專利名稱：一種快速定量檢測肌鈣蛋白t的免疫熒光試紙條組件及其制成的檢測卡組件和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及ー種快速定量檢測肌鈣蛋白T(cTnT)的免疫熒光試紙條以及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
冠心病已成為影響人群健康的主要疾病。急性心肌梗死則是造成冠心病人死亡的主要原因。如何及時(shí)地發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死病人及其相應(yīng)的治療是挽救心肌梗死病人生命的關(guān)鍵所在。傳統(tǒng)的診斷主要是根據(jù)典型的臨床表現(xiàn)，心電圖的改變及實(shí)驗(yàn)室酶學(xué)檢查。但相當(dāng)一部分心肌梗死病人臨床表現(xiàn)不明顯，早期心電圖無明顯改變。在這種情況下，心肌損傷特異性標(biāo)志物的應(yīng)用對心肌梗死的早期確診就起到了關(guān)鍵的作用。肌鈣蛋白T(Cardiactroponin T，cTnT)是ー重要的心肌組織損傷特異性標(biāo)識物，臨床用于急性心肌梗死及其它心肌損傷性疾病的診斷。肌鈣蛋白是橫紋肌的結(jié)構(gòu)蛋白，由Tnl、TnT和TNC三種亞單位組成。TnT是與原肌球蛋白結(jié)合的亞單位，Tnl是肌原纖維ATP酶的抑制性亞單位，TNC是鈣離子結(jié)合亞単位。這三種亞單位與原肌球蛋白一起構(gòu)成肌凝蛋白(Tm)-肌鈣蛋白(Tn)復(fù)合體。在鈣離子的誘導(dǎo)下，調(diào)節(jié)肌肉收縮和舒張的力量和速度。骨骼肌與心肌中的TnT和TnI是由不同的基因編碼的，導(dǎo)致其氨基酸組成序列的差異，因此可以用免疫學(xué)的方法加以區(qū)分。TNC在骨船肌和心肌中則是相同的。cTnT是僅存在于心肌細(xì)胞中的特異性調(diào)節(jié)蛋白，分兩種形式存在游離形式存在于細(xì)胞胞漿中，占6% 8% ;結(jié)合形式存在于心肌收縮單位中肌纖維的細(xì)肌絲上，占92% 94%。當(dāng)出現(xiàn)可逆性心肌缺血，心肌細(xì)胞尚未壞死，但細(xì)胞膜受到損傷，胞漿中的cTnT可短暫釋放入血；當(dāng)發(fā)生不可逆性心肌缺血，心肌細(xì)胞壞死，細(xì)肌絲降解，可導(dǎo)致結(jié)合池cTnT釋放入血。因此不穩(wěn)定型心絞痛(UAP)患者血液中cTnT僅短暫輕度升高隨后恢復(fù)正常；而AMI患者血中cTnT可顯著升高且維持較長時(shí)間。cTnT在心肌損傷后2 8小時(shí)釋放入血，12 24小時(shí)達(dá)高峰，在血中可維持14天左右，所以它的最大有效診斷窗ロ寬至2小時(shí) 14天。在心肌損傷后,cTnT較cTnl更早釋放入血,更易被檢測到,血中濃度更高，對檢測心肌損傷的價(jià)值也就可能更高。cTnT僅存在于心肌細(xì)胞中，可用免疫酶標(biāo)定量法測得，對心肌損傷的診斷具高度敏感和特異性。雖然早期的測定方法不成熟，使cTnT與骨骼肌TnT有微量交叉反應(yīng)，采用心臟特異和非心臟特異兩種抗體測定cTnT，發(fā)現(xiàn)cTnT與骨骼肌TnT有1% 2%的交叉反應(yīng)。檢測方法改進(jìn)后，采用兩種均為心臟特異的單克隆抗體作為檢測抗體測定cTnT時(shí)，與骨骼肌TnT的交叉反應(yīng)陽性率< O. 5%。對75名無心臟病的骨骼肌損傷患者(其中33名Duchenne病，42名運(yùn)動員馬拉松長跑后)用第二代檢測方法檢測cTnT，未發(fā)現(xiàn)I例假陽性反應(yīng)。另據(jù)Rottbauer報(bào)道，用同樣的方法檢測橫紋肌溶解癥患者或健康人馬拉松長跑后，雖然他們的CK可升至正常高限的300倍，卻檢測不到cTnT，另I 例因こ醇中毒導(dǎo)致嚴(yán)重骨骼肌損傷的患者，雖CK達(dá)35000IU/L(正常高限是200IU/L)，而cTnT卻陰性。自1991年首次發(fā)表cTnT有診斷AMI價(jià)值的文章以來，全世界已經(jīng)有十多個(gè)大型臨床試驗(yàn)證實(shí)其對AMI有重要的診斷價(jià)值。Katus等人最早報(bào)道了 cTnT對診斷AMI是高度敏感和特異的。他們選取387例因胸痛而懷疑AMI的患者測定cTnT，發(fā)現(xiàn)所有AMI患者cTnT均升高(> O. lng/ml)，胸痛發(fā)作24小時(shí)內(nèi)cTnT診斷AMI的敏感性和特異性分別為99%和93%，第2天敏感性和特異性均為100%，因cTnT的升高在血清中持續(xù)時(shí)間較長，故到第6天仍均達(dá)100%;而頭24小時(shí)內(nèi)CK和CK-MB的敏感性分別為99%和98%，特異性分別為75%和92%。cTnT的價(jià)值優(yōu)于CK、CK-MB，在AMI后，cTnT升高幅度是CK-MB升高幅度的5倍，診斷AMI的絕對敏感窗(以癥狀發(fā)作后時(shí)間計(jì))在cTnT也遠(yuǎn)較CK和CK-MB寬，cTnT為10. 5 140小時(shí)，CK和CK-MB為9 31小時(shí)。