專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)結(jié)核性胸膜炎的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)結(jié)核性胸膜炎的試劑盒。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人民健康和國(guó)民經(jīng)濟(jì)的傳染病，全球近三分之一人口感染結(jié)核分枝桿菌，而在結(jié)核病高發(fā)區(qū)結(jié)核性胸膜炎是導(dǎo)致胸腔積液的一個(gè)重要病因。結(jié)核性胸膜炎最可靠的診斷方法是確定結(jié)核分枝桿菌的存在或通過(guò)組織切片確定胸膜組織肉芽腫的存在。但通常胸水中結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量很少，利用抗酸染色法檢出的靈敏度極低，而組織切片又是侵入性的診斷方法，臨床操作存在局限性。因此，一些利用生物學(xué)分子標(biāo)志物的診斷方法也相繼出現(xiàn)，比如腺式脫氨酶(adenosine deaminase, ADA)和IFN-Y ,其含量一般認(rèn)為在結(jié)核性胸膜炎胸水中升高，對(duì)于疾病的輔助診斷有一定價(jià)值，但是其疾病特異性不夠理想，因?yàn)樵谄渌恍┘膊≈羞@兩種因子也升高。同時(shí)，研究也表明由于IFN-Y背景較高影響了胸水細(xì)胞的結(jié)核分枝桿菌特異性IFN-Y釋放實(shí)驗(yàn)(IGRA)的準(zhǔn)確性，而且在一些病人中胸水細(xì)胞取得的數(shù)量比較少，不能滿(mǎn)足試驗(yàn)要求。另外，結(jié)核性胸膜炎胸部積水常常被誤診為癌性積水，因此，針對(duì)結(jié)核性胸膜炎新的簡(jiǎn)便易行的診斷方法亟待被研發(fā)出來(lái)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)結(jié)核性胸膜炎的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括用于檢測(cè)免疫因子表達(dá)量的試劑盒和裝置；所述疾病特異性免疫因子為如下I)或2):I)為如下全部9種白介素-6 (IL-6)、白介素-13 (IL-13)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白I (CCLl)、淋巴細(xì)胞趨化因子21 (CCL21)、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10 (IP-10 (CXCLlO))、單核細(xì)胞趨化蛋白2 (CCL8 (MCP-2))、血漿炎性趨化因子(CXCL9 (MIG))和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-I (CXCL12 (SDF-I))；2)為如下9種中的至少一種白介素_6、白介素-13、粒細(xì)胞集落刺激因子、嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白I、淋巴細(xì)胞趨化因子21、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10、單核細(xì)胞趨化蛋白2、血漿炎性趨化因子和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-I。檢測(cè)上述免疫因子表達(dá)量的試劑盒為Human Cytokine/Chemokine Panel I試劑盒、Human Cytokine/Chemokine Panel II試劑盒和Human Cytokine/Chemokine Panel III試劑盒； 上述檢測(cè)免疫因子表達(dá)量的裝置為多功能液相芯片分析儀。上述9種免疫因子均為人源免疫因子。上述的試劑盒在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)結(jié)核性胸膜炎的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
上述應(yīng)用中，該檢測(cè)或輔助檢測(cè)的樣本為離體胸水。
上述應(yīng)用中，所述檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣本是否為結(jié)核性胸膜炎為用上述的試劑盒檢測(cè)待測(cè)樣本的離體胸水中的IL-6、IL-13、G-CSF, CCLU CCL21、IP-10 (CXCLlO),CCL8 (MCP-2), CXCL9 (MIG)和CXCL12 (SDF-I)的表達(dá)量，以確證的肺癌患者離體胸水為對(duì)照，若待測(cè)樣本的離體胸水中9種免疫因子的表達(dá)量均高于或者至少ー種高于所述確證的肺癌患者離體胸水對(duì)照，則待測(cè)樣本為或候選為結(jié)核性胸膜炎；反之，則待測(cè)樣本不為或候選不為結(jié)核性胸膜炎。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明開(kāi)發(fā)出ー種以待測(cè)患者的離體胸水為檢測(cè)對(duì)象，利用ー組免疫學(xué)分子標(biāo)識(shí)，通過(guò)多因子微球檢測(cè)技術(shù)，特異性地鑒別出結(jié)核性胸膜炎的方法，通過(guò)此技術(shù)獲得的多個(gè)免疫標(biāo)識(shí)具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)所需檢測(cè)樣本少(25ul即可一次檢測(cè)多因子)、特異性高、敏感度高(可檢測(cè)閾值低至3. 2pg/ml)、操作簡(jiǎn)便、可以通過(guò)多因子組合方式判斷病情等。


