專利名稱：流感疫苗中的過敏原卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白定量檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種蛋白的檢測方法，特別是利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗來定量檢測流感疫苗中新的過敏原卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白的方法。
背景技術(shù)：
流行性感冒是最具世界流行潛力的疾病，上世紀數(shù)次流行性感冒的世界大流行給全球造成巨大損失。自本世紀初以來，世界衛(wèi)生組織持續(xù)發(fā)布H5N1禽流感人類病例，特別是世界各地陸續(xù)發(fā)布疫情的H5N1禽流感以及近年來爆發(fā)的新型HINl流感(豬流感)，都有可能造成全球的大流行。流感疫苗是預防流行性感冒發(fā)生和流行的最有效方法。目前世界各國生產(chǎn)流感疫苗的主要方式是利用流感病毒流行株在雞胚胎卵囊腔中培養(yǎng)后，經(jīng)過滅活處理，再將流感病毒抗原純化后制備成疫苗。因此疫苗中存在一部分雞卵殘留蛋白，殘留蛋白對部分個體可能作為過敏原，可以引起IgE介導的速發(fā)型(I型)過敏反應?！吨袊幍洹?010版第三部規(guī)定采用酶聯(lián)免疫法檢測，流感疫苗中卵清蛋白含量應不高于500ng/mL。 蛋清中含有多種過敏原，除了卵清蛋白外，還有卵類粘蛋白和卵運鐵蛋白等。其中，蛋清中卵清蛋白含量最高，約占蛋清總蛋白的54%。除此之外，卵類粘蛋白約占蛋清總蛋白的11%。卵運鐵蛋白約占蛋清總蛋白的12%。值得重視的是，某些個體口服或注射含有卵類粘蛋白和卵運鐵蛋白的食物或制劑后會發(fā)生嚴重的過敏反應。由雞胚尿囊液中培養(yǎng)的流感病毒液所制備的流感疫苗殘留有一定量的雞卵清蛋白，目前國內(nèi)外對流感病毒疫苗中卵清蛋白有明確的規(guī)定，但無卵類粘蛋白和卵運鐵蛋白殘留量的相關(guān)規(guī)定。到目如為止，國內(nèi)外對流感疫苗中存在的卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白新的過敏原并未充分認識到，更沒有流感疫苗中對這兩類過敏原含量的規(guī)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種新的流感疫苗中過敏原卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白定量檢測方法，該方法不僅可以定量檢測，而且特異性強、靈敏度高、重復性好、簡便易行，非常適合于快速定量檢測流感疫苗中卵類粘蛋白和卵運鐵蛋白。為了實現(xiàn)上述任務，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案一種流感疫苗中過敏原卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白定量檢測方法，其特征在于，該方法在制備抗卵類粘蛋白或抗卵運鐵蛋白單克隆抗體的基礎上，經(jīng)過配對抗體的篩選和建立的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗，來定量檢測流感疫苗中的卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白。所述的定量檢測方法包括抗卵類粘蛋白或抗卵運鐵蛋白的單克隆抗體的制備和配對抗體的篩選以及雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗的建立。所述的抗卵類粘蛋白或抗卵運鐵蛋白單克隆抗體的制備和配對抗體的篩選方法是將卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白作為免疫原，采用常規(guī)雜交瘤技術(shù)得到抗卵類粘蛋白或抗卵運鐵蛋白的單克隆抗體，并分別常規(guī)標記辣根過氧化物酶，分別將未標記的單克隆抗體作為包被抗體，將標記的單克隆抗體作為酶標抗體，采用陣列法兩兩配對挑選敏感性最高且特異性最好的配對抗體。所述的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗的方法是，在96孔板中，順序加入包被抗體、待測標本和標準品、酶標抗體及底物，于波長410nm測定光吸收值，將上述挑選的最好的一對抗體分別用作包被抗體和酶標抗體來檢測卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白。用5mg/L包被抗體包被96孔板，24小時后用含牛血清白蛋白的緩沖液封閉96孔板，洗滌后加入待測標本(稀釋一定倍數(shù)的流感病毒感染尿囊液 原液、流感疫苗生產(chǎn)中間產(chǎn)品以及流感疫苗成品)和倍比稀釋的卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白標準品，孵育及洗滌后加入酶標抗體，再次孵育及洗滌后以2，2’ -連氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-磺酸)底物顯色，于波長410nm測定光吸收值，以標準品的光吸收值為縱坐標，相應濃度為橫坐標，作標準曲線，根據(jù)待測標本的光吸收值，經(jīng)曲線擬合或換算，得出待測標本中卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白的濃度。