cTnT診斷AMI的價(jià)值優(yōu)于CK,CK-MB的可能原因有(I)心肌中cTnT的含量較高，每克心室肌(濕重)含10-8mg的cTnT，cTnT總量中的6% 8%存在于胞漿中，而這胞漿中的cTnT量已經(jīng)相當(dāng)于心肌中CK的總量，所以cTnT在AMI后的升高幅度要遠(yuǎn)高于CK(cTnT可達(dá)30 40倍，而CK僅升高9倍)。(2) cTnT在心肌損傷后釋放入血也較CK要早，它最早可在癥狀發(fā)作后I小時(shí)在血中檢出，3 4小時(shí)其敏感性可達(dá)50%。(3)其在血中持續(xù)升高的時(shí)間較長。cTnT大部分(94%)以結(jié)合形式存在于心肌細(xì)胞收縮單位中，它從細(xì)肌絲的肌鈣蛋白復(fù)合物中分離出來的過程是ー個(gè)消耗時(shí)間的過程，且此過程不斷進(jìn)行，因此雖然cTnT在血漿中的半衰期只有120分鐘，但卻可在血中持續(xù)升高達(dá)2周左右。在10. 5 140小時(shí)的絕對敏感診斷窗中，100%的AMI患者cTnT均升高，敏感性是CK的6倍。cTnT的測定始于20世紀(jì)90年代初，多采用雙抗體競爭放射免疫法和競爭性ELISA測定法。有研究者將金標(biāo)記或硒標(biāo)記單克隆抗體與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，用紙條法半定量床邊檢測cTnT濃度，最低檢測值為O. I μ g/L。目前cTnT的檢測多采用化學(xué)發(fā)光法，用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記后作為檢測抗體，大大提高了測定的精確性和敏感性，但需要昂貴的檢測設(shè)備。目前的床旁檢測方法(膠體金試紙法)，不能滿足臨床診斷準(zhǔn)確定量的要求，無法對AMI的病程起到很好的療效監(jiān)測作用。因此，建立ー種檢測時(shí)間盡量縮短，并且檢測除了能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行外，還要求能夠進(jìn)行床旁檢測，同時(shí)能定量測定cTnT的檢測方法，從而為臨床提供準(zhǔn)確的診斷依據(jù)，是十分必要的。申請?zhí)?00610130403. 3公開了ー種化學(xué)免疫分析檢測心肌鈣蛋白T的方法，主要是用辣根過氧化物酶促化學(xué)發(fā)光體系，采用雙單抗夾心法和/或競爭法檢測，該方法需要將樣品和與酶的復(fù)合物(固化與固相載體上)置于在反應(yīng)池內(nèi)，再經(jīng)過洗滌后加入酶的底物、氧化劑以及增強(qiáng)劑便可發(fā)光，這種方法的過程復(fù)雜，且耗時(shí)長。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有cTnT檢測技術(shù)的不足，本發(fā)明提供ー種快速檢測cTnT的試紙條組件，以及由該試紙條組件制成的檢測卡。本發(fā)明根據(jù)免疫熒光技術(shù)特點(diǎn)和cTnT抗原抗體系統(tǒng)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)新的原材料，試劑和エ藝流程，應(yīng)用本發(fā)明提供的試紙條檢測cTnT水平，具有簡單，快速，靈敏和特異性好等特點(diǎn)，可同時(shí)定量檢測高值和低值樣品，并且性價(jià)比高，適用于臨床快速檢測。本發(fā)明提供的快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條的檢測反應(yīng)原理為固相雙抗體夾心法的免疫熒光層析法。待測樣品與適當(dāng)比例的熒光標(biāo)記抗體在液相均質(zhì)介質(zhì)中充分混和均勻，在此過程中樣品中的cTnT能專ー性地與熒光標(biāo)記抗cTnT抗體充分結(jié)合，然后再轉(zhuǎn)加到檢測卡上，流經(jīng)檢測卡中的硝酸纖維膜(NC膜)時(shí)，其中所含的、已反應(yīng)結(jié)合在一起的cTnT-抗cTnT熒光抗體復(fù)合物能為膜上檢測線上固定的抗cTnT的另ー個(gè)抗體特異性捕獲，所發(fā)出的熒光可用專用儀器定量測定，熒光強(qiáng)度與樣品中cTnT濃度成正比。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案ー種快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條組件，包括試紙條和與試紙條配合使用且獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體，試紙條包括底襯、依次接合在底襯上的吸水墊、包被分析膜及樣品墊，該包被分析膜上設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，檢測線包被的特異抗體為抗肌鈣蛋白T單克隆抗體，質(zhì)控線包被的特異抗體為兔IgG抗體；鉬卟啉標(biāo)記特異抗體為抗肌I丐蛋白T單克隆抗體和抗兔IgG抗體。