專利名稱：一種制備螺旋藻雙向電泳分析蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于螺旋藻開發(fā)應(yīng)用的技術(shù)，特別涉及一種制備螺旋藻雙向電泳分析蛋白的方法。
背景技術(shù)：
螺旋藻(Spirulina)，是一種光合放氧、呈規(guī)則螺旋形的原核絲狀微藻，系藍藻門(Cyanophyta)、顫藻目(Oscillatoriales)、顫藻科(Oscillatoriaceae)的一個屬[武漢植物學(xué)研究，1997，15 (4) :369-374]，因其富含優(yōu)質(zhì)蛋白和多種生物活性物質(zhì)而受到國內(nèi)外的極大關(guān)注，目前已在大量研究的基礎(chǔ)上形成了龐大的螺旋藻產(chǎn)業(yè)，并應(yīng)用于食品、生物醫(yī)藥保健、飼料、精細化工等領(lǐng)域。該屬中的鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)是國內(nèi)外在商業(yè)化養(yǎng)殖生產(chǎn)與開發(fā)中應(yīng)用最廣泛的品種[Journal of Phycology, 2005,41 (3)622-628]。以雙向電泳(2-DE)為核心技術(shù)之一的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，是當前開展螺旋藻良種選育及種質(zhì)退化和高光效機制等研究的重要前沿技術(shù)，而制得高質(zhì)量的2-DE分析蛋白是有效應(yīng)用該技術(shù)的前提[Trends in Biotechnology，1999，17 (3) : 121-127]。在高等植物或固氮菌等細菌等生物中一般均先用壓榨或超聲波等破碎細胞，進而經(jīng)超速離心或蔗糖密度梯度離心將蛋白分離成水溶性或水不溶性等組分，再用試劑盒純化制得2-DE分析蛋白[Ferns Microbiology Letters, 2008, 288 (I) :92-101]。值得注意的是，螺旋藻在分類學(xué)雖屬藍細菌，且具光合作用等與植物類似的功能，但因其蛋白質(zhì)的含量高、種類多且豐度極不均勻，參照上述其它生物制備2-DE分析蛋白的方法難以制得高質(zhì)量的螺旋藻2-DE分析蛋白[高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2009，30 (6) :1152-1157]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種簡便、高效、低成本的制備螺旋藻雙向電泳分析蛋白的方法——凍融破壁分步提純法。為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是提供一種制備螺旋藻雙向電泳分析蛋白的方法，是將螺旋藻細胞在_20°C冷凍
I.5h后再在4°C融化lh，如此反復(fù)凍融5次完全破碎；用Tris-HCl提取液提取3次得到水溶性蛋白，用SDS(十二烷基磺酸鈉)提取液從沉淀中提得水不溶性蛋白；所述Tris-HCl 提取液的組成125mM Tris-HCI,0. 9% NaCl，pH 6. 8 ;所述 SDS 提取液的組成64mM Tris-HCl提取液、10%甘油、2% SDS,5% P -巰基乙醇，pH 6.8 ;各百分比為質(zhì)量百分比關(guān)系。該方法具體包括下述步驟取0. 75g鈍頂螺旋藻藻泥于5ml離心管中，并加入Tris-HCl提取液3ml，在_20°C冷凍I. 5h后再在4°C融化lh，如此反復(fù)凍融5次至出現(xiàn)深藍紫色熒光，并在顯微鏡下鏡檢無完整細胞；4°C下12000r/min離心20min得上清液1_1 ;沉淀加入3ml Tris-HCl提取液輕輕搖勻后置于4°C 15min，4°C下12000r/min離心20min得上清液1_2 ;如此再抽提I次得上清液1-3 ;合并上清液I-I 3即為螺旋藻水溶性蛋白；在上清液1-3的沉淀中加入3mlSDS提取液并輕輕搖勻，4°C放置6h,每30min搖勻一次，4°C下12000r/min離心20min得上清液II，即為螺旋藻水不溶性蛋白；在上述所提的水溶性蛋白和水不溶性蛋白中分別加入3倍體積預(yù)冷的含10% TCA (三氯乙酸)和0.07% DTT (二硫蘇糖醇)的丙酮溶液，混勻后-20°C靜置4h，4°C下12000r/min離心20min，棄上清液；沉淀中加入3ml含0. 