專利名稱：蛋白質(zhì)ctsf在制備診斷胃癌的試劑中的應(yīng)用及診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種蛋白質(zhì)CTSF在制備診斷胃癌疾病的試劑中的應(yīng)用及診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
胃癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO) 2008年的統(tǒng)計(jì)(世界衛(wèi)生組織年度統(tǒng)計(jì)，2008)，在全世界范圍，胃癌病人的死亡率高居第二。在2006年WHO的統(tǒng)計(jì)中顯示有接近950，000個(gè)新發(fā)病例，同時(shí)有約700，000人死于這一種疾病。在我國(guó)，每年胃癌新發(fā)患者數(shù)超過30萬(wàn)，死于胃癌的人數(shù)約16萬(wàn)，病死率居惡性腫瘤之首，嚴(yán)重威脅人民生命健康(陳竺，全國(guó)第三次死因回顧抽樣調(diào)查報(bào)告，2008)。為降低死亡率，提高胃癌的療效，關(guān)鍵是胃癌的“三早”工作，即早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及早期治療。然而，由于絕大多數(shù)胃癌患者缺乏特異性的臨床癥狀，故早期胃癌診斷率很低，手術(shù)率不足10% (吳云林外科理論與實(shí)踐，2005，10:401);術(shù)后病人的生存期也較短。目前，我國(guó)胃癌總體5年生存率為43. 4%，術(shù)后病理分期(pathological M，pTNM) I、II、III、IV期患者的術(shù)后5年生存率分別為75. 65%,58. 73%,28. 01%和8. 42% (劉炳亞中華胃腸外科雜志，2010，13:163)。因此，提高胃癌的早期診斷率非常重要。而一般體檢和影像學(xué)檢查作用有限，待能夠發(fā)現(xiàn)和明確診斷時(shí)，往往已到了中、晚期，缺少預(yù)警價(jià)值。因此，從長(zhǎng)遠(yuǎn)角度看，應(yīng)致力于發(fā)現(xiàn)敏感性和特異性均較好的腫瘤標(biāo)志物。此外，胃癌異質(zhì)性大，預(yù)后及對(duì)治療的反應(yīng)性差別較大，對(duì)于臨床評(píng)估預(yù)后以及對(duì)治療反應(yīng)性的預(yù)測(cè)與評(píng)價(jià)，均需良好的腫瘤標(biāo)志物。理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)符合以下條件(I)敏感性高；(2)特異性高；(3)腫瘤標(biāo)志物濃度和腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、惡性程度有關(guān)，能協(xié)助腫瘤分期和判斷預(yù)后；(4)半衰期短，有效治療后濃度很快下降，能較快反映體內(nèi)腫瘤的實(shí)際情況；(5)存在于體液，特別是血液中，易于檢測(cè)(劉炳亞中華胃腸外科雜志，2010，13:163)。腫瘤血清標(biāo)志物的研究一直是本領(lǐng)域的研究重點(diǎn)?，F(xiàn)已有多種胃癌腫瘤標(biāo)識(shí)物如癌胚抗原(CEA)，存在于胃癌及其它腺癌患者的血清中，但對(duì)早期胃癌的診斷意義較小，主要用于胃癌治療前后的動(dòng)態(tài)觀察(Lipkin M:Cancer Research, 1988, 48:235 ；Lipkin: JBC Supplymental, 1992，16:1) ;CA125、CA 19-9, CA50、CA724 以及 CA242 等部分糖抗原在部分胃癌患者中可升高，但其敏感性僅20 40 % (Kodera Y:The Americanjournal of gastroenterology, 1996，91:49 ；Chou M:Disease Markers, 2000，16:105 ；Lai IR etal:Hepato—gastroenterology，2002，49:115 Edip U et al!Advances inTheray, 2008, 25:1075);還有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)糖蛋白抗原_72 (TAG-72)對(duì)胃癌的敏感性為69%，特異性為84% (劉軍等實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，1999，15:4);糖蛋白抗原MG7_Ag在血清中有40% -60%的陽(yáng)性檢出率，在胃癌組織中有80% -94%的陽(yáng)性檢出率(Ren JiCancer,2000,88 :280);核小體組蛋白類抗原(IP0 — 38)作為胃癌診斷的敏感性為57. 4%，特異性超過90% (Hao Y etal: J Proteome Res, 2008，7:3668)以上這些指標(biāo)均有利于早期胃癌的診斷。某些腫瘤基因，如DDC、C-myC、C-erb-2、p53以及nm23等對(duì)胃癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移也有一定意義，但廣泛應(yīng)用于臨床仍受限制(劉倩等，人民衛(wèi)生出版社，2004)。