專利名稱：一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis, TB )感染所致的人類疾病，是分支桿菌病的主要類型，主要通過呼吸道傳播。自1882年德國科學(xué)家RrobertKoch發(fā)現(xiàn)TB以來，全球約有兩億人死于TB，且疫情發(fā)展日趨嚴(yán)重。據(jù)WHO預(yù)計，全球現(xiàn)有TB病人2000萬，如不控制今后10年還將有9000萬人發(fā)病。我國現(xiàn)有3. 3億結(jié)核菌感染者，肺結(jié)核病人600多萬，其中有嚴(yán)重傳染性的病人150萬，每年死于結(jié)核病的達(dá)25萬人。因此，結(jié)核病的預(yù)防、早期診斷和及時治療是高度關(guān)注的課題。MTB有H37RV與H37Ra兩種標(biāo)準(zhǔn)菌株，前者為毒力株而后者為減毒突變株，它們均來源于1934年的人肺H37分離株。 與一些臨床分離株不同的是，H37RV對藥物敏感、利于基因工程操作并在TB動物模型中保留了完整毒力，因而該菌株被廣泛應(yīng)用于TB相關(guān)的生物醫(yī)藥研究(MTb H37RV project atSanger Institute, NCBI)。目前常用的結(jié)核病診斷方法有胸部X光透視和主要依靠患者痰液、胸水、支氣管肺泡液的顯微鏡直接涂片檢查(AFP)和培養(yǎng)法，以及分子生物學(xué)和血清學(xué)檢查，這些方法多基于高特異性的抗原建立。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白基因SocAB-murB和其編碼的一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白SocAB-murB。一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白基因凡其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白SocAB-murB，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。一種結(jié)核分枝桿菌蛋白SocAB-murB的表達(dá)載體pET-28b-5bcy45- tfr_5,其特征在于在pET-28b中插入了其堿基序列如SEQ ID NO: I所示的基因?！N表達(dá)結(jié)核分枝桿菌蛋白的工程菌株，其特征在于它是轉(zhuǎn)染了權(quán)利要求3所述的一種結(jié)核分枝桿菌蛋白的表達(dá)載體pET-28b-5bdS- /_r5的大腸桿菌BL21 (DE3)。本發(fā)明的另一個目的是一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白基因SocAB-murB及其編碼的重組蛋白的制備方法的制備方法。一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白基因SocAB-murB的制備方法，它包括以下步驟
I)提取結(jié)核分支桿菌H37RV的基因組；以其為模板，用引物
Fl ATCGCATATG TCGATACACCATGGGGACATTTGCCCTCCARl TCCGTTTCATACCACCACCACCCGTAACGCCCTGAF2 ACGGGTGGTGGTGGTATGAAACGGAGCGGTGTCGGTTCGCTCTR2 ATCGCTCGAG CAACATGCAGCCGATCAGCACGGGTT進(jìn)行第一輪擴增，獲得基因片段^irnrB ·，2)以第一輪擴增獲得的基因片段和欣/ri ，為模板，用引物
Fl ATCGCATATG TCGATACACCATGGGGACATTTGCCCTCCAR2 ATCGCTCGAG CAACATGCAGCCGATCAGCACGGGTT
進(jìn)行第二輪擴增，連接基因片段SocAB ^murB,獲得目的融合基因SocABuurB。一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白SocAB-murB的制備方法，它包括以下步驟
I)將權(quán)利要求5所述的一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白基因SocAB-murB的制備方法制得的融合基因SocAB-murB,插入表達(dá)載體pET_28b中，獲得質(zhì)粒pET-28b-5bcy4Z - tfri 。2)將質(zhì)粒pET-28b-5bdS- /r凡轉(zhuǎn)染至大腸桿菌BL21 (DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)、純化。本發(fā)明的又一個目的是，所述的結(jié)核分枝桿菌重組蛋白SocAB-murB在制備結(jié)核 分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒中作為檢測抗原的應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白的基因SocABiurB及其表達(dá)的一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白SocAB-murB，重組蛋白SocAB-murB具有高特異性、強免疫原性和盡量完整的抗原決定簇，用本發(fā)明提供的結(jié)核分枝桿菌重組蛋白SocAB-murB作為抗原，制備的檢測結(jié)核分枝桿菌抗體IgG試劑盒，與市場上的同類試劑盒相比，具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，很好的滿足了 TB感染臨床診斷的需要。


