專利名稱:蛋白質(zhì)cops2在制備診斷胃癌的試劑中的應(yīng)用及診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域,更具體地說,涉及ー種蛋白質(zhì)C0PS2在制備診斷胃癌的試劑中的應(yīng)用及診斷試劑盒。
背景技術(shù):
胃癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤,根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO) 2008年的統(tǒng)計(jì)(世界衛(wèi)生組織年度統(tǒng)計(jì),2008),在全世界范圍,胃癌病人的死亡率高居第二。在2006年WHO的統(tǒng)計(jì)中顯示有接近950,000個新發(fā)病例,同時(shí)有約700,000人死于這ー種疾病。在我國,毎年胃癌新發(fā)患者數(shù)超過30萬,死于胃癌的人數(shù)約16萬,病死率居惡性腫瘤之首,嚴(yán)重 威脅人民生命健康(陳竺,全國第三次死因回顧抽樣調(diào)查報(bào)告,2008)。為降低死亡率,提高胃癌的療效,關(guān)鍵是胃癌的“三早”工作,即早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及早期治療。然而,由于絕大多數(shù)胃癌患者缺乏特異性的臨床癥狀,故早期胃癌診斷率很低,手術(shù)率不足10% (吳云林外科理論與實(shí)踐,2005,10 :401);術(shù)后病人的生存期也較短。目前,我國胃癌總體5年生存率為43. 4%,術(shù)后病理分期(pathological TNM,pTNM) I、II、III、IV期患者的術(shù)后5年生存率分別為75. 65%,58. 73%,28. 01%和8. 42% (劉炳亞中華胃腸外科雜志,2010,13:163)。因此,提高胃癌的早期診斷率非常重要。而一般體檢和影像學(xué)檢查作用有限,待能夠發(fā)現(xiàn)和明確診斷時(shí),往往已到了中、晩期,缺少預(yù)警價(jià)值。因此,從長遠(yuǎn)角度看,應(yīng)致カ于發(fā)現(xiàn)敏感性和特異性均較好的腫瘤標(biāo)志物。此外,胃癌異質(zhì)性大,預(yù)后及對治療的反應(yīng)性差別較大,對于臨床評估預(yù)后以及對治療反應(yīng)性的預(yù)測與評價(jià),均需良好的腫瘤標(biāo)志物。理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)符合以下條件(I)敏感性高;(2)特異性高;(3)腫瘤標(biāo)志物濃度和腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、惡性程度有關(guān),能協(xié)助腫瘤分期和判斷預(yù)后;(4)半衰期短,有效治療后濃度很快下降,能較快反映體內(nèi)腫瘤的實(shí)際情況;(5)存在于體液,特別是血液中,易于檢測(劉炳亞中華胃腸外科雜志,2010,13 :163)。腫瘤血清標(biāo)志物的研究一直是本領(lǐng)域的研究重點(diǎn)?,F(xiàn)已有多種胃癌腫瘤標(biāo)識物如癌胚抗原(CEA),存在于胃癌及其它腺癌患者的血清中,但對早期胃癌的診斷意義較小,主要用于胃癌治療前后的動態(tài)觀察(Lipkin M Cancer Research, 1988,48 235 ;Lipkin JBC Supplymental, 1992,16 :1) ;CA125、CA 19-9, CA50、CA724 以及 CA242 等部分糖抗原在部分胃癌患者中可升高,但其敏感性僅20 40% (Kodera Y The American journal ofgastroenterology,1996,91 :49 ;Chou M !Disease Markers,2000,16 :105 Lai IR etal Hepato—gastroenterology,2002,49 :115 Edip U et al !Advances in Theray,2008,25 :1075);還有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)糖蛋白抗原-72 (TAG-72)對胃癌的敏感性為69 %,特異性為84% (劉軍等實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,1999,15 :4);糖蛋白抗原MG7_Ag在血清中有40%-60%的陽性檢出率,在胃癌組織中有80%-94%的陽性檢出率(Ren J =Cancer, 2000,88 280);核小體組蛋白類抗原(IP0-38)作為胃癌診斷的敏感性為57.4%,特異性超過90% (Hao Yetal J Proteome Res,2008,7 :3668)以上這些指標(biāo)均有利于早期胃癌的診斷。某些腫瘤基因,如DDC、c-myc、c_erb_2、p53以及nm23等對胃癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移也有一定意義,但廣泛應(yīng)用于臨床仍受限制(劉倩等,人民衛(wèi)生出版社,2004)。