專利名稱：尿肌氨酸及肌酐測定試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥檢測技術領域，具體涉及尿中肌氨酸和肌酐測定試劑盒。
背景技術：
通過檢測生物樣本中小分子或者大分子標志物是疾病篩查與診斷的有效手段，對于疾病的早期診斷、治療和預后具有重要的參考價值和臨床意義。肌氨酸(N—甲基甘氨酸，sarcosine)是ー種存在于人體肌肉和其他組織的天然氨基酸，為甘氨酸的代謝產(chǎn)物。研究表明，肌氨酸在侵襲性前列腺癌中含量顯著升高，且肌氨酸可在尿樣中檢測出來，這ー發(fā)現(xiàn)使得肌氨酸成為前列腺癌非損傷性診斷的一個候選生物標記，也有可能成為更優(yōu)的新型的前列腺癌進展標志物。尿中肌酐的排泄量較少受尿液濃縮和稀釋的影響，故尿中肌酐濃度的測定常用作尿中其他物質排泄?jié)舛鹊膮⒄瘴铩Ｔ诒驹噭┖兄屑◆鳛榧“彼岬膮⒄瘴镌谕环輼悠分型瑫r測定，校正了樣品中肌氨酸的濃度，降低了對臨床樣品的要求。目前對于肌氨酸和肌酐的檢測，分別采用氣相色譜ー質譜法和化學法，它們的主要缺陷是特異性和靈敏度低，方法比較復雜。液相色譜ー同位素稀釋質譜法，屬于非損傷性檢測方法，是近年來獲得迅速發(fā)展的分析測試技術，在體內藥物分析、臨床生化和新生兒遺傳性代謝疾病篩選等領域已有廣泛應用。它具有高度特異性、靈敏度和準確性的特點，且成本低廉，簡單、快速，已成為臨床科研中檢測量值的基準方法之一。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供ー種操作簡便、專ー靈敏的尿中肌氨酸濃度的定量檢測法及配套試劑盒，以滿足開展大規(guī)模臨床前列腺癌研究的需要。本發(fā)明公開的尿肌氨酸和肌酐測定試劑盒的組成包括
1)對照品肌氨酸濃度分別為100-300 μ g/L、1000-3000 μ g /L、5000-8000 μ g /L 和肌酐濃度分別為 100-300mg/L、1000-3000mg/L、5000-8000mg/L 的化學品；
2)質控品肌氨酸濃度為800-1000μ g /L和肌酐濃度為800-1000mg/L的化學品；
3)內標溶液肌氨酸-d350-100mg/L，肌酐-d3 150-200 mg/L的化學品；
4)沉淀劑:こ腈;
5)流動相A:含O. I mmol/L甲酸銨和O. 4%甲酸的20%こ腈水溶液；
6)流動相B:含O. 02%甲酸和20%こ腈的水溶液。采用所述試劑盒進行尿中肌氨酸和肌酐測定方法，其特征在于步驟為
1)標準曲線的繪制用對照品和內標的比值繪制標準曲線，用質控品和內標的比值確認標準曲線；
2)尿樣采集隨機尿，3000rpm離心5min，取上清尿2mL左右_20°C保存，臨用前于室溫下解凍；
3)樣品稀釋處理尿樣中以こ臆尿樣體積比為2 I的比例加入沉淀劑こ腈，除去尿樣中蛋白，并稀釋尿樣至肌氨酸濃度為100-5000 μ g/L，肌酐濃度為100-5000mg/L ；
4)色譜分離純化以硅膠鍵合相填料為色譜柱，流動相A和流動相B采用等度或者梯度洗脫，將肌氨酸和肌酐從色譜柱上洗脫，與其他干擾物質色譜分離；
5)質譜檢測經(jīng)液相色譜儀分離純化的肌氨酸和肌酐，采用電噴霧離子化串聯(lián)質譜儀，在正離子檢測模式下，檢測肌氨酸和肌酐；肌氨酸的母離子，其質量電荷比m/z為90±0.5 ;經(jīng)過進一歩質譜碎裂后同時檢測肌氨酸的母離子和碎片離子，其質量電荷比m/z分別為90±0. 5和44±0. 5 ;肌酐的母離子，其質量電荷比m/z為114±0. 5 ;經(jīng)過進ー步質譜碎裂后同時檢測肌酐的母離子和碎片離子，其質量電荷比m/z分別為114±0. 5和86±0. 5 ；
6)結果計算以肌氨酸和肌酐質譜檢測獲得的峰面積與內標峰面積的比值，代入標準曲線回歸方程，根據(jù)公式y(tǒng) =a+bx計算即可得到肌氨酸或肌酐的濃度值。其中，Y為肌氨酸或肌酐與內標峰面積比值，X為肌氨酸或肌酐的濃度值。
