專利名稱：一種重組巴西堅果過敏原與突變體及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及ー種重組巴西堅果過敏原與突變體及其制備方法和應用。
背景技術：
巴西堅果(Brazil nut),屬王蕊科巴西堅果屬(Family Lecythidaceae),熱帶常綠果樹，大喬木。巴西堅果果仁含硫氨基酸、脂肪、胡蘿卜素、維生素類物質含量非常豐富。近幾年來，巴西堅果的銷售量不斷上升，在歐洲和北美擁有巨大的市場份額，年銷售量超過33億美元，在中國市場也不斷増加，但是它是ー個過敏原，相比雞蛋和牛奶等其它過敏原，堅果引起的過敏反應常常是永久的。巴西堅果過敏的臨床癥狀嚴重，即便食入微量的巴西堅果過敏原食物，也可引發(fā)強烈的過敏反應，在公共衛(wèi)生和食品安全領域中備受關注。另ー 方面，由于交叉過敏的普遍性與復雜性存在，巴西堅果過敏與其他類型的過敏存在嚴重的交叉反應，也増加了其過敏發(fā)生的概率。目前，治療過敏性疾病主要方法有I)利用抗組胺藥物以及類固醇藥物可以緩解癥狀，但是不能徹底根除并且還有可能會帶來副作用。2)特異性免疫治療，被認為是過敏性疾病唯一針對病因的治療方法，已得到普遍共識。而目前進行特異性免疫治療主要是采用過敏原浸提液，如此ー來另ー個問題卻異常突出由于提取物成分復雜，而且還含有大量非特異性抗原，致使標準化困難，嚴重影響了治療效果和臨床應用規(guī)范；同吋，由于過敏原性的存在，即使是采用單純的標準化過敏原進行免疫治療也有一定的風險。采用生物化學分離和純化技術可以獲得較純過敏原，但是這種方法純化工藝復雜且產量低，要消耗大量人カ和財力，因此其廣泛應用受到了較大的限制。相比較而言，利用基因工程技術，通過定點突變的方法獲得低過敏原性或無過敏原性的重組巴西堅果過敏原的突變體，在一定程度上可從源頭上降低治療過程中的風險，同時能夠保留巴西堅果過敏原的生物學活性。另外，重組過敏原的生產條件穩(wěn)定，且標準化程序簡單，有利于廣泛應用于臨床的診斷和治療。因此，重組弱化過敏原將是ー種很好的替代方法，有廣闊的發(fā)展前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對上述存在的問題及天然巴西堅果過敏原提取液的不足，在克隆表達重組巴西堅果過敏原的基礎上，利用生物信息學軟件分析巴西堅果過敏原的抗原表位，突變ー個或多個抗原性高的位點，從而獲得低過敏原性的巴西堅果過敏原突變體，期望能夠安全高效地應用于過敏性疾病的治療。本發(fā)明的另ー個目的是提供一種編碼上述重組巴西堅果過敏原及其突變體的基因。本發(fā)明的另ー個目的是提供ー種含有上述基因的重組質粒載體。本發(fā)明的另ー個目的是提供ー種含有上述基因轉化的重組表達宿主。
本發(fā)明的另ー個目的是提供ー種上述重組巴西堅果過敏原及其突變體的制備方法。本發(fā)明的另ー個目的是提供一種重組巴西堅果過敏原用作藥物或者診斷試劑的制備方法。為實現上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案
本發(fā)明的重組巴西堅果過敏原，是天然存在的巴西堅果過敏原衍生的非天然存在的變異體，其核酸序列經密碼子優(yōu)化后，人工合成全長的重組巴西堅果過敏原基因。采用生物信息學軟件分析其抗原表位，針對ー個或多個抗原性指數高的位點進行有目的的置換，獲得重組巴西堅果過敏原突變體的基因，使其在保持原有生物學活性和空間結構的基礎上，能夠有效地降低重組巴西堅果過敏原的過敏原性。然后利用大腸桿菌表達系統(tǒng)，在人工控制的條件下，獲得高純度的重組巴西堅果過敏原及其突變體蛋白。與天然巴西堅果過敏原相比，該重組蛋白突變體與特異性IgE的結合性能明顯減少，可安全地應用于過敏性基本的 預防和治療。一種重組巴西堅果過敏原，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。