專利名稱：一種從天然水體懸浮物中富集純化藻類細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生態(tài)環(huán)境分析方法，具體涉及從天然水體懸浮顆粒中分離富集純化藻類細(xì)胞的方法，分離得到的藻類細(xì)胞可用于淡水生態(tài)學(xué)、地球化學(xué)領(lǐng)域開展藻類細(xì)胞元素組成、同位素示蹤等研究，屬環(huán)境科學(xué)研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
水中的懸浮物(suspended solids)通常是指懸浮存在于水體中的一大類固態(tài)混合物，包括無機(jī)懸浮顆粒物(不溶于水的泥沙顆粒、黏土膠體顆粒等)、有機(jī)懸浮顆粒物(浮游動植物活體、動物殘體、糞便、碎屑、微生物等)。廣泛存在于天然水體中的懸浮物，不僅影響了天然水體的水質(zhì)理化性質(zhì)(如濁度、色度等)，而且也是各種污染物質(zhì)(重金屬、農(nóng)藥等)和生源要素(C、N、P)的主要載體和存在形式，是水環(huán)境科學(xué)、水域生態(tài)學(xué)與生物地球化學(xué)等領(lǐng)域具有重要價值的研究對象。藻類是ー類具有葉綠素，能進(jìn)行放氧的光合作用；植物體沒有真正根、莖、葉的分化，用單細(xì)胞的孢子或合子進(jìn)行繁殖的低等植物。作為水中懸浮物的主要組成之一，浮游營生于水中的藻類(通常也稱“浮游植物”)是水域生態(tài)系統(tǒng)(尤其是大型水體)的主要生產(chǎn)者，其光合作用將提供食物網(wǎng)的最初能量來源，驅(qū)動著物質(zhì)在不同營養(yǎng)層級中傳遞與循環(huán)利用。近年來，在淡水生態(tài)學(xué)、地球化學(xué)研究中廣泛開展的化學(xué)計量學(xué)、同位素示蹤等研究工作需要對天然水體中藻類細(xì)胞開展元素含量或物質(zhì)組成分析研究，以明確藻類細(xì)胞體內(nèi)元素組成或相關(guān)物質(zhì)的生物地球化學(xué)過程。然而目前天然水體中藻類細(xì)胞的常規(guī)采樣分析方法還難以滿足前述研究的相關(guān)要求。在已有的水域生態(tài)系統(tǒng)觀測規(guī)范(見《水域生態(tài)系統(tǒng)觀測規(guī)范》，中國生態(tài)系統(tǒng)研究網(wǎng)絡(luò)科學(xué)委員會編，中國環(huán)境科學(xué)出版社2007年出版)和國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報道中，對天然水體藻類細(xì)胞體內(nèi)元素含量與物質(zhì)組成進(jìn)行測試分析的方法是以湖泊生態(tài)系統(tǒng)為基礎(chǔ)設(shè)計的，即默認(rèn)湖泊水體中絕大多數(shù)懸浮顆粒物是藻類細(xì)胞，采用微孔濾膜過濾水樣截留懸浮物以實現(xiàn)藻類細(xì)胞在微孔濾膜上富集，并開展后續(xù)測試分析工作(如元素分析、同位素示蹤等)。該方法對開展藻類細(xì)胞內(nèi)元素含量和物質(zhì)組成分析仍存在明顯而突出的不足
一方面，微孔濾膜過濾將使水中其他有機(jī)或無機(jī)懸浮顆粒連同藻類細(xì)胞一起截留在微孔濾膜表面。截留于微孔濾膜表面的懸浮物(藻類細(xì)胞)通常一并進(jìn)行元素分析、同位素示蹤等后續(xù)測試分析工作，同實際情況存在較大偏差。另ー方面，同湖泊相比，河流、水庫等過流型水體中無機(jī)懸浮顆粒物(泥沙顆粒等)在顆粒物中所占比重不容忽視，而藻類細(xì)胞含量則相對偏少。采用微孔濾膜過濾的方式富集水中藻類細(xì)胞，不僅容易出現(xiàn)無機(jī)懸浮顆粒堵塞微孔濾膜，影響微孔濾膜過濾效果，造成濾膜浪費(fèi)，也無法使藻類細(xì)胞得到高效率分離富集。濾后開展的元素分析、同位素示蹤等分析測試工作存在很大誤差。
