專利名稱：一種基于表面等離子共振技術(shù)的食品中生物毒素檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種食品中生物毒素檢測技木。特別是基于表面等離子體共振技木，通過核酸適配體與未標(biāo)記、標(biāo)記樣品進(jìn)行特異性競爭識別，采用分子探針適配體修飾的傳感元件間接檢測食品中生物毒素的方法。
背景技術(shù)：
食品中存在的生物毒素嚴(yán)重危害著人民身體健康，引起了人們的廣泛關(guān)注。生物毒素種類繁多，常見的生物毒素包括罐頭食品及密封腌潰食品中的肉毒桿菌神經(jīng)毒素、果仁中黃曲霉毒素和谷物中的赭曲霉素等，一般具有極強的毒性作用，中毒癥狀各異，可導(dǎo)致神經(jīng)麻痹、癌癥、肝毒性、腎損傷等。食品生產(chǎn)、加工、運輸與食用過程均有可能產(chǎn)生或感染生物毒素，導(dǎo)致嚴(yán)重的食品安全事故。因此，無論在食品安全監(jiān)測工作還是在醫(yī)學(xué)治療過程中，實現(xiàn)對食品中生物毒素的準(zhǔn)確、靈敏、快速、自動化檢測具有極其重要的意義。目前，針對生物毒素的檢測方法較多，主要涉及了生物測定法(細(xì)胞毒性法等)、理化分析法(熒光分析法和色譜及聯(lián)用技術(shù)等)、免疫法(酶聯(lián)免疫分析法、熒光免疫法和電化學(xué)免疫分析法等)。由于生物測定法具有操作繁瑣、費時等缺點，難以廣泛推廣；理化分析方法通常需要昂貴的儀器設(shè)備，對檢測原的要求也比較高，需要經(jīng)過復(fù)雜的樣品前處理才能進(jìn)行。因此，基于免疫法的生物毒素檢測技術(shù)得到了快速發(fā)展，代表性方法為酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)、免疫傳感器等。這些檢測技術(shù)是將生物毒素與其抗體特異性反應(yīng)，能夠快速、準(zhǔn)確的檢測出食品中存在的微量生物毒素。免疫分析是在表面等離子體共振檢測技術(shù)上的應(yīng)用時間最早、范圍最廣、發(fā)展也最為完善的領(lǐng)域之一，但是具有以下缺點(I)抗體需要動物實驗體內(nèi)篩選，抗體使用及存放時間短；(2)抗體的專ー性，導(dǎo)致檢測用的試劑盒和傳感器專ー性強，如針對赭曲霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒是無法檢測其它生物毒素。這些使得芯片重復(fù)使用性能較差、耗材需要量很大、檢測成本昂貴，極大地限制了表面等離子體共振檢測技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展。近年來，隨著適配體體外篩選和檢測技術(shù)的發(fā)展，特別是適配體相對抗體具有篩選簡單、穩(wěn)定性高、成本偏低，逐漸成為抗體的代替品。文獻(xiàn)報道，采用適配體檢測肉毒桿菌神經(jīng)毒素時，檢測限可達(dá)40pg/mL。因此，表面等離子體共振技術(shù)結(jié)合適配體檢測成為近十年來熱門研究方向，與常規(guī)檢測技術(shù)相比，其具有高靈敏度、響應(yīng)快、體積小、無須標(biāo)記、可保持分子的生物活性等優(yōu)點。檢測方法包括直接檢測和競爭檢測法前者直接在傳感芯片上固定相應(yīng)生物毒素的適配體，當(dāng)生物毒素樣品流過時，通過檢測光學(xué)信號變化確定含量。該方法簡單易操作，但對于分子量為幾百Da的生物毒素，無法檢測信號。競爭法需要在傳感器表面固定待測生物毒素，在樣品中加入過量的該生物毒素的適配體進(jìn)行競爭抑制，當(dāng)樣品流經(jīng)傳感器時，可以特異性的吸附未與生物毒素結(jié)合的多余適配體，由于抗體分子量很大(幾萬 幾十萬Da)，從而極大地增強檢測信號，目前被廣泛采用。但傳感芯片的專ー性問題仍然存在，如采用表面等離子體共振原理檢測的儀器BIACore，其常用傳感器芯片CM5成本為2000多元人民幣。專利報道，采用抗體二次競爭抑制表面等離子體共振技術(shù)可解決芯片專ー性問題，但其使用免疫分析檢測抗生素，抗體造價昂貴，芯片使用及存放時間短，且二次競爭抑制要求抗體和待測抗生物均過量，造成檢測成本升高