由于現(xiàn)有的胃癌生物標(biāo)識(shí)物在靈敏度和特異性上的缺陷，雖然在療效監(jiān)測(cè)、提示復(fù)發(fā)、判斷預(yù)后和高危人群的普查中具有一定的價(jià)值，但目前仍不能用于胃癌的確診。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)胃癌的早期高靈敏性，高特異性的診斷，急需在分子水平上尋找到更敏感、更特異的胃癌生物標(biāo)志物。我們?cè)谇捌谘芯恐欣萌说鞍踪|(zhì)組芯片高通量、快速分析的優(yōu)勢(shì)，分析了胃癌病人相關(guān)血清101份(胃癌病人37份、高危病人14份、健康人血清50份)，在較短時(shí)間內(nèi)比較了患者和健康人樣品中的不同，給出了候選血清生物標(biāo)志物，以期早期診斷和有效治療胃癌。蛋白質(zhì)CTSF(Cathepsin F)是組織蛋白酶(Cathepsin)家族的一個(gè)成員，組織蛋白酶是一類在大多數(shù)動(dòng)物組織中都存在的細(xì)胞內(nèi)肽鍵水解酶。到目前為止，在生物界現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)20余種組織蛋白酶，從組織蛋白酶A到組織蛋白酶Z都已有報(bào)道。人體中主要存在11種， 包括組織蛋白酶 B、C、F、H、K、L、0、S、V、W 和 X (Turk V etal:EMBO J, 2001, 20:4629 ；TurkV etal Adixin Enzyme Regul, 2002,42 285 ；Nakanishi H:Aging Res Rev,2003, 2:267 ；Berdowska I, Clin Chim Acta, 2004，342:41),它們與人類腫瘤、骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎等多種重大疾病密切相關(guān)，是近年來備受關(guān)注的一類靶標(biāo)蛋白酶。組織蛋白酶F是一種溶酶體酸性蛋白酶，含有484個(gè)氨基酸，具有刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，溶解基底膜、細(xì)胞外基質(zhì)及結(jié)締組織的能力，廣泛分布于動(dòng)物和人體的組織細(xì)胞中。近幾年來，有關(guān)于組織蛋白酶B、D等在消化系統(tǒng)腫瘤中表達(dá)量升高的報(bào)道(于波等中華胃腸外科雜志，2005，8:507 ;李強(qiáng)等實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2006, 20:208 ；S Dariusz Hepato-RastroenteroloRY, 2008, 55:388)。目前為止，尚未見有關(guān)于組織蛋白酶CTSF應(yīng)用于診斷胃癌的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)CTSF在制備診斷胃癌的試劑中的應(yīng)用及診斷試劑盒，來定性檢測(cè)人血清中的抗蛋白質(zhì)CTSF的IgG抗體的水平，作為輔助胃癌早期診斷的一種手段，大大提高胃癌早期診斷的敏感性和特異性。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下蛋白質(zhì)CTSF在制備診斷胃癌的試劑中的應(yīng)用。—種制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒,該試劑盒采用現(xiàn)在臨床廣泛使用的ELISA技術(shù)，應(yīng)用間接法定性檢測(cè)人血清中抗蛋白質(zhì)CTSF的IgG抗體；具體是用純化的人蛋白質(zhì)CTSF抗原通過包被緩沖液稀釋后包被在酶標(biāo)板上的微孔內(nèi)制成固相抗原，加入封閉液；將標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)血清樣品用樣品稀釋液稀釋后加入各自的抗原測(cè)定孔中，每孔加入含有辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的anti-Human IgG抗體的酶標(biāo)試劑,形成CTSF-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，經(jīng)洗滌液徹底洗滌后加酶底物溶液顯色，酶底物溶液反應(yīng)時(shí)間到后加入酸性終止液；所述酶底物溶液在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，利用顏色的深淺來檢測(cè)樣品中抗蛋白質(zhì)CTSF的IgG抗體的水平。所述純化的人蛋白質(zhì)CTSF (帶GST標(biāo)簽)是從釀酒酵母中過量表達(dá)，親和純化而得到，濃度為50iig/mL。
所述標(biāo)準(zhǔn)品包括OU/mL標(biāo)準(zhǔn)血清I和100U/mL標(biāo)準(zhǔn)血清2,分別為正常人血清以及CTSF抗體為陽(yáng)性的血清稀釋于樣品稀釋液中。所述酶標(biāo)試劑含HRP- 二抗0. 1-1 u g/mL。所述酶底物溶液包括顯色劑A:500mL溶液中含醋酸鈉13.6g，檸檬酸1.6g，30%雙氧水 0. 3mL、顯色劑 B 500mL 溶液中含 TMB 350mg, DMSO 20mL，檸檬酸 H2O 5. Igo所述包被緩沖液為0. 05M pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液，即I升溶液中含I. 59g Na2CO3,