上述重組巴西堅果過敏原的突變體，是在重組巴西堅果過敏原的突變體的基礎上衍生的突變體，其中B細胞或/和T細胞表位的至少ー個表面暴露的保守氨基酸殘基被在天然存在的過敏原來源的分類學目內任何已知的同源蛋白質氨基酸序列中的相同位置不出現的另一殘基取代，該突變體具有與天然出現的過敏原基本相同的α-碳骨架三級結構。本發(fā)明重組巴西堅果過敏原的突變體的制備方法,是在重組巴西堅果過敏原的突變體的基礎上衍生的突變體，其中B細胞或/和T細胞表位的至少ー個表面暴露的保守氨基酸殘基被在天然存在的過敏原來源的分類學目內任何已知的同源蛋白質氨基酸序列中的相同位置不出現的另ー殘基取代，該突變體具有與天然出現的過敏原基本相同的α-碳骨架三級結構。更進ー步地,所述表達宿主為大腸桿菌表達系統(tǒng),該表達系統(tǒng)名稱為Escherichiacoli JM109-B2SQ3，于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC M 2011152，保藏日期為2011年4月29日，保藏地點為中國.武漢.武漢大學；該表達宿主表達與純化后即獲得權利要求I所述的重組巴西堅果過敏原。最詳細的制備方法步驟如下
(O從數據庫中獲取巴西堅果過敏原的核酸序列,根據表達宿主的密碼子偏好性對其進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后序列中GC含量為35飛5%，原氨基酸序列不變；
(2)人工合成優(yōu)化后的核酸序列；
(3)經雙酶切后，與表達載體連接，構建成重組載體；
(4)將重組載體轉化表達宿主中，選擇陽性轉化物；
(5)在2(T38°C下，培養(yǎng)陽性轉化物，用濃度為O.0Γ2. OmmoI/L的IPTG誘導重組蛋白表達，誘導溫度為4 38°C ；
(6)所得培養(yǎng)物經裂解宿主細胞后，純化獲得高純度的重組蛋白。本發(fā)明所述重組巴西堅果過敏原的突變體的制備方法包括如下步驟
Ca)采用生物信息學軟件預測權利要求I所述重組巴西堅果過敏原的氨基酸序列的優(yōu)勢抗原表位；
(b)采用定點法改變抗原性高的位點，用天然存在的過敏原來源的分類學目內任何已知的同源蛋白質氨基酸序列中的相同位置不出現的氨基酸殘基取代原有的氨基酸殘基；(C)獲得巴西堅果過敏原突變體的基因片段，經酶切后，與表達載體連接，構建成突變型重組載體；
(d)按照前述步驟(4) (6)的方法，獲得高純度的重組突變蛋白。本發(fā)明所述重組巴西堅果過敏原及其突變體可以用于制備藥物，制得的藥物用于治療變態(tài)反應性疾病并使對巴西堅果過敏原乃至其它類型過敏的患者產生免疫耐受；或者用來診斷變態(tài)反應性疾病或者判斷其它食品藥品的過敏源性的高低。與現有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果 本發(fā)明利用基因工程技術，經密碼子優(yōu)化后人工合成重組巴西堅果過敏原的編碼基因，并采用生物信息學軟件分析其抗原表位，通過定點突變的方法，針對ー個或多個抗原性高的位點進行定向置換，以降低其過敏源性，構建成低過敏原性的重組巴西堅果過敏原突變體。利用在人工控制的條件下進行蛋白表達，獲得高純度的重組巴西堅果過敏原及其突變體蛋白。與天然巴西堅果過敏原相比，該重組蛋白突變體與特異性IgE的結合能力明顯降低，可安全地應用于過敏性疾病的診斷與治療乃至判斷其它蛋白過敏原性的高低。


圖I為重組巴西堅果過敏原蛋白的誘導表達電泳圖。圖中從左至右分別為Marker、未誘導菌、誘導菌體。Marker從上至下分別為97. 4，66.2，45. O, 31. O, 21. O,14. 4 kD。
具體實施例方式以下結合實施例來進ー步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實施例I重組巴西堅果過敏原的克隆與表達