發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有表面等離子體技術(shù)在檢測食品中生物毒素時存在芯片專ー性、穩(wěn)定性差、耗材量大、造價昂貴等問題，同時極大提高生物毒素檢測限，本發(fā)明提供了ー種食品中生物毒素的表面等離子體共振檢測方法。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種應(yīng)用表面等離子體共振儀的食品中生物毒素檢測方法，利用同一傳感芯片對不同生物毒素的含量進(jìn)行檢測；包括以下步驟
(一)傳感芯片表面適配體固定選擇鏈霉親和素SA修飾的傳感芯片，通過通入5-50 L濃度為l-50ii g/L已標(biāo)記生物素的標(biāo)記分子探針適配體，在表面等離子體傳感芯片上固定上標(biāo)記分子探針適配體；
(ニ)對待測生物毒素進(jìn)行分子探針標(biāo)記，標(biāo)記方法根據(jù)待測物基團(tuán)不同，選擇EDC/NHS法交聯(lián)羧基與氨基或戊ニ醛法交聯(lián)兩個氨基；
(三)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制用0.01-0. lmol/L (pH = 7. 4)的磷酸鹽緩沖液配置生物毒素的標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備液，儲備液濃度為0. Ing/mL至lmg/mL,用磷酸鹽緩沖液將儲備液配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取不同濃度未標(biāo)記待測生物毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液和分子探針標(biāo)記的待測生物毒素充分混合后，競爭結(jié)合生物毒素相應(yīng)的適配體或納米粒子修飾的適配體，其中分子探針標(biāo)記的生物毒素量應(yīng)不少于加入的適配體量；
(四)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線采用表面等離子共振譜儀測量，以0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液為測量基準(zhǔn)，通過微泵通入5-100 u L待測混合樣品，記錄下表面等離子體共振儀光譜圖，通過檢測分子探針的含量，間接檢測生物毒素含量；取不同濃度待測樣品的表面等離子體共振譜圖穩(wěn)定值，繪制工作曲線，并進(jìn)行多項式曲線擬合，獲得回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(五)定量檢測對于未知含量的生物毒素樣品進(jìn)行檢測，同樣按照步驟(三)進(jìn)行；采用表面等離子體共振檢測儀記錄生物毒素的光譜圖；將光譜圖中穩(wěn)定值代入相應(yīng)的回歸曲線方程，計算出食品中生物毒素的濃度值；
(六)通入0.01-0. 05mol/L (pH為2_3)的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，沖洗傳感芯片表面，進(jìn)行傳感元件再生，用于其它生物毒素的檢測。所述分子探針包括線粒體tyrosyl-tRNA合成酶、蛋白激酶MEKI、Rho蛋白等多肽或蛋白質(zhì)，標(biāo)記方法包括EDC/NHS法或戊ニ醛法?？梢圆捎煤怂徇m配體為識別分子，核酸適配體序列與待測物直接相關(guān)。所述步驟(一)傳感器表面適配體固定，包括如下步驟
(1)將鏈霉親和素SA修飾的傳感芯片插入表面等離子體共振檢測儀中，在工作通道中進(jìn)行在線傳感表面修飾；
(2)通入0.02mol/L (pH = 7. 4)的磷酸鹽緩沖液；
(3)通入5-50u L濃度為1-50 u g/L生物素修飾的分子探針適配體溶液，進(jìn)行在線偶聯(lián)
至基線穩(wěn)定；
(4)重復(fù)步驟(2)至(3)，獲得分子探針適配體修飾的傳感芯片。
可以采用分子探針標(biāo)記待測物，與未標(biāo)記樣品一起與核酸適配體發(fā)生特異性競爭識別。所述步驟(三)中納米粒子可以是金屬納米粒子或磁性納米粒子或高分子化合物。所述步驟(四)和(五)中通過檢測分子探針的含量，間接檢測生物毒素的濃度值，提高表面等離子體傳感芯片的可重復(fù)利用性，適用于各種生物毒素的檢測。本發(fā)明的有益效果
