專利名稱：基于表面活性劑修飾連接鞘糖脂的復(fù)合納米材料定量檢測(cè)病毒及酶的生物傳感方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于ー種基于表面活性劑修飾連接鞘糖脂的納米金團(tuán)聚的生物分析技木，其具體涉及基于表面活性劑修飾納米金顆粒連接鞘糖脂類分子的修飾方法；鞘糖脂類修飾納米金顆粒與相關(guān)病毒及酶的特異反應(yīng)；特異反應(yīng)引起納米金顆粒團(tuán)聚反應(yīng)，產(chǎn)生紫外可見吸收光度的變化，定量分析檢測(cè)相關(guān)病毒及酶，及其在實(shí)際分析中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
病毒及酶的快速檢測(cè)對(duì)于生物學(xué)研究、藥物篩選等領(lǐng)域具有極其重要的意義。目 前常用的檢測(cè)技術(shù)是基于病毒或酶催化反應(yīng)中副產(chǎn)物的檢測(cè)以及直接檢測(cè)修飾產(chǎn)物，檢測(cè)方法主要有熒光標(biāo)記示蹤分析，免疫吸附分析，PCR法以及質(zhì)譜法等。這些檢測(cè)技術(shù)靈敏度不高、可靠性差，且需要大型精密的儀器，不能滿足準(zhǔn)確快速檢測(cè)的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提出了一種基于表面活性劑修飾連接鞘糖脂的復(fù)合納米材料定量檢測(cè)病毒及酶的生物傳感方法。此方法可將鞘糖脂類直接作用于修飾表面活性劑的納米金表面，在與其相關(guān)病毒及酶的特異反應(yīng)后，通過紫外可見吸收光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。此方法操作簡(jiǎn)單、快速、通用性強(qiáng)，靈敏度高。本發(fā)明的技術(shù)方案是，將鞘糖脂類分子直接作用于修飾表面活性劑的納米金表面，利用病毒分子中的多個(gè)單體可同時(shí)與多個(gè)表面修飾鞘糖脂類分子的納米金顆粒發(fā)生特異性結(jié)合，引起納米金團(tuán)聚反應(yīng)，可引起紫外吸收光譜的變化用于定量分析檢測(cè)其相關(guān)病毒；而當(dāng)酶作用于鞘糖脂類分子的糖基片段時(shí)，能使片段斷裂，病毒的單體則不能再與鞘糖脂類分子發(fā)生作用，同樣引起相應(yīng)的紫外吸收光譜的變化，定量分析檢測(cè)其相關(guān)酶，即，當(dāng)表面修飾鞘糖脂類分子的納米金顆粒與其相關(guān)病毒作用吋，引起團(tuán)聚反應(yīng)；而加入相關(guān)酶吋，則阻斷了病毒與鞘糖脂類分子的作用，納米金不能團(tuán)聚。此時(shí)反應(yīng)終產(chǎn)物都能產(chǎn)生相應(yīng)的紫外可見吸收光度變化，可定量分析檢測(cè)相關(guān)病毒及酶。所述基于表面活性劑修飾連接鞘糖脂的復(fù)合納米材料定量檢測(cè)病毒及酶的生物傳感方法，包括如下步驟(I)鞘糖脂類分子修飾納米金顆粒；(2)鞘糖脂類修飾納米金顆粒與其相關(guān)病毒及酶的特異反應(yīng)；(3)特異反應(yīng)引起納米金顆粒團(tuán)聚反應(yīng)，產(chǎn)生紫外可見吸收光度的變化，定量分析檢測(cè)其相關(guān)病毒及酶。其中，所述的納米金顆粒是修飾有表面活性劑的納米金顆粒；其中，相關(guān)病毒及酶是指能與修飾有鞘糖脂類分子的納米金顆粒特異性結(jié)合的病毒及酶(如霍亂毒素、β -糖苷酶等)。以下對(duì)本發(fā)明做出進(jìn)ー步說明。
I、鞘糖脂類分子修飾納米金顆粒a、冰水浴中新鮮配制的O. IM NaBH4在攪拌狀態(tài)下加入到4% HAuCl4與O. OlM檸檬酸鈉混合物中，制備成種子液備用。4% HAuCl4溶液中加入表面活性劑，攪拌狀態(tài)下加熱制成生長(zhǎng)液。將種子液加入到生長(zhǎng)液中，攪拌混合，制備成合適尺寸的表面修飾表面活性劑的納米金溶液。將合成好的納米金溶液與PB(50mM ；pH = 7. 4)混合后，于超高速冷凍離心機(jī)中濃縮離心洗漆三次(4°C ；10000r/min ;15min)。