(I)重組巴西堅果過敏原核酸序列的確定JANCBI數據庫中獲取天然巴西堅果過敏原的核酸序列(GenBank登錄號M17146. I)，在該序列的C端加上方便純化的親和標簽6*HIS、STREPII或S蛋白，然后分別在序列的N端和C端加上Nde I、Eco RI、Xho I、Pst I等酶切位點，得到重組巴西堅果過敏原的目的基因片段Ber el。(2)根據大腸桿菌的密碼子偏好性，對目的基因Ber el的核酸序列進行密碼子優(yōu)化，使得目的基因更適合在宿主菌中表達，優(yōu)化后GC含量為35飛5%，原氨基酸序列不變，如SEQ ID NO: I 所示。(3)人工合成優(yōu)化后的Ber el基因序列。(4)經雙酶切后，將目的片段Ber el克隆到原核表達載體pET上，構建重組表達質粒。(5)將重組表達質粒pET- Ber el轉化入表達宿主菌Rosetta中。(6)選擇含重組表達質粒pET- Ber el的表達宿主菌Rosetta在LB培養(yǎng)基中30-37°C培養(yǎng)1-6小時，加入濃度為O. 0Γ2. O mmol/L IPTG誘導表達2_8小時，誘導溫度為4-38°C。誘導后，離心收集菌體，進行SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達量(見圖I)。(7)超聲破碎法裂解菌體獲得目的蛋白的包涵體，裂解液為15-100 mM Tris-Hcl,50-300 mM NaCl, O. 05-1. O mM EDTA。(8)用透析法進行蛋白復性后，以8000-30000rpm的轉速在4°C下離心15-30 min,
收集上清液。(9)復性后得到的上清液，經6*HIS、STREPII或S蛋白標簽的親和層析柱獲得高純度的目的蛋白。實施例2重組巴西堅果過敏原的抗原表位分析及突變位點的確定
(I)運用在線軟件平臺包括 SYFPEITHI，MHCPred, SYFPEITHI, BIMAS, NetMHC II， MHC-THREAD,EpiPredict,HLA-DR4 binding, ProPred, RankPep, SVMHC,PREDEP, PREDICT 等對重組巴西堅果過敏原的氨基酸序列的抗原指數進行分析。綜合各軟件的分析，結果表明重組巴西堅果過敏原氨基酸序列中1-15、18-42、70-95、98-116區(qū)域的抗原值較高。(2)針對抗原值比較高的一個或多個位點進行氨基酸置換，以弱化抗原性。將抗原性改造后的氨基酸序列再進行上述的抗原性分析，如此反復，篩選出抗原性顯著降低的突變位點。實施例3重組巴西堅果過敏原突變體的構建
(I)針對確定的突變位點，按照突變試劑盒提供方法設計突變體引物，Tm值一般要求大于78 °C，引物長度在25-45個堿基之間比較適宜。(2)根據突變試劑盒的要求，以重組巴西堅果過敏原的重組表達質粒為模板，進行突變PCR。(3)用試劑盒中提供的酶消化PCR產物后，轉化感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，測序檢測突變是否成功。
權利要求
1.一種重組巴西堅果過敏原，其特征在于是在重組巴西堅果過敏原的基礎上衍生的非天然存在的突變體，其中B細胞或/和T細胞表位的至少ー個表面暴露的保守氨基酸殘基被在天然存在的過敏原來源的分類學目內任何已知的同源蛋白質氨基酸序列中的相同位置不出現的另ー殘基取代，該突變體具有與天然出現的過敏原基本相同的α-碳骨架三級結構。
2.權利要求I所述的ー種重組巴西堅果過敏原的突變體，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO: I 所示。
3.權利要求I所述ー種重組巴西堅果過敏原的制備方法，其特征在于包括如下步驟編碼權利要求I所述重組巴西堅果過敏原的基因依據相應的表達宿主的情況通過密碼子優(yōu)化得到，并以之獲得重組載體后，轉化大腸桿菌、酵母或植物，得到重組宿主，蛋白表達后得到權利要求I所述的重組巴西堅果過敏原。