所述步驟4)中HYPERS IL silica, 5 μ m, 2. I X 100mm, Thermo,流動相 B :含O. 02%甲酸的20%こ腈溶液，等度洗脫，流速0. 3mL/min,進樣量5 μし將從肌酐色譜柱上洗脫的條件為色譜柱HYPERSIL silica，5um，2. I X 100mm,Thermo，流動相A為含0.1 mmol/L甲酸銨和O. 4%甲酸的20%こ腈溶液，流動相B為含
O.02%甲酸的20%こ腈溶液,梯度洗脫,O O. I min、0. I 2 min、2. I 6 min,流動相B占流動相總量的體積百分數(shù)分別為75%、0%、75%，流速0. 3mL/min，進樣量3μし所述步驟5)中肌氨酸質譜檢測條件為電噴霧離子源，正離子掃描；MRM掃描，肌氨酸檢測通道90. 1>44. 1，±0. 5 m/z，肌氨酸-d3檢測通道93. 1>47. I，土 O. 5 m/z，離子化電壓5000V ;離子化溫度5500C ;噴霧氣60 psi ;加熱氣60 psi ;氣簾氣25 psi ;碰撞氣中等；去簇電壓(DP) :21 V;入口電壓(EP) :4 V;碰撞能(CE):20 V ;出口電壓(CXP) :6V。所述肌酐質譜檢測條件為電噴霧離子源，正離子掃描；MRM掃描，肌酐檢測通道114. 8>86. 1，±0. 5 m/z，肌酐_d3檢測通道 117. 1>89. I (±0.5 m/z)，離子化電壓5000V ;離子化溫度550°C ;噴霧氣60 psi ;加熱氣60 psi ;氣簾氣25 psi ;碰撞氣中等；去簇電壓(DP) 26 V ;入口電壓(EP) 7 V ;碰撞能(CE) 18 V ;出口電壓(CXP) 5 V。本發(fā)明尿肌氨酸和肌酐測定試劑盒，配備了用于制備試劑盒標準曲線的、肌氨酸或肌酐含量穩(wěn)定的對照品和質控品。以こ腈作為沉淀劑處理樣品，用改性劑優(yōu)化流動相，等度或者梯度洗脫法將肌氨酸和肌酐與樣品中結構類似的其他干擾物質色譜分離，在特異性方面具有明顯優(yōu)勢，以保留時間最短(肌氨酸和肌酐的色譜保留時間分別為2. 6min和3. lmin)，且靈敏度高、準確性好、檢測成本低，響應值最大而滿足臨床和科研上對分析方法快速和高通量的要求。通過優(yōu)化樣品處理、流動相改性、正離子模式下以多反應監(jiān)測(MRM) LC-MS測定，以同位素稀釋內標法定量，尿樣中肌氨酸的最低檢測限(LOD)為20yg/L，最低定量限(LLOQ) % 100 μ g/L,在100 8000 μ g/L濃度范圍內，線性相關系數(shù)大于O. 99，提取回收率的相對偏差均小于11%，準確度在87. 8% 99. 5%之間，批內、批間精密度均小于12%。肌酐的最低檢測限(LOD)為5mg/L，最低定量限(LLOQ)為100 mg/L,在100 8000 mg/L濃度范圍內，線性相關系數(shù)大于O. 99，提取回收率的相對偏差均小于9%，準確度在87. 8% 108%之間，批內、批間精密度均小于15%。


圖I空白尿樣中肌氨酸的色譜 圖2空白尿樣中肌酐的色譜 圖3肌氨酸濃度分別為100，1000, 5000 μ g/L的標準曲線；
圖4肌酐濃度分別為100，1000,5000mg/L的標準曲線；
圖5肌氨酸濃度分別為300，3000，8000 μ g/L的標準曲線； 圖6肌酐濃度分別為300，3000，8000mg/L的標準曲線。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發(fā)明作進ー步闡述，但并不限制本發(fā)明。實施例I
I、試劑盒的配制
(1)對照品肌氨酸濃度分別為100μ g/L, 1000 μ g /L, 5000 μ g /L和肌酐濃度分別為100mg/L，1000mg/L, 5000mg/L 的化學品；
(2)質控品肌氨酸濃度為800μ g /L和肌酐濃度為800mg/L的化學品；
(3)內標溶液肌氨酸-d350mg /L ,肌酐_d3 150mg/L的化學品；
(4)沉淀劑こ腈；