圖I為多因子表達(dá)水平比較圖2為經(jīng)過(guò)抗原刺激后細(xì)胞分泌上清中抗原特異性免疫因子表達(dá)水平的比較
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、試劑盒在檢測(cè)或輔助檢測(cè)結(jié)核性胸膜炎中的應(yīng)用本發(fā)明以離體胸水為檢測(cè)對(duì)象，利用ー組免疫學(xué)分子標(biāo)識(shí)，通過(guò)多因子微球檢測(cè)技術(shù)，特異性地鑒別出結(jié)核性胸膜炎的方法。I、檢測(cè)免疫因子表達(dá)量的試劑盒和裝置檢測(cè)免疫分子的表達(dá)水平檢測(cè)或輔助檢測(cè)結(jié)核性胸膜炎的試劑盒包括檢測(cè)免疫因子表達(dá)量的試劑盒和裝置，檢測(cè)上述免疫因子表達(dá)量的試劑盒為Human Cytokine/Chemokine Panel I試劑盒、Human Cytokine/Chemokine Pane II i式齊[J盒和 Human Cytokine/Chemokine Panel III 試劑盒；上述檢測(cè)免疫因子表達(dá)量的裝置為多功能液相芯片分析儀。樣品收集臨床上確診的(η = 27)結(jié)核性胸膜炎患者離體胸水(TPF)，以(η = 27)結(jié)核性胸膜炎患者離體血漿(TP)、(η = 12)肺結(jié)核初發(fā)病人離體血漿(無(wú)胸膜炎，已經(jīng)經(jīng)過(guò)臨床診斷，TB)以及(η = 15)肺癌患者離體胸水(已經(jīng)經(jīng)過(guò)臨床診斷，CPF)為對(duì)照檢測(cè)。η為樣本的數(shù)量。檢測(cè)的9種免疫分子如下1レ6(人白介素-6)、1レ13(人白介素-13)、6-05 (粒細(xì)胞集落刺激因子)、CCLl (嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白I)、CCL21(淋巴細(xì)胞趨化因子21)、IP-10 (CXCLlO)(干擾素誘導(dǎo)蛋白-10)、CCL8 (MCP-2)(單核細(xì)胞趨化蛋白2)、CXCL9 (MIG)(血漿炎性趨化因子)、CXCL12 (SDF-I)(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-I)。檢測(cè)上述9種免疫分子表達(dá)量所使用試劑盒(敏感度高，低至3.2pg/ml):美國(guó)Millipore 公司 Human Cytokine/Chemokine Panel I、II、III(Cat. No. MPXHCYT0-60K、MPXHCYP2-62K、MPXHCYP3-63K)。
其中G-CSF、IL-6、IL-13、IP-10 (CXCLlO)用 Human Cytokine/ChemokinePanelI (MPXHCYT0-60K)檢測(cè)；CCL21(CCL21/6Ckine)、CCLl(CCL1/I309)、CCL8(MCP-2)、CXCL12(SDF-I)用 HumanCytokine/Chemokine Panel II (MPXHCYP2-62K)檢測(cè)；CXCL9/MIG (CXCL9 (Μ IG))用 Human Cytokine/Chemokine Pane IIII(MPXHCYP3-63K)檢測(cè)。所使用儀器和軟件(儀器名稱(chēng)是Luminex-200，軟件名稱(chēng)是Luminex xP0NENT3. Isoftware):多功能液相芯片分析儀 Luminex-200 (Luminex Corporation, USA)；Luminex χΡΟΝΕΝΤ 3. Isoftware (Luminex Corporation, USA)。按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)和上述儀器分別檢測(cè)上述樣品(均取25ul即可)中9種免疫分子的表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法運(yùn)用SPSS軟件，首先通過(guò)one-way analysis ofvariance (ANOVA)方法進(jìn)行方差齊性分析，當(dāng)方差齊時(shí)后續(xù)通過(guò)Tukey HSD或LSD方法檢驗(yàn)組間差異性，當(dāng)方差不齊時(shí)Tambane或DunnettT3方法檢驗(yàn)組間差異性。當(dāng)p < O. 05時(shí)，說(shuō)明兩組間存在顯著性差異。(*P < O. 05 ；**p < O. 005 ；***p < O. 0005)；結(jié)果如圖I、表2和表3所示，TB :肺結(jié)核初發(fā)病人離體血漿，TP :結(jié)核性胸膜炎患者離體血漿，TPF:結(jié)核性胸膜炎患者離體胸水，CPF:肺癌患者離體胸水，縱坐標(biāo)為各因子的表達(dá)量；表2為T(mén)B、TP、TPF、CPF表達(dá)量平均值(單位pg/ml)
