專利名稱：透明質(zhì)酸一步法化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種ー步法進行人血清、體液或組織勻衆(zhòng)中透明質(zhì)酸(HyaluronicAcid，簡稱HA)含量檢測的化學(xué)發(fā)光試劑盒。屬于免疫分析醫(yī)學(xué)范疇。
背景技術(shù)：
近年來的臨床醫(yī)學(xué)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸含量變化與腫瘤的生長、浸潤和擴散密切相關(guān)，尤其發(fā)現(xiàn)檢測血清HA對診斷腫瘤有一定價值，可作為區(qū)分良、惡性腫 瘤的ー個重要指標(biāo)。它還有助于肝病的診斷和鑒別診斷、病情判斷和預(yù)后評估，還是抗纖維化藥物治療的ー個非常重要的動態(tài)觀察手段。目前，HA的檢測方法主要以放射免疫方法為主，文獻CN1047391A公開了ー種放射免疫方法檢測透明質(zhì)酸(H A)含量的方法。它將碘標(biāo)記的HA(125I-HA)與未知量標(biāo)本中的H A共同競爭加入的透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(HABP)，再用第一抗體、第二抗體將結(jié)合復(fù)合物沉淀下來，測其放射性計數(shù)，通過標(biāo)準(zhǔn)品的濃度-計數(shù)關(guān)系計算出擬合方程，根據(jù)樣本放射性計數(shù)反推出其中的HA含量來。這是ー種比較靈敏、準(zhǔn)確的透明質(zhì)酸檢測方法。但是上述方法也存在一定的缺陷一、加樣步驟繁瑣。整個實驗包括三步加樣和離心等過程，反應(yīng)的總計時間達到2個多小時；ニ、試劑盒操作自動化程度低，試劑盒的有效期也很短。只有30-45天；三、使用125I作為標(biāo)記物，對環(huán)境產(chǎn)生放射性污染，對操作人員健康有潛在危害。同樣，在市場上也有一部分的HA化學(xué)放光和酶聯(lián)檢測試劑，據(jù)了解，它們大多數(shù)都是采用三步法反應(yīng)模式，免疫反應(yīng)的時間一般都要I. 5-2個小時左右，可以說操作起來都比較繁瑣。究其原因在于這些試劑盒都借助了 HA與HABP之間的結(jié)合反應(yīng)，而HABP是ー個成分和結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的蛋白，提純エ藝復(fù)雜，純度也不會太高，且其與HA的結(jié)合力沒有像抗原和抗體的結(jié)合力那么強，所以，一、不能用它直接包被，干擾因素比較多，造成試劑的重復(fù)性差。ニ、不能用它直接標(biāo)記，HABP某些活性基團極易失活，造成試劑的穩(wěn)定性差。本發(fā)明從根本上解決了透明質(zhì)酸試劑盒不能一歩法檢測的難題，可以讓操作更方便，讓檢測更準(zhǔn)確。其反應(yīng)原理為預(yù)先在固相載體(例如96孔微孔板)上包被HA，再依次加入校準(zhǔn)品或樣品和HA酶結(jié)合物，反應(yīng)過程中固相包被HA與樣本中的HA共同與限量的HABP-anti-HABP-HRP進行競爭性結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)過一定的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間，經(jīng)洗滌除去某些游離成分，最終在固相板上形成HABP-anti-HABP-HRP的復(fù)合物。校準(zhǔn)品或樣本中的HA含量越高，在包被板上形成的復(fù)合物就越少。測定時，先洗去包被板中的液體，再加入發(fā)光底物液A和B，發(fā)光底物液中的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化，形成ー個激發(fā)態(tài)的中間體，當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時，會釋放等能級的光子，對光子進行測定從而實現(xiàn)定量分析。本試劑盒的突出技術(shù)優(yōu)勢具體在于(I)采用化學(xué)發(fā)光定量測定方法，充實了透明質(zhì)酸的免疫檢測手段，進ー步突出了方法學(xué)具有的靈敏度高，特異性強，精密度好，線性范圍寬，試劑穩(wěn)定性好等優(yōu)點。