優(yōu)選地，所述底襯一面涂覆黏膠或雙面膠，用以固定所述的吸水墊、包被分析膜及 樣品墊，其中，硝酸纖維膜粘附在所述底襯的中間，兩端分別與所述吸水墊和樣品墊連接。優(yōu)選地，所述吸水墊為ー種濾紙，為吸水紙或?yàn)V油紙；所述吸水墊粘附在所述底襯上，同時(shí)吸水墊與硝酸纖維膜重疊l_2mm連接。優(yōu)選地，所述包被分析膜為硝酸纖維膜，且在所述包被分析膜上噴涂抗肌鈣蛋白T單克隆抗體和兔IgG抗體。優(yōu)選地，所述樣品墊為玻璃纖維膜，且用含O. 01% -O. 5% PEG聚こニ醇、I % ~5%牛血清白蛋白、O. 01% -O. 05%表面活性劑的O. 04M磷酸鹽緩沖液浸泡處理過，其中，磷酸鹽緩沖液PH為7. 2，浸泡處理后，放置在25-40°C溫度下干燥過夜，所述樣品墊與硝酸纖維膜重疊l_2mm連接。優(yōu)選地，所述的獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體為抗肌鈣蛋白T單克隆抗體和抗兔IgG抗體，并分別用含有如下組分的O. 02M磷酸鹽緩沖液稀釋后用塑料瓶密封而得O. 01% -O. 5%聚こニ醇、1% -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油、O. 01% -O. 05%表面活性齊 。優(yōu)選地，所述獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記的激發(fā)光光源范圍為390_420nm，發(fā)射光波長范圍為 600nm-700nm。一種制備上述定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條組件的方法，包括以下步驟I)抗體的制備選用純化的基因工程表達(dá)的抗肌鈣蛋白T單克隆抗體、抗兔IgG抗體和純化的兔IgG ；2)包被分析膜的制備采用噴膜機(jī)分別在ー硝酸纖維膜上畫檢測線和質(zhì)控線，劃線細(xì)致均勻，檢測線與質(zhì)控線間隔5mm ；用檢測線包被緩沖液稀釋抗肌鈣蛋白T單克隆抗體至濃度為10-20ug/ml，采用噴膜機(jī)將抗肌鈣蛋白T單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測線上；用質(zhì)控線包被緩沖液稀釋純化的兔IgG抗體至濃度為10_20ug/ml，采用噴膜機(jī)將純化的兔IgG抗體對應(yīng)噴印在硝酸纖維膜的質(zhì)控線上；
將噴膜后的硝酸纖維膜放入25_40°C的真空干燥箱內(nèi)，干燥后取出密封備用；3)樣品墊的制備將玻璃纖維膜用含O. 01 % -O. 5 %聚こニ醇、I % -5 %牛血清白蛋白、O. 01% -O. 05%表面活性劑的O. 04M磷酸鹽緩沖液浸泡，放入30-50°C的真空干燥箱內(nèi)，干燥后即成樣品墊，取出密封備用；4)鉬卟啉標(biāo)記特異抗體的制備將肌鈣蛋白T單克隆抗體和抗兔IgG抗體，分別用O. IM碳酸氫鈉溶液稀釋至Img/ml,分別加入30-50mg鉬卩卜啉溶解液,攪勻，室溫孵育I小時(shí)，姆隔15分鐘混勻一次,最后用G25凝膠柱過柱分離純化，收集標(biāo)記好的鉬卟啉標(biāo)記抗體，用O. 02M磷酸鹽緩沖液稀釋混勻后于4 C保存；5)免疫熒光試紙條的制備 先將包被分析膜粘附在底襯中間位置上，在包被分析膜一端粘附吸水墊，二者重疊l_2mm ;在包被分析膜另一端粘附樣品墊，二者重疊l_2mm ;再將黏貼好包被分析膜、吸水墊和樣品墊的底襯裁切成細(xì)條；，即成ー種快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙。優(yōu)選地，所述檢測線包被緩沖液為含有O. 8-1 %的甲醇、1-1. 5%海藻糖或者蔗糖、抗肌鈣蛋白T單克隆抗體lmg/ml的50mM pH值為7. 6的磷酸鹽緩沖液或三羥甲基甲胺基丙磺酸緩沖液。優(yōu)選地，所述質(zhì)控線包被緩沖液為含O. 7-1 %的甲醇、O. 5-0. 8%的牛血清白蛋白、兔IgG抗體O. 5mg/ml50mM的pH值為7. 6磷酸鹽緩沖液。應(yīng)用上述快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條的免疫熒光檢測卡組件，所述檢測卡組件包括試紙條組件、用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的蓋板和用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的背板組成的卡盒，所述背板包括放置所述試紙條的卡槽和用干與所述蓋板結(jié)合的卡齒，所述蓋板包括可觀測檢測結(jié)果的檢測窗、可滴加樣品的加樣孔和用干與所述背板的卡齒結(jié)合的固定孔，所述試紙條通過所述卡齒與所述固定孔結(jié)合而嵌合在所述背板和所述蓋板之間，其中，所述包被硝酸纖維膜正對所述檢測窗，所述樣品墊正對所述加樣孔；另外，獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。