圖I為第二輪PCR擴增產(chǎn)物SocAB-murB的凝膠電泳 圖2是表達(dá)質(zhì)粒pET-28b- SocAB-murB的構(gòu)建流程 圖3是誘導(dǎo)后菌體12% SDS - PAGE電泳圖，其中M表示Marker，I表示目的蛋白。
具體實施例方式實施例I 一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白基因的制備 重組蛋白基因SocAB-murB的融合
通過計算機分析TB H37RV基因組全序列，篩選出結(jié)核分枝桿菌的強抗原表位SocAB蛋白(GenBank: HM222605. I)、murB (GenBank: EU840989. I) DNA 序列，并設(shè)計擴增引物。5bc仙擴增引物
Fl ATCGCATATG TCGATACACCATGGGGACATTTGCCCTCCA 50. 0% Tm=66. 71Rl TCCGTTTCATACCACCACCACCCGTAACGCCCTGA 57. 14% Tm=64. 59murB擴增引物
F2 ACGGGTGGTGGTGGTATGAAACGGAGCGGTGTCGGTTCGCTCT 60. 47% Tm=67. 79R2 ATCGCTCGAG CAACATGCAGCCGATCAGCACGGGTT 58. 33% Tm=65. 07Fl和Rl用于擴增SocAB基因的片段，F(xiàn)2和R2用于擴增欣/_^5基因的片段；引物Fl和R2分別帶有NdeI和XhoI的酶切位點，引物F2和Rl順序互補，并共同對應(yīng)于基因片段的5’末端序列；
結(jié)核分支桿菌H37RV(購自中國藥品生物制品檢定所)的菌體，加IOOmL蛋白酶K(10mg/mL),置56°C水浴消化4小時，用常規(guī)酚/氯仿法純化，獲得結(jié)核分支桿菌H37RV基因組；
以結(jié)核分支桿菌H37RV基因組為模板，以引物Fl和Rl擴增SocAB基因的片段，以引物F2和R2擴增murB基因的片段；
50 mL 擴增體系ddH20 31. 5 mL, IOXbuffer 5. O mL, 4XdNTP 4. O mL,上、下游引物混液 4.0 mL, DNA I. 5 mL, Taqplus O. 2 mL (I U)；
進(jìn)行第一輪擴增；產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后切割，將含DNA條帶的膠塊按DNA快速純化試劑盒(購自六合通-北京TAKARA公司，產(chǎn)品名稱TAKARA MiniBEST Plasmidpurification)說明回收DNA 'SocAB目的DNA片段和■/_/·/ 目的DNA片段
以第一輪PCR擴增得到的目的DNA片段和目的DNA片段為模板，加入引物Fl和R2擴增皿ri 目的DNA片段；擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如附圖I所示；
也就是以SocAB取murB基因片段為模板用連接PCR擴增SocAB、murB融合基因，中間以4個Gly (ggtggtggtggt)連接；得融合基因片段目的DNA片段表達(dá)載體mUSocAB-inurB的構(gòu)建及鑒定
質(zhì)粒DNA和 SocAB-murB均經(jīng)內(nèi)切酶切，50 mL體系10 x buffer 5.0 mL, DNA 12mL，Xho I和Nde I各15 U，ddH20補至50 mL;37°C水浴6 h ；50 mL酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，切割DNA條帶瓊脂塊，并用DNA快速純化試劑盒回收DNA ；
將融合基因片段克隆至pET-28b質(zhì)粒(具有Xho I和Nde I酶切位點，購自華美生物公司)，20 mL 連接體系ddH2015.0 mL, 10 x buffer 2. O mL, PET_28b 2.0 mL, Pab
I.0 mL, T4DNA連接酶20 U ;質(zhì)粒自身連接對照，20 mL連接反應(yīng)體系ddH2 O 16. O mL,10 X buffer 2. OmL, PET_28b 2. O mL, T4DNA 連接酶 20 U ;按上述加樣后，混勻、稍離心，14°C _16°C連接過夜；轉(zhuǎn)化疋coli涂平板(含有15微克/毫升卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基)并挑克隆提質(zhì)粒測序，確定序列正確的克隆，質(zhì)粒構(gòu)建圖見附圖2。測序引物為Fl和R2及T7 promoter和T7 terminator的通用引物。所有擴增引物和測序引物的合成以及重組質(zhì)粒序列pET-28b-5bdi - /_ri 的測定都由華大基因公司提供服務(wù)。測得目的融合基因SocABimrB的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。實施例2結(jié)核分枝桿菌重組蛋白的表達(dá)、純化
將驗證正確克隆的質(zhì)粒(pET-28b-轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)(購自華美