本發(fā)明試劑盒所有組分從緩沖液到原材料再到制備條件均經(jīng)過了最優(yōu)化篩選與配比，大大提高了試劑盒的的靈敏度，特異性，檢測范圍和準(zhǔn)確性。試劑盒的底物系統(tǒng)使用魯米諾(Luminol)/過氧化氫/辣根過氧化物酶(HRP)/對碘苯酹(p-iodophenol)底物發(fā)光系統(tǒng),其在精心配比的Tris-HCL緩沖液中延長了底物系統(tǒng)發(fā)光持續(xù)時間，I小時內(nèi)對樣品的測定值變化在10%以內(nèi)，大大提高了測定結(jié)果的穩(wěn)定性。同時，本試劑盒適用于開放式化學(xué)發(fā)光檢測儀器，更有利于其進一歩推廣和應(yīng)用。(2)液體試劑可直接使用，無需提前配制；可拆卸板條最大滿足實驗設(shè)計要求。(3) 一歩法反應(yīng)，操作極為簡單，只需向微孔中連續(xù)加入校準(zhǔn)品或樣本及HA酶結(jié)合物，反應(yīng)I小時即可。(4)間接法形成酶結(jié)合物，從根本上解決辣根過氧化物酶直接標(biāo)記HABP存在的不穩(wěn)定、易失活的問題，試劑盒的穩(wěn)定性大大改善，有效期可以達到6個月，而且測定結(jié)果的重復(fù)性也明顯提高。 (5)采用LogX-(I-BZiBci)擬合方法進行數(shù)據(jù)處理，避免個別低值血樣發(fā)光值偏出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，無法計算的弊病。本試劑盒在具備了靈敏度高，測值準(zhǔn)確，重復(fù)性好，試劑穩(wěn)定，有效期長，等技術(shù)優(yōu)勢的基礎(chǔ)上，科學(xué)性、創(chuàng)新性地解決了 HA酶促法(化學(xué)發(fā)光和酶聯(lián)法)試劑普遍存在的技術(shù)難題，大大筒化了操作步驟，令其獨特品質(zhì)在國內(nèi)的HA非放試劑中名列前茅。

發(fā)明內(nèi)容
ー種ー步法進行人血清、體液或組織勻衆(zhòng)中透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid,簡稱HA)含量檢測的化學(xué)發(fā)光試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測透明質(zhì)酸的化學(xué)發(fā)光試劑盒包括1)HA校準(zhǔn)品2)HA包被板3) HA酶結(jié)合物4)化學(xué)發(fā)光底物液A和化學(xué)發(fā)光底物液B。上述本發(fā)明的試劑盒中，所述的HA校準(zhǔn)品內(nèi)含有經(jīng)準(zhǔn)確定值的HA抗原。上述本發(fā)明的試劑盒中，所述的HA包被板上包被有與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)的HA(HA-BSA)。上述本發(fā)明的試劑盒中，所述的用于HA包被板的HA-BSA其制備方法如下準(zhǔn)確稱取5mg HA抗原,溶解于2ml 0. lmol/L pH 5. 6磷酸鹽緩沖液(PB)加IOmg牛血清白蛋白，溶解后加5mg I-こ基-3-(3-ニ甲基氨基丙基)-碳ニ亞胺(EDC) 4°C反應(yīng)17-20小時，裝入透析袋于1000ml 0. 01mol/L pH7. 4PB中透析，換液4次，取出凍存于-15°C以下備用。上述本發(fā)明的試劑盒中，所述的HA酶結(jié)合物是由透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(HABP)和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的HABP抗體分別按體積比I : 2000和I : 6500稀釋到酶稀釋液中(含50mmol/L ΡΒ,Ο. 25% BSA，10%丙三醇)，經(jīng)過4°C 20小時二者充分反應(yīng)后配制而成。上述本發(fā)明的試劑盒中，所述的HA酶結(jié)合物中HABP的制備方法如下取新鮮牛鼻軟骨，洗凈后切成小塊，加入4mol/L鹽酸胍，制成均漿，4°C提取30小時，抽提液13000g離心I小時，上清液對水透析，冷凍干燥后即得HABP粗品，HABP粗品I. 6g，溶于25ml 0. ImoI/L Tris-HCKpH 7. 3)中，加入5mg胰蛋白酶，于37°C溫育2小時，加入Img大豆胰蛋白酶擬制因子，在上述HABP粗品酶解液中，加入38g鹽酸胍，用0. 5mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液補足體積至50ml，與親和層析凝膠混合，置于透析袋中，對蒸餾水透析，4°C過夜，透析后將凝膠裝柱，依次用lmol/L和3mol/L的氯化鈉(NaCl)梯度洗脫未吸附物及雜蛋白，然后用4mol/L鹽酸胍洗脫，分步收集洗脫液，各組份分別取少量與碘標(biāo)記HA (125I-HA)反應(yīng)，合并與125I-HA有結(jié)合的組份，對水透析后，用PEG20000進行濃縮成3mg/ml，凍存于-15°C以下保存。上述本發(fā)明的試劑盒中，所述的HA酶結(jié)合物中HABP抗體的制備方法如下采用常規(guī)免疫法將HABP按照O. 5mg/kg的免疫劑量融合完全佐劑多點注射到大耳白實驗用兔子的背部皮下，間隔15天后相同方法、相同免疫劑量注射HABP融合的不完全佐劑，共免疫5次，頸動脈取血，分離出血清，測定血清滴度，硫酸銨2次分級沉淀得到兔IgG，透析于2000ml50mmol/L pH7. 4PB緩沖液中過夜，透析4次后取出，凍存于_15°C以下備用。上述本發(fā)明的試劑盒中，所述的HA酶結(jié)合物中酶標(biāo)記HABP抗體的制備方法如下采用改良高碘酸鈉氧化法將HABP抗體與辣根過氧化物酶(HRP)聯(lián)結(jié)稱取5mg HRP溶解于Iml蒸餾水中，加入O. 2ml新配的O. lmol/L高碘酸鈉(NaI04)溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，將上述溶液裝入透析袋中，對lmmol/L pH4. 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜，加20 μ I
0.2mol/L pH9. 5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9· O 9· 5，然后立即加入IOmgHABP抗體在ImlO. OlM碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時，加O. Iml新配的4mg/ml硼氫化鈉(NaBH4)液，混勻，再置4°C 2小時，將上述液裝入透析袋中，對O. 15mol/L pH7. 4PB透析，4°C過夜。上述本發(fā)明的試劑盒中，所述的化學(xué)發(fā)光底物液A的制備方法為6mmol/L過氧化氫，50mmol/L pH7. ITris-HCL緩沖液；化學(xué)發(fā)光底物液B的制備方法為4mmol/L Luminol,
1.2mmol/L p-iodophenol, 50mmoI /T, pH8. 6Tris_HCl 緩沖液。上述本發(fā)明的試劑盒中，所述的數(shù)據(jù)擬合方法為以校準(zhǔn)品的標(biāo)示濃度的Log值為橫坐標(biāo)，以(1-B/BJ值為縱坐標(biāo)的數(shù)學(xué)擬合方程。上述本發(fā)明的試劑盒中，所述的HA校準(zhǔn)品和HA酶結(jié)合物的加樣量均為50μ 1，一步法，反應(yīng)時間為I小時。上述本發(fā)明的試劑盒中，所述的與HA偶聯(lián)的BSA可以被其它蛋白或多肽替代；微孔板可以被其它適宜包被的材料，如塑料試管、塑料珠等替代；用于標(biāo)記的辣根過氧化物酶可以被堿性磷酸酶或其它熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物替代，并用相應(yīng)的儀器進行檢測。


附圖I為本發(fā)明檢測方法的流程圖附圖2 :本發(fā)明與北方所放射免疫試劑盒測值相關(guān)性比較圖
具體實施例方式實施例I :制備本發(fā)明的透明質(zhì)酸一歩法化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒一、HA校準(zhǔn)品的制備。l、50mmol/L ρΗ7· 4 磷酸鹽緩沖液(PB)Na2HPO4 · 12Η20 14. 5 克NaH2PO4 · 2H20 I. 48 克溶解于1000ml去離子水中，測其pH值為7. 4。