雖然目前還可以采用64 μ m浮游生物網(wǎng)在水下拖網(wǎng)，或采集一定體積(如1L)水樣滴加魯哥試劑沉淀濃縮等方式實現(xiàn)對水體中藻類細(xì)胞富集，但上述方法僅適用于對藻類物種和現(xiàn)存量進(jìn)行顯微鏡定性鏡檢或定量計數(shù)分析。同微孔膜濾的方法一祥，上述方法無法根本解決從懸浮顆粒物中分離出藻類細(xì)胞的核心難題；而由于采用化學(xué)方式殺死藻類細(xì)胞，這在一定程度上對天然水體藻類細(xì)胞自身化學(xué)組成造成污染，并不適用于藻類細(xì)胞元素分析或同位素示蹤實驗研究。從天然水體懸浮物中富集分離純化藻類細(xì)胞是開展藻類細(xì)胞元素分析、同位素示蹤實驗的關(guān)鍵基礎(chǔ)，但國內(nèi)目前仍未見有相關(guān)研究報道。因此，有必要開發(fā)出ー套從天然水體中富集純化藻類細(xì)胞的方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種分離富集效率高、純度高的從天然水體懸浮物中富集純化藻類細(xì)胞的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
ー種從天然水體懸浮物中富集純化藻類細(xì)胞的方法，其步驟為
1)水樣采集與預(yù)處理從天然水體中取一定體積的水樣，并將水樣濾過64μ m浮游生物網(wǎng)，以去除浮游動物和大顆粒懸浮物；
2)懸浮顆粒物濃縮富集將第I)步過濾后的水樣進(jìn)行濃縮富集處理，使含水率在80% 90%間，得到懸浮物勻漿并放入冰箱中避光保存；
3)無機(jī)娃溶膠的制備將無機(jī)娃溶膠用水進(jìn)行稀釋，使之密度為1260kg/m3 1290kg/
m3 ；
4)離心機(jī)上分離純化將第3)步制備得到的無機(jī)硅溶膠加入離心管內(nèi)，再將第2)步得到的懸浮物勻漿從冰箱取出后震蕩或攪拌均勻，再添加到無機(jī)硅溶膠表面，懸浮物勻漿和無機(jī)硅溶膠的體積比為1:3-1:4，最后將添加有懸浮物勻漿和無機(jī)硅溶膠的離心管放在離心機(jī)上進(jìn)行分離純化，離心機(jī)轉(zhuǎn)速1500 2000rpm/min,分離純化10 20min ；
5)取液保存離心后，移取離心管頂部Icm深度之上的物質(zhì)即為富集純化的藻類細(xì)胞并避光保存至冰箱中即可。第2)步懸浮顆粒物濃縮富集使用連續(xù)流離心機(jī)，連續(xù)流離心機(jī)工作轉(zhuǎn)速18000 22000rpm，離心過程中不斷攪拌使水樣懸浮物均勻分布。若水中懸浮物濃度較高且主要為無機(jī)泥沙顆粒(水體渾濁且偏黃)，第I)步水樣濾過64 μπι浮游生物網(wǎng)之前可靜置沉淀15 30min，以去除易沉的大顆粒泥沙。若為海水或硬度較大的淡水樣品，所述濃縮富集后的懸浮物勻漿需用去離子水潷洗以進(jìn)一歩去除其中豐富的ニ價陽離子；也可以使用離子交換膜進(jìn)行離子交換，離子交換膜配置與ニ價陽離子相同電導(dǎo)率的一價陽離子。本發(fā)明分離富集效率高，純度高，操作簡單，過程易控制，可有效避免傳統(tǒng)膜濾方法富集天然水體懸浮顆粒但無法分離純化藻類細(xì)胞的缺陷，能夠滿足科學(xué)、高效開展天然水體藻類細(xì)胞元素組成、同位素示蹤等實驗研究的相關(guān)要求。


圖I-本發(fā)明流程圖。
