專利名稱：一種紫薇屬植物莖尖染色體制片方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物染色體制片方法，具體涉及紫薇屬莖尖染色體制片方法。
背景技術(shù)：
紫薇屬植物(Lagerstroemia)隸屬于千屈菜科(Lythraceae),其主要種如大花紫薇、尾葉紫薇等都是我國夏季重要的觀賞花木。與其他園林花卉相比，紫薇屬染色體研究要落后很多，且該屬植物多為中小染色體，不易染色，經(jīng)典的細胞學(xué)手段難以識別其染色體，從而限制了深入理解紫薇屬分子細胞遺傳學(xué)機制研究的進行。因紫薇屬植物多為非整倍體且染色體較小(Graham and Cavalcanti, 2001),所以此屬植物染色體數(shù)目報道不統(tǒng)一，Bowden認為紫薇與大花紫薇染色體數(shù)目均為2n =50 (Bowden, 1945) ;Guha卻認為其染色體數(shù)目僅為2n = 48 (Guha，1972).國內(nèi)幾種重要染色體圖譜中對紫薇屬植物染色體數(shù)目記載也各不相同，主要集中在2n = 50或2n = 48.宋平(2009)、童俊(2009)等在紫薇多倍體倍性鑒定時均采用常規(guī)壓片法，目前尚未有人對紫薇染色體的制片技術(shù)進行系統(tǒng)研究。紫薇屬植物由于細胞壁較厚且染色體小而多，使用常規(guī)壓片法時會因預(yù)處理液及解離液的毒害作用而使染色體更加短縮，并且在壓片過程中染色體易重疊，不易獲得清晰分裂相，難以達到熒光原位雜交實驗所需染色體的標準，不利于實驗的進行。因此，使用常規(guī)壓片方法制得的染色體壓片只能用于常規(guī)觀察計數(shù)及初歩核型分析，無法通過熒光原位雜交進行精確核型分析，迫切需要一種新的染色體制片技術(shù)，其制片能夠滿足熒光原位雜交精確核型分析的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種紫薇屬莖尖染色體制片方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明提供ー種紫薇屬植物(Lagerstroemia)莖尖生長點染色體制片方法,包括以下步驟(I)取紫薇屬莖尖生長點于固定液中固定；(2)將固定后的莖尖生長點用蒸餾水洗凈轉(zhuǎn)移至前低滲溶液處理；(3)蒸餾水洗凈吸干水分，于混合酶液中酶解；(4)將酶解后的莖尖生長點用蒸餾水潤洗，低滲處理；(5)將低滲處理后的莖尖置于載玻片，滴加步驟(I)所述的固定液，壓碎莖尖，烤干載玻片；再次滴加固定液，再次烤干；冷卻后滴加熒光染液染色；滴加熒光封片液。其中，步驟(I)為選取紫薇屬一年生枝條莖尖生長點或初冬修剪經(jīng)冷藏處理的枝條水培后新發(fā)出的莖尖生長點最內(nèi)側(cè)長度為0. 5 I. Ocm的莖尖部分。
其中，步驟⑴的取材時間優(yōu)選為上午9:00 11:00。其中，步驟(I)固定液其配方為無水こ醇冰醋酸三氯甲烷體積比為5こ3こ2。所述冰醋酸、三氯甲烷均為分析純。其中，步驟⑴固定時間為18 24h。其中，步驟(I)固定條件優(yōu)選為-20°C。其中，步驟⑵前低滲溶液為0. 075mol/L的KCl。其中，步驟⑵前低滲溶液處理時間為20 30min。優(yōu)選地，前低滲溶液處理時間為30min其中，步驟(3)混合酶液為2. 5%纖維素酶2. 5%的果膠酶0.01%蛋白酶K按體積比2 I 3配制得到。其中，步驟(3)酶解條件為37°C水浴酶解4 5h。其中，步驟(4)低滲處理的時間為20 30min。優(yōu)選地，低滲處理時間為30min。步驟⑷采用雙蒸水進行低滲處理。其中，步驟(5)的第一次烤干載玻片前，是將壓碎莖尖后，棄去大塊的組織，趁材料未干時加一滴固定液，使剩余組織均勻涂布于載玻片上，酒精燈火焰上微微加熱烤干。