由于現(xiàn)有的胃癌生物標(biāo)識物在靈敏度和特異性上的缺陷,雖然在療效監(jiān)測、提示復(fù)發(fā)、判斷預(yù)后和高危人群的普查中具有一定的價(jià)值,但目前仍不能用于胃癌的確診。為了實(shí)現(xiàn)對胃癌的早期高靈敏性,高特異性的診斷,急需在分子水平上尋找到更敏感、更特異的胃癌生物標(biāo)志物。我們在前期研究中利用人蛋白質(zhì)組芯片高通量、快速分析的優(yōu)勢,分析了胃癌病人相關(guān)血清101份(胃癌病人37份、高危病人14份、健康人血清50份),在較短時(shí)間內(nèi)比較了患者和健康人樣品中的不同,給出了候選血清生物標(biāo)志物,以期早期診斷和有效治療胃癌。蛋白C0PS2(C0P9 constitutive photomorphogenic homo log subunit 2)是 C0P9構(gòu)成性光敏形態(tài)發(fā)生同源物亞基2,是C0P9信號復(fù)合體(C0P9 sinalosome, CSN)的ー種亞型。CSN最初是在對擬南芥種子植入發(fā)育的光形態(tài)發(fā)生的遺傳學(xué)分析中被發(fā)現(xiàn),是植物 光形態(tài)發(fā)生的ー個負(fù)調(diào)節(jié)子,是ー個E3連接酶的調(diào)節(jié)因子,可以促進(jìn)NEDD8/RUBI從特定的E3連接酶上解離下來。真核生物的C0P9信號復(fù)合體是細(xì)胞內(nèi)高度保守的多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合物,主要定位于細(xì)胞核,在結(jié)構(gòu)上與26S蛋白酶體亞復(fù)合物高度相關(guān)。CSN的具體功能目前尚未明確,主要體現(xiàn)為兩方面的活性脫Nedd化作用和磷酸化作用;在細(xì)胞內(nèi)同SCF遍在蛋白連接酶復(fù)合體等許多蛋白質(zhì)復(fù)合物發(fā)生相互作用;調(diào)節(jié)多種信號分子靶向遍在蛋白-26S蛋白酶體的穩(wěn)定性。因此,CSN是連接信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與蛋白質(zhì)降解的分子平臺(王妍生命的化學(xué),2004,5 :4)。目前,尚未見有將C0PS2蛋白質(zhì)作為胃癌生物標(biāo)志物的報(bào)導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題,本發(fā)明提供ー種蛋白質(zhì)C0PS2在制備診斷胃癌的試劑中的應(yīng)用及診斷試劑盒,來定性檢測人血清中的抗蛋白質(zhì)C0PS2的IgG抗體的水平,作為輔助胃癌早期診斷的ー種手段,大大提高胃癌早期診斷的敏感性和特異性。為達(dá)到上述目的,本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下蛋白質(zhì)C0PS2在制備診斷胃癌的試劑中的應(yīng)用。—種制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒,該試劑盒采用現(xiàn)在臨床廣泛使用的ELISA技木,應(yīng)用間接法定性檢測人血清中抗蛋白質(zhì)C0PS2的IgG抗體;具體是用純化的人蛋白質(zhì)C0PS2抗原通過包被緩沖液稀釋后包被在酶標(biāo)板上的微孔內(nèi)制成固相抗原,加入封閉液;將標(biāo)準(zhǔn)品與待測血清樣品用樣品稀釋液稀釋后加入各自的抗原測定孔中,每孔加入含有辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的anti-Human IgG抗體的酶標(biāo)試劑,形成C0PS2-抗體-酶標(biāo)ニ抗復(fù)合物,經(jīng)洗滌液徹底洗滌后加酶底物溶液顯色,酶底物溶液反應(yīng)時(shí)間到后加入酸性終止液;所述酶底物溶液在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,利用顔色的深淺來檢測樣品中抗蛋白質(zhì)C0PS2的IgG抗體的水平。所述純化的人蛋白質(zhì)C0PS2 (帶GST標(biāo)簽)是從釀酒酵母中過量表達(dá),親和純化而得到,濃度為251^/111し所述標(biāo)準(zhǔn)品包括0U/mL標(biāo)準(zhǔn)血清I和100U/mL標(biāo)準(zhǔn)血清2,分別為正常人血清以及C0PS2抗體為陽性的血清稀釋于樣品稀釋液中。
所述酶標(biāo)試劑含HRP- ニ抗O. 1-1 μ g/mL。所述酶底物溶液包括顯色劑A :500mL溶液中含醋酸鈉13. 6g,檸檬酸I. 6g,30%雙氧水 O. 3mL、顯色劑 B 500mL 溶液中含 TMB 350mg, DMSO 20mL,檸檬酸· H2O 5. Igo所述包被緩沖液為O. 05M pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液,即I升溶液中含I. 59g Na2CO3,2. 93g NaHCO3。所述封閉液為O. 5% BSA的O. 01mol/L pH 7. 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS)溶液,即 I 升溶液中含 5g 牛血清白蛋白(BSA),8g NaCl, O. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 · 12Η20,0· 2gKCl。所述樣品稀釋液為O. 01mol/L pH 7. 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS)。所述洗滌液為O. 01mol/L pH 7. 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBST),PBST內(nèi)含0. 05%Tween-20,即 I 升溶液中含 8g NaCl, 0. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 · 12H20,0. 2g KCl,0.5mL Tween-20。所述終止液為2mol/L H2SO4溶液。所述試劑盒中的試劑均可以加入防腐剤,以便于保存。本發(fā)明的有益效果在于1.提供的血清生物標(biāo)志物的特異性為91%,敏感性為90%,具有高特異性和高敏感性的特點(diǎn)。2.提供一種靈敏、安全、可靠、易操作的商品化試劑盒,定性測定人血清中抗蛋白質(zhì)C0PS2的IgG抗體的水平,有助于輔助早期診斷胃癌。
圖I是銀染鑒定C0PS2的表達(dá)濃度、純化狀況示意圖;圖中I表示標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液濃度為5 μ g/mL2表示標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液濃度為10 μ g/mL3表示標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液濃度為25 μ g/mL4表示標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液濃度為50 μ g/mL5表示標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液濃度為100 μ g/mL6表示經(jīng)瓊脂糖親和介質(zhì)(谷胱甘肽)(國家生化工程技術(shù)研究中心)分離純化后的C0PS2蛋白質(zhì)樣品(含GST標(biāo)簽)。7表示蛋白質(zhì)分子量marker,從大到小分子量分別是170KD,130KD,95KD,72KD,55KD。圖2是Western-Blotting鑒定C0PS2的表達(dá)、純化狀況示意圖;圖中I表示經(jīng)瓊脂糖親和介質(zhì)(谷胱甘肽)(國家生化工程技術(shù)研究中心)分離純化后的C0PS2蛋白質(zhì)樣品(含GST標(biāo)簽)。2表示蛋白質(zhì)分子量marker,從大到小分子量分別是130KD,95KD,72KD,55KD。圖3是正常人、高危、胃癌患者血清中抗蛋白質(zhì)C0PS2的IgG抗體的濃度變化。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例和附圖做進(jìn)ー步的說明。
I.表達(dá)、純化及鑒定C0PS2 蛋白質(zhì)C0PS2是從前期研究中的經(jīng)過基因工程改造過的釀酒酵母,利用半乳糖誘導(dǎo)過量表達(dá),瓊脂糖親和介質(zhì)(谷胱甘肽)分離純化,并經(jīng)過Western-Blotting鑒定,分別如圖I和圖2所示。為了更清楚的表達(dá),圖中采用了帶有灰度的背景。2.血清樣品的準(zhǔn)備全血標(biāo)本于室溫放置2小時(shí)或 4°C過夜后于IOOOg離心20分鐘左右,取上清即可立即檢測;或進(jìn)行分裝,并將標(biāo)本放于-20°C或-80°C保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。解凍后的樣品應(yīng)再次離心,然后檢測。所檢測樣品中不能含有NaN3,因?yàn)镹aN3抑制辣根過氧化物酶(HRP)的活性。3. ELISA法各種緩沖液及試劑的配制方法(I)包被緩沖液0. 05M pH 9. 6 的 Na2CO3-NaHCO3
包被緩沖液質(zhì)量(g)
Na2CO3I. 59
NaHCO32.93
CldH2O加至 1000 mL(2)樣品稀釋液pH 7. 4 PBS溶液
樣品稀釋液質(zhì)量(g)
NaCl8.O
KH2PO4O. 2
Na2HPO1 · 12E02. 9
KClO. 2
ddH20加至 1000 mL(3)洗滌液pH 7. 4 的 PBST 溶液
洗滌液質(zhì)量(g)
NaCl8.O
KH3PO4O. 2Na3HPO4 · 12 O2.9
KCiO. 2
Tween-20O. 5 mL
ddH20加至 1000 mL(4)封閉液0. 5% BSA 的 pH 7. 4 PBS 溶液
權(quán)利要求
1.蛋白質(zhì)C0PS2在制備診斷胃癌的試劑中的應(yīng)用。
