專利名稱：一種檢測金黃色葡萄球菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種快速富集、篩選、定性及定量檢測金黃色葡萄球菌的方法及其專用試紙。
背景技術(shù)：
民以食為天，食品是人類賴以生存和發(fā)展的最基本的物質(zhì)條件，但是全球及我國接連不斷發(fā)生的食源性病原微生物引起的食品安全事故和突發(fā)性公共衛(wèi)生事件卻引發(fā)了人們對食品安全的高度關(guān)注，據(jù)聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，食源性疾病的漏報率在95%以上，其中因食源性致病微生物而引起的感染和食物中毒超過85%。食源性致病菌快速檢測一直是研究關(guān)注的焦點，食源性致病菌快速檢測是采用微生物學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、生物物 理、免疫學(xué)的方法對食品及其加工、貯藏等環(huán)境中的致病菌進行分離、檢測、鑒定和計數(shù)?，F(xiàn)在廣泛使用的食源性病原微生物檢測方法主要有以下幾種平皿培養(yǎng)分離計數(shù)法、聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)與突光PCR檢驗方法、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)等。在食源性致病微生物中，金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的機會很多。美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。金黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛(wèi)生難題，在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，占整個細菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占到45%，我國每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多，例如近期某名牌速凍水餃引起中毒的事件。因此，建立健全的食品安全標準和研究食源性致病菌的快速檢測方法就顯得尤為重要。膠體金免疫層析法自1971年被Faulk等人創(chuàng)立以來，由于其具有方便快速、特異性強、穩(wěn)定性好、不需要特殊儀器和試劑、肉眼可判斷結(jié)果等優(yōu)點而得到廣泛的應(yīng)用。膠體金標記實質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程，即氯金酸(HAuC14)在還原劑作用下,聚合成一定大小的金顆粒,形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金與抗體蛋白吸附機理可能是膠體金顆粒表面負電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。免疫層析法是一種基于免疫膠體金技術(shù)的快速診斷技術(shù)，其原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維膜的某一區(qū)帶，當該干燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗體的區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實現(xiàn)特異性的免疫診斷。傳統(tǒng)的平皿培養(yǎng)分離鑒定法是應(yīng)用微生物增菌培養(yǎng)、分離、生化鑒定等方法對食品中可能存在的食源性致病菌進行定性和定量的檢驗。