4.根據權利要求3所述ー種重組巴西堅果過敏原的制備方法，其特征在于所述表達宿主為大腸桿菌表達系統(tǒng)，該表達系統(tǒng)名稱為Escherichia coli JM109-B2SQ3，于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC M 2011152，保藏日期為2011年4月29日，保藏地點為中國.武漢.武漢大學；該表達宿主表達與純化后即獲得權利要求I所述的重組巴西堅果過敏原。
5.根據權利要求3所述的ー種重組巴西堅果過敏原的制備方法，其特征在于包括如下步驟 (O從數據庫中獲取巴西堅果過敏原的核酸序列,根據表達宿主的密碼子偏好性對其進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后序列中GC含量為35飛5%，原氨基酸序列不變； (2)人工合成優(yōu)化后的核酸序列； (3)經雙酶切后，與表達載體連接，構建成重組載體； (4)將重組載體轉化表達宿主中，選擇陽性轉化物； (5)在2(T38°C下，培養(yǎng)陽性轉化物，用濃度為O.0Γ2. Ommol/L的誘導劑來誘導重組蛋白表達，誘導溫度為4 38°C ； (6)所得培養(yǎng)物經裂解宿主細胞后，純化獲得高純度的重組蛋白。
6.權利要求2所述的ー種重組巴西堅果過敏原的突變體的制備方法，其特征在于包括如下步驟 Ca)采用生物信息學軟件預測權利要求I所述重組巴西堅果過敏原的氨基酸序列的優(yōu)勢抗原表位； (b)采用定點法改變抗原性高的位點，用天然存在的過敏原來源的分類學目內任何已知的同源蛋白質氨基酸序列中的相同位置不出現的氨基酸殘基取代原有的氨基酸殘基； (C)獲得巴西堅果過敏原突變體的基因片段，經酶切后，與表達載體連接，構建成突變型重組載體； Cd)按照權利要求5所述步驟(4) (6)的方法，獲得高純度的重組突變蛋白。
7.權利要求1-6所述的重組巴西堅果過敏原或其突變體在制備藥物中的應用，該藥物用于治療變態(tài)反應性疾病并使對巴西堅果過敏原乃至其它類型過敏的患者產生免疫耐受；或者用來診斷變態(tài)反應性疾病或者判斷其它食品藥品的過敏原性的高低。
8.權利要求7中所述的藥物或診斷試劑，其特征在于它包含根據權利要求1飛中任意一項的重組過敏原，任選與藥用或者診斷試劑中可接受的賦形劑和/或載體，并且任選佐 劑和/或偶聯劑組合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組巴西堅果過敏原與突變體及其制備方法和應用。本發(fā)明所述重組巴西堅果過敏原是天然存在的過敏原衍生的非天然存在的變異體，氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本發(fā)明利用基因工程技術，經密碼子優(yōu)化后人工合成重組巴西堅果過敏原的編碼基因，采用生物信息學軟件分析其抗原表位，通過定點突變針對一個或多個抗原性高的位點進行定向置換，降低其過敏源性，構建成低過敏原性的重組巴西堅果過敏原突變體。利用在人工控制的條件下進行蛋白表達，獲得高純度的重組巴西堅果過敏原及其突變體蛋白。與天然過敏原相比，該重組蛋白突變體與特異性IgE的結合能力明顯降低，可安全地應用于過敏性疾病的診斷與治療乃至判斷其它蛋白質的過敏原性的高低。
文檔編號G01N33/68GK102690340SQ20121008938
公開日2012年9月26日 申請日期2012年3月30日 優(yōu)先權日2012年3月30日
發(fā)明者何穎, 劉雪婷, 鄒澤紅, 陳惠芳, 陶愛林, 高潔榮 申請人:廣州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院