(5)流動相A:含0. I mmol/L甲酸銨和0. 4%甲酸，20%こ腈的水溶液
(6)流動相B:含O. 02%甲酸和20%こ腈水溶液。2、尿樣采集隨機尿，3000rpm離心5min，取上清尿2 mL左右-20°C保存，臨用前于室溫下解凍。3、樣品處理取100 μ L尿樣，加入20 μ L肌氨酸和肌酐的混合內標溶液，再加入200 μ L沉淀劑，混旋30s，15000 rpm離心3 min,棄沉淀，然后再吸取100 μ L上清液與300 μ Lこ腈混合，轉移至進樣瓶，供LC-MS/MS分析。4、肌氨酸色譜條件及質譜儀器參數(shù)
色譜條件
色譜柱HYPERSIL silica,5μπι, (2· I X 100mm，Thermo)，柱溫室溫，流動相 B:含
O.02%甲酸的20%こ腈溶液，等度洗脫，流速0. 3mL/min,進樣量5 μし質譜條件
電噴霧離子源，正離子掃描；MRM掃描，肌氨酸檢測通道90. 1>44. I (±0.5m/z)，肌氨酸-d3檢測通道93. 1>47. I (±0. 5 m/z)，離子化電壓:5000V ;離子化溫度550°C ;噴霧氣60 psi ;加熱氣60 psi ;氣簾氣25 psi ;碰撞氣中等；去簇電壓(DP) :21 V;入口電壓(EP) 4 V ;碰撞能(CE) 20 V ;出口電壓(CXP) 6 V。5、肌酐色譜條件及質譜儀器參數(shù)
色譜條件
色譜柱HYPERSIL silica, 5um, (2. I X 100mm, Thermo),柱溫室溫,流動相 A :含 0. Immol/L甲酸銨和0. 4%甲酸的20%こ腈溶液，流動相B 0. 02%甲酸的20%こ腈溶液，梯度洗脫，O 0. I min、0. I 2 min、2. I 6 min,流動相B占流動相總量的體積百分數(shù)分別為 75%、0、75%，流速0. 3mL/min，進樣量3μ し質譜條件
電噴霧離子源，正離子掃描；MRM掃描，肌酐檢測通道114. 8>86. I (±0.5 m/z)，肌酐-d3檢測通道117. 1>89. I (±0. 5 m/z)，離子化電壓:5000V ;離子化溫度550°C ;噴霧氣60 psi ;加熱氣60 psi ;氣簾氣25 psi ;碰撞氣中等;去簇電壓(DP) 26 V;入口電壓(EP):7 V;碰撞能(CE) :18 V ;出口電壓(CXP) :5 V。6、結果計算采用內標法，以峰面積計算樣品中肌氨酸和肌酐濃度。圖I和圖2分別為空白尿樣中肌氨酸和肌酐的色譜圖，在此條件下，肌氨酸和肌酐 的保留時間為2. 3和3. Imin,圖1、2還可以看出在尿中肌氨酸和肌酐與其他雜質峰能很好地分離。相應的峰面積和肌氨酸及肌酐含量計算結果列于表I。表I肌氨酸和肌酐代表性樣品測定結果
權利要求
1.一種尿肌氨酸和肌酐測定試劑盒，其特征在于組成包括 1)對照品肌氨酸濃度分別為100-300 μ g/L、1000-3000 μ g /L、5000-8000 μ g /L 和肌酐濃度分別為 100-300mg/L、1000-3000mg/L、5000-8000mg/L 的化學品； 2)質控品肌氨酸濃度為800-1000μ g /L和肌酐濃度為800-1000mg/L的化學品； 3)內標溶液肌氨酸-d350-100mg/L，肌酐_d3 150-200 mg/L的化學品； 4)沉淀劑:こ腈; 5)流動相A:含O. I mmol/L甲酸銨和O. 4%甲酸的20%こ腈水溶液； 6)流動相B:含O. 02%甲酸的20%こ腈水溶液。