制備上述快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條組件制成的檢測卡組件的方法，包括以下步驟I)背板和蓋板的制備用聚苯こ烯或聚氯こ烯等塑料材質(zhì)制成背板和蓋板，所述背板包括放置所述試紙條組件的卡槽和用干與所述蓋板結(jié)合的卡齒，所述蓋板包括可測結(jié)果的檢測窗、可滴加樣品的加樣孔以及用干與所述背板的卡齒結(jié)合的固定孔；2)組裝將試紙條放在所述背板的所述卡槽內(nèi)，通過所述背板的卡齒與所述蓋板的固定孔結(jié)合，將試紙條嵌合在背板和蓋板之間，其中，包被分析膜正對所述檢測窗，樣品墊正對所述加樣孔；3)包裝將I人份的檢測卡與一包干燥劑封裝在鋁箔塑料袋內(nèi)，并配備I瓶獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體，將多組所述鋁箔塑料袋和所述獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體裝入一個(gè)包裝盒，在2°C _8°C環(huán)境下避光不凍存的進(jìn)行保存。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用免疫熒光快速檢測技術(shù)，利用熒光的高靈敏特點(diǎn)，且樣品與熒光標(biāo)記抗體在試劑瓶內(nèi)反應(yīng)后再加入檢測卡。由于樣品與熒光標(biāo)記抗體在液相中全面接觸，反應(yīng)充分，因此可大幅度提高反應(yīng)靈敏度，同時(shí)增加了樣品的稀釋倍數(shù)，去除了樣品的基質(zhì)效應(yīng)，使定量結(jié)果有很好的可重復(fù)性，而且此方法省略了直接加樣步驟，提高了定量結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度，可滿足同時(shí)檢測高值和低值的臨床診斷要求。應(yīng)用本發(fā)明提供的試紙條檢測人體內(nèi)cTnT水平，成本低廉，操作簡單、快速、靈敏，且特異性好，只需要配套專用熒光檢測儀，因此可廣泛應(yīng)用于各級醫(yī)療檢驗(yàn)場所，尤其是基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)，包括鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院等均可開展。本發(fā)明對于心腦血管事件發(fā)生的預(yù)防有極為重要的意義。


圖I為本發(fā)明的試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明的檢測卡結(jié)構(gòu)示意圖；圖3是鉬卟啉發(fā)光材料的發(fā)射光譜曲線；圖4為本發(fā)明的反應(yīng)方式示意圖；圖5為本發(fā)明的檢測結(jié)果示意圖；圖6為本發(fā)明的肌鈣蛋白T檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。附圖標(biāo)記1 :底襯；2 :吸水塾；3 :包被分析I旲；4 :檢測線；5 :質(zhì)控線；6 :樣品塾；7 :加樣孔；8 :檢測窗；9 :項(xiàng)目名稱；10 :固定孔；11 :蓋板；12 :卡槽；13 :背板；14 :卡齒；15 :怕B卜琳標(biāo)記抗體；16 :肌韓蛋白T ； 17 :檢測線抗肌韓蛋白T單克隆抗體；18 :質(zhì)控線兔IgG抗體。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)ー步說明，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例一參照附圖I，ー種快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條組件，包括試紙條和與試紙條配合使用且獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體，試紙條包括底襯I、依次接合在底襯I上的吸水墊2、包被分析膜3及樣品墊6，該包被分析膜上3設(shè)有檢測線4和質(zhì)控線5，檢測線4包被的特異抗體為抗肌鈣蛋白T單克隆抗體，質(zhì)控線5包被的特異抗體為兔IgG抗體；鉬卟啉標(biāo)記特異抗體為抗肌鈣蛋白T單克隆抗體和抗兔IgG抗體。其中，底襯I 一面涂覆黏膠或雙面膠，用以固定吸水墊2、包被分析膜3及樣品墊6，其中，包被分析膜3附在底襯I的中間，兩端分別與吸水墊2和樣品墊6連接。吸水墊2為ー種濾紙，為吸水紙或?yàn)V油紙；吸水墊2粘附在底襯I上，同時(shí)吸水墊2與包被分析膜3重疊1-2_連接。包被分析膜3為硝酸纖維膜。樣品墊6為玻璃纖維膜，且用含O. 01% -O. 5% PEG (聚こニ醇)、I % _5 %牛血清白蛋白、O. 01% -O. 05%表面活性劑的O. 04M磷酸鹽緩沖液浸泡處理過，其中，磷酸鹽緩沖液PH為7. 2，浸泡處理后，放置在25-40°C溫度下干燥過夜，樣品墊6與硝酸纖維膜3重疊I-2mm連接。獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體為抗肌鈣蛋白T單克隆抗體和抗兔IgG抗體，并分別用含有如下組分的O. 02M磷酸鹽緩沖液稀釋后用塑料瓶密封而得0. 01%-O. 5%聚こニ醇、1% -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油、O. 01% -O. 05%表面活性剤。制備上述定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條組件的方法，包括以下步驟I)抗體的制備選用純化的基因工程表達(dá)的抗肌鈣蛋白T單克隆抗體和純化的兔IgG。2)包被分析膜3的制備
