專利名稱：抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多克隆抗體，尤其涉及一種抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體，還涉及分泌多克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株以及該多克隆抗體在博爾納病病毒檢測中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
博爾納病病毒(Borna disease virus，BDV)是一種具有高度嗜神經(jīng)性的病毒，宿主幾乎涵蓋了所有的溫血動物。被感染宿主表現(xiàn)出以明顯精神、行為異常為特征的神經(jīng)精神性癥狀，這與某些人類精神障礙的癥狀極為相似。美國、英國和日本等地的調(diào)查顯示，在精神分裂癥、抑郁癥、雙相情感障礙等疾病患者外周血液中可以檢測出BDV相關(guān)抗原，BDV可能與這些神經(jīng)遞質(zhì)功能異常的疾病存在某種聯(lián)系。如果能夠確認(rèn)人類的神經(jīng)精神性疾病 與BDV有關(guān)，將會極大地幫助人們防治這類危害越來越大的疾病。但BDV對人體的感染致病性還存在很多疑問，需要進(jìn)一步加以研究證實。由于該病毒對宿主處于持續(xù)慢性感染，復(fù)制程度低，檢測病毒是否存在感染較為困難。因此需要建立高效靈敏和準(zhǔn)確的檢測技術(shù)對BDV進(jìn)行更加全面的研究。血清免疫學(xué)檢測法是利用抗原和抗體之間的特異性反應(yīng)，通過檢測標(biāo)記在反應(yīng)物上的示蹤物，對血清中的抗原或抗體進(jìn)行定性或定量測定的快速檢測技術(shù)。其中酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)是最常見的測定方法，具有簡單、快捷、靈敏等優(yōu)點，在BDV流行病學(xué)檢測和臨床研究中已經(jīng)作為一種重要手段，同時也可以結(jié)合核酸檢測來增大診斷的準(zhǔn)確率。BDV的基因序列總長8. 9 kb，是一種單股負(fù)鏈非分節(jié)段的RNA病毒，基因組開放式讀碼框(ORF)編碼6種蛋白；其中ORF I編碼核蛋白(p40)和ORF II編碼磷蛋白(p24)是主要致病蛋白。BDV磷蛋白在被感染的細(xì)胞中含量豐富、變異程度最小，是進(jìn)行血清學(xué)診斷的主要依據(jù)。國內(nèi)曾有使用定量PCR方法檢測某些動物血液中的BDV磷蛋白(p24)核酸片段(何豐，馮裕星，孫后超等.新疆伊犁地區(qū)動物腦組織博爾納病病毒P24基因片段的檢測[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2010，30 (I) :31-35.展群領(lǐng)，張英英，徐鳴明等.新疆伊犁地區(qū)不同品種犬博爾納病病毒自然感染調(diào)查[J].中華流行病學(xué)雜志。但目前尚無制備BDV磷蛋白多克隆抗體以及相關(guān)ELISA檢測的報道，由于ELISA檢測適合臨床多樣本檢測且特異性高，使在檢測樣本中的抗原或循環(huán)免疫復(fù)合物時具有更高的準(zhǔn)確性和可靠性。此外該多克隆抗體尚可用于免疫組化、免疫熒光和動物實驗等研究，因此研發(fā)BDV磷蛋白多克隆抗體和相關(guān)的應(yīng)用技術(shù)是相當(dāng)必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體及其制備方法。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體的制備方法，包括如下步驟
步驟一，將博爾納病病毒磷蛋白原核表達(dá)載體pET41a-p24轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中，培養(yǎng)，誘導(dǎo)，裂解，純化，制得重組博爾納病病毒磷蛋白。
步驟二，以步驟一中重組博爾納病病毒磷蛋白為抗原，采用常規(guī)多克隆抗體制備方法制備抗血清。步驟三，純化抗血清，即得。步驟一中所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。所述誘導(dǎo)所用的誘導(dǎo)劑為IPTG。所述裂解是在冰浴下超聲裂解直至菌液透徹清亮。利用上述方法制備的抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體。一種檢測博爾納病病毒的間接免疫熒光檢測試劑盒，包括上述的抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體。 進(jìn)一步，所述間接免疫熒光檢測試劑盒還包括間接免疫熒光檢測方法通常用的試齊U，該試劑盒能特異結(jié)合博爾納病病毒分泌磷蛋白抗原，鑒定博爾納病病毒磷蛋白的細(xì)胞定位。一種檢測博爾納病病毒的ELISA試劑盒，包括上述的抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體。進(jìn)一步，所述ELISA試劑盒還包括ELISA常用的試劑，該試劑盒能精確檢測血漿、腦脊液及組織中博爾納病病毒分泌的磷蛋白抗原。