b、將鞘糖脂類溶液加入到a液中，持續(xù)攪拌(25°C ;120r/min)，使鞘糖脂類分子直接修飾到納米金顆粒上(避光，備用)。2、鞘糖脂類分子修飾納米金顆粒與其相關(guān)病毒及酶的特異反應(yīng)a、將鞘糖脂類分子修飾的納米金溶液與反應(yīng)buffer混合，離心洗滌兩次(4°C ；10000r/min ；15min)后，加入其相關(guān)病毒于37°C恒溫水浴下反應(yīng)lOmin。b、將鞘糖脂類分子修飾納米金溶液與反應(yīng)buffer混合，離心洗滌兩次(4°C ；10000r/min ；15min)后,加入相關(guān)酶于37°C恒溫水浴下反應(yīng)lOmin。之后，再加入相關(guān)病毒于37°C恒溫水浴下反應(yīng)IOmin。3、特異反應(yīng)引起納米金顆粒團(tuán)聚反應(yīng)，產(chǎn)生紫外可見吸收光度的變化，定量分析檢測(cè)相關(guān)病毒及酶a、病毒的定量分析檢測(cè)步驟將鞘糖脂類分子修飾納米金溶液與相關(guān)病毒反應(yīng)，最終產(chǎn)物(60 μ L)轉(zhuǎn)移到微量石英比色皿中，放入紫外光譜儀，監(jiān)測(cè)400nm到800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)其紫外吸收強(qiáng)度。b、酶的定量分析檢測(cè)步驟將鞘糖脂類分子修飾納米金溶液與相關(guān)酶反應(yīng)后，再加入相關(guān)病毒反應(yīng)，最終產(chǎn)物(60μυ轉(zhuǎn)移到微量石英比色皿中，放入紫外光譜儀，監(jiān)測(cè)400nm到800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)其紫外吸收強(qiáng)度。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :基于神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)修飾的復(fù)合納米材料定量檢測(cè)霍亂毒素(CTB)的生物傳感方法I)基于神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)修飾納米金顆粒方法a、冰水浴中新鮮配制的60uL O. IMNaBH4在攪拌狀態(tài)下加入到2mL4% HAuCl4與O. OlM檸檬酸鈉混合物中，制備成種子液備用。4% HAuCl4溶液中加入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，攪拌狀態(tài)下加熱制成生長(zhǎng)液。將種子液加入到生長(zhǎng)液中，攪拌混合，制備成顆徑約為IOnm左右的納米金溶液。將合成好的納米金溶液與PB (50mM ；pH = 7. 4)混合后，濃縮離心洗漆三次(4°C ；10000r/min ；15min)。b、將IOul O. 64mM GMl加入到CTAB修飾的納米金溶液中，持續(xù)攪拌(25°C; 120r)，使GMl直接修飾到納米金顆粒上。2) GMl修飾納米金顆粒與霍亂毒素(CTB)的特異反應(yīng)步驟在20ul GMl修飾的納米金溶液加入不同濃度CTB (60pM 220nM)，于37°C恒溫水浴下反應(yīng)IOmin。3)特異反應(yīng)引起納米金顆粒團(tuán)聚反應(yīng)，產(chǎn)生紫外可見吸收光度的變化，定量分析檢測(cè)霍亂毒素(CTB)的步驟將20ul神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)修飾納米金溶液與5ul不同濃度霍亂毒素(CTB)(60pM 220nM)反應(yīng)最終產(chǎn)物(超純水定容60yL)轉(zhuǎn)移到微量石英比色皿中，放入紫外光譜儀，監(jiān)測(cè)400nm到800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)其紫外吸收強(qiáng)度。實(shí)施例2:基于神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)修飾復(fù)合納米材料定量檢測(cè)β_糖苷酶(β -galactosidase)的生物傳感方法I)基于神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)修飾納米金顆粒方法a、冰水浴中新鮮配制的60uL O. IMNaBH4在攪拌狀態(tài)下加入到2mL4% HAuCl4與O. OlM檸檬酸鈉混合物中，制備成種子液備用。