專利名稱：甲狀腺素酶聯(lián)免疫體外診斷試劑盒中酶結(jié)合物稀釋液的制備方法
甲狀腺素酶聯(lián)免疫體外診斷試劑盒中酶結(jié)合物稀釋液的制備方法本發(fā)明屬于生物體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種甲狀腺素酶聯(lián)免疫體外診斷試劑盒中酶結(jié)合物稀釋液的制備方法。ELISA試劑的具體檢測(cè)方法很多，各種方法都不可缺少酶結(jié)合物。酶結(jié)合物在ELISA實(shí)際中非常關(guān)鍵，其靈敏度、顯色背景和穩(wěn)定性對(duì)試劑質(zhì)量至關(guān)重要。高靈敏度、低顯色背景和良好的穩(wěn)定性是高品質(zhì)ELISA試劑所要達(dá)到的基本要求。酶結(jié)合物的靈敏度在很大程度上是由其自身的性質(zhì)決定的，但酶結(jié)合物所用稀釋液對(duì)其靈敏度有一定的影響，酶稀釋液的良好與否還對(duì)酶結(jié)合物的穩(wěn)定性和顯色背景有非常明顯影響。因此，制備性能良好的酶稀釋液是ELISA試劑生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)。 常見的用于甲狀腺素酶稀釋液一般使用緩沖系統(tǒng)(如PBS)、小牛血清(或牛血清白蛋白等)、解離劑、防腐劑及表面活性劑等制備而成。但用該稀釋液制備的工作濃度酶結(jié)合物穩(wěn)定性較差，有效期很短。為了保持酶結(jié)合物的穩(wěn)定，傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫體外診斷試劑中的酶結(jié)合物是以濃縮液的形式儲(chǔ)存的，當(dāng)使用時(shí)用酶稀釋液作適當(dāng)倍數(shù)的稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用，一般在2-8°C保存不超過一周。用戶使用比較麻煩，而且往往由于稀釋液誤差造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。如何提高酶聯(lián)免疫體外診斷試劑中的酶結(jié)合物的穩(wěn)定性，又能方便檢驗(yàn)人員的使用，是眾多診斷試劑制造商長(zhǎng)期以來努力解決的問題。本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了ー種甲狀腺素酶聯(lián)免疫體外診斷試劑盒中酶結(jié)合物稀釋液的制備方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明設(shè)計(jì)了ー種甲狀腺素酶聯(lián)免疫體外診斷試劑盒中酶結(jié)合物稀釋液的制備方法，包括以下步驟，在500ml蒸餾水中依次加入下列物質(zhì)A)配制緩沖液，pH值為7. 0-8. 0 ；B)在上述緩沖液中加入明膠，濃度為0. 3-1. 3g/L，加熱攪拌，使其充分溶解；C)加入BSA，濃度為0. 5-1. 5g/L，攪拌，使其充分溶解；D)加入解離劑，濃度為0. 2-1. 2g/L，攪拌，使其充分溶解；E)加入Tween-20，濃度為0. lml/L-1. 2ml/L，攪拌，使其充分溶解；F)加入Proclin300，濃度為0. 2-1. 2g/L，攪拌，使其充分溶解；G)加入酚紅I %的無水こ醇溶液1ml，終濃度為l_2ml/L，攪拌，使其充分溶解；H)待充分溶解后補(bǔ)足蒸餾水至IL ；I)最后用IOM NaOH或IOM HCL調(diào)pH值為7. 0-8. 0得到酶稀釋液；J)將濃縮酶結(jié)合物以所需的比例加入到上述酶稀釋液中充分混勻即可。
所述緩沖液為濃度為0. 05M-0. 2M PBS或濃度為0. 01-0. 2M Tris-HCL緩沖液。所述解離劑為ANS解離劑。所述的酶結(jié)合物為使辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶與抗原或抗體通過化學(xué)交聯(lián)而成的復(fù)合物。所述濃縮酶結(jié)合物與酶稀釋液的比例為I : 2000。 本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，通過改進(jìn)酶聯(lián)免疫體外診斷試劑中的酶稀釋液來提高酶結(jié)合物的穩(wěn)定性，提高靈敏度。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步描述。 實(shí)施例I :在500ml蒸餾水中依次加入下列物質(zhì)。A)配置Tris-HCL緩沖液，其中Tris 12. Ilg ；HCL 49ml ；緩沖液的pH值為7. O-8. 0 oB)在上述緩沖液中加入明膠0. 5g，終濃度為0. 3-1. 3g/L，加熱攪拌，使其充分溶解。C)加入BSA 0. 5g，濃度為0. 5-1. 5g/L，攪拌，使其充分溶解。D)加入ANS 0. 5g，濃度為0. 2-1. 2g/L，攪拌，使其充分溶解。E)加入 Tween-200. 5ml，濃度為 0. lml/L-1. 2ml/L，攪拌，使其充分溶解。F)加入Proclin3000. 