專利名稱：一種梅花染色體周年性制片方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物染色體制片方法，具體是一種梅花染色體周年性制片方法。
背景技術(shù)：
梅花(Prunus mume Sieb. et Zucc.)是重要的木本花丼,對(duì)梅花進(jìn)行染色體層面的研究，是對(duì)其進(jìn)行基因定位、構(gòu)建物理圖譜的重要前提。然而受限于木本植物，其染色體層面的研究極其局限?，F(xiàn)有文獻(xiàn)記載，梅的染色體數(shù)目據(jù)國(guó)外Okabe (1927 ，1929)報(bào)道是2n = 16,24,Oginuma等(1987,1989)發(fā)表是2n = 16。在國(guó)內(nèi)，主要是黃哲(1989)首次對(duì)梅花的染色體進(jìn)行了研究，黃燕文、包滿珠等(1995)對(duì)野梅、果梅和花梅染色體的數(shù)目及形態(tài)進(jìn)行了研究,林盛華、褚孟嫄(1999)對(duì)梅花染色體進(jìn)行了研究，鑒定梅品種資源的倍數(shù)性，為梅分類起源和遺傳育種提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。他們所采用的試驗(yàn)材料主要是花后新芽及冬季休眠枝條水培萌發(fā)的新芽，取材周期短，時(shí)間受限。染色體顯帶、熒光原位雜交等技術(shù)需要大量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證，而使用傳統(tǒng)的莖尖材料進(jìn)行染色體制片，取材方便，分裂相豐富，雖然能夠滿足染色體計(jì)數(shù)及常規(guī)核型分析的需要，但若需要進(jìn)行大量重復(fù)實(shí)驗(yàn)，傳統(tǒng)的取材方法無(wú)法對(duì)材料進(jìn)行長(zhǎng)期保存，無(wú)法滿足大量重復(fù)實(shí)驗(yàn)的要求，因而嚴(yán)重阻礙了梅花染色體的深入研究。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決梅花染色體研究過程中染色體制片取材周期短、時(shí)間受限的問題，本發(fā)明提供一種梅花染色體周年性制片方法。本發(fā)明所述梅花染色體周年性制片方法，根據(jù)時(shí)間選取如下分生組織作為制片材料I)春季，梅花早春枝條新發(fā)莖尖；2)初夏，梅花未成熟胚，以及梅花未成熟胚組織培養(yǎng)所得生長(zhǎng)點(diǎn)；3)夏、秋，梅花一年生實(shí)生苗頂端生長(zhǎng)點(diǎn)；4)冬季，梅花休眠枝條水培所得莖尖。其中，所述的梅花早春枝條新發(fā)莖尖，為梅花葉芽正常萌動(dòng)伸長(zhǎng)時(shí)，剝?nèi)[片及大葉，所取得的萌發(fā)莖尖。其中，所述的梅花未成熟胚，為授粉后25 35天，用石錘除去梅花果實(shí)的果肉，打開果核取出種子，所取的未成熟胚。其中，所述的梅花未成熟胚組織培養(yǎng)所得生長(zhǎng)點(diǎn)，為以6-BA濃度是lmg/L、IBA濃度是0. 2mg/L的MS培養(yǎng)基進(jìn)行梅花組織培養(yǎng)，暗培養(yǎng)一周，胚伸長(zhǎng)時(shí)，切取的0. 5cm伸長(zhǎng)部位作為梅花未成熟胚組織培養(yǎng)所得生長(zhǎng)點(diǎn)。其中，所述的梅花一年生實(shí)生苗頂端生長(zhǎng)點(diǎn)，為于第一年8月初對(duì)梅花種子進(jìn)行2°C低溫沙藏，55-65天后梅花種子發(fā)芽，播種栽培于溫室，次年4月中旬移栽至大田，同時(shí)對(duì)梅花一年生實(shí)生苗進(jìn)行修剪，待分枝后，于上午切取一年生枝條頂端生長(zhǎng)點(diǎn)作為梅花一年生實(shí)生苗頂端生長(zhǎng)點(diǎn)。其中，切取梅花一年生枝條頂端生長(zhǎng)點(diǎn)的時(shí)間為上午9:00 11:00。