生物公司)宿主菌，目的蛋白在包含體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)將含有pET-28b- SocAB-murB,的BL21(DE3)宿主菌培養(yǎng)到OD 0.6，用終濃度ImM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，4小時之后收集菌體、超聲破碎、高速離心、收集沉淀。對收集的沉淀用Ni柱(Pharmcia公司chelating sephrose fastflow)進(jìn)行純化，用如下溶液洗脫300mM咪唑，20mM Tris,500Mm NaCl，8M Urea。核分枝桿菌重組蛋白融合基因表達(dá)的蛋白共477個氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。實施例3結(jié)核分枝桿菌重組蛋白鑒定
I、純度和分子量的測定經(jīng)SDS - PAGE電泳檢測(蛋白上樣量10 μ g)，為單一區(qū)帶，薄層掃描鑒定純度為95. 8%。分子量約為51Kd，檢測結(jié)果見附圖3。濃度測定經(jīng)Folin-酚法測定，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)參比品，抗原蛋白濃度為 3. 2±0· 15mg/mL。
活性測定用間接ELISA方法測定。包被量2. O μ g/孔，使用內(nèi)部質(zhì)控血清測定OD值。結(jié)果見表I。
表1結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白活性測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白基因凡其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。
2.一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白SocAB-murB，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一種結(jié)核分枝桿菌蛋白SocAB-murB的表達(dá)載體pET-28b-5bcJi - tfri ,其特征在于在pET-28b中插入了其堿基序列如SEQ ID NO: I所示的基因。
4.一種表達(dá)結(jié)核分枝桿菌蛋白的工程菌株，其特征在于它是轉(zhuǎn)染了權(quán)利要求3所述的一種結(jié)核分枝桿菌蛋白的表達(dá)載體pET-28b-5bdS- /_r5的大腸桿菌BL21 (DE3)。
5.一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白基因的制備方法，它包括以下步驟 1)提取結(jié)核分支桿菌H37RV的基因組；以其為模板，用引物Fl ATCGCATATG TCGATACACCATGGGGACATTTGCCCTCCARl TCCGTTTCATACCACCACCACCCGTAACGCCCTGAF2 ACGGGTGGTGGTGGTATGAAACGGAGCGGTGTCGGTTCGCTCTR2 ATCGCTCGAG CAACATGCAGCCGATCAGCACGGGTT進(jìn)行第一輪擴增，獲得基因片段^irnrB ·， 2)以第一輪擴增獲得的基因片段和欣/ri ，為模板，用引物Fl ATCGCATATG TCGATACACCATGGGGACATTTGCCCTCCAR2 ATCGCTCGAG CAACATGCAGCCGATCAGCACGGGTT 進(jìn)行第二輪擴增，連接基因片段SocAB ^murB,獲得目的融合基因SocABuurB。
6.—種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白SocAB-murB的制備方法,它包括以下步驟 1)將權(quán)利要求5所述的一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白基因SocABimrB的制備方法制得的融合基因SocAB-murB,插入表達(dá)載體pET_28b中，獲得質(zhì)粒pET_28b-5bcJi - tfri ；2)將質(zhì)粒pET-28b-5bdS- /r凡轉(zhuǎn)染至大腸桿菌BL21(DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)、純化。
7.權(quán)利要求2所述的結(jié)核分枝桿菌重組蛋白SocAB-murB在制備結(jié)核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒中作為檢測抗原的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白的基因SocAB-murB及其表達(dá)的一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白SocAB-murB，重組蛋白SocAB-murB具有高特異性、強免疫原性和盡量完整的抗原決定簇，用本發(fā)明提供的結(jié)核分枝桿菌重組蛋白SocAB-murB作為抗原，制備的檢測結(jié)核分枝桿菌抗體IgG試劑盒，與市場上的同類試劑盒相比，具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，很好的滿足了TB感染臨床診斷的需要。
文檔編號G01N33/68GK102660559SQ20121013057
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月28日
發(fā)明者于庭, 包洪, 張宇, 李艷蕾, 肖霞, 金玉芬, 黃晶 申請人:吉林大學(xué)