TBTPTPFCPF
IL-658.31 53. 14 60048.70 18226.04
IL-131.45 4.28 41.63 13.28
G-CSF9.42 13.79 267.29 68.22
CCLl3.05 3.92 63.76 5.19
CCL21191.96 188.26 3878.91 790.21
IP-10 (CXCLlO) 2642.36 3264. 07 24893.96 2267.16 CCL8 (MCP-2) 26.54 30. 12 1090.80 83.48 CXCL9 (MIG) 4064. 36 5192. 27 57717. 57 4667.42
CXCL12 (SDF-I) 2884.58 3117. 20 11767. 09 4699.12表3 為 TB、TP、TPF、CPF 最低值(min)和最高值(max)TBTPTPFCPF
IL-6min 4.885744 1.908569 1271.473 1575.334
max 426.8048 232.8232 199838.7 79692.23 IL-13min 1.430298 1.430298 1.994356 0.9893296
max 1.687857 20.38994 90.08186 35.10225 G-CSFmin 1.829041 9.153311 1.829041 1.829041
max 39.6813 20.42487 699.2226 213.9518 CCLlmin 0.2103856 0.7800636 1.829041 1.78375
max 9.516727 10.15748 699.2226 23.06967 CCL21min19.5 0.7800636 6.315319 21.62217
max 387.1454 10.15748 143.1675 2263.908 IP-10(CXCLlO) min 295.3258 877.8007 10000 956.7337
max 9271.346 7085.62 66826.13 5151.034 CCL8 (MCP-2) min 4.819355 4.882813 259.8504 18.48032 max 38.87123 42.98889 3815.444 448.1277 CXCL9 (MIG)min 994.6805 517.4866 50000 999.1582
max 9894.631 15210.34 91176.38 9763.798 CXCL12 (SDF-I) min 1762.057 1324.53 4220.98 1303.208
max 6770.598 6846.027 23313.39 10631.9可以看出，這組免疫分子(9種)在結(jié)核性胸膜炎胸水中均為高表達(dá)，且均顯著性高于CPF (肺癌患者離體胸水)，與其他對(duì)照組均也有顯著性差異，提示可以作為預(yù)示結(jié)核性胸膜炎的診斷標(biāo)識(shí)。2、特異性抗原刺激后胸水中免疫分子的表達(dá)水平I)結(jié)核分枝桿菌裂解物的制備A、復(fù)蘇 H37Rv凍存的H37Rv (結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)株，ATCC，25618)解凍后在7H9培養(yǎng)基(BD公司，Difco Middlebrook 7H9Broth, Lot. 0305232)孵育，培養(yǎng)液 0D580 值為 O. 6 時(shí)離心收集細(xì)菌H37Rv菌體，_80°C保存?zhèn)溆?。B、滅活 H37Rv 菌體H37Rv菌體經(jīng)65°C，30分鐘滅活，離心棄上清后滅活的H37RV菌體_80°C保存?zhèn)溆?。C、H37RV菌體超聲裂解將上述滅活的H37RV菌體(IXlO8CFU)用5ml的I X PBS (磷酸ニ氫鉀(KH2PO4)
O.27g，磷酸氫ニ鈉(Na2HPO4) :1.4 ,氯化鈉(NaCl) :8g，氯化鉀(KCl) O. 2g，溶解于IL雙蒸水，PH值7. 4)稀釋后，重懸并分裝至I. 5mL離心管內(nèi)，置于冰上待用。超聲破碎儀探頭用次氯酸鈉和酒精消毒后，按照如下程序設(shè)定(表4)進(jìn)行菌體超聲(超聲時(shí)間12min)，得到 裂解液，用于后續(xù)抗原刺激實(shí)驗(yàn)。表4為超聲破碎儀裂解菌體的程序設(shè)定變幅桿Φ 3
溫度4°C超聲時(shí)間 12min
超聲開(kāi)2s
輸出功率 20%超聲關(guān)2sD、蛋白含量測(cè)定Bradford法測(cè)定上述裂解液中蛋白濃度(300 μ g/mL)，分裝后_80°C保存?zhèn)溆谩?