其中，所述的梅花休眠枝條水培所得莖尖，為于11月中旬取一年生枝條蠟封處理，4°C低溫保存一個(gè)月后水培，一周后發(fā)芽，所取的萌發(fā)莖尖。本發(fā)明所述的梅花染色體周年性制片方法，包含以下步驟(I)所取制片材料用卡諾固定液低溫4°C固定20h以上，作為固定后的材料待用；(2)配制纖維素酶和果膠酶的酶溶液，纖維素酶的重量百分 含量為2. 0 2. 5%，果膠酶的重量百分含量為2. 0 2. 5% ;(3)將步驟(I)中固定后的材料用纖維素酶和果膠酶的酶溶液常溫酶解，酶解時(shí)間長(zhǎng)度90 150min，作為酶解后的材料待用；(4)將酶解后的材料進(jìn)行壓片法制片。其中，步驟(2)所述配制纖維素酶和果膠酶的酶溶液，纖維素酶的重量百分含量?jī)?yōu)選2. 38 %，果膠酶的重量百分含量?jī)?yōu)選2. 38 %。其中，步驟(3)所述用纖維素酶和果膠酶的酶溶液常溫酶解，酶解溫度優(yōu)選37°C，酶解時(shí)間長(zhǎng)度優(yōu)選I IOmin。本發(fā)明利用梅花不同時(shí)期的分生組織進(jìn)行制片，克服了以往的梅花染色體制片取材受限于冬季及早春的時(shí)間限制，實(shí)現(xiàn)周年性制片。梅花染色體周年性制片方法克服了傳統(tǒng)取材的時(shí)間限制，周期長(zhǎng)，取材靈活，制片效果良好，有利于梅花染色體深入研究。


圖I :梅花粉瓣早春枝條新發(fā)莖尖染色體100倍油鏡鏡檢圖像。圖2 :梅花粉瓣未成熟胚染色體100倍油鏡鏡檢圖像。圖3:梅花粉瓣未成熟胚組織培養(yǎng)所得生長(zhǎng)點(diǎn)染色體100倍油鏡鏡檢圖像。圖4:梅花粉瓣一年生實(shí)生苗頂端生長(zhǎng)點(diǎn)染色體100倍油鏡鏡檢圖像。圖5:梅花粉瓣休眠枝條水培所得莖尖染色體100倍油鏡鏡檢圖像。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I早春枝條新發(fā)莖尖染色體制片梅花品種粉瓣的萌動(dòng)葉芽于2012年3月上旬采自北京鷲峰森林公園梅花溫室。當(dāng)葉芽萌動(dòng)伸長(zhǎng)時(shí)，剝?nèi)[片及大葉，取下萌發(fā)莖尖。將取得的莖尖直接用卡諾固定液低溫4°C固定20h以上，固定后，用蒸餾水潤(rùn)洗，吸水紙吸干。取纖維素酶0. 20g、果膠酶0. 20g、蒸懼水9. 60g配制成纖維素酶和果膠酶的酶溶液。將固定后的莖尖放入酶溶液中，37°C酶解150min，酶解后，用蒸餾水潤(rùn)洗，吸水紙吸干。切取胚頂端，置于載玻片上，用解剖針搗碎，平攤面積盡量大，滴加卡寶品紅染色液，染色lOmin，加蓋玻片用力壓片。
光學(xué)顯微鏡鏡檢效果(圖I) :100倍油鏡鏡檢，染色體清晰可見，可以計(jì)數(shù)，長(zhǎng)度適宜。經(jīng)計(jì)數(shù)，梅花染色體2n = 16。實(shí)施例2未成熟胚染色體制片梅花品種粉瓣未成熟果實(shí)于2011年5月初(授粉后25 35天)取于青島梅園。用石錘除去果肉，打開果核，取出種子，將未成熟胚取出。將取得的未成熟胚直接使用卡諾固定液低溫4°C固定20h以上，固定后，用蒸餾水潤(rùn)洗，吸水紙吸干。取纖維素酶0. 25g、果膠酶0. 25g、蒸懼水9. 50g配制成纖維素酶和果膠酶的酶溶 液。將固定后的未成熟胚放入酶溶液中，37°C酶解90min，用蒸餾水潤(rùn)洗，吸水紙吸干。切取未成熟胚頂端，置于載玻片上，用解剖針搗碎，平攤面積盡量大，滴加卡寶品紅染色液，染色lOmin，用力壓片。光學(xué)顯微鏡鏡檢效果(圖2) :100倍油鏡鏡檢，染色體清晰可見，可以計(jì)數(shù)，長(zhǎng)度適宜。經(jīng)計(jì)數(shù)，梅花染色體2n = 16。實(shí)施例3未成熟胚組織培養(yǎng)所得生長(zhǎng)點(diǎn)染色體制片進(jìn)行梅花品種粉瓣的未成熟胚組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為MS+6-BA (lmg/L)+IBA(0. 