一種檢測博爾納病病毒的Western-Blot試劑盒，包括上述的抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體。進(jìn)一步,所述Western-Blot試劑盒還包括Western-Blot常用的試劑,該試劑盒能夠檢測組織、細(xì)胞、血漿、腦脊液中博爾納病病毒分泌的磷蛋白抗原，用于檢測博爾納病毒感染。本發(fā)明成功制備了 BDV磷蛋白多克隆抗體，為深入研究DBV感染的機制以及相關(guān)疾病的診斷、治療奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明的優(yōu)點是(I)本發(fā)明提供的抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體的特異性好，效價高，制備方法簡單易行；(2)本發(fā)明供的抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體可用于DVB的檢測。


圖I為間接免疫熒光實驗檢測磷蛋白在BDV感染的OL細(xì)胞中的表達(dá)；
圖2為間接免疫熒光實驗檢測磷蛋白在正常OL細(xì)胞中的表達(dá)；
圖3為Western-Blot實驗檢測抗BDV磷蛋白多克隆抗體與重組磷蛋白和天然磷蛋白的特異性反應(yīng)；
圖中，I為重組磷蛋白+抗BDV磷蛋白多克隆抗體，2為BDV感染的OL細(xì)胞+抗BDV磷蛋白多克隆抗體，3為正常OL細(xì)胞+抗BDV磷蛋白多克隆抗體，4為BDV重組核蛋白+抗BDV磷蛋白多克隆抗體。
具體實施例方式實施例I :BDV重組磷蛋白的制備 步驟I、蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
用博爾納病病毒的ORF II基因和pET41a質(zhì)粒(購買于德國Novagen公司)采用重組質(zhì)粒的常用構(gòu)建方法，構(gòu)建P24重組原核表達(dá)載體pET41a-p24，然后將p24重組原核表達(dá)載體pET41a-p24轉(zhuǎn)化至感受態(tài)BL21 (DE3)大腸桿菌中，卡那霉素抗性篩選，37°C恒溫箱過夜培養(yǎng)，次日挑取單菌落，接種到5mL含有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 0C 220r/min搖床過夜培養(yǎng)，次日取50 ii L菌液接種到5管5mL含卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C220r/min搖床培養(yǎng)3小時左右直到測菌液0D600值為0. 6，這時在4管中分別加入IPTG至終濃度為0. 5、1、1. 5、2mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時設(shè)I管不加入IPTG作為陰性對照，繼續(xù)恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，在4、8和16小時分別收集ImL 菌液，將菌液13000r/min離心lmin，棄上清，用5 X Loading buffer重懸沉淀，煮沸變性5分鐘后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳初步分析誘導(dǎo)條件對蛋白表達(dá)量的影響。步驟2、重組蛋白的純化
重新挑單菌落過夜培養(yǎng)，次日取2ml菌液接種到200mL LB培養(yǎng)基中，按2mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4小時進(jìn)行表達(dá)，離心后棄上清，用20mL緩沖液(50mmol/L Tris-HCl, PH值
8.0)懸浮菌體，在冰浴下超聲裂解直至菌液透徹清亮，12000r/min離心5分鐘，使用孔徑為
0.45um的濾膜對上清進(jìn)行過濾。用平衡緩沖液平衡純化柱，然后將過濾后的上清液過純化柱進(jìn)行親和層析純化，取含20mmol/L Tris-HCl (PH 8. 0)、50mmol/L咪唑和500mmol/LNaCl的洗滌緩沖液洗去未結(jié)合的雜蛋白，最后取含20mmol/L Tris-HClCPH 8. 0)、500mmol/L咪唑和500mmol/L NaCl的洗脫緩沖液洗脫得到純化的p24重組蛋白，取20 y L純化蛋白變性上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)形式和純化效果，將剩余蛋白置_20°C保存。實施例2 :抗體制備 步驟I、免疫和注射
準(zhǔn)備兩只雄性8周齡大的清潔級新西蘭大白兔，每只約3 kg。用生理鹽水稀釋免疫原(0. 5mg/家兔),然后與弗氏完全佐劑(CFA)進(jìn)行I :1混合,用3mL注射器抽取該乳化液,抗原(實施例I獲得的P24重組蛋白)和佐劑完全混合形成穩(wěn)定的乳劑，接上25G針頭，排除注射器中的氣泡。從籠中取出兔子放在平坦處，在4個不同的部位(一般在背部或腿后部)進(jìn)行皮下注射，每個區(qū)域大約用1/4 (0. 125mg)的免疫原，保證免疫原可以持久存在從而提高免疫應(yīng)答。撫去注射處的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮膚。捏出皮膚，將針頭以相對皮膚15度的角度進(jìn)針，進(jìn)針深度為lcm-2cm，小心不要刺入肌肉中。注射結(jié)束后，將針在注射處放置幾秒鐘后再輕輕拔出，并用乙醇在注射處消毒。在4個部位重復(fù)上述操作。用相同方法免疫另一只家兔。首次免疫前，尾靜脈采血分離血清用作陰性對照，免疫程序如表I所示。表I免疫流程___