5ml，濃度為0. 2-1. 2g/L，攪拌，使其充分溶解。G)加入酚紅(1%的無水こ醇溶液)lml，終濃度為l_2ml/L，攪拌，使其充分溶解。H)待充分溶解后補(bǔ)足蒸餾水至1しI)最后用IOM NaOH或IOM HCL調(diào)pH值為7. 4得到酶稀釋液。J)將濃縮酶結(jié)合物以I : 2000的比例加入到上述酶稀釋液中充分混勻即可。實(shí)驗(yàn)ー用抗T4-HRP酶結(jié)合物溶液(I 2000)檢測(cè)血清或血漿標(biāo)本中的T4，采用如下步驟(I)在已包被T4_IgG抗原的微孔板中依次加入標(biāo)本50ul，同時(shí)做兩孔陰性對(duì)照、一孔陽性對(duì)照、一孔空白對(duì)照，然后每孔(除空白對(duì)照孔外)加入本發(fā)明實(shí)施例I制備的抗T4-HRP酶結(jié)合物溶液50ul，置37°C孵育30分鐘。(2)棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗板5次。(3)各孔加底物溶液A 50ul，底物液B 50ul，置37°C孵育15分鐘。(4)各孔加終止液50ul,終止反應(yīng)。(5)將反應(yīng)板置酶標(biāo)儀比色計(jì)450nm波長(zhǎng)處用空白孔校零，讀取各孔OD值。(6)計(jì)算，CutOff值=(陰性對(duì)照平均OD值+陽性對(duì)照平均OD值)X0. 5。(7)結(jié)果判斷標(biāo)本OD值小于CutOff值為陽性，大于或等于CutOff值為陰性。在已包被T4_IgG抗原的微孔板中加入經(jīng)系列稀釋的抗體，按照常規(guī)反應(yīng)過程進(jìn)行試驗(yàn)，分別對(duì)比傳統(tǒng)甲狀腺素酶結(jié)合物和本發(fā)明酶結(jié)合物，加顯色劑顯色，用2M硫酸溶液終止反應(yīng)后，在酶標(biāo)儀上讀數(shù)，結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.ー種甲狀腺素酶聯(lián)免疫體外診斷試劑盒中酶結(jié)合物稀釋液的制備方法，包括以下步驟，在500ml蒸餾水中依次加入下列物質(zhì) A)配制緩沖液，pH值為7.0-8. 0 ； B)在上述緩沖液中加入明膠，濃度為0.3-1. 3g/L，加熱攪拌，使其充分溶解； C)加入BSA，濃度為0.5 -1. 5g/L，攪拌，使其充分溶解； D)加入解離劑，濃度為0.2-1. 2g/L，攪拌，使其充分溶解； E)加入Tween-20，濃度為0.lml/L-1. 2ml/L，攪拌，使其充分溶解； F)加入Proclin300，濃度為0.2-1. 2g/L，攪拌，使其充分溶解； G)加入酚紅I%的無水こ醇溶液1ml，終濃度為l_2ml/L，攪拌，使其充分溶解； H)待充分溶解后補(bǔ)足蒸餾水至IL； I)最后用IOMNaOH或IOM HCL調(diào)pH值為7. 0-8. 0得到酶稀釋液； J)將濃縮酶結(jié)合物以所需的比例加入到上述酶稀釋液中充分混勻即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的甲狀腺素酶聯(lián)免疫體外診斷試劑盒中酶結(jié)合物稀釋液的制備方法，其特征在于所述緩沖液為濃度為0. 05M-0. 2M PBS或濃度為0. 01-0. 2M Tris-HCL緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的甲狀腺素酶聯(lián)免疫體外診斷試劑盒中酶結(jié)合物稀釋液的制備方法，其特征在于所述解離劑為ANS解離劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的甲狀腺素酶聯(lián)免疫體外診斷試劑盒中酶結(jié)合物稀釋液的制備方法，其特征在于所述的酶結(jié)合物為使辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶與抗原或抗體通過化學(xué)交聯(lián)而成的復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種甲狀腺素酶聯(lián)免疫體外診斷試劑盒中酶結(jié)合物稀釋液的制備方法，其步驟為在500ml的蒸餾水中依次加入下列試劑，待前一種溶解后再加入后一種；Tris；HCL；明膠；BSA；ANS；Tween-20；Proclin300；酚紅；待充分溶解后補(bǔ)足蒸餾水至1L；用NaO或HCL調(diào)PH值為7.4。將濃縮酶結(jié)合物以所需的比例加入到上述酶稀釋液中充分混勻。本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，通過改進(jìn)酶聯(lián)免疫體外診斷試劑中的酶稀釋液來提高酶結(jié)合物的穩(wěn)定性，提高靈敏度。
文檔編號(hào)G01N33/535GK102645530SQ20121009959
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月6日
發(fā)明者曹紋野, 李子樵 申請(qǐng)人:上海藍(lán)怡科技有限公司