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中加5%小牛血清。2、將HA濃抗原準(zhǔn)確稀釋成25，50，100，200,400,800ng/ml幾個濃度，SO為校準(zhǔn)品稀釋液，共7瓶。ニ、HA包被板的制備緩沖液I :包被液SOmmo I /T, pH7. 4PB 緩沖液2:封閉液SOmmoI /T, pH7. 4PB10% 蔗糖O. 5% BSA0.1% 防腐剤。包被板的制備將HA-BSA按比例稀釋到50mmol/L pH7. 4PB包被液，100 μ I/孔加到微孔板中，2 8°C放置過夜，扣干。加入封閉液150 μ I/孔，2 8°C放置過夜，棄去封閉液，扣干，待其自然干燥后，用鋁箔袋真空密封后備用。三、濃縮洗滌液的制備。配方為15% NaClI % 吐溫(Tween 20)50mmol/L pH7. 4 磷酸鹽緩沖液混合均勻，分別按20ml/瓶分裝，2_8°C儲存。實施例2 :本發(fā)明的透明質(zhì)酸一歩法化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒的操作方法。以上實施例I制備的透明質(zhì)酸一歩法化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒的具體操作方法為a.向微孔板各孔中加入50 μ I HA校準(zhǔn)品或待測樣本。b.向微孔板各孔中加入50 μ I HA酶結(jié)合物。c.將微孔板放置振蕩器上，室溫振蕩反應(yīng)60分鐘。d.棄去微孔板內(nèi)液體，每孔加入洗滌液，靜置30秒鐘后吸干或甩干。如此反復(fù)洗滌5次。結(jié)束后在紙上將微孔板扣干。e.每孔各加入50 μ I (I滴)底物液A和底物液B，加樣完畢后將微孔板震蕩混合。f.在室溫(14 28°C )環(huán)境下避光反應(yīng)10分鐘后在微孔發(fā)光儀上測量各孔發(fā)光值。實施例3本發(fā)明透明質(zhì)酸一歩法化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒的方法學(xué)鑒定按照本領(lǐng)域常規(guī)制造及檢定規(guī)程對實施例I中制備的試劑盒進行檢定，結(jié)果見表I。表I試劑盒的方法學(xué)鑒定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種ー步法檢測透明質(zhì)酸(HA)的化學(xué)發(fā)光試劑盒，其特征在于試劑盒包括1)HA校準(zhǔn)品2) HA包被板3) HA酶結(jié)合物4)化學(xué)發(fā)光底物液A和化學(xué)發(fā)光底物液B。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的HA包被板上包被有與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)的 HA(HA-BSA)。
3.如權(quán)利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所述的HA-BSA按照如下方法制備準(zhǔn)確稱取5mg HA抗原，溶解于2ml O. lmol/L pH 5. 6磷酸鹽緩沖液(PB)加IOmg牛血清白蛋白，溶解后加5mg I-こ基-3-(3-ニ甲基氨基丙基)-碳ニ亞胺(EDC) 4 °C反應(yīng)17-20小吋，裝入透析袋于IOOOml O. 01mol/L pH7. 4PB中透析，換液4次，取出凍存于-15°C以下備用。
4.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的HA酶結(jié)合物是由透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(HABP)和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的HABP抗體分別按體積比I : 2000和I : 6500稀釋到酶稀釋液中(含50mmol/L PB, O. 25% BSA，10%丙三醇)，經(jīng)過4°C 20小時二者充分反應(yīng)后配制而成。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于其中HABP的制備方法如下取新鮮牛鼻軟骨，洗凈后切成小塊，加入4mol/L鹽酸胍，制成均漿，4°C提取30小時，抽提液13000g離心I小時，上清液對水透析，冷凍干燥后即得HABP粗品，HABP粗品I. 6g，溶于25ml O. lmol/LTris-HCKpH 7. 