2.93g NaHCO3。所述封閉液為0. 5%BSA的0. Olmol/L pH 7. 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS)溶液，即I升溶液中含 5g 牛血清白蛋白(BSA)，8g NaCl, 0. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 12H20，0. 2g KCl。所述樣品稀釋液為0. 01mol/L pH 7. 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS)。所述洗滌液為0. 01mol/L pH 7. 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBST)，PBST內(nèi)含0. 05%Tween-20，即 I 升溶液中含 8g NaCl, 0. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 12H20，0. 2g KCl,0.5mL Tween-20o所述終止液為2mol/L H2SO4溶液。所述試劑盒中的試劑均可以加入防腐劑，以便于保存。本發(fā)明的有益效果在于1.提供的血清生物標(biāo)志物的特異性為92%，敏感性為90%，具有高特異性和高敏感性的特點(diǎn)。2.提供一種靈敏、安全、可靠、易操作的商品化試劑盒，定性測(cè)定人血清中抗蛋白質(zhì)CTSF的IgG抗體的水平，有助于輔助早期診斷胃癌。


圖I是銀染鑒定CTSF的表達(dá)濃度、純化狀況示意圖； 圖中I表示標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液濃度為5 U g/mL2表示標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液濃度為10 U g/mL3表示標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液濃度為25 U g/mL4表示標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液濃度為50 U g/mL5表示標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液濃度為100 U g/mL6表示經(jīng)瓊脂糖親和介質(zhì)(谷胱甘肽)(國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心)分離純化后的CTSF蛋白質(zhì)樣品(含GST標(biāo)簽)。7表示蛋白質(zhì)分子量marker，從大到小分子量分別是170KD，130KD，95KD，72KD，55KD。圖2是Western-Blotting鑒定CTSF的表達(dá)、純化狀況示意圖；圖中I表示經(jīng)瓊脂糖親和介質(zhì)(谷胱甘肽)(國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心)分離純化后的CTSF蛋白質(zhì)樣品(含GST標(biāo)簽)。2表示蛋白質(zhì)分子量marker，從大到小分子量分別是130KD，95KD，72KD，55KD。圖3是健康人、高危、胃癌患者血清中抗蛋白質(zhì)CTSF的IgG抗體的濃度變化。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例和附圖做進(jìn)一步的說明。I 表達(dá)、純化及鑒定CTSF :蛋白質(zhì)CTSF是從前期研究中的經(jīng)過基因工程改造過的釀酒酵母，利用半乳糖誘導(dǎo)過量表達(dá)，瓊脂糖親和介質(zhì)(谷胱甘肽)分離純化，并經(jīng)過Western-Blotting鑒定,分別如圖I和圖2所示。為了更清楚的表達(dá)，圖中采用了帶有灰度的背景。2.血清樣品的準(zhǔn)備全血標(biāo)本于室溫放置2小時(shí)或4°C過夜后于IOOOg離心20分鐘左右，取上清即可立即檢測(cè)；或進(jìn)行分裝，并將標(biāo)本放于_20°C或_80°C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后檢測(cè)。所檢測(cè)樣品中不能含有NaN3,因?yàn)镹aN3抑制辣根過氧化物酶(HRP)的活性。3. ELISA法各種緩沖液及試劑的配制方法(I)包被緩沖液0. 05M pH 9. 6 的 Na2CO3-NaHCO權(quán)利要求
1.蛋白質(zhì)CTSF在制備診斷胃癌的試劑中的應(yīng)用。