具體實施例方式天然水體中浮游藻類是ー類元素組成相對一致的有機(jī)生命體，而其他懸浮顆粒物 的組成成分則較為復(fù)雜。在物理性質(zhì)上，浮游藻類細(xì)胞密度接近于水體，同其他懸浮顆粒物相比較小，且不同藻種間的密度差異并不明顯，通常在920kg/m3 1280kg/m3之間。而浮游動物體密度則通常相對較大(密度約在1500kg/m3左右)，無機(jī)懸浮顆粒物密度則更大(如泥沙顆粒密度大于2300kg/m3)?；谏鲜霾町悾景l(fā)明提出采用密度梯度離心的方法，通過離心カ場作用使不同密度的顆粒物分別停留在特定密度介質(zhì)層中，進(jìn)而實現(xiàn)從天然水體懸浮物中分離純化藻類細(xì)胞的目的。根據(jù)上述思路，本發(fā)明提出了“連續(xù)流離心濃縮富集一無機(jī)硅溶膠密度梯度離心純化一C:Chla評估檢驗效果”的總體技術(shù)方案，具體技術(shù)流程圖見附圖I。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)ー步說明。參見圖1，從圖上可以看出，本發(fā)明的具體操作步驟為
I)水樣采集與預(yù)處理
從天然水體取一定體積水樣，通常為60 80L，視水樣中懸浮物含量多寡而定。根據(jù)水體表觀特征判別水中懸浮物主要組成與大致的藻類細(xì)胞濃度水平。若水中懸浮物濃度較高且主要為無機(jī)泥沙顆粒(水體渾濁且偏黃)，可靜置沉淀15 30min，去除易沉的大顆粒泥沙后濾過64 μ m浮游生物網(wǎng)(25#浮游生物網(wǎng))，去除浮游動物和其他大顆粒懸浮物。若水中無機(jī)泥沙顆粒較少，懸浮物以有機(jī)碎屑和藻類細(xì)胞為主(水體偏綠或偏褐色)，可直接將水樣濾過64 μ m浮游生物網(wǎng)。2)懸浮顆粒物濃縮富集與保存
為使天然水體懸浮物(含藻類細(xì)胞)能夠滿足離心分離的要求，需要提升濃度水平，故采用連續(xù)流離心機(jī)(如CEPA-LE/GLE連續(xù)流離心機(jī))，滿足從大容量天然水體中濃縮富集懸浮物(含藻類細(xì)胞)的要求。連續(xù)流離心機(jī)工作參數(shù)
I采集水樣量60 80L ；
I水樣進(jìn)樣流量200 300mL/min ；
I離心機(jī)工作轉(zhuǎn)速18000 22000rpm ；
連續(xù)進(jìn)樣離心過程中采用機(jī)械攪拌方式維持進(jìn)樣器內(nèi)水樣懸浮物混合均勻。離心過程中人工值守以確保離心富集產(chǎn)物(懸浮物顆粒勻漿)不溢流出取樣池，并可在過濾過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、改變離心力以調(diào)節(jié)過濾產(chǎn)物的產(chǎn)率與含水率，保證懸浮物能夠有效濃縮富集并不影響后續(xù)分離純化工作。濃縮富集后水樣含水率在80% 90%間，懸浮物通常以粘稠狀勻漿態(tài)形式存在，故稱之為懸浮物勻漿。將懸浮物勻漿放入冰箱中避光保存，防止葉綠素a (Chla)分解。3)制備特定密度的無機(jī)硅溶膠用于分離純化
硅溶膠是納米級ニ氧化硅微粒在水中均勻擴(kuò)散形成的膠體溶液(HiSiO2 · ηΗ20)，按照膠體分散介質(zhì)的不同，通常分為有機(jī)硅溶膠和無機(jī)水性硅溶膠兩種。但由于本發(fā)明所涉及藻類細(xì)胞分離效果評估(C:Chla)與后續(xù)分析處理(元素分析、物質(zhì)組分分析等)需避免在離心分離過程中C、N、P等化學(xué)物質(zhì)對藻類細(xì)胞的污染，故要求使用無機(jī)水性硅膠溶液。本發(fā)明推薦采用杜邦公司生產(chǎn)Ludox TM-50型無機(jī)硅溶膠進(jìn)行實驗，該無機(jī)硅溶膠顆粒粒徑10 20nm，分散性較好，對細(xì)胞無毒性和刺激性，市售密度為1400kg/m3。為滿足密度梯度分離需要，即需要保證所采用分離介質(zhì)的密度略高于藻類細(xì)胞而低于其他懸浮顆粒物，故需要對市售Ludox TM-50無機(jī)硅溶膠進(jìn)行常溫下稀釋制備。根據(jù)藻類細(xì)胞的密度上限，本發(fā)明提出制備后硅溶膠密度范圍大致為1260kg/m3 1290 kg/m3，對于藍(lán)藻(密度較輕)含量較多的樣品可以取下限而對于硅藻(密度較重)含量較多的樣品可以取上限。而最適宜的硅溶膠密度值需綜合長期實驗經(jīng)驗最終確定。
