專利名稱：一種基于不同嚴(yán)謹(jǐn)度的用于檢測(cè)dna結(jié)合蛋白的微孔板核酸雜交elisa方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于不同嚴(yán)謹(jǐn)度的用于檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白的微孔板核酸雜交ELISA方法。
背景技術(shù)：
DNA binding protein (全文中統(tǒng)稱為“DNA結(jié)合蛋白”)是指含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可與單鏈或雙鏈DNA特異性或普遍結(jié)合的一類蛋白。轉(zhuǎn)錄因子是序列特異性DNA結(jié)合蛋白，含有一個(gè)或多個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBDs)，可與特異的DNA序列結(jié)合進(jìn)而調(diào)控遺傳信息的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，控制細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞周期，分化以及對(duì)外界環(huán)境的應(yīng)答。轉(zhuǎn)錄因子是基因表達(dá)調(diào)控通路及網(wǎng)絡(luò)的樞紐，許多疾病都與轉(zhuǎn)錄因子的異常表達(dá)及活化存在密切的關(guān)系。因此，有關(guān)檢測(cè)分析轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及活化程度的方法技術(shù)研究一直是生物科學(xué)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。目前，已經(jīng)建立多種基于DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及活化程度的檢測(cè)分析方法。最經(jīng)典的是1981年Garner，M. M.發(fā)明的凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)，即EMSA (Electrophoresis Mobility Shift Assay)。該技術(shù)最初用于研究 DNA 結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動(dòng)得慢，以此來(lái)反映轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及活化程度。這一技術(shù)目前仍非常有效地用于轉(zhuǎn)錄因子蛋白檢測(cè)分析，但存在放射性標(biāo)記對(duì)實(shí)驗(yàn)人員及環(huán)境危害的缺陷。因此后來(lái)發(fā)展了一系列對(duì)此技術(shù)進(jìn)行非放射性標(biāo)記的改進(jìn)。DNase印跡法(Galas, D. J., 1978)，外切核酸酶法(Wang. J. K，2006 )以及最近發(fā)展起來(lái)的染色質(zhì)免疫共沉淀芯片(Bulyk，M.L，2006; Zhu, C.，etal. , 2009;Viggiani, C.J.，2009)，蛋白質(zhì)結(jié)合微陣列(Bulyk，M. L, 2006)和電化學(xué)方法(Boon，E.M.，2002)等等也是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及活化程度的方法，但是這些方法都有一定的缺陷，如步驟復(fù)雜，耗時(shí)，需要相應(yīng)的儀器，需要特異性抗體等等。轉(zhuǎn)錄因子和DNA之間的相互作用一直是科研工作者關(guān)注的對(duì)象。鑒于這些技術(shù)目前仍然存在的缺點(diǎn)，發(fā)展一種既不需要針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的特異性抗體又不需要放射性標(biāo)記或核酸酶的轉(zhuǎn)錄因子的檢測(cè)方法具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和活化水平的檢測(cè)技術(shù)中存在的問(wèn)題和不足，提供一種基于不同嚴(yán)謹(jǐn)度雜交的DNA結(jié)合蛋白的ELISA檢測(cè)方法，它主要通過(guò)DNA binding protein在低嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下能增強(qiáng)雙鏈DNA結(jié)合的穩(wěn)定性，因而在高嚴(yán)謹(jǐn)洗脫條件下能夠穩(wěn)定的以雙鏈形式存在而不被洗脫的原理，配合HRP顯色，用來(lái)檢測(cè)DNAbinding protein。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)DNA binding protein表達(dá)和活化水平的新方法。所述的基于不同嚴(yán)謹(jǐn)度雜交的DNA binding protein的ELISA檢測(cè)方法,包括單鏈核酸分子包被微孔板的制備和運(yùn)用制備的微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白。核酸分子包被微孔板的技術(shù)關(guān)鍵是如何將核酸分子牢固地連接固定到微孔板內(nèi)，使固定的核酸分子既保持與液相中DNA binding protein的結(jié)合活性,又能夠經(jīng)受頻繁的洗滌而不致脫落。