3)中，加入5mg胰蛋白酶，于37°C溫育2小時，加入Img大豆胰蛋白酶擬制因子，在上述HABP粗品酶解液中，加入38g鹽酸胍，用O. 5mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液補足體積至50ml，與親和層析凝膠混合，置于透析袋中，對蒸餾水透析，4°C過夜，透析后將凝膠裝柱，依次用lmol/L和3mol/L的氯化鈉(NaCl)梯度洗脫未吸附物及雜蛋白，然后用4mol/L鹽酸胍洗脫，分步收集洗脫液，各組份分別取少量與碘標(biāo)記HA (125I-HA)反應(yīng)，合并與125I-HA有結(jié)合的組份，對水透析后，用PEG 20000進行濃縮成3mg/ml，凍存于-15°C以下保存。
6.如權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于其中HABP抗體的制備方法如下采用常規(guī)免疫法將HABP按照0. 5mg/kg的免疫劑量融合完全佐劑多點注射到大耳白實驗用兔子的背部皮下，間隔15天后相同方法、相同免疫劑量注射HABP融合的不完全佐劑，共免疫5次，頸動脈取血，分離出血清，測定血清滴度，硫酸銨2次分級沉淀得到兔IgG，透析于2000ml 50mmol/L pH7. 4PB緩沖液中過夜，透析4次后取出，凍存于-15°C以下備用。
7.如權(quán)利要求4，5或6所述的試劑盒，其特征在于其中酶標(biāo)記HABP抗體的制備方法如下采用改良高碘酸鈉氧化法將HABP抗體與辣根過氧化物酶(HRP)聯(lián)結(jié)稱取5mg HRP溶解于Iml蒸餾水中，加入0. 2ml新配的0. lmol/L高碘酸鈉(NaIO4)溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。將上述溶液裝入透析袋中，對lmmol/L pH4. 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜。加20 μ I 0. 2mol/L pH9. 5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9. O 9. 5，然后立即加AlOmg HABP抗體在Iml 0. OlM碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時，加0. Iml新配的4mg/ml硼氫化鈉(NaBH4)液，混勻，再置4°C 2小時，將上述液裝入透析袋中，對0. 15mol/L pH7. 4PB 透析，4°C過夜。
8.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的化學(xué)發(fā)光底物液A的制備方法為6mmol/L過氧化氫，50mmol/L pH7. ITri s-HCL緩沖液；化學(xué)發(fā)光底物液B的制備方法為4mmol/L Luminol, I. 2mmol/L p-iodophenol, 50mmoI /T, pH8. 6Tris-HCl 緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種一步法進行人血清、體液或組織勻漿中透明質(zhì)酸含量檢測的化學(xué)發(fā)光法試劑盒，屬免疫分析醫(yī)學(xué)范疇。其采用固相包被及間接標(biāo)記酶技術(shù)，從根本上解決了透明質(zhì)酸試劑盒不能一步法檢測的難題，可以讓操作更方便，讓檢測更準(zhǔn)確，讓試劑更穩(wěn)定。本發(fā)明試劑盒包括有校準(zhǔn)品；包被板；酶結(jié)合物和化學(xué)發(fā)光底物液A和B。試劑盒中HA校準(zhǔn)品和酶結(jié)合物的加樣量均為50μl，一步法，反應(yīng)時間1小時。通過嚴謹?shù)姆椒▽W(xué)鑒定，確定了科學(xué)合理的正常值范圍，并對臨床測值結(jié)果與放免法試劑盒進行統(tǒng)計學(xué)比較，表明試劑盒具備靈敏度高，測值準(zhǔn)確，重復(fù)性好，試劑穩(wěn)定等諸多技術(shù)優(yōu)點，值得市場的大力推廣和應(yīng)用。
文檔編號G01N33/532GK102692408SQ201210125220
公開日2012年9月26日 申請日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月26日
發(fā)明者白云鵬 申請人:北京北方生物技術(shù)研究所