每疫次數(shù)I時間 j免疫形式 I佐劑添加I抗原劑量
首次免疫第I文皮下多點注射 —CFA500 n g/只
第二次免疫第14天皮下多點注射 IFA_500 Hg/只
第三次免疫第35天皮下多點注射 IFA_500 Hg/只
胥面了欠免疫I第56天I腹腔注射 I不加佐劑|500tig/只
弗氏完全佐劑是一種油包水的乳濁液(Paraffin Oil)，能夠非常有效的誘導(dǎo)產(chǎn)生高
滴度的抗體。弗氏完全佐劑含結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁成分，可以加強對抗原的抗體反應(yīng)。弗
氏不完全佐劑在弗氏完全佐劑(Paraffin Oil 85%)中加入了結(jié)核分枝桿菌成分(Arlacel
A 15%)。步驟2、取血將新西蘭大白兔輕輕放入固定架上，二甲苯涂于耳緣靜脈的上中部，用刀片傾斜45度在該處切出0. 23cm-0. 3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在結(jié)束之前出現(xiàn)凝固可用溫水輕擦切口處，再繼續(xù)收集。收集適量血液后可用消毒后的紗布輕擦患處，輕按患處10秒-20秒確定血流停止后方可結(jié)束。將血液在37°C恒溫箱中放置30分鐘，再在4°C放置過夜。用藥鏟將血凝塊從管壁上撥落，將血液轉(zhuǎn)移至塑料離心管中，4°C, 10, OOOg離心10分鐘，收集上清液即為抗血清。步驟3、抗體純化
首先是準(zhǔn)備BDV磷蛋白(P24)s印harose CL-4B親和柱。通常準(zhǔn)備5mL或10 mL BDV磷蛋白(P24) s印harose CL-4B填料，在真空瓶中將等體積的填料和TBS緩沖溶液混合，攪拌。抽真空約15min以除去填料中的氣泡，否則在柱中形成的氣泡影響柱子的容量和分離效果。將BDV磷蛋白(P24) s印harose CL-4B填料緩慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度為I mL/min-2 mL/min，避免柱干，利用10倍于床體積并經(jīng)過預(yù)冷的TBS緩沖溶液平衡柱子。其次是制備抗血清，將抗血清放入冰水或4°C冰箱中緩慢解凍以避免蛋白質(zhì)的聚 集。在蛋白質(zhì)解凍過程中出現(xiàn)的聚集可通過37°C預(yù)熱而溶解。加入固體疊氮化鈉至濃度為
0.05%，4°C，15，OOOxg離心5分鐘，移出澄清的抗血清再經(jīng)過濾器過濾除去多余的脂肪。將抗血清用TBS緩沖溶液以I :5的比例進(jìn)行稀釋，再用過濾器進(jìn)行過濾。以0. 5mL/min的速度將抗血清加入柱中，為保證抗血清與填料的結(jié)合,需連續(xù)上柱2次并保留上樣流出液。用TBS緩沖溶液清洗柱子至A (280nm)〈O. 008后加pH2. 7洗脫緩沖溶液，以
0.5mL/min的速度洗脫至所有蛋白均流下來。用已經(jīng)加入IOOuL中和緩沖溶液的I. 5 mLEP管分管收集洗脫液，混勻后用pH試紙檢查洗脫液的pH，如果pH低于7可利用中和緩沖液調(diào)至約PH7. 4以防止抗體的變性。在柱中加入10mL，pHl. 9洗脫緩沖溶液，按上述方法收集洗脫液至A (280nm)〈0.008。利用分光光度計測定各管中蛋白質(zhì)的含量。若蛋白濃度低于0. 5mg/mL可加入10%的甘油以便保存，將純化的抗體分裝后在2V _8°C保存。實施例3 :多克隆抗體特異性的測定 間接免疫熒光染色法
將持續(xù)感染BDV的OL細(xì)胞涂片，以正常OL細(xì)胞為對照。移去培養(yǎng)基后，PBS洗片3次，每次3min。用4%多聚甲醛固定20min,PBS洗片3次。加入0. 2%Triton_X100破膜30min,PBS洗片3次。加入5%BSA封閉lOmin。實施例2所述的多克隆抗體(用PBS緩沖液I :200稀釋)作為一抗加入，4°C水盒孵育過夜。次日用PBS洗片3次；避光，滴加FITC標(biāo)記羊抗兔二抗(用PBS緩沖液I :50稀釋)，37°C孵育Ih ；PBS洗片3次。用藍(lán)綠激發(fā)綠光在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。結(jié)果如圖1，圖2所示可見細(xì)胞核內(nèi)有明亮的綠色局灶性熒光點，與文獻(xiàn)中報道的磷蛋白主要在細(xì)胞核中分布的結(jié)果相一致，說明該多抗能和天然的磷蛋白特異性的結(jié)合。免疫印跡法