2.權利要求I所述試劑盒用于尿中肌氨酸和肌酐測定的方法，其特征在于步驟為 1)標準曲線的繪制用對照品和內標的比值繪制標準曲線，用質控品和內標的比值確認標準曲線； 2)尿樣采集隨機尿，3000rpm離心5min，取上清尿2mL左右_20°C保存，臨用前于室溫下解凍； 3)樣品稀釋處理尿樣中以こ腈尿樣體積比為2 I的比例加入沉淀劑こ腈，除去尿樣中蛋白，并稀釋尿樣至肌氨酸濃度為100-5000 μ g/L，肌酐濃度為100-5000mg/L ； 4)色譜分離純化以硅膠鍵合相填料為色譜柱，用流動相A和/或流動相B等度或者梯度洗脫，使肌氨酸和肌酐與其他干擾物質色譜分離； 5)質譜檢測經(jīng)液相色譜儀分離后的肌氨酸和肌酐，采用電噴霧離子化串聯(lián)質譜儀，在正離子檢測模式下，檢測肌氨酸和肌酐；肌氨酸的母離子，其質量電荷比m/z為90±0. 5 ；經(jīng)過進一歩質譜碎裂后同時檢測肌氨酸的母離子和碎片離子，其質量電荷比m/z分別為90±0. 5和44±0. 5 ;肌酐的母離子，其質量電荷比m/z為114±0. 5 ;經(jīng)過進ー步質譜碎裂后同時檢測肌酐的母離子和碎片離子，其質量電荷比m/z分別為114±0. 5和86±0. 5 ； 6)結果計算以肌氨酸和肌酐質譜檢測獲得的峰面積與內標峰面積的比值，計算肌氨酸或肌酐的濃度值。
3.根據(jù)權利要求2所述測定方法，其特征在于步驟4)所述肌氨酸與其他干擾物質色譜分離的條件是色譜柱HYPERS IL silica, 5 μ m, 2. I X 100mm, Thermo,流動相 B :含 O. 02%甲酸的20%こ腈溶液，流速0. 3mL/min，進樣量5 μし
4.根據(jù)權利要求2所述測定方法，其特征在于步驟4)所述肌酐與其他干擾物質色譜分離的條件是色譜柱HYPERSIL silica, 5 μ m, 2. I X 100mm, Thermo，流動相 A :含 O. Immol/L甲酸銨和O. 4%甲酸的20%こ腈溶液，流動相B :含O. 02%甲酸的20%こ腈溶液，梯度洗脫，O O. I min、0. I 2 min、2. I 6 min，流動相A 流動相B體積百分比分別為25% 75%,100% 0%,25% 75%，流速O. 3mL/min，進樣量3 μ し
5.根據(jù)權利要求2所述測定方法，其特征在于步驟5)所述肌氨酸質譜檢測條件為電噴霧離子源，正離子掃描；MRM掃描，肌氨酸檢測通道90. 1>44. 1，±0. 5 m/z，肌氨酸_d3檢測通道93. 1>47. I，土O. 5 m/z，離子化電壓:5000V ;離子化溫度550 °C ;噴霧氣60 psi ；加熱氣60 psi ;氣簾氣25 psi ;碰撞氣中等；去簇電壓(DP):21 V;入口電壓(EP) :4 V ；碰撞能(CE):20 V ;出口電壓(CXP) :6 V。
6.根據(jù)權利要求2所述測定方法，其特征在于所述步驟5)肌酐質譜檢測條件為電噴霧離子源，正離子掃描；MRM掃描，肌酐檢測通道114. 8>86. 1，±0. 5 m/z，肌酐_d3檢測通道.117. 1>89. I ±0. 5 m/z ，離子化電壓:5000V ;離子化溫度550°C ;噴霧氣60 psi ;加熱氣60 psi ;氣簾氣25 psi ;碰撞氣中等；去簇電壓(DP):26 V;入口電壓(EP) :7 V ;碰撞能(CE) 18 V ;出口電壓(CXP) 5 V。
全文摘要
本發(fā)明涉及尿中肌氨酸和肌酐測定試劑盒，屬醫(yī)藥檢測技術領域。該試劑盒的組成包括用于制備試劑盒標準曲線的、肌氨酸或肌酐含量穩(wěn)定的對照品和質控品，肌氨酸-d350-100mg/L，肌酐-d3150-200mg/L內標溶液，乙腈沉淀劑，以及添加甲酸銨和甲酸作為改性劑的流動相。本發(fā)明以乙腈作為沉淀劑除去尿樣中蛋白，添加改性劑，優(yōu)化流動相洗脫方式，將肌氨酸和肌酐與樣品中結構類似的其他干擾物質色譜分離，在特異性方面具有明顯優(yōu)勢，肌氨酸和肌酐的色譜保留時間分別為2.6min和3.1min，以保留時間最短、且靈敏度高、準確性好、檢測成本低、響應值最大，而滿足臨床和科研上對分析方法快速和高通量的要求。
文檔編號G01N30/02GK102680599SQ20121014553
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月11日 優(yōu)先權日2012年5月11日
發(fā)明者葉軍, 李軍艷, 林益華, 章開程, 胡英偉 申請人:上海特敏生物醫(yī)藥科技有限公司