其特點是穩(wěn)定可靠，是目前最成熟，使用最廣泛的細菌檢驗方法，但是此法存在檢測時間長，過程繁瑣，對操作人員技術(shù)要求高以及對特定血清型難以分離鑒定的問題。PCR聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的DNA復(fù)制。樣品經(jīng)前處理增菌后，采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，在加入引物后，以提取的DNA為模版進行PCR擴增。通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產(chǎn)物是否有特征條帶，從而對樣品中是否存在食源性致病菌進行快速檢驗用PCR技術(shù)檢測有害微生物，具有特異性強、靈敏度高和操作簡便、省時等優(yōu)點。熒光PCR即在普通PCR基礎(chǔ)上加入一條特異的寡核苷酸熒光探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品的初始模版，可以通過測定放射性強度考查樣品中微生物數(shù)量。但是PCR反應(yīng)受樣品情況的影響比較大，特別在食源性有害微生物檢查中，食品中的成分(糖類、酸類，油脂等物質(zhì))會干擾反應(yīng)的正常進行。而檢測的環(huán)境，中間處理環(huán)節(jié)也會帶來一些PCR反應(yīng)抑制劑，從而使PCR反應(yīng)呈現(xiàn)較高的假陽性和假陰性率。最為關(guān)鍵的是 ，PCR檢測無從判斷食源性病原微生物的感染性，即DNA或RNA檢測的陽性結(jié)果無法判斷是無感染性的死亡微生物還是具備感染性的活微生物。酶聯(lián)免疫吸附分析法是把抗原抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用原理有機地結(jié)合起來的一種檢測技術(shù)。該技術(shù)主要依據(jù)抗原(抗體)能結(jié)合到固相載體的表面仍具有其免役活性；抗體(抗原)與酶結(jié)合所形成的結(jié)合物仍保持免疫活性和酶的活性；結(jié)合物與相應(yīng)的抗原(抗體)反應(yīng)后，結(jié)合的酶仍能催化底物生成有色物質(zhì)，而顏色的深淺可定量抗體(抗原)的含量。酶聯(lián)免疫吸附分析法具有靈敏度高、快速、特異性很強、和測試成本低等特點，但是此法需要大型儀器來輔助，不利于現(xiàn)場的快速檢測。同樣，酶聯(lián)免疫吸附分析法也有抗原陽性的結(jié)果無法判斷是死亡微生物還是活微生物的缺陷。為對我國食品安全作出貢獻，豐富致病菌的檢測方法，提高對食源性致病菌的檢測速度，為可能出現(xiàn)的食品安全問題提供應(yīng)對方法，需要對現(xiàn)有食源性致病菌的檢測技術(shù)做出改進，尋找一種集富集、篩選、定性、定量于一體的具備感染性的食源性致病菌的檢測方法。實際應(yīng)用中，要求該方法具有快速、簡便、穩(wěn)定性好、靈敏度高、不需要大型儀器等特點，為食品安全檢測、臨床快速診斷以及水質(zhì)等樣品現(xiàn)場快速篩查提供直觀的、肉眼可辨的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測金黃色葡萄球菌的方法及其專用的檢測試紙，以克服現(xiàn)有的檢測方法中靈敏度要求高、富集過程復(fù)雜、檢測時間長、無法區(qū)分致病菌活性，且需要大型儀器等缺陷。技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供一種檢測金黃色葡萄球菌的方法，步驟包括使包被有金黃色葡萄球菌特異性抗體的超順磁納米粒子與待測樣品混合形成抗體-磁性粒子-金黃色葡萄球菌的復(fù)合物；在外加磁場吸引作用下，收集所述的復(fù)合物；將所述的復(fù)合物接種到培養(yǎng)基中進行6-12小時的培養(yǎng)；用金黃色葡萄球菌膠體金免疫層析試紙進行定性或定量檢測。上述方法的優(yōu)選方案之一為，所述的包被有金黃色葡萄球菌特異性抗體的超順磁納米粒子為以Fe3O4納米粒子為內(nèi)核，以SiO2為外殼，表面標記金黃色葡萄球菌特異性抗體的磁性納米粒子。