取硝酸纖維膜，調(diào)試BIO-DOT噴膜機(jī)，膜液量為25ul/35cm，機(jī)器劃線，檢測線與質(zhì)控線間隔5mm，劃線細(xì)致均勻；用檢測線包被緩沖液稀釋抗肌鈣蛋白T單克隆抗體至濃度為10-20ug/ml，采用BIO-DOT噴膜機(jī)將抗肌鈣蛋白T單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測線上；其中檢測線包被緩沖液的制備50mM pH7. 6PBS緩沖液，含甲醇I %、海藻糖I %、牛血清白蛋白O. 5%、ICll抗體lmg/ml ο用質(zhì)控線包被緩沖液稀釋純化的兔IgG至濃度為10_20ug/ml，采用BIO-DOT噴膜機(jī)將純化的兔IgG分別對應(yīng)噴印在硝酸纖維膜的和質(zhì)控線上；其中質(zhì)控線包被緩沖液的制備50mM pH7. 6PB緩沖液，含甲醇I %、牛血清白蛋白O. 8%、兔 IgG 抗體 O. 5mg/ml。將噴印好的硝酸纖維膜放置25°C _37°C真空干燥箱處理I小時(shí)，裝袋密封備用。3)樣品墊6的制備將玻璃纖維膜用含O. 2% PEG、2. 5%牛血清白蛋白、O. 03%表面活性劑的O. 04M磷酸鹽緩沖液浸泡，放入30-50°C的真空干燥箱內(nèi)，干燥3小時(shí)后，即成樣品墊6，取出密封備用；4)鉬卟啉標(biāo)記特異抗體的制備將抗cTnT單克隆抗體和抗兔IgG抗體，分別用O. IM碳酸氫鈉溶液稀釋至Img/ml，各取5ml抗體溶液，分別加入30mg鉬卟啉鉬卟啉溶解液，攪勻，室溫孵育I小時(shí)，每隔15分鐘混勻一次。最后用G25凝膠柱過柱分離純化，收集標(biāo)記好的鉬卟啉標(biāo)記抗體，用含O. 01% -O. 5% PEGU % -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油、O. 01% -O. 05%表面活性劑的O. 02M磷酸鹽緩沖液稀釋，用塑料瓶密封包裝，于4°C保存。5)免疫熒光試紙條的制備先將包被分析膜粘附在底襯I中間位置上，在包被分析膜3 —端粘附吸水墊2，ニ者重疊l-2mm ;在包被分析膜3另一端粘附樣品墊6，二者重疊l_2mm ;再將黏貼好包被分析膜3、吸水墊2和樣品墊6的底襯I裁切成細(xì)條；即成ー種快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫突光試紙。參照附圖2，一種應(yīng)用上述快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條的免疫熒光檢測卡組件，包括試紙條組件、用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的蓋板11和用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的背板13組成的卡盒，背板13包括放置試紙條的卡槽12和用于與蓋板11結(jié)合的卡齒14，蓋板11包括可觀測檢測結(jié)果的檢測窗8、可滴加樣品的加樣孔7和用干與背板的卡齒14結(jié)合的固定孔10,試紙條通過卡齒14與固定孔10結(jié)合而嵌合在背板13和蓋板11之間，其中，包被硝酸纖維膜3正對檢測窗8，樣品墊6正對加樣孔7 ;另外，獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。制備上述快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條組件制成的檢測卡組件的方法，其特征在于包括以下步驟I)制成背板13和蓋板11 用聚苯こ烯或聚氯こ烯等塑料材質(zhì)制成背板13和蓋板11，背板13包括放置所述試紙條組件的卡槽12和用于與蓋板11結(jié)合的卡齒14，蓋板11包括可測結(jié)果的檢測窗8、可滴加樣品的加樣孔7以及用干與背板的卡齒14結(jié)合的固定孔10 ；2)組裝 將試紙條放在背板13的卡槽12內(nèi)，通過背板13的卡齒14與蓋板11的固定孔10結(jié)合，將試紙條嵌合在背板13和蓋板11之間，其中，包被分析膜3正對檢測窗8，樣品墊6正對加樣孔7 ；3)包裝將I人份的檢測卡與一包干燥劑封裝在鋁箔塑料袋內(nèi)，并配備I瓶獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體，將多組所述鋁箔塑料袋和所述獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體裝入一個(gè)包裝盒，在2°C _8°C環(huán)境下避光不凍存的進(jìn)行保存。