其中，步驟(5)所述的熒光染液為g/mL DAPI熒光染液，加入量為20y L，染色時間為IOmin。其中，步驟(5)中染色后，沖去染液，滴加熒光封片液，得到具有紫薇屬莖尖染色體的玻片。本發(fā)明提供了制的具有紫薇屬莖尖染色體的玻片。本發(fā)明提供了上述制片方法在紫薇屬基因組功能學(xué)中的應(yīng)用。本發(fā)明采用火焰法制片，省去常規(guī)制片方法中預(yù)處理、解離、染色壓片過程，通過直接固定，提高制片效率，避免預(yù)處理液及解離液對染色體的毒害作用，維持染色體原始形態(tài)，同時擴大了紫薇屬染色體制片的取材范圍。本發(fā)明提供了紫薇屬莖尖染色體壓片中各處理的最佳時間，找到了最適合紫薇屬的染色體制片技術(shù)，克服了現(xiàn)有技術(shù)中壓片過程中染色體易重疊，不易獲得清晰分裂相等問題。同時，本發(fā)明的火焰干燥法沒有染色和壓片過程，這樣在熒光原位雜交過程中避免了染色體結(jié)構(gòu)遭到破壞，并免去了低溫掀蓋玻片過程，能夠完好保存所有分裂相，保證良好的分裂相用于后期熒光原位雜交實驗。


圖I:本發(fā)明方法制得的屋久島紫薇一年生枝條莖尖生長點染色體玻片100倍油鏡鏡檢圖。圖2:本發(fā)明方法制得的福建紫薇一年生枝條莖尖生長點染色體玻片100倍油鏡鏡檢圖。圖3:常規(guī)壓片法制得的屋久島紫薇一年生枝條莖尖生長點染色體玻片100倍油鏡鏡檢圖。圖4:常規(guī)壓片法制得的福建紫薇一年生枝條莖尖生長點染色體玻片100倍油鏡鏡檢圖。具體實施例方式以下實施例進ー步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。若未特別指明，實施例中所用試劑為市售。實施例I本發(fā)明紫薇屬屋久島紫薇莖尖染色體制 片方法紫薇屬屋久島紫薇屋久島紫薇栽植于國家花卉中心(北京小湯山)種質(zhì)資源圃，于早上9:00取一年生植株莖尖生長點最內(nèi)側(cè)長度為0. 5cm的莖尖部分。直接放入固定液(按體積比，無水こ醇冰醋酸(分析純)三氯甲烷(分析純)=5 : 3 : 2)中于-20°C冰箱中固定18h。實驗前取出，于蒸餾水中潤洗洗凈固定液，轉(zhuǎn)移至0. O75mol/LKC1溶液中前低滲30min ;將前低滲處理后的莖尖生長點用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，放入混合酶液中于37°C水浴酶解4h，混合酶液為2. 5%纖維素酶2. 5%的果膠酶0. 01%蛋白酶K = 2 I 3(體積比)。酶解后，用蒸餾水潤洗，使用ddH20進行后低滲30min;取ー張干凈的載玻片，用鑷子夾取適量莖尖置于其上，加一滴前述改良的固定液，迅速用鑷子將莖尖壓碎，夾去大塊組織，趁材料未干時馬上加一滴固定液，用鑷子將剰余材料均勻涂布在載玻片上，在酒精燈火焰上微微加熱烤干.然后迅速再滴加一滴固定液，在酒精燈上再次烤干。冷卻后向載玻片上滴加20 ii L 2u g/mL DAPI熒光染液，染色IOmin流水沖去染液，加一滴抗淬滅熒光封片液，置于熒光顯微鏡下觀察。鏡檢效果在100倍油鏡的情況下，有60%的細胞分裂相，染色體清晰可見且分散良好，長度適宜，可以計數(shù)。結(jié)果見圖I。實施例2本發(fā)明紫薇屬福建紫薇莖尖染色體制片方法紫薇屬福建紫薇福建紫薇栽植于國家花卉中心(北京小湯山)種質(zhì)資源圃，于早上11:00取初冬修剪經(jīng)冷藏處理的枝條水培后新發(fā)出的莖尖生長點最內(nèi)側(cè)長度為I. Ocm的莖尖部分。直接放入固定液按體積比，無水こ醇冰醋酸(分析純)三氯甲烷(分析純)=5 : 3 : 2中于-20°C冰箱中固定24h。