上述檢測金黃色葡萄球菌的方法的優(yōu)選方案之二為，所述的包被有金黃色葡萄球菌特異性抗體的超順磁納米粒子 是采用如下方法制備的，步驟包括(a)將包裹SiO2的Fe3O4磁性納米粒子分散在有機溶劑中，加入N-(2_氨基乙基)-3_氨基丙基三甲基硅烷，混合反應(yīng)，制成表面氨基化的超順磁性納米粒子；其中，N- (2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲基硅烷與包裹SiO2的Fe3O4磁性納米粒子比例為O. 06mL到O. 12mL比Img納米粒子；(b)將表面氨基化的磁性納米粒子分散于含質(zhì)量濃度為1% 2%戊二醛的磷酸緩沖液中，將金黃色葡萄球菌特異性抗體與步驟(a)所得表面氨基化的磁性納米粒子偶聯(lián)，得到包被有金黃色葡萄球菌特異性抗體的超順磁納米粒子；其中，所述的磷酸緩沖液的pH = 7. 4。上述檢測金黃色葡萄球菌的方法的優(yōu)選方案之三為，所述的特異性抗體為抗金黃色葡萄球菌的多克隆抗體或單克隆抗體。上述檢測金黃色葡萄球菌的方法的優(yōu)選方案之四為，所述的表面氨基化的磁性納米粒子與抗金黃色葡萄球菌多克隆抗體的質(zhì)量比為I : O. 005 O. 05。上述檢測金黃色葡萄球菌的方法的優(yōu)選方案之五為，所述的表面氨基化的磁性納米粒子與抗金黃色葡萄球菌單克隆抗體的質(zhì)量比為I : O. 003 O. 03。上述檢測金黃色葡萄球菌的方法的優(yōu)選方案之六為，所述的外加磁場的強度為3000 7000Gs。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供一種用于上述檢測方法的膠體金免疫層析試紙，包括涂布有膠體金標記的金黃色葡萄球菌單克隆抗體復(fù)合物的結(jié)合墊；和沿層析方向依次噴涂有金黃色葡萄球菌單克隆抗體的檢測線、噴涂有羊抗兔IGg抗體的質(zhì)控線的分析膜；其中，按上述的方法進行檢測，所述膠體金免疫層析試紙的檢測時靈敏度為104cfu/mL菌液。上述的膠體金免疫層析試紙的優(yōu)選方案之一為，所述的試紙還包括PVC底板、樣品墊、結(jié)合墊、分析膜、吸水墊，且沿層析方向的疊放順序依次為底板、樣品墊、結(jié)合墊、分析膜、吸水墊。上述的膠體金免疫層析試紙的優(yōu)選方案之二為，所述的膠體金平均粒徑范圍為10_80nm。上述的膠體金免疫層析試紙的優(yōu)選方案之三為，所述的膠體金免疫層析試紙是以如下方法制備的，步驟包括a)、制備膠體金標記的金黃色葡萄球菌單克隆抗體復(fù)合物采用兩次離心的方法將膠體金標記的金黃色葡萄球菌單克隆抗體包被于10-80nm粒徑的膠體金表面，13000r/min離心，并用硼酸緩沖溶液離心洗滌，濃縮至原體積的1/50-1/2，4°C冷藏保存；b)、制備樣品墊將玻璃纖維膜浸入含有BSA和表面活性劑吐溫20的PBS緩沖溶液中，取出在網(wǎng)孔平板上于30-45°C晾干備用；c)、制備結(jié)合墊將a)步驟中制備的膠體金標記的金黃色葡萄球菌單克隆抗體復(fù)合物分散于含BSA和PBS的緩沖溶液中，并均勻涂布在剪切好的玻璃纖維素膜上，在網(wǎng)孔平板上于30-45°C晾干備用；d)、制備分析膜將金黃色葡萄球菌單克隆抗體和羊抗鼠IgG ( 二抗)定點涂布在分析膜的不同位置，分別作為檢測線和質(zhì)控線，于30-45°C晾干備用；e)、組裝膠體金免疫層析試紙將吸水墊和步驟b) d)所制備的結(jié)合墊、樣品墊、分析膜依照沿層析方向依次為底板、樣品墊、結(jié)合墊、分析膜、吸水墊的順序疊放，貼在PVC底板上,并切成試紙形狀。