2)特異性抗原刺激后胸水A、準(zhǔn)備細(xì)胞結(jié)核性胸膜炎患者離體胸水樣本離心(1，500rpm, 5min)后獲取胸水細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)法細(xì)胞計(jì)數(shù)并觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)，用含10% (質(zhì)量百分含量)胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度5 X IO6細(xì)胞/mL。B、抗原刺激細(xì)胞用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后收取上清進(jìn)行多因子檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)步驟準(zhǔn)備96孔U型細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入5X IO5上述A得到的胸水細(xì)胞，加入由I)的C得到的H37Rv抗原裂解液(最終使用濃度是10 μ g/mL)進(jìn)行刺激，細(xì)胞吹打混勻。37°C 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育72小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清(抗原刺激后)并分裝于_80°C保存，用于后續(xù)免疫因子檢測(cè)。同時(shí)，以不加入任何刺激物的細(xì)胞為對(duì)照，方法同上，72小時(shí)后收集培養(yǎng)上清(不刺激)待用。H37Rv裂解液刺激細(xì)胞后上清因子表達(dá)水平可反映抗原/疾病特異性。。3)檢測(cè)免疫分子的表達(dá)水平用上述I中的試劑盒和儀器檢測(cè)培養(yǎng)上清(刺激后)、培養(yǎng)上清(不刺激)中9種免疫因子的表達(dá)量，按照上述I的統(tǒng)計(jì)方法統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖2、表5和表6所示，其中，no sti為不加入結(jié)核分枝桿菌裂解物刺激，H37Rv為加入結(jié)核分枝桿菌裂解物刺激，縱坐標(biāo)為各因子的表達(dá)量；表5為上清中各因子表達(dá)量的平均值
no sti H37Rv
IL-62.29 12.26
IL-131.43 28.52
G-CSF1.79 3.69
CCLl10.40 129.05
CCL21159.51 217.40CCL8 (MCP-2)23.25 39.43
IP-10(CXCLlO) 124.52 531.69 CXCL12 (SDF-I) 332.55 271.93 CXCL9 (MIG) 1402.08 7194.06表6為上清中各因子表達(dá)量的最大值(max)和最小值(min)
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)結(jié)核性胸膜炎的試劑盒，包括用于檢測(cè)免疫因子表達(dá)量的試劑盒和裝置； 所述免疫因子為如下I)或2): 1)為如下全部9種白介素-6、白介素-13、粒細(xì)胞集落刺激因子、嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白I、淋巴細(xì)胞趨化因子21、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10、單核細(xì)胞趨化蛋白2、血漿炎性趨化因子和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子I ; 2)為如下9種中的至少I(mǎi)種白介素-6、白介素-13、粒細(xì)胞集落刺激因子、嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白I、淋巴細(xì)胞趨化因子21、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10、單核細(xì)胞趨化蛋白2、血漿炎性趨化因子和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子I。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于 所述檢測(cè)免疫因子表達(dá)量的試劑盒為Human Cytokine/Chemokine Panel I試劑盒、Human Cytokine/Cnemokine Panel II 1式劑盒和 Human Cytokine/Chemokine PanelIII 試劑盒； 所述檢測(cè)免疫因子表達(dá)量的裝置為多功能液相芯片分析儀。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于 所述9種免疫因子均為人源免疫因子。
4.權(quán)利要求1-3中任一所述的試劑盒在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)結(jié)核性胸膜炎的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述檢測(cè)或輔助檢測(cè)的樣本為離體胸水。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)結(jié)核性胸膜炎的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括用于檢測(cè)免疫因子表達(dá)量的裝置；所述免疫因子為如下1)或2)1)為如下全部9種IL-6、IL-13、G-CSF、CCL1、CCL21、IP-10(CXCL10)、CCL8(MCP-2)、CXCL9(MIG)和CXCL12(SDF-1)。2)為如下9種中的至少一種IL-6、IL-13、G-CSF、CCL1、CCL21、IP-10(CXCL10)、CCL8(MCP-2)、CXCL9(MIG)和CXCL12(SDF-1)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明開(kāi)發(fā)出一種以胸水為檢測(cè)對(duì)象，利用一組免疫學(xué)分子標(biāo)識(shí)，通過(guò)多因子微球檢測(cè)技術(shù)，特異性地鑒別出結(jié)核性胸膜炎的方法，可以通過(guò)多因子組合方式提高疾病診斷的準(zhǔn)確率及科學(xué)判斷病情等。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102621331SQ201210098089
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月5日
發(fā)明者于楊, 劉海鷹, 張艷, 金奇 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所