07% DTT的預(yù)冷丙酮溶液，洗滌后-20°C靜置2h，4°C下12000r/min離心20min，棄上清液，如此反復(fù)抽提3次至上清液完全無色；沉淀經(jīng)真空冷凍干燥，即制得用于螺旋藻雙向電泳分析的水溶性蛋白和水不溶性蛋白。本發(fā)明的顯著優(yōu)點本發(fā)明所建的螺旋藻2-DE分析蛋白制備方法一凍融破壁分步提純法，與現(xiàn)有螺旋藻2-DE分析蛋白制備方法相比，具有操作簡便、儀器設(shè)備簡單、成本低廉和信息量更豐富等顯著優(yōu)點，它可顯著提升螺旋藻蛋白質(zhì)2-DE圖譜的信息量和分辨率，從而為后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)等生物信息學(xué)研究奠定了必要基礎(chǔ)。


圖I為鈍頂螺旋藻ZJU0101的水溶性蛋白雙向電泳圖譜。圖2為鈍頂螺旋藻ZJU0101的水不溶性蛋白雙向電泳圖譜。圖3為鈍頂螺旋藻ZJU0104的水溶性蛋白雙向電泳圖譜。圖4為頂螺旋藻ZJU0104的水不溶性蛋白雙向電泳圖譜。
具體實施例方式本發(fā)明針對螺旋藻的細胞壁主要由多糖和黏多肽組成、僅含極少量纖維素、只要凍融數(shù)次即可使其破裂等顯著不同于高等植物等其它生物的特點，通過研究建立了基于凍融破壁和蛋白質(zhì)分步提純的螺旋藻2-DE分析蛋白的制備方法，即凍融破壁分步提純法。我們以鈍頂螺旋藻品系ZJU0101為材料，反復(fù)凍融5次使藻細胞完全破碎后，先用Tris-HCl提取液提取3次得到水溶性蛋白，再用SDS提取液從沉淀中提得水不溶性蛋白。將上述水溶性和水不溶性蛋白分別用TCA/丙酮法純化后作雙向電泳(2-DE)分析，電泳圖上可辨蛋白點分別達512和765個，而兩者間匹配率僅為7%，說明利用此法能制得適于2-DE分析的高質(zhì)量的螺旋藻水溶性蛋白和水不溶性蛋白。本發(fā)明用于示例的詳細技術(shù)方案可以通過以下步驟實施I、選用材料為公知的鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)品系ZJU0101,浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生物資源與分子工程實驗室也有保存。2、試劑和儀器等電聚焦膠條(24cm，pH4_7)、礦物油、IPG buffer (pH4-7)和蛋白質(zhì)分子量標準等購自GE Healthcare Biosciences (美國)；二硫蘇糖醇(DTT)和碘乙酰胺等購自Bio-Rad(美國)；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、尿素、硫脲、丙磺酸(CHAPS)、低熔點瓊脂糖、Tris、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)等購自Amresco (美國)。所用的等電聚焦儀、垂直電泳系統(tǒng)和紫外-可見掃描分光光度計等為Amersham Pharmcia Biotech (美國)產(chǎn)品；冷凍干燥儀為VirTis (美國)產(chǎn)品；掃描儀GS-800和TOQuest軟件等為Bio-Rad(美國)產(chǎn)品。3、水溶性蛋白和水不溶性蛋白的制備取0. 75g鈍頂螺旋藻藻泥于5ml離心管中，并加入Tris-HCl提取液(125mMTris-HCI, 0. 9% NaCl，pH 6. 8) 3ml，在 _20°C冷凍 I. 5h 后再在 4°C融化 lh，如此反復(fù)凍融 5次至出現(xiàn)深藍紫色熒光，并在顯微鏡下鏡檢無完整細胞。4°C下12000r/min離心20min得上清液I-I ;沉淀加入3ml Tris-HCl提取液輕輕搖勻后置于4°C 15min，4°C下12000r/min離心20min得上清液1-2 ;如此再抽提I次得上清液1_3 ;合并上清液1_1 3即為螺旋藻水溶性蛋白。