本發(fā)明可以通過如下方式實現(xiàn)，也可以使用同樣效果的類似方式將超聲粉碎處理過的待測樣品(如食品)與包被有金黃色葡萄球菌特異性抗體的超順磁納米粒子混合，形成抗體-磁性粒子-金黃色葡萄球菌的復(fù)合物；在外加磁場吸引作用下，收集所述的復(fù)合物；將所述的復(fù)合物或由其上洗脫下來的金黃色葡萄球菌在液體或固體培養(yǎng)基中進行不超過2小時的培養(yǎng)；將經(jīng)富集和培養(yǎng)的待測樣品滴加到樣品墊上，樣品通過滲透與虹吸作用進入結(jié)合墊，使結(jié)合墊上固定的所述的納米金顆粒-抗體復(fù)合物重新溶解游離，樣品中的金黃色葡萄球菌抗原與納米金顆粒-抗體復(fù)合物結(jié)合成納米金顆粒-抗體-抗原像三明治一樣的夾心層復(fù)合物，在吸水墊的虹吸作用下，上述夾心復(fù)合物離開結(jié)合墊進入分析膜，向吸水墊方向流動，在此過程中上述納米金顆粒-抗體-抗原復(fù)合物在分析膜上被固定在分析膜上的金黃色葡萄球菌的抗體攔截，形成納米金顆粒-抗體-抗原-抗體復(fù)合物，從而使檢測線顯紅色，而未與金黃色葡萄球菌抗原結(jié)合的納米金顆粒-抗體復(fù)合物則繼續(xù)像吸水墊方向移動，在被固定在質(zhì)控線上的羊抗鼠(二抗)攔截，形成納米金顆粒-抗體-二抗復(fù)合物，從而使質(zhì)控線顯色。結(jié)果判斷檢測線和質(zhì)控線都顯紅色為陽性；只有質(zhì)控線顯紅色，檢測線不顯色為陰性；無論檢測線顯色與否，質(zhì)控線不顯色則視為無效。檢測線上攔截的膠體金的數(shù)量與樣品中的抗原的含量有關(guān)，即樣品中的抗原含量越多，檢測線上攔截下來的膠體金越多，檢測線的紅色越深，在金標免疫層析儀上的信號強度也就越強，以該信號強度與標準濃度的金黃色葡萄球菌菌液為基準作標準曲線，從而實現(xiàn)金黃色葡萄球菌的定量檢測。如本文所述，本發(fā)明中的“膠體金”即是特定粒徑的納米顆粒，一般粒徑為10-80nm，其實現(xiàn)方法為用I %的氯金酸，在適量還原劑檸檬酸三鈉的作用下，制成粒徑在10-80nm的納米金顆粒，由于靜電的作用而呈一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，所述的膠體金在500-550nm左右有強吸收峰，并且本身呈顯酒紅色或者紫色，因此可用作免疫層析反應(yīng)的標記物。所述膠體金顆粒參與了金黃色葡萄球菌單克隆抗體吸附到金顆粒表面的包被過程，其吸附機理是利用所述膠體金在堿性的條件下顯負電，與金黃色葡萄球菌單克隆抗體的正電基團靠靜電吸附而牢固結(jié)合，因而膠體金標記的金黃色葡萄球菌單克隆抗體復(fù)合物具有良好的穩(wěn)定性。上述金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析試紙的一種優(yōu)選方案為，所述的底板材料為PVC塑料板，所述的樣品墊為玻璃纖維素膜，所述的結(jié)合墊材料為玻璃纖維素膜，所述的分析膜材料為硝酸纖維素膜(即是NC膜)，所述吸水墊的材料為植物纖維濾紙。它們沿層析方向依次按樣品墊、結(jié)合墊、分析膜、吸水墊的順序排列在PVC塑料底板上。如本文所述，本發(fā)明中的“樣品墊”是檢測時樣品的滴加部位；如本文所述，本發(fā)明中的“結(jié)合墊”是固定有膠體金標記的金黃色葡萄球菌單克隆抗體復(fù)合物的前處理過的玻璃纖維素膜，在滴加被檢樣品后，該復(fù)合物可以在試紙上和樣品中的金黃色葡萄球菌發(fā)生免疫層析反應(yīng)；如本文所述，本發(fā)明中的“分析膜”是金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析試紙的核、心，金黃色葡萄球菌單克隆抗體和羊抗兔IGg抗體分別被噴涂固定在分析膜的不同位置，分別作為檢測線和質(zhì)控線。如本文所述，本發(fā)明中的“吸水墊”在檢測的過程中通過虹吸作用提供層析的動力；
如本文所述，本發(fā)明的“PVC塑料底板”為整個試紙?zhí)峁┕潭ㄐ螤畹闹魏推渌嚰埥M成部件的附著。有益效果本發(fā)明的方法和試紙集富集、篩選、定性、定量于一體，能夠檢測仍然具備感染活性的食源性致病菌的檢測方法。該方法具有快速(3小時內(nèi))、簡便、穩(wěn)定性好、靈敏度高、不需要大型儀器等特點，檢測靈敏度達104cfu/mL菌液。