實驗前取出，于蒸餾水中潤洗洗凈固定液，轉(zhuǎn)移至0. O75mol/LKC1溶液中前低滲20min ;將前低滲處理后的莖尖生長點用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，放入混合酶液中于37°C水浴酶解5h，混合酶液為2. 5%纖維素酶2. 5%的果膠酶0.01%蛋白酶K = 2 I 2 (體積比)。酶解后，用蒸餾水潤洗，使用ddH20進行后低滲20min;取一張干凈的載玻片，用鑷子夾取適量莖尖置于其上，加一滴固定液，迅速用鑷子將莖尖壓碎，夾去大塊組織，趁材料未干時馬上加一滴固定液，用鑷子將剰余材料均勻涂布在載玻片上，在酒精燈火焰上微微加熱烤干.然后迅速再滴加一滴固定液，在酒精燈上再次烤干。冷卻后向載玻片上滴加20 ii L 2 ii g/mL DAPI熒光染液，染色IOmin流水沖去染液，加一滴突光封片液，置于突光顯微鏡下觀察。鏡檢效果在100倍油鏡的情況下，有50%的細胞分裂相，染色體清晰可見且分散良好，長度適宜，可以計數(shù)。結(jié)果見圖2。實施例3常規(guī)壓片法紫薇屬屋久島紫薇染色體制片方法采用常規(guī)壓片法進行制片。紫薇屬屋久島紫薇，于早上9:00取種子萌發(fā)的根尖。放入0. 002mol/L 8-羥基喹啉中20_25°C室溫預(yù)處理3h。然后用蒸餾水洗凈根尖，轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液(無水こ醇冰こ酸=3 1)4°C保存過夜。實驗前取出，于蒸餾水中潤洗洗凈固定液，轉(zhuǎn)移至0. O75mol/LKC1溶液中前低滲30min ;將前低滲處理后的根尖用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，放入濃鹽酸與こ醇混合液(I I)中于室溫下解離Ih 20min;解離后，用蒸餾水潤洗，使用ddH20進行后低滲30min ;卡寶品紅溶液染色30min后壓片觀察染色體制片效果。鏡檢效果在100倍油鏡的情況下，有30%的細胞分裂相，染色體清晰可見，分散程度一般，可以計數(shù)。結(jié)果見圖3。實施例4常規(guī)壓片法紫薇屬福建紫薇染色體制片方法采用常規(guī)壓片法進行制片。紫薇屬福建紫薇，于早上11:00取種子萌發(fā)的根尖。放入0. 002mol/L 8-羥基喹啉中20_25°C室溫預(yù)處理3h。然后用蒸餾水洗凈根尖，轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液(無水こ醇冰こ酸=3 I)4°C保存過夜。實驗前取出，于蒸餾水中潤洗洗浄固定液，轉(zhuǎn)移至0. O75mol/LKC1溶液中前低滲30min ;將前低滲處理后的根尖用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，放入濃鹽酸與こ醇混合液(I I)中于室溫下解離Ih IOmin;解離后，用蒸餾水潤洗，使用ddH20進行后低滲30min ;卡寶品紅溶液染色30min后壓片觀察染色體制片效果。鏡檢效果在100倍油鏡的情況下，有20%的細胞分裂相，染色體清晰可見，分散程度一般，可以計數(shù)，結(jié)果見圖4。通過比較實施例1-4的制片效果，發(fā)現(xiàn)使用常規(guī)壓片法時會因預(yù)處理液及解離液的毒害作用而使染色體更加短縮，而且壓片過程中染色體易重疊，不易獲得清晰分裂相，只能用于常規(guī)觀察計數(shù)及初歩核型分析.本發(fā)明的火焰法制片省去預(yù)處理、解離、染色壓片過程，直接固定，提高制片效率，避免預(yù)處理液及解離液對染色體的毒害作用，維持染色體原始形態(tài)，獲得更好的分裂相。同時，火焰干燥法沒有染色和壓片過程，這樣在熒光原位雜交過程中避免了染色體結(jié)構(gòu)遭到破壞，并免去了低溫掀蓋玻片過程，能夠完好保存所有分裂相，保證良好的分裂相用于后期雜交實驗。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。權(quán)利要求