(1)本發(fā)明解決芯片專一‘丨生差問題，引入線粒體tyrosyl-tRNA合成酶、蛋白激酶MEKI、Rho蛋白等多肽或蛋白質(zhì)作為標(biāo)記分子，采用標(biāo)記分子的適配體對表面等離子體共振傳感芯片進(jìn)行修飾，將待測生物毒素的測量轉(zhuǎn)換為對標(biāo)記分子的測量，實現(xiàn)傳感芯片的通 用性，可對食品中不同生物毒素進(jìn)行分子標(biāo)記后測量。具體檢測原理見附圖I ;
(2)本發(fā)明解決芯片穩(wěn)定性差問題，采用適配體作為芯片表面通用配體，再生容易。相對抗體可重復(fù)使用性強，極大地延長了芯片的使用壽命，降低檢測成本；
(3)本發(fā)明解決試劑消耗量大問題，采用待測樣品生物毒素與分子標(biāo)記的生物毒素混合后，加入適量的生物毒素適配體，即可進(jìn)行競爭結(jié)合。相對于以往的競爭抑制結(jié)合思想，無須加入過量的適配體，既實現(xiàn)了響應(yīng)信號放大，也節(jié)省了試劑消耗；
(4)本發(fā)明提高了檢測靈敏度，操作中可選用納米粒子修飾的生物毒素適配體，基于表面等離子體共振檢測時，信號顯著增加。


圖I是本發(fā)明所述的生物毒素檢測原理圖；其中&為食品中生物毒素，g為蛋白質(zhì)標(biāo)記的生物毒素，_為生物毒素適配體，Ij為蛋白激酶MEKI適配體，，為金屬納米粒子。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作以詳細(xì)描述。實施例具體實例分子探針以蛋白激酶MEKI為例，選擇兩種食品中生物毒素肉毒桿菌神經(jīng)毒素和黃曲霉毒素為檢測對象，具體操作步驟如下
(1)傳感器表面適配體固定選擇鏈霉親和素SA修飾的傳感芯片，通過通入20y L濃度為30 u g/L已標(biāo)記生物素的蛋白激酶MEKI適配體，在表面等離子體傳感芯片上固定上蛋白激酶MEKI適配體；
(2)分子標(biāo)記物偶聯(lián)將待測物通過戊ニ醛法與蛋白激酶MEKI進(jìn)行偶聯(lián)標(biāo)記，標(biāo)記方法根據(jù)待測物基團(tuán)不同選擇，包括EDC/NHS法、戊ニ醛法等，如肉毒桿菌神經(jīng)毒素，可采用EDC/NHS法與蛋白激酶MEKI連接，待用；
(3)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制稱取肉毒桿菌神經(jīng)毒素標(biāo)準(zhǔn)品10mg，溶解于0. 01 mol/L (pH =7. 4) HEPBS緩沖液定容至10 mL,即為I mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；用磷酸鹽緩沖液將儲備液配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度在pg/mL"ng/mL級，依次為Opg/mL, 20pg/mL, 500pg/mL,2ng/mL,4ng/mL,6ng/mL ；
(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制將上述濃度為Ong/mL未標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)溶液與適量的蛋白激酶MEKI標(biāo)記的肉毒桿菌神經(jīng)毒素溶液充分混合；再加入肉毒桿菌神經(jīng)毒素相應(yīng)的適配體或納米粒子修飾的適配體，其中蛋白激酶MEKI標(biāo)記的肉毒桿菌神經(jīng)毒素量應(yīng)不少于加入的適配體量；采用表面等離子共振譜儀測量，通入0. 01mol/L (pH = 7. 4) HEPBS緩沖液作為測量基準(zhǔn)，然后泵入待測混合樣品，待表面等離子體共振響應(yīng)值穩(wěn)定后，記錄表面等離子體共振光譜 (5)通入0.02mol/L(pH = 2. 4)甘氨酸-鹽酸溶液，沖洗傳感芯片表面，破壞蛋白激酶MEKI與適配體的結(jié)合，完成傳感元件再生；
(6)濃度由低到高，依次通入其他濃度(20pg/mL-6ng/mL)的待測標(biāo)準(zhǔn)樣品測量方法同