2.一種制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒，其特征在于，該試劑盒采用現(xiàn)在臨床廣泛使用的ELISA技術(shù)，應(yīng)用間接法定性檢測(cè)人血清中抗蛋白質(zhì)CTSF的IgG抗體；具體是用純化的人蛋白質(zhì)CTSF抗原通過包被緩沖液稀釋后包被在酶標(biāo)板上的微孔內(nèi)制成固相抗原，加入封閉液；將標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)血清樣品用樣品稀釋液稀釋后加入各自的抗原測(cè)定孔中，每孔加入含有辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的anti-Human IgG抗體的酶標(biāo)試劑,形成CTSF-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，經(jīng)洗滌液徹底洗滌后加酶底物溶液顯色，酶底物溶液反應(yīng)時(shí)間到后加入酸性終止液；所述酶底物溶液在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，利用顏色的深淺來檢測(cè)樣品中抗蛋白質(zhì)CTSF的IgG抗體的水平。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒，其特征在于，所述純化的人蛋白質(zhì)CTSF是從釀酒酵母中過量表達(dá)，親和純化而得到，濃度為50 u g/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)品包括0 U/mL標(biāo)準(zhǔn)血清I和100 U/mL標(biāo)準(zhǔn)血清2，分別為正常人血清和CTSF抗體為陽(yáng)性的血清稀釋于樣品稀釋液中。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒，其特征在于，所述酶底物溶液包括顯色劑A :500 mL溶液中含醋酸鈉13. 6 g，檸檬酸I. 6 g,30 %雙氧水0.3 mL、顯色劑 B :500 mL 溶液中含 TMB 350 mg, DMSO 20 mL，檸檬酸 H2O 5. I g。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒，其特征在于，所述包被緩沖液為0. 05 M pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液，即I升溶液中含I. 59 g Na2CO3, 2. 93 g NaHCO30
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒，其特征在于，所述封閉液為0. 5 % BSA的0. 01 mol/L pH 7. 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS)溶液，即I升溶液中含5g 牛血清白蛋白(BSA)，8 g NaCl, 0. 2 g KH2PO4, 2. 9 g Na2HPO4 12H20,0. 2 g KC1。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒，其特征在于，所述樣品稀釋液為0. 01mol/L pH 7. 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS)。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒，其特征在于，所述洗滌液為 0. 01 mol/L pH 7. 4 磷酸鹽-Nacl 緩沖液(PBST)，PBST 內(nèi)含 0. 05 % Tween-20,即 I 升溶液中含 8 g NaCl, 0. 2 g KH2PO4, 2. 9 g Na2HPO4 12H20,0. 2 g KCl, 0. 5 mL Tween-20
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒，其特征在于，所述終止液為 2 mol/L H2SO4 溶液。
11.根據(jù)權(quán)利要求2至10中任一所述的制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中的試劑均可以加入防腐劑，以便于保存。
全文摘要
本發(fā)明公開一種蛋白質(zhì)CTSF在制備診斷胃癌的試劑中的應(yīng)用及診斷試劑盒，采用現(xiàn)在臨床廣泛使用的ELISA技術(shù)，應(yīng)用間接法定性檢測(cè)人血清中抗蛋白質(zhì)CTSF的IgG抗體；具體是用純化的人蛋白質(zhì)CTSF抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中依次加入待測(cè)血清，再加入含有辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的anti-HumanIgG抗體的酶標(biāo)試劑，形成CTSF-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加酶底物溶液TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，用顏色的深淺檢測(cè)樣品中CTSF的IgG抗體的水平。本發(fā)明所提供的試劑盒，作為輔助胃癌早期診斷的一種手段，大大提高胃癌早期診斷的敏感性和特異性。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102680706SQ20121014908
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者劉炳亞, 朱正綱, 李建芳, 楊麗娜, 燕敏, 王靖方, 郭書娟, 陶生策 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)