為了使固定的核酸分子具有與液相中轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合的活性，要求用于固定的核酸分子具有足夠的長(zhǎng)度，特別是核酸分子上所嵌合的轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合序列，要與微孔板表面間存在充分的距離，避免微孔板表面對(duì)核酸分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)造成空間障礙。用于與微孔板表面連接的核酸分子的一端應(yīng)連接較長(zhǎng)的手臂分子(arm，linker，spacer molecules),如 C12、PEG (Hexaethylene glycol)等。微孔板表面固定的核酸分子密度要適宜，避免過(guò)密的核酸分子造成蛋白質(zhì)結(jié)合的空間障礙。在微孔板內(nèi)包被核酸分子過(guò)程中，要注意洗滌以除去那些未吸附到微孔板的核酸分子，還要注意進(jìn)行封閉，避免造成非特異性結(jié)合的假陽(yáng)性結(jié)果。制備了單鏈核酸分子包被的微孔板為本發(fā)明轉(zhuǎn)錄因子蛋白的檢測(cè)提供了工具。首先要將與之不完全互補(bǔ)的單鏈核酸，和含有轉(zhuǎn)錄因子蛋白的細(xì)胞全蛋白或核蛋白抽提物，與微孔板在適宜溫度下孵育適當(dāng)時(shí)間，使轉(zhuǎn)錄因子蛋白，微孔板包被的核酸，加入的不完全互補(bǔ)的核酸結(jié)合，形成“核酸/蛋白質(zhì)”復(fù)合物。在這個(gè)過(guò)程中應(yīng)在DNA結(jié)合緩沖液中加入適量的非競(jìng)爭(zhēng)性DNA，如鮭魚精DNA，poly(d1-dC)等，防止形成非特異性結(jié)合。然后在適宜溫度下進(jìn)行高嚴(yán)謹(jǐn)洗脫，洗去那些沒(méi)有DNA binding protein保護(hù)結(jié)合不牢固的核酸。最后進(jìn)行化學(xué)生色或發(fā)光技術(shù)進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。該方法通過(guò)以下步驟可以快速的實(shí)現(xiàn)DNA binding protein的檢測(cè)分析
(1)準(zhǔn)備核酸分子，包括固定探針和顯色探針，均為單鏈核酸； (2)將固定探針連接固定到微孔板內(nèi)；
(3)將DNAbinding protein和顯色探針與微孔板共孵育；
(4)高嚴(yán)謹(jǐn)洗脫，除去未穩(wěn)定結(jié)合的核酸分子；
(5)顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色,反應(yīng)DNAbinding protein的表達(dá)和活化水平。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明據(jù)有如下有益效果
本發(fā)明提供了一種制備和使用成本較低的檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和活化水平的新方法，依靠用于傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的酶標(biāo)儀，運(yùn)用成熟的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程，在不需要核酸酶和針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的特異性抗體的情況下，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和活化水平的高通量檢測(cè)分析，具有高靈敏度、低費(fèi)用、不需要使用核酸酶和針對(duì)DNA結(jié)合蛋白的特異性抗體的優(yōu)點(diǎn)。


圖1為本發(fā)明所述方法的實(shí)驗(yàn)步驟示意圖2為不同濃度DNA結(jié)合蛋白c-jun的檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。
此處僅僅以基于不同嚴(yán)謹(jǐn)度的微孔板核酸雜交的ELISA方法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白c-Jun的實(shí)驗(yàn)，示例說(shuō)明本發(fā)明專利的具體實(shí)施方式
(圖1)。實(shí)施例地高辛標(biāo)記的單鏈核酸和與之不完全互補(bǔ)的biotin標(biāo)記的核酸的設(shè)計(jì)及化學(xué)合成
c-Jun是核轉(zhuǎn)錄激活蛋白I(AP-1)家族的組成成員。AP-1蛋白家族主要包括Jun (c-Jun、Jun-B 和 Jun. D)和 Fos (c_Fos、FosB、Fra_l 和 Fra. 2)2 個(gè)蛋白家族。c-Jun不僅和Jun或Fos家族成員結(jié)合，以AP-1的形式發(fā)揮生物學(xué)功能，也可以單獨(dú)作為轉(zhuǎn)錄因子參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。各種刺激如生長(zhǎng)信號(hào)、紫外線或環(huán)境污染物可以誘導(dǎo)c-Jun活化，活化的c-Jun通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，參與增殖、分化和細(xì)胞凋亡等多種生理過(guò)程。