本發(fā)明的檢測原理參照附圖3，對鉬卟啉發(fā)光材料的發(fā)射光譜曲線進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鉬卟啉所具有的特征光譜的激發(fā)光光源范圍為390_420nm,發(fā)射光波長范圍為600_700nm。由于鉬B卜啉發(fā)光標(biāo)記物的特點(diǎn)，使得以其作為標(biāo)記物的免疫熒光試紙條可與儀器結(jié)合，使得基于鉬卟啉發(fā)光技術(shù)的免疫層析試紙條可進(jìn)行靈敏度極高的多重分析、且對目標(biāo)被檢測物進(jìn)行靈敏度極高的精確定量檢測。另外，本發(fā)明的快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條及檢測卡，利用熒光的高靈敏特點(diǎn)，使待測樣品與鉬卟啉標(biāo)記先在試劑瓶內(nèi)反應(yīng)，由于待測樣品與鉬卟啉標(biāo)記在液相中全面接觸，反應(yīng)充分，因此可大幅度提高反應(yīng)靈敏度，同時(shí)增加了待測樣品的稀釋倍數(shù)，去除了待測樣品的基質(zhì)效應(yīng)，使定量結(jié)果有很好的可重復(fù)性；而且鉬卟啉標(biāo)記上的特異抗體與待測樣品充分結(jié)合形成ー復(fù)合物，然后將復(fù)合物轉(zhuǎn)加到檢測卡的加樣孔7的樣品墊6上，實(shí)現(xiàn)鉬卟啉發(fā)光材料與免疫層析技術(shù)相結(jié)合從而檢測人體內(nèi)肌鈣蛋白T水平。如圖4所示，當(dāng)復(fù)合物加到檢測卡的加樣孔7的樣品墊6上后，在吸水墊2的吸カ下鉬卟啉標(biāo)記抗體15流經(jīng)到檢測卡中的包被分析膜3上，如果該復(fù)合物具有肌鈣蛋白T，其能被檢測線4上的肌鈣蛋白T單克隆抗體17捕獲，在緑色光照射下以紅外光光信號的形式表現(xiàn)出來，所發(fā)出的熒光可用專用儀器定量測定，熒光強(qiáng)度與樣品中肌鈣蛋白T的濃度成正比。如果復(fù)合物中肌鈣蛋白T低于最低檢測標(biāo)準(zhǔn)，則檢測線4不會發(fā)出熒光。另外，參閱圖5的a、b、c所示，試紙條有效的情況下，檢測線4上的抗肌鈣蛋白T單克隆抗體17與質(zhì)控線5上的兔IgG抗體18均會與復(fù)合物反應(yīng)發(fā)出熒光，即檢測線4與質(zhì)控線5均發(fā)光，試紙條檢測結(jié)果呈 陽性；只有質(zhì)控線5發(fā)光，試紙條檢測結(jié)果呈陰性；兩條線均未發(fā)光，試紙條檢測結(jié)果無效。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制
首先，將提純的肌鈣蛋白T標(biāo)準(zhǔn)品用I : 10稀釋的正常人血清(采用pH7.20.02MPB緩沖液稀釋)作為稀釋液配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為Ong/ml、IOng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的6份樣品。其次，姆個(gè)樣品分別用10個(gè)肌I丐蛋白T試紙條檢測10次，10次檢測儀器判讀的樣品檢測T值和對照C值分別取平均值，最終根據(jù)二者的比值得出每個(gè)濃度對應(yīng)的T/C結(jié)果，列于表I。表I、不同濃度下的T/C值
權(quán)利要求
1.ー種快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條組件，其特征在于 包括試紙條和與試紙條配合使用且獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體，試紙條包括底襯(I)、依次接合在底襯(I)上的吸水墊(2)、包被分析膜(3)及樣品墊(6)，該包被分析膜上(3)設(shè)有檢測線(4)和質(zhì)控線(5)，檢測線(4)包被的特異抗體為抗肌鈣蛋白T單克隆抗體，質(zhì)控線(5)包被的特異抗體為兔IgG抗體；鉬卟啉標(biāo)記特異抗體為抗肌鈣蛋白T單克隆抗體和抗兔IgG抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條組件，其特征在于所述底襯(I) 一面涂覆黏膠或雙面膠，用以固定所述的吸水墊(2)、包被分析膜(3)及樣品墊(6)，其中，包被分析膜(3)粘附在所述底襯(I)的中間，兩端分別與所述吸水墊(2)和樣品墊(6)連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條組件，其特征在于所述吸水墊(2)為ー種濾紙，為吸水紙或?yàn)V油紙；所述吸水墊(2)粘附在所述底襯(I)上，同時(shí)吸水墊(2)與包被分析膜(3)重疊l-2mm連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的ー種快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條，其特征在于包被分析膜(3)為硝酸纖維膜，且在包被分析膜(3)上噴涂抗肌鈣蛋白T單克隆抗體和兔IgG抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條組件，其特征在于所述樣品墊(6)為玻璃纖維膜，且用含O. 01%-0. 