2mg/L)。將子葉切去一半后進(jìn)行接種。暗培養(yǎng)一周，胚出現(xiàn)伸長(zhǎng)時(shí)，切取伸長(zhǎng)部位0. 5cm ( 一周后取材，則組織膨大，不便于操作)。將取得的材料直接使用卡諾固定液低溫4°C固定20h以上，固定后，用蒸餾水潤(rùn)洗，吸水紙吸干。取纖維素酶0. 25g、果膠酶0. 25g、蒸懼水IOg配制成纖維素酶和果膠酶的酶溶液。將固定后的材料放入酶溶液中，37°C酶解llOmin，酶解后，用蒸餾水潤(rùn)洗，吸水紙吸干。切取胚頂端，置于載玻片上，用解剖針搗碎，平攤面積盡量大，滴加卡寶品紅染色液，染色lOmin，用力壓片。光學(xué)顯微鏡鏡檢效果(圖3) :100倍油鏡鏡檢，染色體清晰可見，可以計(jì)數(shù)，長(zhǎng)度適宜。經(jīng)計(jì)數(shù)，梅花染色體2n = 16。實(shí)施例4 一年生實(shí)生苗頂端生長(zhǎng)點(diǎn)染色體制片于2010年8月初對(duì)梅花品種粉瓣種子進(jìn)行2°C低溫沙藏，60天后梅花種子發(fā)芽，播種栽培于溫室。2011年4月中旬移栽至大田，同時(shí)對(duì)梅花一年生實(shí)生苗進(jìn)行修剪。待分枝后，于上午9:00 11:00切取梅花一年生枝條頂端生長(zhǎng)點(diǎn)。將所取一年生實(shí)生苗頂端生長(zhǎng)點(diǎn)直接使用卡諾固定液低溫4°C固定20h以上，固定后，用蒸餾水潤(rùn)洗，吸水紙吸干。取纖維素酶0. 25g、果膠酶0. 25g、蒸餾水IOg配制成纖維素酶和果膠酶的酶溶液。將固定后的一年生實(shí)生苗頂端生長(zhǎng)點(diǎn)放入酶溶液中，37°C酶解llOmin，酶解后，用蒸餾水潤(rùn)洗，吸水紙吸干。切取胚頂端，置于載玻片上，用解剖針搗碎，平攤面積盡量大，滴加卡寶品紅染色液，染色lOmin，用力壓片。光學(xué)顯微鏡鏡檢效果(圖4) :100倍油鏡鏡檢，染色體分散良好，便于計(jì)數(shù)，長(zhǎng)度適宜。經(jīng)計(jì)數(shù)，梅花染色體2n = 16。實(shí)施例5冬季休眠枝條水培所得莖尖染色體制片于2011年11月中旬取梅花品種粉瓣一年生枝條，同時(shí)進(jìn)行蠟封處理。4°C低溫保存一個(gè)月后瓶插水培，一周后陸續(xù)發(fā)芽，取萌發(fā)莖尖。將所取莖尖直接使用卡諾固定液低溫4°C固定20h以上，固定后，用蒸餾水潤(rùn)洗，吸水紙吸干。取纖維素酶0. 25g、果膠酶0. 25g、蒸懼水IOg配制成纖維素酶和果膠酶的酶溶液。將固定后的莖尖放入酶溶液中，37°C酶解llOmin，酶 解后，用蒸餾水潤(rùn)洗，吸水紙吸干。切取胚頂端，置于載玻片上，用解剖針搗碎，平攤面積盡量大，滴加卡寶品紅染色液，染色lOmin，用力壓片。光學(xué)顯微鏡鏡檢效果(圖5) :100倍油鏡鏡檢，染色體分散好，便于計(jì)數(shù)，長(zhǎng)度適宜。經(jīng)計(jì)數(shù)，梅花染色體2n = 16。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種梅花染色體周年性制片方法，其特征在于，根據(jù)時(shí)間選取如下分生組織作為制片材料 I)春季，梅花早春枝條新發(fā)莖尖；2)初夏，梅花未成熟胚，以及梅花未成熟胚組織培養(yǎng)所得生長(zhǎng)點(diǎn)；3)夏、秋，梅花一年生實(shí)生苗頂端生長(zhǎng)點(diǎn)；4)冬季，梅花休眠枝條水培所得莖尖。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述的梅花早春枝條新發(fā)莖尖，為梅花葉芽正常萌動(dòng)伸長(zhǎng)時(shí)，剝?nèi)[片及大葉，所取得的萌發(fā)莖尖。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述的梅花未成熟胚，為授粉后25 35天，用石錘除去梅花果實(shí)的果肉，打開果核取出種子，所取的未成熟胚。