專(zhuān)利名稱(chēng)：含組氨酸標(biāo)簽重組人內(nèi)皮抑素質(zhì)譜絕對(duì)定量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用質(zhì)譜技術(shù)來(lái)絕對(duì)定量組氨酸標(biāo)簽重組人內(nèi)皮抑素的方法
背景技術(shù)：
內(nèi)皮抑素具有廣泛的抗腫瘤血管生成作用，其作用機(jī)制是通過(guò)抑制形成血管的內(nèi)皮細(xì)胞遷移而抑制腫瘤新生血管的生成，阻斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供給，從而抑制腫瘤增殖或轉(zhuǎn)移。 2005年SFDA批準(zhǔn)了重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液(恩度),作為首個(gè)血管內(nèi)皮抑制素肺癌新藥，該重組人內(nèi)皮抑素含有組氨酸標(biāo)簽。作為上市的藥物，重組人內(nèi)皮抑素的生物樣品定量方法對(duì)于評(píng)價(jià)藥物在體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)行為具有重要的意義。現(xiàn)有的重組人內(nèi)皮抑素的定量方法主要有放射性同位素標(biāo)記(Current Drug Metabolism, 2006, 7, 565-576)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(J. Clin. Oncol. 21 (2003) 223-231)，尚無(wú)質(zhì)譜定量方法。放射性同位素標(biāo)記方法對(duì)操作人員和環(huán)境有特殊要求，相對(duì)于酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法質(zhì)譜定量技術(shù)具有更好的選擇性和精密度。因此建立一種基于質(zhì)譜的組氨酸標(biāo)簽重組人內(nèi)皮抑素的定量方法是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，建立一種含組氨酸標(biāo)簽重組人內(nèi)皮抑素的生物樣品提取方法并建立其質(zhì)譜定量方法。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是，首先利用含金屬Ni2+瓊脂糖凝膠樹(shù)脂提取血漿中的含組氨酸標(biāo)簽重組人內(nèi)皮抑素，經(jīng)洗脫后用胰蛋白酶水解，選取胰蛋白酶水解的重組人內(nèi)皮抑素的特異性肽段，選擇的特異性肽段是該的蛋白胰酶水解后獨(dú)有的?；诟咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)，利用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式對(duì)特異性肽段進(jìn)行分析，建立可靠，穩(wěn)定的LC-MS/MS定量方法。合成一段與特異性肽段相似的合成肽段作為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行定量分析建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而實(shí)現(xiàn)特異性肽段的定量。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下所述。一種含組氨酸標(biāo)簽重組人內(nèi)皮抑素質(zhì)譜定量方法，包括生物樣品的提取方法和質(zhì)譜定量方法，具體步驟如下A、生物樣品制備方法(I)樣品提取柱的制備200 U L含金屬Ni2+瓊脂糖凝膠(Ni2+S^harose)加入離心柱，冷凍離心機(jī)離心去除液體(500g，lmin)。加入平衡液放置于渦旋混合器(900rpm， 5min),離心沖洗兩次。預(yù)備上樣。(2)生物樣品的提取含重組蛋白血漿200 ii L加入樣品提取離心柱，4°C放置于潤(rùn)旋混合器(900rpm, 20min)使蛋白與樹(shù)脂充分結(jié)合，離心(500g, Imin)去除液體,加入 400 u L平衡液置于渦旋混合器(900rpm, 5min)洗兩次,再加入400 U L雜質(zhì)洗脫液置于渦旋混合器(900rpm, 5min)洗脫雜質(zhì),最后加入400 ii L蛋白洗脫液置于潤(rùn)旋混合器(900rpm, 5min)洗脫目的蛋白。
(3)蛋白樣品的胰蛋白酶消化將提取后的蛋白洗脫液用離心超濾方法置換為 100 u L的消化緩沖液，再加入2 u L胰蛋白酶溶液，渦旋混合，37°C孵育12小時(shí)得酶解樣品， 加入2 ii L酶解反應(yīng)終止液和2 ii L內(nèi)標(biāo)溶液后用于質(zhì)譜定量。B、LC-MS/MS 檢測(cè)方法(1)色譜條件為Shimadzu LC(SLC_20A)型液相色譜系統(tǒng)；色譜柱 Agilent300SB-C8column(3. 5 u m, 1 SOmmX2. 1mm);流動(dòng)相含 0. I 甲酸的水，乙臆，梯度洗脫；柱溫400C，流速0. 2mL/min ;進(jìn)樣量10 u L。(2)質(zhì)譜條件為API 4000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子化源和Analyst I. 3據(jù)處理軟件；離子源電噴霧離子化源；正離子方式檢測(cè)；電噴霧電壓為 5500V ;溫度550°C ;源內(nèi)氣體I :氮?dú)鈮毫?0PSI ;氣體2 :氮?dú)鈮毫?0PSI ;氣簾氣氮?dú)鈮毫?5PSI ;掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)；特異性肽段和內(nèi)標(biāo)的序列和檢測(cè)m/z以及其相應(yīng)的 DP和CE值見(jiàn)表I ；表I肽段MRM監(jiān)測(cè)值