5%PEG聚こニ醇、1%-5%牛血清白蛋白、O. 01%-0. 05%表面活性劑的O. 04M磷酸鹽緩沖液浸泡處理過，其中，磷酸鹽緩沖液PH為7.2，浸泡處理后，放置在25-40°C溫度下干燥，所述樣品墊(6)與包被分析膜(3)重疊l_2mm連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條組件，其特征在于所述的獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體為抗肌鈣蛋白T單克隆抗體和抗兔IgG抗體，并分別用含有如下組分的O. 02M磷酸鹽緩沖液稀釋后用塑料瓶密封而得0. 01%-0. 5%聚乙ニ醇、1%-5%牛血清白蛋白、5%-20%甘油、O. 01%-0. 05%表面活性剤。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條組件，其特征在于所述獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記的激發(fā)光波長范圍為390-420nm，發(fā)射光波長范圍為600nm-700nmo
8.ー種制備權(quán)利要求I所述的定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條組件的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)抗體的制備 選用純化的基因工程表達(dá)的抗肌鈣蛋白T單克隆抗體、抗兔IgG抗體和純化的兔IgG ； 2)包被分析膜(3)的制備 采用噴膜機(jī)分別在ー硝酸纖維膜上畫檢測線(4)和質(zhì)控線(5)，劃線細(xì)致均勻，檢測線(4)與質(zhì)控線(5)間隔5mm； 用檢測線包被緩沖液稀釋抗肌鈣蛋白T單克隆抗體至濃度為10-20ug/ml，采用噴膜機(jī)將抗肌鈣蛋白T單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測線(4)上； 用質(zhì)控線包被緩沖液稀釋純化的兔IgG抗體至濃度為10-20ug/ml，采用噴膜機(jī)將純化的兔IgG抗體對應(yīng)噴印在硝酸纖維膜的質(zhì)控線(5)上；將噴膜后的硝酸纖維膜放入25-40°C的真空干燥箱內(nèi)，干燥后取出密封備用； 3)樣品墊(6)的制備 將玻璃纖維膜用含O. 01%-0. 5%聚こニ醇、1%-5%牛血清白蛋白、O. 01%-0. 05%表面活性劑的O. 04M磷酸鹽緩沖液浸泡，放入30-50 V的真空干燥箱內(nèi)，干燥后即成樣品墊(6 )，取出密封備用； 4)鉬卟啉標(biāo)記特異抗體的制備 將肌鈣蛋白T單克隆抗體和抗兔IgG抗體，分別用O. IM碳酸氫鈉溶液稀釋至lmg/ml，分別加入30-50mg的鉬卟啉溶解液，攪勻，室溫孵育I小時(shí)，每隔15分鐘混勻一次，最后用G25凝膠柱過柱分離純化，收集標(biāo)記好的鉬卟啉標(biāo)記抗體，用O. 02M磷酸鹽緩沖液稀釋混勻后于4 C保存； 5)免疫熒光試紙條的制備 先將包被分析膜粘附在底襯(I)中間位置上，在包被分析膜(3) —端粘附吸水墊(2)，二者重疊1_2_ ;在包被分析膜(3)另一端粘附樣品墊(6)，二者重疊1-2_ ;再將黏貼好包被分析膜(3)、吸水墊(2)和樣品墊(6)的底襯(I)裁切成細(xì)條，即成ー種快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的ー種制備權(quán)利要求I所述的定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條的方法，其特征在于，所述檢測線包被緩沖液為含有O. 8-1%的甲醇、1-1. 5%海藻糖或者蔗糖、抗肌鈣蛋白T單克隆抗體lmg/ml的50mM pH值為7. 6的磷酸鹽緩沖液或三羥甲基甲胺基丙磺酸緩沖液。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的ー種制備權(quán)利要求I所述的定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條的方法，其特征在于，所述檢測線包被緩沖液為含甲醇O. 8%、蔗糖I. 5%、牛血清白蛋白O. 6%、抗肌鈣蛋白T單克隆抗體lmg/ml的20mM pH值為7. 6的三羥甲基甲胺基丙磺酸緩沖液。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的ー種制備權(quán)利要求I所述的定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條的方法，其特征在于，所述檢測線包被緩沖液為含含甲醇1%、海藻糖1%、牛血清白蛋白O. 5%、抗肌鈣蛋白T單克隆抗體lmg/ml的20mM pH值為7. 6的磷酸鹽緩沖液。