(4)，獲得相應(yīng)表面等離子體共振光譜圖；取肉毒桿菌神經(jīng)毒素的表面等離子體譜圖穩(wěn)定值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行多項式曲線擬合，獲得濃度-穩(wěn)定值關(guān)系回歸曲線方程；
(7)傳感芯片再生后，將實際未知濃度待測樣品按步驟(4)與蛋白激酶MEKI標(biāo)記的肉毒桿菌神經(jīng)毒素溶液充分混合；泵入的表面等離子體共振譜儀中，同時記錄肉毒桿菌神經(jīng)毒素的光譜圖，確定相應(yīng)穩(wěn)定值，代入各自標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定各組分含量，檢測限可達(dá)Pg/mL^ng/mL級,低于國家規(guī)定的最高允許含量；
(8)再次通入0.02mol/L (pH = 2. 4)甘氨酸-鹽酸溶液,沖洗表面等離子體共振傳感芯片，進(jìn)行芯片再生，用于黃曲霉毒素檢測；將適配體變換為黃曲霉毒素適配體，而肉毒桿菌神經(jīng)毒素-蛋白激酶MEKI偶聯(lián)物變?yōu)辄S曲霉毒-蛋白激酶MEKI偶聯(lián)物；黃曲霉毒檢測中步驟(3)中配制的溶液濃度改為 Opg/mL, 100pg/L, 500pg/L, 2ng/mL, 5ng/mL, I Ong/mL 檢測限可達(dá)到pg/mL ng/mL，低于國家規(guī)定的最高允許含量。本發(fā)明為了敘述的準(zhǔn)確和方便，在實施例中以肉毒桿菌神經(jīng)毒素和黃曲霉毒為例進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明同樣適用于食品中其他生物毒素的測定，如蓖麻毒素、河豚毒素等生物毒素的精確檢測和定性分析。傳感器表面再生所用溶液選擇0.02mol/L (pH = 2. 4)甘氨酸-鹽酸溶液，但還可以選擇鹽溶液或弱酸弱堿溶液或高離子強度電解質(zhì)溶液，如
0.5mol/L氫氧化鈉溶液或10 mmol/L甘氨酸/鹽酸緩沖溶液，破壞標(biāo)記分子探針與適配體的結(jié)合，因此上述內(nèi)容均在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。此外，根據(jù)實施例的方法進(jìn)行檢測樣品，與現(xiàn)有表面等離子體檢測技術(shù)相比，準(zhǔn)確度提高2 10倍，探頭壽命延長10倍以上，現(xiàn)有表面等離子體檢測技術(shù)不能準(zhǔn)確檢測的黃曲霉素等小分子量(〈1000Da)物質(zhì)，可以采用本發(fā)明的方法獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用表面等離子體共振儀的食品中生物毒素檢測方法，利用同一傳感芯片對不同生物毒素的含量進(jìn)行檢測；其特征在于包括以下步驟 (一)傳感芯片表面適配體固定選擇鏈霉親和素SA修飾的傳感芯片，通過通入5-50 L濃度為l-50ii g/L已標(biāo)記生物素的標(biāo)記分子探針適配體，在表面等離子體傳感芯片上固定上標(biāo)記分子探針適配體； (ニ)對待測生物毒素進(jìn)行分子探針標(biāo)記，標(biāo)記方法根據(jù)待測物基團(tuán)不同，選擇EDC/NHS法交聯(lián)羧基與氨基或戊ニ醛法交聯(lián)兩個氨基； (三)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制用0.01-0. lmol/L (pH = 7. 4)的磷酸鹽緩沖液配置生物毒素的標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備液，儲備液濃度為0. Ing/mL至lmg/mL,用磷酸鹽緩沖液將儲備液配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取不同濃度未標(biāo)記待測生物毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液和分子探針標(biāo)記的待測生物毒素充分混合后，競爭結(jié)合生物毒素相應(yīng)的適配體或納米粒子修飾的適配體，其中分子探針標(biāo)記的生物毒素量應(yīng)不少于加入的適配體量； (四)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線采用表面等離子共振譜儀測量，以0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液為測量基準(zhǔn)，通過微泵通入5-100 