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述的梅花未成熟胚組織培養(yǎng)所得生長(zhǎng)點(diǎn)，為以6-BA濃度是lmg/L、IBA濃度是O. 2mg/L的MS培養(yǎng)基進(jìn)行梅花組織培養(yǎng)，暗培養(yǎng)一周，胚伸長(zhǎng)時(shí)，切取的O. 5cm伸長(zhǎng)部位作為梅花未成熟胚組織培養(yǎng)所得生長(zhǎng)點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述的梅花一年生實(shí)生苗頂端生長(zhǎng)點(diǎn)，為于第一年8月初對(duì)梅花種子進(jìn)行2°C低溫沙藏，55-65天后梅花種子發(fā)芽，播種栽培于溫室，次年4月中旬移栽至大田，同時(shí)對(duì)梅花一年生實(shí)生苗進(jìn)行修剪，待分枝后，于上午切取一年生枝條頂端生長(zhǎng)點(diǎn)作為梅花一年生實(shí)生苗頂端生長(zhǎng)點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制片方法，其特征在于，切取梅花一年生枝條頂端生長(zhǎng)點(diǎn)的時(shí)間為上午9:00 11:00。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制片方法，其特征在于，所述的梅花休眠枝條水培所得莖尖，為于11月中旬取一年生枝條蠟封處理，4°c低溫保存一個(gè)月后水培，一周后發(fā)芽，所取的萌發(fā)莖尖。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的制片方法，其特征在于，包含以下步驟 (1)所取制片材料用卡諾固定液低溫4°C固定20h以上，作為固定后的材料待用； (2)配制纖維素酶和果膠酶的酶溶液，纖維素酶的重量百分含量為2.O 2. 5%，果膠酶的重量百分含量為2. O 2. 5% ; (3)將步驟(I)中固定后的材料用步驟(2)配制的纖維素酶和果膠酶的酶溶液常溫酶解，酶解時(shí)間長(zhǎng)度90 150min，作為酶解后的材料待用； (4)將酶解后的材料進(jìn)行染色壓片法制片。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制片方法，其特征在于，步驟(2)所述的纖維素酶和果膠酶的酶溶液，纖維素酶的重量百分含量為2. 38%，果膠酶的重量百分含量為2. 38%。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制片方法，其特征在于，步驟(3)所述用纖維素酶和果膠酶的酶溶液常溫酶解，酶解溫度為37°C，酶解時(shí)間長(zhǎng)度為llOmin。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種梅花染色體周年性制片方法，該方法根據(jù)時(shí)間選取如下分生組織作為制片材料1)春季，早春枝條新發(fā)莖尖；2)初夏，梅花未成熟胚，以及未成熟胚組織培養(yǎng)所得生長(zhǎng)點(diǎn)；3)夏、秋，梅花一年生實(shí)生苗頂端生長(zhǎng)點(diǎn)；4)冬季，梅花休眠枝條水培所得莖尖。以上述的制片材料進(jìn)行染色體制片，依次進(jìn)行低溫固定、酶解、染色壓片，均可獲得分散良好、清晰的染色體圖像。本發(fā)明解決了梅花染色體研究過程中染色體制片取材周期短、時(shí)間受限的問題。
文檔編號(hào)G01N1/28GK102768131SQ201210146739
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月11日
發(fā)明者孫麗丹, 張啟翔, 楊煒茹, 陳晶鑫 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)