圖I本發(fā)明的膠體金免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)示意圖，它的一種表現(xiàn)形式是由底板、吸水墊、分析膜、結(jié)合墊及結(jié)合墊上散布的膠體金顆粒-抗體復(fù)合物、樣品墊按照一定得疊放次序固定于粘性PVC底板上制成，分析膜上沿層析方向依次固定有檢測線、質(zhì)控線。圖2本發(fā)明的膠體金免疫層析試紙的結(jié)果判定圖，檢測線和質(zhì)控線都顯色為陽性；只有質(zhì)控線顯色，檢測線不顯色為陰性；無論檢測線顯色與否，質(zhì)控線不顯色則視為無效。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如分子標記操作手冊或臨床檢測操作手冊，或按照制造廠商所建議的條件。實施例I免疫化超順磁性納米磁珠的制備及細菌富集I、磁核Fe3O4的合成及其包硅用雙蒸水分別配制FeSO4 · 7H20、FeCl3 · 6Η20、2· 5mol/L的NaOH三種溶液，將所配FeSO4 · 7H20、FeCl3 · 6H20兩種溶液混合，使混合溶液中二價鐵離子的濃度為O. 15mol/L,，三價鐵離子的濃度為O. 25mol/L，在劇烈攪拌下將上述配置好的NaOH溶液緩緩滴加到混合鐵鹽溶液中，將所得的沉淀在60°C陳化2h，用雙蒸水將沉淀物清洗3 5次，過濾后在60°C干燥24h，在瑪瑙研缽中研磨后即為產(chǎn)物，60°C干燥，室溫保存?zhèn)溆?。由于磁核Fe3O4的分散性差，粒徑不均勻，且易和其它物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，所以必須對磁核進行包硅，以得到化學(xué)性能穩(wěn)定、分散性好的核殼型磁珠。本實驗采用反相微乳液法對磁核Fe3O4進行包裹，將TritonX-100、正己醇、環(huán)己烷按照I : I : 2至I : I : 10的比例混合均勻，超聲使其形成穩(wěn)定的微乳液體系，再加入磁性Fe3O4納米粒子,超聲并向體系中滴加質(zhì)量濃度為30% 35%的濃氨水至體系分散均勻，繼續(xù)向體系中緩慢滴加正硅酸乙酯(TEOS)。反應(yīng)完成后，靜置過夜使粒子陳化。在磁場的作用下分離磁性納米粒子后，用乙醇洗滌粒子5次，在400°C下煅燒粒子，以去除粒子表面的有機物，收集二氧化硅包裹的磁性納米粒子，干燥并室溫保存?zhèn)溆谩?、表面氨基化磁性納米粒子的制備及其免疫化取IOOmg的二氧化硅包裹的磁性納米粒子，將其分散于400mL甲醇/丙三醇(體積比為I : 3 I : 5)的混合溶液中，再加入300至IOOOyL的蒸餾水，超聲使納米粒子分散均勻，攪拌并向體系中加入5mL至IOmL的N-(2-氨基乙基)_3_氨基丙基三甲基硅烷，反應(yīng)O. 5h后，在3000Gs磁場作用下分離納米粒子，用乙醇和蒸餾水各洗滌3次，得到表面修飾了 -NH2的磁性納米粒子，置于60°C真空烘箱中干燥后室溫保存?zhèn)溆?。取上述制備的表面氨基化的磁性納米粒子IOOmg分散于O. 01mol/L的PBS(pH =
7.4)溶液中，再加入戊二醛溶液使其終濃度為1<% 2%，反應(yīng)Ih后，用上述PBS溶液洗滌磁性納米粒子3次，以除去過量的戊二醛，再加入抗金黃色葡萄球菌的單克隆抗體，繼續(xù)反應(yīng)4 6h，磁性納米粒子表面的氨基與抗體上的氨基連接，形成免疫化超順磁納米粒子。在3000Gs磁場下磁性分離，將得到的磁性粒子重新分散于緩沖溶液中，使其終濃度濃度為50mg/ml。4 °C保存?zhèn)溆谩嵤├?金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析試紙的制備I、膠體金標記金黃色葡萄球菌單克隆抗體復(fù)合物的制備將金黃色葡萄球菌單克隆抗體標記于所制備好的平均粒徑為IO-SOnm的膠體金表面，然后用O. 002M的硼酸緩沖溶液兩次離心洗滌，濃縮至原體積的1/50-1/2，一般為1/25，4°C保存?zhèn)溆谩?