u L待測混合樣品，記錄下表面等離子體共振儀光譜圖，通過檢測分子探針的含量，間接檢測生物毒素含量；取不同濃度待測樣品的表面等離子體共振譜圖穩(wěn)定值，繪制工作曲線，并進(jìn)行多項式曲線擬合，獲得回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線； (五)定量檢測對于未知含量的生物毒素樣品進(jìn)行檢測，同樣按照步驟(三)進(jìn)行；采用表面等離子體共振檢測儀記錄生物毒素的光譜圖；將光譜圖中穩(wěn)定值代入相應(yīng)的回歸曲線方程，計算出食品中生物毒素的濃度值； (六)通入0.01-0. 05mol/L (pH為2_3)的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，沖洗傳感芯片表面，進(jìn)行傳感元件再生，用于其它生物毒素的檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述分子探針包括凝血酶或溶菌酶或免疫球蛋白E，標(biāo)記方法包括EDC/NHS法或戊ニ醛法。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于采用核酸適配體為識別分子，核酸適配體序列與待測物直接相關(guān)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(一)傳感器表面適配體固定，包括如下步驟 (1)將鏈霉親和素SA修飾的傳感芯片插入表面等離子體共振檢測儀中，在工作通道中進(jìn)行在線傳感表面修飾； (2)通入0.02mol/L (pH = 7.4)的磷酸鹽緩沖液； (3)通入5-50y L濃度為1-50 u g/L生物素修飾的分子探針適配體溶液，進(jìn)行在線偶聯(lián)至基線穩(wěn)定； (4)重復(fù)步驟(2)至(3)，獲得分子探針適配體修飾的傳感芯片。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于采用分子探針標(biāo)記待測物，與未標(biāo)記樣品一起與核酸適配體發(fā)生特異性競爭識別。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(三)中納米粒子可以是金屬納米粒子或磁性納米粒子或高分子化合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(四)和(五)中通過檢測分子探針的含量，間接檢測生物毒素的濃度值，提高表面等離子體傳感芯片的可重復(fù)利用性，適用于各種生物毒素的檢測
全文摘要
一種基于表面等離子共振技術(shù)的食品中生物毒素的檢測方法，屬于食品安全危害因子檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括傳感表面適配體固定、樣品標(biāo)記、樣品檢測、傳感元件再生四個步驟，利用同一傳感芯片對不同生物毒素的含量進(jìn)行檢測；其特征在于采用傳感芯片表面連接標(biāo)記分子探針相應(yīng)的適配體；對食品樣品進(jìn)行一系列預(yù)處理，加入分子探針標(biāo)記的生物毒素，混合后競爭結(jié)合金屬納米粒子修飾的生物毒素相應(yīng)的適配體；利用表面等離子體共振檢測儀檢測分子探針的含量，間接檢測生物毒素；并對傳感芯片進(jìn)行再生，用于檢測其它生物毒素。本發(fā)明傳感芯片上用于識別分子的適配體與傳統(tǒng)抗體相比，具有穩(wěn)定性高、響應(yīng)快速、操作簡便的特點，不僅大大延長了芯片的使用壽命，也顯著提高了檢測靈敏度，并實現(xiàn)了同一表面等離子體共振傳感芯片對食品中各種生物毒素的檢測。
文檔編號G01N21/55GK102628802SQ20121011073
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者王利兵, 蘇榮欣, 韓偉 申請人:王利兵