2.ー種制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒,其特征在于,該試劑盒采用現(xiàn)在臨床廣泛使用的ELISA技術(shù),應(yīng)用間接法定性檢測人血清中抗蛋白質(zhì)C0PS2的IgG抗體;具體是用純化的人蛋白質(zhì)C0PS2抗原通過包被緩沖液稀釋后包被在酶標(biāo)板上的微孔內(nèi)制成固相抗原,加入封閉液;將標(biāo)準(zhǔn)品與待測血清樣品用樣品稀釋液稀釋后加入各自的抗原測定孔中,每孔加入含有辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的anti-Human IgG抗體的酶標(biāo)試劑,形成C0PS2-抗體-酶標(biāo)ニ抗復(fù)合物,經(jīng)洗滌液徹底洗滌后加酶底物溶液顯色,酶底物溶液反應(yīng)時(shí)間到后加入酸性終止液;所述酶底物溶液在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,利用顔色的深淺來檢測樣品中抗蛋白質(zhì)C0PS2的IgG抗體的水平。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒,其特征在于,所述純化的人蛋白質(zhì)C0PS2是從釀酒酵母中過量表達(dá),親和純化而得到,濃度為25μ g/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒,其特征在于,所述標(biāo)準(zhǔn)品包括OU/mL標(biāo)準(zhǔn)血清I和100U/mL標(biāo)準(zhǔn)血清2,分別為正常人血清以及C0PS2抗體為陽性的血清稀釋于樣品稀釋液中。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒,其特征在于,所述酶底物溶液包括顯色劑A :500mL溶液中含醋酸鈉13. 6g,檸檬酸I. 6g,30%雙氧水O. 3mL、顯色劑B 500mL 溶液中含 TMB 350mg, DMSO 20mL,檸檬酸· Η205· lg。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒,其特征在于,所述包被緩沖液為O. 05M pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液,即I升溶液中含I. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO30
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒,其特征在于,所述封閉液為O. 5% BSA的O. Olmol/L pH 7. 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS)溶液,即I升溶液中含5g牛血清白蛋白(BSA),8g NaCl, O. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 · 12H20,0.2g KC1。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒,其特征在于,所述樣品稀釋液為O. 01mol/L pH 7. 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS)。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒,其特征在于,所述洗滌液為 0. 01mol/L pH 7. 4 磷酸鹽-NaCl 緩沖液(PBST),PBST 內(nèi)含 0. 05% Tween-20,即 I 升溶液中含 8g NaCl, 0. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 · 12Η20,0· 2g KCl,O. 5mL Tween-20
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒,其特征在于,所述終止液為 2mol/L H2SO4 溶液。
11.根據(jù)權(quán)利要求2至10中任一所述的制備診斷胃癌疾病的診斷試劑盒,其特征在干,所述試劑盒中的試劑均可以加入防腐剤,以便于保存。
全文摘要
本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)COPS2在制備診斷胃癌的試劑中的應(yīng)用及診斷試劑盒,采用現(xiàn)在臨床廣泛使用的ELISA技術(shù),應(yīng)用間接法定性檢測人血清中抗蛋白質(zhì)COPS2的IgG抗體;用純化的人蛋白質(zhì)COPS2抗原包被微孔板,制成固相抗原,往包被抗原的微孔中依次加入待測血清,再加入含有辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的anti-HumanIgG抗體的酶標(biāo)試劑,形成COPS2-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物,經(jīng)過徹底洗滌后加酶底物溶液TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,用顏色的深淺檢測樣品中COPS2的IgG抗體的水平。本發(fā)明所提供的試劑盒,作為輔助胃癌早期診斷的一種手段,大大提高胃癌早期診斷的敏感性和特異性。
文檔編號G01N33/68GK102680707SQ20121014914
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者劉炳亞, 朱正綱, 李建芳, 楊麗娜, 燕敏, 王靖方, 郭書娟, 陶生策 申請人:上海交通大學(xué)