權(quán)利要求
1.一種含組氨酸標(biāo)簽重組人內(nèi)皮抑素的生物樣品提取方法并建立其質(zhì)譜定量方法，具體步驟如下A、生物樣品制備方法將含金屬Ni2+瓊脂糖凝膠加入離心柱，冷凍離心機(jī)離心去除液體；加入平衡液離心沖洗兩次；含重組蛋白血漿加入，4°C渦旋混勻20min，加入平衡液洗兩次，加入雜質(zhì)洗脫液， 最后加入蛋白洗脫液洗脫目的蛋白；將提取后的蛋白洗脫液用離心超濾方法置換為消化緩沖液，再加入2 u L胰蛋白酶溶液，渦旋混合，37°C孵育12小時(shí)得酶解樣品，加入2 ii L酶解反應(yīng)終止液和2 ii L內(nèi)標(biāo)溶液后用于質(zhì)譜定量；B、LC-MS/MS檢測(cè)方法色譜條件為島津SLC-20A型液相色譜系統(tǒng)；色譜柱安捷倫300SB-C8柱，3. 5iim， 150mmX2. Imm ;流動(dòng)相A :含體積百分比0. I %甲酸的水，B :乙腈，梯度洗脫；柱溫40°C，流速0. 2mL/min ;進(jìn)樣量10 y L ;質(zhì)譜條件為API 4000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子化源和Analyst I. 3數(shù)據(jù)處理軟件；離子源電噴霧離子化源；正離子方式檢測(cè)；電噴霧電壓為5500V ;溫度550°C;源內(nèi)氣體I :氮?dú)鈮毫?0PSI ;氣體2 :氮?dú)鈮毫?0PSI ;氣簾氣氮?dú)鈮毫?5PSI ；DP 90V ；CE :40V ;掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)；特異性肽段多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)設(shè)定值，Ql =802. 3，Q3 651. 8 ;內(nèi)標(biāo)肽段多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)設(shè)定值，Ql :816. 9，Q3 :666. 4。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的含組氨酸標(biāo)簽重組人內(nèi)皮抑素質(zhì)譜絕對(duì)定量方法，其特征在于所述的平衡液是含有20mM咪唑，500mM氯化鈉的0. IM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液， pH 7.6 ;雜質(zhì)洗脫液是含有80mM咪唑，500mM氯化鈉的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH7.6 ;蛋白洗脫液是含有500mM咪唑，500mM氯化鈉的0. IM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液， PH 7.6 ;所述的消化緩沖液，是0. IM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH 7.6 ;所述的胰蛋白酶溶液，是IOOii g/mL的胰蛋白酶溶液；所述的酶解終止液，是20%的甲酸水溶液；所述的內(nèi)標(biāo)溶液，是I U g/mL的合成肽段內(nèi)標(biāo)水溶液。
全文摘要
本發(fā)明的含組氨酸標(biāo)簽重組人內(nèi)皮抑素質(zhì)譜絕對(duì)定量方法，屬于分析技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明基于LC-MS/MS，利用Ni2+瓊脂糖凝膠樹(shù)脂提取血漿樣品中的含組氨酸標(biāo)簽重組人內(nèi)皮抑素，并利用重組人內(nèi)皮抑素經(jīng)胰蛋白酶水解產(chǎn)生的特異性肽段定量策略，以一段與特異性肽段序列相似的合成肽段為內(nèi)標(biāo)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)血漿樣品中含組氨酸標(biāo)簽重組人內(nèi)皮抑素的絕對(duì)定量。本發(fā)明主要包括生物樣品制備方法、LC-MS/MS測(cè)定方法、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和精密度測(cè)定。本發(fā)明方法線性關(guān)系良好、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可用于重組人內(nèi)皮抑素注射液的血藥濃度測(cè)定及藥動(dòng)學(xué)研究。
文檔編號(hào)G01N30/88GK102621266SQ201210085248
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者李盈淳, 梁艷, 湯志遠(yuǎn), 王廣基, 肖亞楠, 郝海平 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)