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的ー種制備權(quán)利要求I所述的定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條的方法，其特征在于，所述質(zhì)控線包被緩沖液為含O. 7-1%的甲醇、O. 5-0. 8%的牛血清白蛋白、兔IgG抗體O. 5mg/ml50mM的pH值為7. 6磷酸鹽緩沖液。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的ー種制備權(quán)利要求I所述的定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條的方法，其特征在于，所述質(zhì)控線包被緩沖液為含甲醇1%、牛血清白蛋白O. 8%、兔IgG抗體O. 5mg/ml的50mM pH值為7. 6磷酸鹽緩沖液。
14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的ー種制備權(quán)利要求I所述的定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條的方法，其特征在于，所述質(zhì)控線包被緩沖液為含甲醇O. 7%、牛血清白蛋白O. 5%、兔IgGO. 5mg/ml的50mM pH值7. 6的磷酸鹽緩沖液。
15.ー種應(yīng)用權(quán)利要求I所述的快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條的免疫熒光檢測卡組件，其特征在于所述檢測卡組件包括試紙條組件、用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的蓋板(11)和用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的背板(13)組成的卡盒，所述背板(13)包括放置所述試紙條的卡槽(12)和用干與所述蓋板(11)結(jié)合的卡齒(14)，所述蓋板(11)包括可觀測檢測結(jié)果的檢測窗(8)、可滴加樣品的加樣孔(7)和用干與所述背板的卡齒(14)結(jié)合的固定孔(10)，所述試紙條通過所述卡齒(14)與所述固定孔(10)結(jié)合而嵌合在所述背板(13)和所述蓋板(11)之間，其中，所述包被分析膜(3)正對所述檢測窗(8)，所述樣品墊(6)正對所述加樣孔(7 );另外，獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。
16.權(quán)利要求15所述的快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條組件制成的檢測卡組件的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)制成背板(13)和蓋板(11) 用聚苯こ烯或聚氯こ烯等塑料材質(zhì)制成背板(13)和蓋板(11)，所述背板(13)包括放置所述試紙條組件的卡槽(12)和用干與所述蓋板(11)結(jié)合的卡齒(14)，所述蓋板(11)包括可測結(jié)果的檢測窗(8)、可滴加樣品的加樣孔(7)以及用干與所述背板的卡齒(14)結(jié)合的固定孔(10)； 2)組裝: 將試紙條放在所述背板(13)的所述卡槽(12)內(nèi)，通過所述背板(13)的卡齒(14)與所述蓋板(11)的固定孔(10)結(jié)合，將試紙條嵌合在背板(13)和蓋板(11)之間，其中，包被分析膜(3)正對所述檢測窗(8)，樣品墊(6)正對所述加樣孔(7)； 3)包裝 將I人份的檢測卡與一包干燥劑封裝在鋁箔塑料袋內(nèi)，并配備I瓶獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體，將多組所述鋁箔塑料袋和所述獨(dú)立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體裝入ー個(gè)包裝盒，在2°C _8°C環(huán)境下避光不凍存的進(jìn)行保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫熒光試紙條組件及其制成的檢測卡，紙條組件包括了試紙條和獨(dú)立包裝的鉑卟啉標(biāo)記特異抗體，該試紙條包括了底襯，粘附于底襯上的包被分析膜、粘附于底襯上且與硝酸纖維膜的其中一端接合的樣品墊和粘附于底襯上且與硝酸纖維膜的另一端接合的吸水墊，包被分析膜上設(shè)有檢測線和質(zhì)控線；所述檢測線包被抗肌鈣蛋白T單克隆抗體，質(zhì)控線包被兔IgG抗體，檢測卡則將一卡盒和試紙條組件結(jié)合即可，應(yīng)用本發(fā)明所提供的試紙條以及檢測卡檢測人血液、血清或血漿中肌鈣蛋白T，操作簡單、快速、靈敏和特異性好等特點(diǎn)，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/558GK102692508SQ201210133789
公開日2012年9月26日 申請日期2012年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月28日
發(fā)明者李必松, 梁萬興, 羅琪, 謝愛武 申請人:廣州鴻琪光學(xué)儀器科技有限公司