、IgM包被不同的熒光微球，建立了卵巢癌相關抗原自身抗體譜液相芯片檢測試劑盒，應用其進行血清學檢測，可同時檢測血清中這六種抗原的IgG、IgM型自身抗體的含量，解決了高效快速地檢測多種卵巢癌相關抗原自身抗體的問題。該試劑盒適用于人群中卵巢癌高發(fā)性評估診斷以及預后效果評價觀察，可以直接用于早期診斷卵巢癌、判斷患者預后狀況等方面，具有快速性、客觀性和準確性等優(yōu)點。本發(fā)明其與現(xiàn)有技術相比具有如下有益效果〈1>通量大可以同時檢測同一樣本中的6個抗原的自身抗體；<2>所需樣品量少只需要I μ I血清樣品即可完成多種抗原自身抗體的檢測；<3>簡單快捷應用本發(fā)明檢測不到2小時即可完成；<4>操作容易適合一般分子生物學檢驗人員使用，無需豐富的專業(yè)知識，實驗結果由相應的分析儀自動讀取，排除了主觀性；<5>無毒無害不涉及有毒、有害的試劑。
具體實施例方式卵巢癌相關抗原自身抗體譜液相芯片檢測試劑盒及其制備方法研究一、實驗材料研究所使用的六種基因工程抗原，均由發(fā)明者自行在大腸桿菌中表達、純化獲得。人免疫球蛋白IgG、IgM購自北京賽馳生物科技有限公司。八種聚苯乙烯熒光微球為耦聯(lián)羥基微球，均購自美國Luminex公司(編號為101、 102、103、104、105、106、107、108)，每種各自帶有其獨特的熒光光譜。微球表面活化劑Sulfo-NHS、EDC購自Pierec公司。藻紅蛋白藕聯(lián)的羊抗人IgG Fe和羊抗人IgM μ鏈購自Santa-Cruz公司。二、試劑盒的制備制備突光微球液相芯片取八種聚苯乙烯熒光微球分別包被具有序列表中SEQ. ID. No. I至SEQ. ID. No. 6的氨基酸序列的6種基因工程卵巢癌相關抗原TM4SF1、C1D、TIZ、OV-142, FXRl、OV-189和人免疫球蛋白IgG、IgM。具體步驟如下取八種聚苯乙烯熒光微球(編號為101、102、103、104、105、106、107、108)，6種
基因工程卵巢癌相關抗原和人免疫球蛋白IgG、IgM各對應一種聚苯乙烯熒光微球；每種聚苯乙烯熒光微球各取2. 5X IO6個，經(jīng)超聲霧化和旋渦振蕩充分重懸后，以活化緩沖液 (O. lmol/L NaH2PO4溶液pH 6. 2)洗漆2次后置于1.5ml Eppendorf管中，管中反應體系包括80 μ I NaH2PO4活化緩沖液、表面活化劑Sulfo-NHS和EDC(均為50g/L,新鮮配制)各 10 μ 1，室溫下孵育20分鐘進行微球表面的碳氧化學修飾以利于耦聯(lián)；漂洗后的活化微球加入50(^1耦聯(lián)緩沖液(0.0511101/1 MES pH 5. 0，其中含125 μ g相應抗原蛋白)，振蕩孵育后繼而以200 μ I封閉/保存緩沖液PBS-TBN(PBS中含濃度O. 1%BSA,0. 02% Tween-20,
O.05% NaN3 pH 7.4)封閉微球表面的未結合位點，即得包被微球溶液。分別取八種上述包被微球溶液，以分析緩沖溶液(O. 1% BSA,O. 01mol/L疊氮鈉，O. 01mol/L PBS, pH 7. 4)按 I 5稀釋后，在血球記數(shù)儀下計算微球濃度并調(diào)整其終濃度至lX106/ml，4°C避光保存?zhèn)溆?。將制備好的八種包被微球溶液各自包裝，然后組裝成檢測試劑盒，備用。三、試劑盒的應用應用本試劑盒檢測血清中抗原自身抗體步驟如下6種卵巢癌相關抗原血清中自身抗體含量的檢測所有反應均在I. 5ml Eppendorf管中完成，總反應體系為100 μ 1，加入各卵巢癌相關抗原蛋白包被的微球(5000 個/種)，加入稀釋的檢測血清，孵育30分鐘并經(jīng)PBS-I % BSA漂洗2次后，加入人IgG、IgM 蛋白包被的微球(5000個/種)，加入藻紅蛋白藕聯(lián)的羊抗人IgG Fe和羊抗人IgM μ 鏈，孵育30分鐘并經(jīng)PBS-I % BSA漂洗2次后，以LuminexlOO系統(tǒng)檢測讀取數(shù)據(jù)。每個樣本測兩次，取平均值。參照品的構建所有反應均在I. 5ml Eppendorf管中完成，總反應體系為100 μ 1， 其中以合適稀釋濃度梯度的人IgG、IgM蛋白包被的微球混合液(5000個/種)，加入藻紅蛋白藕聯(lián)的羊抗人IgG Fe和羊抗人IgM μ鏈，孵育30分鐘并經(jīng)PBS-I % BSA漂洗2次后，以LuminexlOO系統(tǒng)檢測。LuminexlOO包括一束分類激光(635nm)以判定微球的熒光色譜決定被測物的性質(zhì)和一束報告激光(532nm)分別計數(shù)50個微球獲得其MFI以定量。繪制參照品曲線，得出曲線方程。將自身抗體含量檢測中得到的數(shù)據(jù)代入曲線方程可得出相應抗原自身抗體的相對含量。將檢測所得的自身抗體的相對含量繪制ROC曲線進行分析，ROC曲線下面積在