取BDV感染的OL細(xì)胞和正常的OL細(xì)胞，使用蛋白提取試劑盒裂解細(xì)胞并分別提取細(xì)胞蛋白，將提取的蛋白和純化的重組BDV磷蛋白各取20 ii L，加入5XLoading buffer煮沸5min進(jìn)行蛋白變性，離心后各取上清2 u L上樣行SDS-PAGE電泳(100V，2h)，根據(jù)預(yù)染Marker將目的條帶切下，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(100V, 75min)，用5%脫脂奶粉室溫封閉I h，加入實施例2所述的多克隆抗體(用TBST緩沖液配制的封閉液I :5000稀釋)作為一抗4°C緩慢搖動過夜。次日用TBST緩沖液室溫下洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG (用TBST緩沖液配制的封閉液I :2000稀釋)作為二抗37°C孵育Ih后洗膜3次，用ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光并使用凝膠成像儀拍照保存。結(jié)果如圖3所示，該多抗能特異性識別重組磷蛋白和BDV感染的OL細(xì)胞蛋白，而正常OL細(xì)胞蛋白未出現(xiàn)特異性條帶。間接ELISA方法
用0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3(PH 9.6)包被緩沖液分別將博爾納磷蛋白抗原、博爾納核蛋白抗原和單純皰疹病毒感染OL細(xì)胞提取蛋白(HSV-OL)稀釋至101!^/1，每孔1001^加入酶標(biāo)板中，4°C過夜。次日棄孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液PBST洗3次，每孔加200 u L封閉液于37°C封閉lh，用PBST洗板3次后，每孔加入100 u L兔抗血清，用免疫前血清做為陰性對照，免疫兔血清為陽性對照，PBS為空白對照，37°C溫育lh。用PBST再次洗板3次后，每孔中加入IOOiiL I 2500稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，37°C溫育lh，PBST洗板4次，各反應(yīng)孔中加入TMB底物溶液100 u L，37°C溫育lOmin。最后于各反應(yīng)孔中加入50 y L 2mol/L硫酸終止反應(yīng)。在ELISA酶標(biāo)儀上于450nm處以空白對照孔調(diào)零后測各孔吸光值(A值)。判定標(biāo)準(zhǔn)為0D值大于等于陰性對照的2. I倍為陽性。如表2所示，博爾納P24多抗對博爾納磷蛋白抗原更有特異性，對核蛋白及皰疹病毒感染OL細(xì)胞無交叉反應(yīng)。表2 ELISA檢測多抗與BDV磷蛋白特異性反應(yīng)
權(quán)利要求
1.一種抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體的制備方法，包括如下步驟 步驟一，將博爾納病病毒磷蛋白原核表達(dá)載體pET41a-p24轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中，培養(yǎng)，誘導(dǎo)，裂解，純化，制得重組博爾納病病毒磷蛋白； 步驟二，以步驟一中重組博爾納病病毒磷蛋白為抗原，采用常規(guī)多克隆抗體制備方法制備抗血清； 步驟三，純化抗血清，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟一中所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟一中所述誘導(dǎo)所用的誘導(dǎo)劑為IPTG。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟一中所述裂解是在冰浴下超聲裂解直至菌液透徹清亮。
5.利用權(quán)利要求I 4任一項所述方法制備的抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體。
6.一種檢測博爾納病病毒的間接免疫熒光檢測試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求5所述的抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體。
7.—種檢測博爾納病病毒的ELISA試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求5所述的抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體。
8.一種檢測博爾納病病毒的Western-Blot試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求5所述的抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體的制備方法，所述的多克隆抗體能特異性結(jié)合博爾納病病毒磷蛋白抗原。所述抗博爾納病病毒磷蛋白的多克隆抗體的制備方法,是制備重組博爾納病病毒磷蛋白，將其免疫新西蘭大白兔，制備抗血清，獲得多克隆抗體?？共柤{病病毒磷蛋白的多克隆抗體在制備用于檢測博爾納病病毒的抗體檢測試劑的應(yīng)用，所述檢測包括免疫印跡法、間接免疫熒光法和間接ELISA法。本發(fā)明提供的抗博爾納病病毒磷蛋白多克隆抗體的特異性好，效價高；制備方法簡便易行。
文檔編號G01N33/569GK102653557SQ201210121569
公開日2012年9月5日 申請日期2012年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月24日
發(fā)明者張亮, 謝鵬, 馬麗華, 黃榮忠 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)