c-Jun功能異常與許多疾病如惡性腫瘤、腦血管病等的發(fā)生密切相關(guān)。c-jun是一類序列特異性轉(zhuǎn)錄因子，基因組中與c-jun結(jié)合的共同基序(consensus)DNA序列發(fā)生序列特異性識(shí)別結(jié)合,調(diào)控基因的表達(dá)?；蚪M中與c-Jun結(jié)合的共同基序DNA序列表達(dá)一般為5’-TGA(G/C)TCA-3’。因此，設(shè)計(jì)和制備用于檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的核酸分子時(shí)，所準(zhǔn)備的哦核酸分子上必須含有c-Jun結(jié)合的共同繼續(xù)DNA序列。設(shè)計(jì)并由上海生工合成如下兩條堿基序列反向互補(bǔ)的寡核苷酸，分別用于包被微孔板和檢測(cè)
c-Jun (固定探針)如SEQ ID NO:1所示； c-Jun (顯色探針)如SEQ ID NO:2所示。將5’端修飾有地高辛的寡核苷酸以20nM濃度溶解在PBS中，將5’端修飾有biotin的寡核苷酸以5nM濃度溶解在高嚴(yán)謹(jǐn)雜交液(10 mM HEPES, pH 7.9,50 mMKCl, 2. 5mM DTT, 0.1mM EDTA, 10% Glycerol, 5%BSA)中。地高辛標(biāo)記的單鏈核酸與包被有地高辛抗體的微孔板孵育。地高辛抗體1:3000稀釋，IOOul/孔，4°C包被過(guò)夜后，傾去反應(yīng)液，PBST洗三次除去多余的地高辛抗體；用封閉液(含有1%0VA和10ug/ml的鮭魚精DNA)封閉，200ul/孔，37°C ,封閉2h，傾去封閉液烘干備用。微孔板封閉處理好后，每孔內(nèi)加入IOOul溶解在PBS中的地高辛標(biāo)記的寡核苷酸，37°C孵育30分鐘。傾去反應(yīng)液，用PBST洗三次。至此則制備好了可用于檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子c-jun的單鏈核酸分子包被微孔板。包被好的微孔板密閉保存在4°C冰箱。將DNA binding protein(純蛋白),biotin修飾的核酸與微孔板共孵育；將轉(zhuǎn)錄因子c-Jun蛋白以不同的濃度稀釋在DNA結(jié)合緩沖液(10 mM HEPES，pH7. 9、50 mM KCl, 2. 5mMDTT, 0.1mM EDTA，10% Glycerol, 5%BSA)中，以每孔IOul的體積加入包被的微孔板中，再加A IOOul/孔biotin修飾的寡核苷酸，37°C孵育20分鐘。趁熱傾去反應(yīng)液，拍干。雜交液稀釋的SA-HRP與biotin修飾的核酸反應(yīng)；每孔加入IOOul用雜交液1:1000稀釋的SA-HRP，37°C孵育20分鐘。趁熱傾去反應(yīng)液，拍干。高嚴(yán)謹(jǐn)洗脫3次，除去未穩(wěn)定結(jié)合的核酸分子；200ul/孔雜交液，37°C孵育10分鐘，除去沒(méi)有轉(zhuǎn)錄因子保護(hù)的不穩(wěn)定結(jié)合的核酸分子。HRP底物顯色，反應(yīng)DNA binding protein的表達(dá)和活化水平。加入辣根過(guò)氧化物酶的化學(xué)生色底物，IOOul/孔，室溫孵育適宜時(shí)間，加入濃硫酸，50ul/孔，終止顯色反應(yīng)。將終止顯色反應(yīng)的微孔板置于酶標(biāo)儀中，在480nm波長(zhǎng)下讀取吸光值。依據(jù)蛋白梯度和吸光值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用細(xì)胞全蛋白或核蛋白抽提物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，需要先測(cè)出蛋白濃度，然后用DNA結(jié)合緩沖液稀釋至一定濃度后進(jìn)行檢測(cè)，方法同純蛋白的檢測(cè)。在DNA結(jié)合緩沖液中加入0. 05mg/ml的poly(dl-dC)用于抑制非特異性結(jié)合反應(yīng)。檢測(cè)結(jié)果
檢測(cè)結(jié)果表明該方法能檢測(cè)到3. 75ng的c-jun蛋白，具有很高靈敏度，且在0-60ng之間有較好的 線性。申請(qǐng)人中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院
名稱一種基于不同嚴(yán)謹(jǐn)度的用于檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白的微孔板核酸雜交ELISA方法SEQ ID NO:1 c-Jun (固定探針)AAAAAAAAAAAAAACGCTGACTCATSEQ ID NO:2 c-Jun (顯色探針)AAAAAAAATGAGTCAG
權(quán)利要求
1.一種基于不同嚴(yán)謹(jǐn)度的用于檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白的微孔板核酸雜交ELISA方法，其特征在于所述方法是根據(jù)當(dāng)DNA結(jié)合蛋白存在吋，在高嚴(yán)謹(jǐn)洗脫條件下能增強(qiáng)雙鏈DNA結(jié)合的穩(wěn)定性而不被洗脫的原理，設(shè)計(jì)兩條核酸序列，一條核酸序列是固定探針，含有DNA結(jié)合蛋白特異結(jié)合的核酸序列，該序列末端依據(jù)微孔板表面的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行相應(yīng)的化學(xué)修飾，以便連接固定到微孔板表面；另一條核酸序列是顯色探針，是與固定探針不完全互補(bǔ)的核酸序列，其末端依據(jù)顯色系統(tǒng)進(jìn)行相應(yīng)的修飾，以便檢測(cè)分析；顯色探針與含DNA結(jié)合蛋白的細(xì)胞全蛋白或核蛋白抽提物與微孔板共孵育時(shí)，在高嚴(yán)謹(jǐn)洗脫條件下能夠形成穩(wěn)定雙鏈而不被洗脫下來(lái)，通過(guò)末端修飾標(biāo)記進(jìn)行顯色時(shí)有顏色顯示；若不含有DNA結(jié)合蛋白，顯色探針在高嚴(yán)謹(jǐn)洗脫條件下將會(huì)被洗脫下來(lái)，顯色時(shí)將無(wú)顏色顯示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于不同嚴(yán)謹(jǐn)度的用于檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白微孔板核酸雜交ELISA方法，其特征在于所述方法包括如下步驟 (1)準(zhǔn)備核酸分子，包括固定探針和顯色探針，均為單鏈核酸； (2)將固定探針連接固定到微孔板內(nèi)； (3)將DNA結(jié)合蛋白和顯色探針與微孔板共孵育； (4)高嚴(yán)謹(jǐn)洗脫，除去未穩(wěn)定結(jié)合的核酸分子； (5)顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色，反映DNA結(jié)合蛋白的表達(dá)和活化水平。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于不同嚴(yán)謹(jǐn)度的用于檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白微孔板核酸雜交ELISA方法，其特征在于步驟(I)中所述核酸分子均為化學(xué)合成的單鏈寡核苷酸，其序列中含有DNA蛋白可識(shí)別并與之結(jié)合的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于不同嚴(yán)謹(jǐn)度的用于檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白微孔板核酸雜交ELISA方法，其特征在于步驟(2)和(3)中所述的微孔板表面帶有氨基、羧基、C12或PEG。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于不同嚴(yán)謹(jǐn)度的用于檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白微孔板核酸雜交ELISA方法，其特征在于步驟(2)中所述將固定探針連接固定到微孔板是核酸分子末端修飾的化學(xué)基團(tuán)與微孔板表面修飾的化學(xué)基團(tuán)間發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)，將固定探針固定到微孔板表面。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于不同嚴(yán)謹(jǐn)度的用于檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白微孔板核酸雜交ELISA方法，其特征在于步驟(3)中所述DNA結(jié)合蛋白包括人工表達(dá)制備的、含有DNA結(jié)合蛋白的細(xì)胞全蛋白或核蛋白抽提物。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于不同嚴(yán)謹(jǐn)度的用于檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白微孔板核酸雜交ELISA方法，其特征在于步驟(3)中所述共孵育是核酸序列堿基互補(bǔ)配對(duì)和DNA結(jié)合蛋白與兩條核酸分子間特異性識(shí)別并結(jié)合的過(guò)程。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于不同嚴(yán)謹(jǐn)度的用于檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白的微孔板核酸雜交ELISA方法。本發(fā)明所述方法是通過(guò)DNA結(jié)合蛋白在低嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下能增強(qiáng)雙鏈DNA結(jié)合的穩(wěn)定性，在高嚴(yán)謹(jǐn)洗脫條件下能夠穩(wěn)定的以雙鏈形式存在而不被洗脫的原理，用來(lái)檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白。本發(fā)明所述方法是一種檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白表達(dá)和活化水平的新方法，具有高靈敏度、低費(fèi)用、不需要使用核酸酶和針對(duì)DNA結(jié)合蛋白的特異性抗體的優(yōu)點(diǎn)，既解決了以往檢測(cè)方法中需要核酸酶和特異性抗體的問(wèn)題，又能保證檢測(cè)靈敏度，還可以對(duì)尚未有特異性抗體的DNA結(jié)合蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK103048463SQ201210131678
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月2日
發(fā)明者曾令文, 方志遠(yuǎn), 張文娟 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院