0.5-0. 7間說明診斷效果較差，0. 7-0. 9間診斷效果中等，大于0. 9則診斷效果較好，本研究選取ROC曲線下面積在0. 7以上、靈敏度和特異度均可以達到70%的作為檢測指標，進而對其靈敏度和特異度進行評價，找出最佳交叉點作為其臨界值(見表I)。表I各抗原蛋白相應自身抗體IgG、IgM cut off值及在還同血清中的陽性率
權利要求
1.一種卵巢癌相關抗原自身抗體譜液相芯片檢測試劑盒，其特征在于主要包括分別包被6種基因工程卵巢癌相關抗原和人免疫球蛋白IgG、IgM的八種熒光微球；所述6種基因工程卵巢癌相關抗原為TM4SF1、C1D、TIZ、OV-142, FXRU 0V-189，它們分別具有序列表中 SEQ. ID. No. I 至 SEQ. ID. No. 6 的氨基酸序列。
2.根據(jù)權利要求I所述的卵巢癌相關抗原自身抗體譜液相芯片檢測試劑盒，其特征在于所述突光微球為稱聯(lián)輕基微球。
3.根據(jù)權利要求I所述卵巢癌相關抗原自身抗體譜液相芯片檢測試劑盒的制備方法，其特征在于取八種聚苯乙烯熒光微球分別包被具有序列表中SEQ. ID. No. I至SEQ. ID. No. 6的氨基酸序列的6種基因工程卵巢癌相關抗原TM4SF1、C1D、TIZ、OV-142, FXRU 0V-189和人免疫球蛋白IgG、IgM。
4.根據(jù)權利要求3所述卵巢癌相關抗原自身抗體譜液相芯片檢測試劑盒的制備方法， 其特征在于該方法包括以下步驟取八種聚苯乙烯熒光微球，6種基因工程卵巢癌相關抗原和人免疫球蛋白IgG、IgM各對應一種聚苯乙烯熒光微球；每種聚苯乙烯熒光微球各取2.5 X IO6個，經(jīng)超聲霧化和旋渦振蕩充分重懸后，以0. lmol/L pH 6. 2的NaH2PO4溶液作為活化緩沖液，洗漆2次后置于I. 5ml Eppendorf管中，管中反應體系包括80 y INaH2PO4活化緩沖液、新鮮配制的濃度均為50g/L的表面活化劑Sulfo-NHS和EDC各10 y 1，室溫下孵育20分鐘進行微球表面的碳氧化學修飾以利于耦聯(lián)；漂洗后的活化微球加入500 Ul含 125iig相應抗原蛋白的0.05mol/L pH 5. OMES耦聯(lián)緩沖液，振蕩孵育后繼而以200 封閉 /保存緩沖液PBS-TBN封閉微球表面的未結合位點，即得包被微球溶液。
5.根據(jù)權利要求4所述卵巢癌相關抗原自身抗體譜液相芯片檢測試劑盒的制備方法， 其特征在于分別取八種所述包被微球溶液，以分析緩沖溶液按I : 5稀釋后，在血球記數(shù)儀下計算微球濃度并調(diào)整其終濃度至lX106/ml，4°C避光保存?zhèn)溆茫凰龇治鼍彌_溶液為含濃度 0. 1% BSA,0. 01mol/L 疊氮鈉的 0. 01mol/L pH 7. 4 的 PBS。
6.根據(jù)權利要求5所述卵巢癌相關抗原自身抗體譜液相芯片檢測試劑盒的制備方法， 其特征在于所述封閉/保存緩沖液PBS-TBN是含濃度0. 1%BSA,0. 02% Tween-20,0. 05% NaN3 pH 7. 4 的 PBS。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種卵巢癌相關抗原自身抗體譜液相芯片檢測試劑盒及其制備方法，該試劑盒主要包括分別包被6種基因工程卵巢癌相關抗原和人免疫球蛋白IgG、IgM的八種熒光微球；6種基因工程卵巢癌相關抗原為TM4SF1、C1D、TIZ、OV-142、FXR1、OV-189，它們分別具有序列表中SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的氨基酸序列。本發(fā)明采用液相芯片技術，實現(xiàn)了同時檢測血清中這六種抗原的IgG、IgM型自身抗體的含量，解決了高效快速地檢測多種卵巢癌相關抗原自身抗體的問題。該試劑盒適用于人群中卵巢癌高發(fā)性評估診斷以及預后效果評價觀察，可以直接用于早期診斷卵巢癌、判斷患者預后狀況等方面。
文檔編號G01N33/574GK102590531SQ20121007997
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月24日 優(yōu)先權日2012年3月24日
發(fā)明者李力, 陽志軍 申請人:廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所