、膠體金免疫層析試紙的制備2. I樣品墊的制備本實施例選用玻璃纖維素膜作樣品墊材料，將玻璃纖維素膜放入樣品墊處理液(O. OlM的PBS (PH = 7. 4)，含有I % BSA, O. I %的Trion X-100)中浸泡，于30-45 °C干燥，一般選用37 °C。2. 2結(jié)合墊的制備本實施例選用玻璃纖維素膜作樣品墊材料，將上述制備的膠體金標記金黃色葡萄球菌單克隆抗體復(fù)合物重新分散于O. OlM的PBS (PH = 7. 4，含5%的蔗糖，I %的BSA)中，并噴涂于結(jié)合墊上，于30-45°C干燥備用，一般選用37°C。2. 3分析膜(硝酸纖維素膜或者NC膜)的制備用劃膜儀將金黃色葡萄球菌單克隆抗體和羊抗兔IGg抗體分別定點噴涂在分析膜的不同位置，自上而下依次是質(zhì)控線、檢測線。將噴涂好抗體的NC膜于30-45°C干燥備用，一般選用37°C。 2. 4膠體金免疫試紙的組裝所述金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析試紙的組裝將吸水墊和(b_d)所制備的結(jié)合墊、樣品墊、分析膜依照重疊次序關(guān)系貼在PVC底板上，其中重疊次序為所述PVC底板在最底層，其上中間部位為分析膜，在靠近質(zhì)控線的一端重疊所述的吸水墊，在靠近檢測線的一端重疊所述結(jié)合墊，在結(jié)合墊上重疊樣品墊。組裝好的PVC板縱向剪切成寬度為4_的條狀，裝在有樣品窗和檢測窗的塑料殼內(nèi)即成為金黃色葡萄球菌的快速檢測試紙。實施例3
I、通過檢測90份食品樣品對本發(fā)明的試紙進行特異性測試
將50份含金黃色葡萄球菌的食品樣品、10份含大腸桿菌0157:H7的食品樣品、10份含有單增李斯特菌的食品樣品、10份阪崎腸桿菌的食品樣品、10份空白培養(yǎng)基作為待測樣品，分別超聲IOmin后，取出5ml與50 μ I包被有金黃色葡萄球菌特異性抗體的超順磁納米粒子混合，形成抗體-磁性粒子-金黃色葡萄球菌的復(fù)合物；在外加磁場吸引作用下，收集所述的復(fù)合物；將所述的復(fù)合物接種到7. 5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-12h，在3000Gs磁場下磁性分離出抗體-磁性粒子-金黃色葡萄球菌的復(fù)合物,磁性分離后的菌液在15000r/min下離心20min，然后溶解于O. 9%的氯化鈉溶液中，取出100 μ L滴加到檢測條的樣品孔中，靜置IOmin后觀察結(jié)果。試紙目測結(jié)果50份含金黃色葡萄球菌的食品樣品均顯示為陽性樣品；10份含大腸桿菌0157:Η7的食品樣品、10份含有單增李斯特菌的食品樣品、10份阪崎腸桿菌的食品樣品、10份空白培養(yǎng)基均顯示為陰性樣品。在試驗中，質(zhì)控線不顯色的試紙，其結(jié)果均視為無效。本實施例的結(jié)果充分證明本發(fā)明金黃色葡萄球菌膠體金免疫層析試紙的特異性很好。2、金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析試紙的靈敏度測試挑取一個金黃色葡萄球菌的菌落接種到3mL的7. 5%氯化鈉肉湯液態(tài)培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)18h，經(jīng)計數(shù)菌液濃度為lX108cfu/mL左右。先超聲IOmin后，再用O. OlM的PBS (pH = 7. 4)(或者O. 9%的NaCl溶液)作為稀釋液，配置上述金黃色葡萄球菌系列濃度如下108、IO7, IO6, ΙΟ5、104、IO3,102、10、0cfu/mL，將上述稀釋好的菌液分別滴加到檢測條的樣品孔內(nèi)，靜置IOmin后觀察結(jié)果，滴加菌液濃度為104-108cfu/mL的檢測條的檢測線和質(zhì)控線均顯紅色，為陽性；而菌液濃度為103、102、10、0cfU/mL只有質(zhì)控線顯紅色，為陰性。