本發(fā)明的流感疫苗中的過敏原卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白定量檢測方法，是在單克隆抗體基礎上建立的新方法，運用定量檢測卵類粘蛋白和卵運鐵蛋白雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗，可以快速定量檢測卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白，在國內(nèi)外首次檢測到流感病毒原液中卵類粘蛋白的含量在0. 9 258ng/mL之間，卵運鐵蛋白的濃度在2 450ng/mL之間。為提高和控制流感疫苗質(zhì)量，減少和防止流感病毒疫苗接種后的過敏反應提供重要依據(jù)。單克隆抗體是識別單一表位的抗體，所以本發(fā)明的特異性強；又因為經(jīng)過抗體的配對篩選，所以本發(fā)明的靈敏度高；本發(fā)明是建立在酶聯(lián)免疫吸附試驗的基礎上的，如果采取預包被抗體的方案，檢測過程只需3小時左右；由于單克隆抗體質(zhì)量易于控制，檢測時各復孔間的光吸收值間誤差很小，所以本發(fā)明還有簡便易行、重復性好的特點。
具體實施例方式按照本發(fā)明的技術(shù)方案，在制備抗卵類粘蛋白或抗卵運鐵蛋白單克隆抗體的基礎上，經(jīng)過配對抗體的篩選和建立雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗，來定量檢測卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白?？孤杨愓车鞍谆蚩孤堰\鐵蛋白單克隆抗體的制備是將卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白作為免疫原，采用常規(guī)雜交瘤技術(shù)得到抗卵類粘蛋白或抗卵運鐵蛋白的單克隆抗體。配對雙抗體的篩選方法是將得到的單克隆抗體分別常規(guī)標記辣根過氧化物酶，分別將未標記的單克隆抗體作為包被抗體，將標記的單克隆抗體作為酶標抗體，采用陣列法兩兩配對挑選最好條件的配對抗體，建立雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗的系統(tǒng)。最好條件的配對抗體的挑選方法是選擇敏感性最高，即檢測相同濃度的卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白的光吸收值最高，且特異性高(即檢測無關(guān)蛋白的光吸收值最低，也即非特異本底最低)的配對抗體。雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗的方法是，在96孔板中，加入5mg/L包被抗體，24小時后用含牛血清白蛋白的緩沖液封閉96孔板，洗滌后加入經(jīng)稀釋的雞胚尿囊液中提取的流感病毒原液標本和倍比稀釋的卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白標準品，孵育及洗滌后加入酶標抗體，再次孵育及洗滌后以2，2’_連氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-磺酸)底物顯色，于波長410nm測定光吸收值，以卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白標準品的光吸收值為縱坐標，相應濃度為橫坐標，作標準曲線，根據(jù)待測標本的光吸收值，經(jīng)曲線擬合或換算，得出流感疫苗中卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白的濃度。
以下是發(fā)明人給出的實施例實施例I :定量檢測流感病毒原液中卵類粘蛋白將卵類粘蛋白作為免疫原，采用常規(guī)雜交瘤技術(shù)，經(jīng)細胞融合、篩選及克隆化，共得到8株抗卵類粘蛋白的單克隆抗體，分別命名為FMU-OMl FMU-0M8。經(jīng)過抗體的配對篩選后，將FMU-0M5單克隆抗體作為包被抗體，而將FMU-0M6單克隆抗體標記辣根過氧化物酶后作為酶標抗體。用PH9. 6,0. 05mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩沖液稀釋包被抗體FMU-0M5至5mg/L，加入96孔板，100 U I/孔，保濕，4°C放置24小時。用洗滌緩沖液洗96孔板3次，加入含I %牛血清白蛋白的緩沖液，室溫封閉30分鐘。洗板3次，加入待測經(jīng)稀釋雞胚尿囊液中提取的流感病毒原液標本和倍比稀釋的卵類粘蛋白標準品，100 u I/孔，37°C孵育I小時。洗板3次，分別加入I : 500稀釋的酶標抗體FMU-0M6，IOOiU/孔，37°C孵育I小時。洗板3次，以2，2’-連氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-磺 酸)底物顯色，IOOiU/孔，37°C放置5分鐘，于波長410nm測定光吸收值。以標準品的光吸收值為縱坐標，相應濃度為橫坐標，作標準曲線，其靈敏度達0. 5ng/mL。根據(jù)待測標本的光吸收值，經(jīng)曲線擬合，得出7批不同流感病毒原液中卵類粘蛋白的含量在0. 9 258ng/mL之間。標準品為Sigma產(chǎn)品，即為已知濃度的用來免疫小鼠的卵類粘蛋白。