稀釋倍數(shù)與稀釋后硅溶膠密度根據(jù)以下公式計算
權(quán)利要求
1.ー種從天然水體懸浮物中富集純化藻類細(xì)胞的方法，其特征在于其步驟為 1)水樣采集與預(yù)處理從天然水體中取一定體積的水樣，并將水樣濾過64μ m浮游生物網(wǎng)，以去除浮游動物和大顆粒懸浮物； 2)懸浮顆粒物濃縮富集將第I)步過濾后的水樣進(jìn)行濃縮富集處理，使含水率在80% 90%間，得到懸浮物勻漿并放入冰箱中避光保存； 3)無機(jī)娃溶膠的制備將無機(jī)娃溶膠用水進(jìn)行稀釋，使之密度為1260kg/m3 1290kg/m3 ； 4)離心機(jī)上分離純化將第3)步制備得到的無機(jī)硅溶膠加入離心管內(nèi)，再將第2)步得到的懸浮物勻漿從冰箱取出后震蕩或攪拌均勻，再添加到無機(jī)硅溶膠表面，懸浮物勻漿和無機(jī)硅溶膠的體積比為1:3-1:4，最后將添加有懸浮物勻漿和無機(jī)硅溶膠的離心管放在離心機(jī)上進(jìn)行分離純化，離心機(jī)轉(zhuǎn)速1500 2000rpm/min,分離純化10 20min ； 5)取液保存離心后，移取離心管頂部Icm深度之上的物質(zhì)即為富集純化的藻類細(xì)胞并避光保存至冰箱中即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從天然水體懸浮物中富集純化藻類細(xì)胞的方法，其特征在于第2)步懸浮顆粒物濃縮富集使用連續(xù)流離心機(jī)，連續(xù)流離心機(jī)工作轉(zhuǎn)速18000 22000rpm，離心過程中不斷攪拌使原水樣懸浮物均勻分布。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的從天然水體懸浮物中富集純化藻類細(xì)胞的方法，其特征在于第I)步水樣濾過64 μπι浮游生物網(wǎng)之前靜置沉淀15 30min，以去除易沉的大顆粒泥沙。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從天然水體懸浮物中富集純化藻類細(xì)胞的方法，其特征在于所述濃縮富集后的懸浮物勻漿用去離子水潷洗以去除天然水體中的ニ價陽離子。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從天然水體懸浮物中富集純化藻類細(xì)胞的方法，其特征在于所述濃縮富集后的懸浮物勻漿用離子交換膜進(jìn)行離子交換，以去除天然水體中的ニ價陽離子，離子交換膜配置與ニ價陽離子相同電導(dǎo)率的一價陽離子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從天然水體懸浮物中富集純化藻類細(xì)胞的方法，1)將水樣濾過64μm浮游生物網(wǎng)，以去除浮游動物和大顆粒懸浮物；2)將過濾后的水樣進(jìn)行濃縮富集處理，使含水率在80%～90%間，得到懸浮物勻漿；3)制備密度為1260～1290kg/m3的無機(jī)硅溶膠；4)將制備得到的無機(jī)硅溶膠加入離心管內(nèi)，再將懸浮物勻漿添加到無機(jī)硅溶膠表面，最后將離心管放在離心機(jī)上進(jìn)行分離純化；5)離心后，移取離心管頂部1cm深度之上的物質(zhì)即為富集純化的藻類細(xì)胞并避光保存至冰箱中即可。本發(fā)明分離富集效率高，純度高，操作簡單，過程易控制，能夠滿足科學(xué)、高效開展天然水體藻類細(xì)胞元素組成、同位素示蹤等實驗研究的相關(guān)要求。
文檔編號G01N1/40GK102620974SQ20121009911
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月6日
發(fā)明者馮婧, 劉靜, 張利萍, 方芳, 李哲, 郭勁松, 龔本洲 申請人:重慶大學(xué)