本發(fā)明金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析試紙的靈敏度為104cfu/mL。3、金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析試紙的穩(wěn)定性測試將上述試紙密封干燥，置于室溫下的干燥柜里，每隔30天取出和新制的試紙，按照本實施例3中1(特異性測試)的方法平行檢測金黃色葡萄球菌的陽性和陰性食品樣品，比較二者檢測結(jié)果。結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析試紙于室溫下干燥保存6個月后，和新制的試紙平行檢測金黃色葡萄球菌的陽性和陰性樣品，結(jié)果測試條的的特異性和靈敏度均沒有降低，說明本發(fā)明的測試條穩(wěn)定性良好。實施例4定量檢測30份食品樣品I、將經(jīng)過前培養(yǎng)后的金黃色葡萄球菌的濃度為108cfu/mL的菌液作為標準菌液，先超聲IOmin后，再用O. OlM的PBS (pH = 7. 4)(或者O. 9%的NaCl溶液)作為菌液的稀釋液，配置系列濃度標準品如下IO8、107、IO6、ΙΟ5、ΙΟ4、103、IO2、10、0cfu/mL。2、將上述稀釋好的各濃度待測菌液滴加到檢測卡的檢測孔中，IOmin后通過定量檢測儀(金標免疫層析儀)讀出定量檢測線和質(zhì)控線的比值(每個樣品平行測定三次取平均值)，繪制相應(yīng)的標準曲線。3、用上述標準曲線設(shè)置金標免疫層析定量檢測儀的內(nèi)置標準曲線。 4、按照上述實施例3中I (特異性測試)的方法檢測30份含金黃色葡萄球菌的食品樣品，菌液滴加到樣品窗IOmin后，將試紙條插入金標免疫層析儀的樣品口進行檢測，測出食品樣品中的金黃色葡萄球菌經(jīng)富集并培養(yǎng)6-12小時后的濃度。食品樣品中的金黃色葡萄球菌的量與其富集并培養(yǎng)6-12h后的的量成正比，從而間接求得食品樣品中金黃色葡萄球菌的含量。5、以傳統(tǒng)平皿培養(yǎng)分離鑒定法所測得的金黃色葡萄球菌菌落數(shù)為標準，進行兩組結(jié)果的比較，所得的比值范圍為試紙定量 法平皿培養(yǎng)法= 0.276 7. 28 1，試紙法測得的菌落數(shù)均處于與平皿培養(yǎng)法相同的數(shù)量級之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢測金黃色葡萄球菌的方法，步驟包括使包被有金黃色葡萄球菌特異性抗體的超順磁納米粒子與待測樣品混合，形成抗體-磁性粒子-金黃色葡萄球菌的復(fù)合物；在外加磁場吸引作用下，收集所述的復(fù)合物；將所述的復(fù)合物接種到培養(yǎng)基中進行6-12小時的培養(yǎng)；用金黃色葡萄球菌膠體金免疫層析試紙進行定性或定量檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的包被有金黃色葡萄球菌特異性抗體的超順磁納米粒子為以Fe3O4納米粒子為內(nèi)核，以SiO2為外殼，表面標記金黃色葡萄球菌特異性抗體的磁性納米粒子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的包被有金黃色葡萄球菌特異性抗體的超順磁納米粒子是采用如下方法制備的，步驟包括 (a)將包裹SiO2的Fe3O4磁性納米粒子分散在有機溶劑中，加入N-(2_氨基乙基)_3_氨基丙基三甲基硅烷，混合反應(yīng)，制成表面氨基化的超順磁性納米粒子；其中，N-(2-氨基乙基)-3_氨基丙基三甲基硅烷與包裹SiO2的Fe3O4磁性納米粒子比例為O. 06mL到O. 12mL比Img納米粒子； (b)將表面氨基化的磁性納米粒子分散于含質(zhì)量濃度為1% 2%戊二醛的磷酸緩沖液中，將金黃色葡萄球菌特異性抗體與步驟(a)所得表面氨基化的磁性納米粒子偶聯(lián)，得到包被有金黃色葡萄球菌特異性抗體的超順磁納米粒子；其中，所述的磷酸緩沖液的pH =7. 