在上清液1-3的沉淀中加入3ml SDS提取液(64mM Tris_HCl、10%甘油、2%SDS,5% ￠-巰基乙醇，pH 6.8)并輕輕搖勻，4°C放置6h，每30min搖勻一次，4°C下12000r/min離心20min得上清液II，即為螺旋藻水不溶性蛋白。在上述所提的水溶性蛋白和水不溶性蛋白中分別加入3倍體積預(yù)冷的含10% TCA和0. 07% DTT的丙酮溶液，混勻后_20°C靜置4h，4°C下12000r/min離心20min，棄上清液。沉淀中加入3ml含0. 07% DTT的預(yù)冷丙酮溶液，洗滌后_20°C靜置2h，4°C下12000r/min離心20min，棄上清液，如此反復(fù)抽提3次至上清液完全無色，沉淀經(jīng)真空冷凍干燥，即制得用于螺旋藻2-DE分析的水溶性蛋白和水不溶性蛋白。4、2_DE和軟件分析將經(jīng)真空冷凍干燥的蛋白樣品用適量裂解液(7M尿素、2M硫脲、4% CHAPS,2% IPGbuffer,40mM DTTUmM PMSF)充分溶解，4°C下12000r/min離心20min得上清液，參照考馬 斯亮藍 G-250 法定量[Analytical Biochemistry, 1976,72 :248-254]后進行 2-DE 分析。采用24cm pH4-7 IPG膠條，上樣的總體積450 yl、總蛋白量800 y g。等電聚焦程序為50V主動水化12h，500V線性除鹽lh，1000V線性除鹽3h，8000V線性升壓4h，8000V快速聚焦110000V-hr，500V保持。聚焦后的膠條經(jīng)兩次平衡后轉(zhuǎn)至濃度為12. 5%的膠上作第二向電泳，先以2W/gel電泳45min后，再以17W/gel電泳使溴酚藍至膠底部。用考馬斯亮藍G-250染色，脫色并掃描后，圖像用TOQuest軟件分析。5、結(jié)果與分析圖1、2為鈍頂螺旋藻ZJU0101水溶性蛋白和水不溶性蛋白的2-DE圖譜。由圖I、2可知，ZJUO101水溶性蛋白和水不溶性蛋白圖譜的可辨蛋白點分別達512和765個，且兩者明顯不同，匹配率僅為I0A。說明利用本法能制得適于2-DE分析的較高質(zhì)量的鈍頂螺旋藻水溶性蛋白和水不溶性蛋白。蛋白質(zhì)樣品制備是獲得高分辨率和高信息量2-DE凝膠圖譜，取得高水平蛋白質(zhì)組學(xué)研究成果的必要前提與關(guān)鍵步驟[Electrophoresis, 2007, 28 (6) :1022-1024]。Hongsthong 等[Molecular Biotechnology, 2007, 36 (2) 123-130]用壓榨法破碎純頂螺旋藻細胞，并用密度梯度離心制得水溶性和水不溶性等蛋白組分，再經(jīng)試劑盒純化后作2-DE分析，所得水溶性和水不溶性蛋白圖譜的相似性較高，可辨蛋白點各約400個，匹配率約50%;林重陽等[高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2009，3(K6) :1152-1157]用超聲波破碎鈍頂螺旋藻細胞，并用Triton提取液抽提全蛋白，經(jīng)TCA/丙酮法純化后作2-DE分析，因受藻膽蛋白等高豐度蛋白影響較大，上樣量等受限，可辨蛋白點僅約200個。本發(fā)明用反復(fù)凍融法破碎鈍頂螺旋藻細胞后，先用Tris-HCl提取液提得水溶性蛋白，再用SDS提取液從沉淀中提得水不溶性蛋白，兩者再用TCA/丙酮法純化后，2-DE圖譜的可辨蛋白點分別達510多和760多個，且匹配率僅7%。這表明，(I)反復(fù)凍融不僅能有效破碎螺旋藻的細胞壁，而且所需的儀器設(shè)備與操作均比壓榨法和超聲波法簡便，且作用力較溫和而對蛋白質(zhì)的損傷更??；(2)Tris-HCl和SDS提取液分步提取，不僅能將破壁螺旋藻中的水溶性蛋白和水不溶性蛋白較徹底地分離，而且不存在如密度梯度離心分離過程中難免丟棄某些蛋白組分等問題，從而既可有效減小高豐度的藻膽蛋白等對周邊低豐蛋白的掩蓋，又能使蛋白組分盡可能不丟失[海洋與湖沼，2010，41(3) =348-351] ; (3) TCA/丙酮法不僅能有效去除螺旋藻蛋白提取液中的色素和糖類等對2-DE有影響的 雜質(zhì)，而且可對蛋白樣品進行濃縮，以便于后續(xù)研究，因而在效果、操作和成本上均優(yōu)于試劑盒純化法[Proteomics，2005，5(10) :2497-250] ； (4)用SDS提取液提取螺旋藻蛋白，不僅提取效率顯著比Triton提取液的高，而且對蛋白質(zhì)樣品2-DE等電聚焦基本無影響。