4% HAuCl4溶液中加入十六烷基三甲基溴化 銨(CTAB)，攪拌狀態(tài)下加熱制成生長(zhǎng)液。將種子液加入到生長(zhǎng)液中，攪拌混合，制備成顆徑約為IOnm左右的納米金溶液。將合成好的納米金溶液與PB (50mM ；pH = 7. 4)混合后，濃縮離心洗漆三次(4°C ；10000r/min ；15min)。b、將IOul O. 64mM GMl加入到CTAB修飾的納米金溶液中，持續(xù)攪拌(25°C; 120r)，使GMl直接修飾到納米金顆粒上。2) GMl修飾納米金顆粒與β -糖苷酶及霍亂毒素(CTB)的特異反應(yīng)步驟a、于在20ul GMl修飾的納米金溶液加入不同活度β -糖苷酶(β -galactosidase) (1U 510U),于 37°C恒溫水浴下反應(yīng) IOmin0b、再在反應(yīng)完成后的上述a液中加入IOul霍亂毒素(CTB)，繼續(xù)于37°C恒溫水浴下反應(yīng)IOmin03)特異反應(yīng)引起納米金顆粒團(tuán)聚反應(yīng)，產(chǎn)生紫外可見吸收光度的變化，定量分析檢測(cè)β-糖苷酶(β -galactosidase)的步驟將20ul神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)修飾納米金溶液與5ul不同活度β -糖苷酶(β -galactosidase) (1U 510U)反應(yīng)后，再與IOul CTB反應(yīng)，其最終產(chǎn)物(超純水定容 60 UL)轉(zhuǎn)移到微量石英比色皿中，放入紫外光譜儀，監(jiān)測(cè)400nm到800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)其紫外吸收強(qiáng)度。
權(quán)利要求
1.一種基于磷脂雙分子層膜包裹的納米顆粒團(tuán)聚的霍亂毒素的生物傳感方法，包括以下步驟 (1)制備磷脂雙分子層膜包裹的金納米顆粒探針，其中，磷脂雙分子層膜由GM1分子與磷脂分子共同形成； (2)CTB與受體GM1特異性結(jié)合反應(yīng)； (3)產(chǎn)物溶液的檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物傳感方法，其特征在于，步驟(I)所述的磷脂雙分子層膜的構(gòu)成成份中包含頭端修飾巰基的磷脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物傳感方法，其特征在于，步驟(3)所述的檢測(cè)方法是利用紫外可見光吸收分析技術(shù)對(duì)產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物傳感方法，其特征在于，步驟(I)所述的納米顆粒探針是修飾有拉曼染料的納米顆粒探針；步驟(3)所述的檢測(cè)方法是利用SERS分析技術(shù)對(duì)產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種定量分析霍亂毒素的生物傳感方法，制備了拉曼染料修飾的磷脂雙分子層膜包裹的金納米顆粒探針，選用功能化磷脂，即頭端修飾巰基的磷脂，它能共價(jià)結(jié)合在金納米顆粒表面，使金納米顆粒探針的穩(wěn)定性得到了提高?；魜y毒素B亞單元(CTB)與多個(gè)受體GM1分子特異性結(jié)合，導(dǎo)致包裹有GM1分子的金納米顆粒團(tuán)聚，表面等離子體發(fā)生耦合作用，實(shí)現(xiàn)了高靈敏的SERS檢測(cè)。同時(shí)，該方法會(huì)產(chǎn)生光吸收性質(zhì)的變化，也可以通過比色法進(jìn)行檢測(cè)。操作步驟簡(jiǎn)單、快速，不需要對(duì)底物進(jìn)行任何標(biāo)記，成本低，靈敏度高，特異性好，有望成為有用的檢測(cè)與鑒定霍亂毒素的技術(shù)手段，對(duì)于食品安全監(jiān)測(cè)以及控制和預(yù)防食源性疾病具有重要的意義。
文檔編號(hào)G01N21/33GK102661927SQ20121011614
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月19日
發(fā)明者俞汝勤, 唐麗娟, 文茜, 楚霞, 蔣健暉 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)