實施例2 :定量檢測流感病毒原液中卵運鐵蛋白將卵運鐵蛋白作為免疫原，采用常規(guī)雜交瘤技術(shù)，經(jīng)細胞融合、篩選及克隆化，分別得到18株抗卵運鐵蛋白的單克隆抗體，分別命名為FMU-OTl FMU-0T18。經(jīng)過抗體的配對篩選后，將FMU-0T12單克隆抗體作為包被抗體，而將FMU-0T6單克隆抗體標記辣根過氧化物酶后作為酶標抗體。用pH9. 6,0. 05mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩沖液稀釋包被抗體FMU-OT12至5mg/L，加入96孔板，100 yl /孔，保濕，4°C放置24小時。用洗滌緩沖液洗96孔板3次，加入含1%牛血清白蛋白的緩沖液，室溫封閉30分鐘。洗板3次，加入待測經(jīng)稀釋雞胚尿囊液中提取的流感病毒原液標本和倍比稀釋的卵運鐵蛋白標準品，100 iil/孔，37°C孵育I小時。洗板3次，加入I 500稀釋的酶標抗體FMU-0T6，100iil/孔，37°C孵育I小時。洗板3次，以2，2’-連氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-磺酸)底物顯色，IOOiU/孔，37°C放置5分鐘，于波長410nm測定光吸收值。以標準品的光吸收值為縱坐標，相應濃度為橫坐標，作標準曲線。根據(jù)待測標本的光吸收值，經(jīng)曲線擬合和分子量換算，得出7批不同流感病毒原液中卵運鐵蛋白的濃度在2ng/mL 450ng/mL之間。
權(quán)利要求
1.一種流感疫苗中的過敏原卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白定量檢測方法，其特征在于，在制備抗卵類粘蛋白或抗卵運鐵蛋白單克隆抗體的基礎上，經(jīng)過配對抗體的篩選和建立雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗，來定量檢測卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于 所述的抗卵類粘蛋白或抗卵運鐵蛋白的制備方法是將卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白作為免疫原，采用常規(guī)雜交瘤技術(shù)得到抗卵類粘蛋白或抗卵運鐵蛋白的單克隆抗體； 所述的配對雙抗體的篩選方法是將得到的抗卵類粘蛋白或抗卵運鐵蛋白單克隆抗體分別常規(guī)標記辣根過氧化物酶，分別將未標記的單克隆抗體作為包被抗體，將標記的單克隆抗體作為酶標抗體，采用陣列法兩兩配對，挑選選擇敏感性最高，即檢測相同濃度的卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白的光吸收值最高，且特異性高的配對抗體；建立雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗的系統(tǒng)； 所述的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗的方法是，在96孔板中，加入5mg/L包被抗體，24小時后用含牛血清白蛋白的緩沖液封閉96孔板，洗滌后加入經(jīng)稀釋的雞胚尿囊液中提取的流感病毒原液標本和倍比稀釋的卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白標準品，孵育及洗滌后加入酶標抗體，再次孵育及洗滌后以2，2’ -連氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-磺酸)底物顯色，于波長410nm測定光吸收值，以卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白標準品的光吸收值為縱坐標，相應濃度為橫坐標，作標準曲線，根據(jù)待測標本的光吸收值，經(jīng)曲線擬合或換算，得出流感疫苗中卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白的濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種流感疫苗中的過敏原卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白定量檢測方法，在制備抗卵類粘蛋白或抗卵運鐵蛋白單克隆抗體的基礎上，經(jīng)過配對抗體的篩選，建立的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗，來定量檢測流感疫苗中卵類粘蛋白和卵運鐵蛋白。為了減少由雞胚尿囊腔內(nèi)純化制備的流感疫苗中殘留卵類粘蛋白或卵運鐵蛋白引起的接種人群中過敏反應的發(fā)生率，該方法特異性強、靈敏度高、重復性好、簡便易行，非常適合疾病控制中快速定量檢測流感疫苗或食品中卵類粘蛋白和卵運鐵蛋白。
文檔編號G01N33/68GK102650640SQ20121012167
公開日2012年8月29日 申請日期2012年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月24日
發(fā)明者劉志佳, 劉蓓, 周幸春, 宋朝君, 張宇絲, 張春梅, 張赟, 徐竹蔚, 方亮, 易靜, 李永明, 李琦, 楊琨, 金伯泉, 陳麗華, 馬櫻 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學