由此可見，本發(fā)明所建的制備螺旋藻2-DE分析蛋白的方法一凍融破壁分步提純法，與已有方法相比，具有操作簡便、儀器設(shè)備簡單、成本低廉、圖譜分辨率高和信息量更豐富等優(yōu)點。作為另一個實例，我們選取了鈍頂螺旋藻品系ZJU0104來驗證本發(fā)明的實用性。利用上述方法獲得了 ZJU0104的水溶性蛋白和水不溶性蛋白的2-DE圖譜(圖3、4)，兩者的可辨蛋白點分別達546和811個，且匹配率僅為11%，進一步說明本發(fā)明建立的“凍融破壁分步提純法”是一種制備螺旋藻2-DE分析蛋白有效而簡便的方法。
權(quán)利要求
1.一種制備螺旋藻雙向電泳分析蛋白的方法，其特征在于，是將螺旋藻細胞在-20°C冷凍I. 5h后再在4°C融化lh，如此反復(fù)凍融5次完全破碎；用Tris-HCl提取液提取3次得到水溶性蛋白，用SDS提取液從沉淀中提得水不溶性蛋白； 所述 Tris-HCl 提取液的組成125mM Tris-HCI,0. 9% NaCl，pH 6. 8 ;所述 SDS 提取液的組成64mM Tris-HCl提取液、10%甘油、2% SDS、5% P -巰基乙醇，pH 6. 8;各百分比為質(zhì)量百分比關(guān)系。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，具體包括下述步驟 取0. 75g鈍頂螺旋藻藻泥于5ml離心管中，并加入Tris-HCl提取液3ml，在_20°C冷凍.I. 5h后再在4°C融化lh，如此反復(fù)凍融5次至出現(xiàn)深藍紫色熒光，并在顯微鏡下鏡檢無完整細胞； .4°C下12000r/min離心20min得上清液1-1 ;沉淀加入3ml Tris-HCl提取液輕輕搖勻后置于4°C 15min，4°C下12000r/min離心20min得上清液1_2 ;如此再抽提I次得上清液 .1-3 ;合并上清液I-I 3即為螺旋藻水溶性蛋白； 在上清液1-3的沉淀中加入3ml SDS提取液并輕輕搖勻，4°C放置6h，每30min搖勻一次，4°C下12000r/min離心20min得上清液II,即為螺旋藻水不溶性蛋白； 在上述所提的水溶性蛋白和水不溶性蛋白中分別加入3倍體積預(yù)冷的含10% TCA和.0.07% DTT的丙酮溶液，混勻后_20°C靜置4h，4°C下12000r/min離心20min，棄上清液；沉淀中加入3ml含0. 07% DTT的預(yù)冷丙酮溶液，洗滌后_20°C靜置2h，4°C下12000r/min離心.20min，棄上清液，如此反復(fù)抽提3次至上清液完全無色；沉淀經(jīng)真空冷凍干燥，即制得用于螺旋藻雙向電泳分析的水溶性蛋白和水不溶性蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及螺旋藻開發(fā)應(yīng)用技術(shù)，旨在提供一種制備螺旋藻雙向電泳分析蛋白的方法。該方法是將螺旋藻細胞在-20℃冷凍1.5h后再在4℃融化1h，如此反復(fù)凍融5次完全破碎；用Tris-HCl提取液提取3次得到水溶性蛋白，用SDS提取液從沉淀中提得水不溶性蛋白。本發(fā)明所建的螺旋藻2-DE分析蛋白制備方法——凍融破壁分步提純法，與現(xiàn)有螺旋藻2-DE分析蛋白制備方法相比，具有操作簡便、儀器設(shè)備簡單、成本低廉和信息量更豐富等顯著優(yōu)點，可顯著提升螺旋藻蛋白質(zhì)2-DE圖譜的信息量和分辨率，從而為后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)等生物信息學(xué)研究奠定了必要基礎(chǔ)。
文檔編號G01N1/28GK102645357SQ201210084120
公開日2012年8月22日 申請日期2012年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月27日
發(fā)明者于金鑫, 劉新穎, 汪志平, 王景梅, 藍瑾瑾, 邵斌, 陳子元 申請人:浙江大學(xué)