1.ー種紫薇屬植物(Lagerstroemia)莖尖生長點染色體制片方法,包括以下步驟 1)取紫薇屬莖尖生長點于固定液中固定； 2)將固定后的莖尖生長點用蒸餾水洗凈轉(zhuǎn)移至前低滲溶液處理； 3)蒸餾水洗凈吸干水分，于混合酶液中酶解； 4)將酶解后的莖尖生長點用蒸餾水潤洗，低滲處理； 5)將低滲處理后的莖尖置于載玻片，滴加步驟I)所述的固定液，壓碎莖尖，烤干載玻片；再次滴加固定液，再次烤干；冷卻后滴加熒光染液染色；滴加熒光封片液。
2.如權(quán)利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述步驟I)為選取紫薇屬一年生枝條莖尖生長點或初冬修剪經(jīng)冷藏處理的枝條水培后新發(fā)出的莖尖生長點最內(nèi)側(cè)長度為0.5 I. Ocm的莖尖部分。
3.如權(quán)利要求2所述的制片方法，其特征在于，所述步驟I)取材時間為上午9:00 11:00。
4.如權(quán)利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述步驟I)固定液其配方為無水こ醇冰醋酸三氯甲烷體積比為5:3:2。
5.如權(quán)利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述步驟I)固定時間為18 24h。
6.如權(quán)利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述步驟2)前低滲溶液處理時間為20 30mino
7.如權(quán)利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述步驟3)混合酶液為2.5%纖維素酶2. 5%的果膠酶0.01%蛋白酶K按體積比2 I 2-3配制得到。
8.如權(quán)利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述步驟3)酶解條件為37°C水浴酶解4 5h。
9.如權(quán)利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述步驟4)低滲處理的時間為20 30mino
10.權(quán)利要求1-9任一所述的制片方法在紫薇屬基因組功能學(xué)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紫微屬植物莖尖生長點染色體制片方法。本發(fā)明方法選取紫薇屬植物一年生枝條莖尖生長點或初冬修剪經(jīng)冷藏處理的枝條水培后新發(fā)出的莖尖生長點最內(nèi)側(cè)長度為0.5～1.0cm的部分，依次經(jīng)固定液(按體積比乙醇∶冰醋酸∶三氯甲烷＝5∶3∶2)固定、前低滲處理、混合酶液酶解后低滲處理，火焰干燥法制片。本發(fā)明的染色體制片方法省去預(yù)處理、解離、染色壓片過程，直接固定，提高制片效率，避免預(yù)處理液及解離液對染色體的毒害作用，維持染色體原始形態(tài)，獲得更好的染色體分散效果，同時擴大了紫薇屬植物染色體制片的取材范圍及時間。本發(fā)明方法的制片能夠用于熒光原位雜交實驗，為紫薇屬基因組的進一步研究奠定良好基礎(chǔ)。
文檔編號G01N1/28GK102645360SQ20121011191
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月16日
發(fā)明者孫明, 張啟翔, 楊冰潔, 潘會堂, 王佳, 程堂仁 申請人:北京林業(yè)大學(xué)