4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的方法，其特征在于，所述的特異性抗體為抗金黃色葡萄球菌的多克隆抗體或單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的表面氨基化的磁性納米粒子與抗金黃色葡萄球菌多克隆抗體的質(zhì)量比為I : O. 005 O. 05。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的表面氨基化的磁性納米粒子與抗金黃色葡萄球菌單克隆抗體的質(zhì)量比為I : O. 003 O. 03。
7.一種用于權(quán)利要求I所述方法的膠體金免疫層析試紙，包括涂布有膠體金標記的金黃色葡萄球菌單克隆抗體復(fù)合物的結(jié)合墊；和沿層析方向依次噴涂有金黃色葡萄球菌單克隆抗體的檢測線、噴涂有羊抗兔IGg抗體的質(zhì)控線的分析膜；其中，按權(quán)利要求I的方法進行檢測，所述膠體金免疫層析試紙的檢測時靈敏度為104cfu/mL菌液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的膠體金免疫層析試紙，其特征在于，所述的試紙還包括PVC底板、樣品墊、結(jié)合墊、分析膜、吸水墊，且沿層析方向的疊放順序依次為底板、樣品墊、結(jié)合墊、分析膜、吸水墊。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的膠體金免疫層析試紙，其特征在于，所述的膠體金平均粒徑范圍為10_80nm。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的膠體金免疫層析試紙，其特征在于，所述的膠體金免疫層析試紙是以如下方法制備的，步驟包括 a)、制備膠體金標記的金黃色葡萄球菌單克隆抗體復(fù)合物采用兩次離心的方法將膠體金標記的金黃色葡萄球菌單克隆抗體包被于10-80nm粒徑的膠體金表面，13000r/min離心，并用硼酸緩沖溶液離心洗滌，濃縮至原體積的1/50-1/2，4°C冷藏保存； b)、制備樣品墊將玻璃纖維膜浸入含有BSA和表面活性劑吐溫20的PBS緩沖溶液中，取出在網(wǎng)孔平板上于30-45°C晾干備用；c)、制備結(jié)合墊將a)步驟中制備的膠體金標記的金黃色葡萄球菌單克隆抗體復(fù)合物分散于含BSA和PBS的緩沖溶液中，并均勻涂布在剪切好的玻璃纖維素膜上，在網(wǎng)孔平板上于30-45 °C晾干備用； d)、制備分析膜將金黃色葡萄球菌單克隆抗體和羊抗鼠IgG(二抗)定點涂布在分析膜的不同位置，分別作為檢測線和質(zhì)控線，于30-45°C晾干備用； e)、組裝膠體金免疫層析試紙將吸水墊和步驟b) d)所制備的結(jié)合墊、樣品墊、分析 膜依照沿層析方向依次為底板、樣品墊、結(jié)合墊、分析膜、吸水墊的順序疊放，貼在PVC底板上，并切成試紙形狀。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測金黃色葡萄球菌的方法，即一步法富集篩選金黃色葡萄球菌，步驟包括利用包被有金黃色葡萄球菌特異性抗體的超順磁納米粒子與金黃色葡萄球菌發(fā)生特異性結(jié)合形成復(fù)合物；在外加磁場吸引作用下，收集超順磁納米粒子復(fù)合物；將富集的復(fù)合物接種到培養(yǎng)基中進行6-12小時的培養(yǎng)；并用金黃色葡萄球菌膠體金免疫層析試紙進行定性或定量檢測。還提供相應(yīng)的快速檢測金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析試紙，靈敏度達104cfu/mL菌液，可用于食品安全檢測、臨床快速診斷以及水質(zhì)等樣品現(xiàn)場快速篩查。
文檔編號G01N33/558GK102645536SQ20121011629
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月19日
發(fā)明者徐寬, 支援, 沈鶴柏, 牛凱莉 申請人:沈鶴柏